I. Fisiologi Reproduktif

I.1 Biologi Molekuler bagi Klinisi

1. Biologi Molekuler bagi Klinisi

Rangkaian DNA di atas jelas merupakan suatu mutan, namun fakta bahwa kita

dapat mengenali kriptogram ini sebagai sebuah rangkaian nukleotida dan mendiagnosis

adanya mutasi menunjukkan kemajuan yang luar biasa dalam pemahaman tentang biologi

manusia. Biologi molekuler adalah suatu ilmu subspesialistik mengenai pemahaman

struktur dan fungsi genom, pelengkap yang utuh dari DNA (asam deoksiribonukleat),

makromolekul yang mengandung semua informasi herediter.

Gregor Mendel, seorang biarawan Austria mempelajari kebun kacang polongnya

sepanjang sebagian besar masa hidupnya di biara dan merupakan orang pertama yang

mengungkapkan prinsip-prinsip hereditas pada tahun 1860an. Ia mendeskripsikan sifat

dominan dan resesif dan hukum-hukum transmisi yang mengatur pewarisan homozigot

dan heterozigot dari sifat-sifat tersebut. Teori Mendel tersebut baru dikemukakan pada

tahun 1900. Sayangnya, Mendel meninggal dunia 16 tahun sebelum hasil kerjanya diakui

Teori pembentukan pasangan dan pemisahan kromosom saat pembelahan sel

dikemukakan pada tahun 1903, namun baru pada tahun 1946 di Universitas Yale, Edward

Tatum dan Joshua Lederberg melakukan demonstrasi pada bakteri bahwa DNA

membawa informasi herediter. James Watson dan Francis Crick, yang bekerja di

Laboratorium Cavendish di Cambridge, mengusulkan struktur DNA pada 1953 dengan

menciptakan suatu model berdasarkan parameter dari Maurice Wilkins dan Rosalind

Franklin yang dikumpulkan melalui x-ray crystallography. Crick, Watson, dan Wilkins

menerima Hadiah Nobel pada 1962; Franklin wafat pada 1958, dan Hadiah Nobel tidak

diberikan kepada orang yang telah meninggal dunia. Replikasi DNA melibatkan berbagai

sistem enzim. DNA polimerase diisolasi pada tahun 1958, sedangkan RNA polimerase

diisolasi pada tahun 1960. Pada tahun 1978, Werner Arberm Hamilton Smith, dan Daniel

Nathans menerima Hadiah Nobel atas penemuannya pada tahun 1960an tentang enzim-

enzim untuk penggabungan dan pemotongan DNA. Penggunaan enzim ligase dan

restriction endonuclease memungkinkan produksi molekul DNA rekombinan, yang

pertama kali dilakukan oleh Paul Berg di Universitas Stanford pada 1972.

1

Pada tahun 1975, E.M Southern dari Universitas Edinburgh mengembangkan

teknik untuk mentransfer DNA dari gel agarose ke filter nitroselulosa, memungkinkan

fragmen-fragmen DNA untuk digabungkan dengan radiolabeled RNA probes dan

kemudian diisolasi. Kloning gen atau fragmen DNA mengikuti terobosan bahwa plasmid

yang membawa molekul DNA asing dapat dimasukkan ke bakteri, memicu replikasi DNA

asing tersebut.

Genom adalah satu set lengkap DNA pada suatu organisme. Studi tentang fungsi

dan interaksi seluruh gen pada genom membutuhkan suatu nama baru, yaitu genomik,

yang dimuat dalam satu jurnal dengan judul yang sama pada 1987.

Kita telah memasuki masa biologi molekuler. Tidak lama lagi, masalah-masalah

endokrin akan dapat dijelaskan, didiagnosis, dan dirawat pada level molekuler. Sebentar

lagi, pemeriksaan hormon tradisional akan segera ditinggalkan. Kekuatan biologi

molekuler akan menyentuh kita semua, dan kontribusi-kontribusi biologi molekuler akan

dipaparkan melalui buku ini. Sayangnya, biologi molekuler memiliki bahasanya sendiri,

bahasa yang hampir tidak bisa dimengerti oleh orang awam. Bab ini menawarkan

panduan kedokteran molekuler.

Untuk memulai suatu buku klinis dengan bab tentang biologi molekuler dan

biokimia hanyalah ditujukan untuk menekankan bahwa keputusan klinis yang kompeten

ditemukan di dasar-dasar ilmu pengetahuan. Di sisi lain, praktik klinis tidak membutuhkan

kemahiran ilmu sains dasar yang teknis dan rumit. Tujuan dari 2 bab pertama ini bukan

untuk menyajikan pelajaran intensif tentang ilmu sains dasar, namun lebih untuk meninjau

prinsip-prinsip yang paling penting dan informasi yang diperlukan untuk perkembangan

konsep-konsep fisiologis dan klinis yang perlu diikuti. Lebih jauh lagi, bab tersebut

dimaksudkan sebagai referensi dari detail-detail tertentu yang sulit diingat.

2. Kromosom

Kita semua adalah eukariot, organism dengan sel-sel yang memiliki nukleus yang

dibatasi oleh membran nuklear, dan bermultiplikasi melalui mitosis. Bakteri adalah

prokariot, organism tanpa nukleus yang sebenarnya, dan reproduksinya melalui

pembelahan sel. Kecuali DNA dalam mitokondria, semua DNA kita dikemas dalam suatu

nukleus yang dikelilingi oleh membran nuklear. Mitokondria dipercaya sebagai keturunan

dari bakteri primitif yang ditelan oleh nenek moyang kita, dan mitokondria masih

mengandung beberapa gen yang penting. Karena ova kaya akan mitokondria, penyakit-

2

penyakit yang disebabkan oleh gen-gen mitokondrial (misalnya neuropati optik Leber)

ditransmisikan melalui ibu. Mitokondria pada sperma tereliminasi selama fertilisasi.

Kromosom merupakan paket-paket materi genetik yang mengandung molekul DNA

(yang mengandung banyak gen) yang ditempeli oleh sejumlah besar protein yang

mempertahankan struktur kromosom serta memainkan peranan penting dalam ekspresi

gen. Sel somatik manusia mengandung 46 kromosom, 22 pasang autosom, dan sepasang

kromosom seks. Semua sel somatik adalah diploid, dengan 23 pasang kromosom. Hanya

gamet yang haploid, dengan 22 kromosom autosom dan 1 kromosom seks. Ukuran

kromosom bervariasi, mulai dari 50 juta sampai 250 juta pasangan basa. Kromosom 1

mengandung gen terbanyak (2.968), sedangkan kromosom Y memiliki jumlah paling

sedikit (231). Semuanya mengandung sebuah bagian kecil yang disebut sentromer, yang

membagi kromosom menjadi 2 lengan, yaitu lengan p yang lebih pendek dan lengan q

yang lebih panjang. Kedua anggota dari semua pasangan autosom bersifat homolog, tiap

homolog adalah turunan dari masing-masing orangtua. Jumlah kromosom tidak

menunjukkan level dari kerumitan evolusi; anjing memiliki 78 kromosom, sedangkan ikan

gurami memiliki 104!

Suatu gen merupakan suatu unit dari DNA dalam kromosom yang dapat diaktivasi

untuk mentranskripsikan suatu RNA spesifik.Lokasi suatu gen pada kromosom tertentu is

designated lokusnya. Karena ada 22 pasang autosom, sebagian besar gen berpasangan.

Pasangan tersebut bersifat homozigot bila mirip dan bersifat heterozigot bila tidak mirip.

Hanya 2% dari genom manusia yang mengandung gen yang mengkode sintesis protein.

Karyotipe manusia yang umum merupakan suatu rangkaian dari kromosom-

kromosom menjadi pasanga-pasangan, biasanya setelah perlakuan proteolitik dan

pengecatan Giemsa untuk menciptakan pola banding yang khas, memungkinkan adanya

blueprint yang berguna untuk penentuan lokasi. Pengecatan karakterisitik membagi tiap

lengan menjadi region-regio, dan tiap regio menjadi band (pita) yang diberi nomor dari

sentromernya ke arah luar. Suatu titik pada suatu kromosom dinyatakan dengan urutan

sebagai berikut: nomor kromosom, simbol lengan (p untuk lengan pendek dan q untuk

lengan panjang), nomor regio, dan nomor band. Misalnya, 7q31.1 adalah lokasi gen

fibrosis sistik.

Mitosis

3

Semua eukariot, dari yeast hingga manusia, mengalami pembelahan dan multiplikasi sel

yang mirip. Proses pembelahan inti sel pada semua sel somatik disebut mitosis, di mana

tiap kromosom mebelah menjadi 2. Untuk perutmbuhan dan perkembangan normal,

seluruh informasi genomik harus direproduksi pada setiap sel. Mitosis terdiri dari tahap-

tahap berikut:

Interfase

Pada fase ini, semua aktivitas sel normal terjadi kecuali pembelahan aktif. Pada tahap ini,

kromosom X inaktif (Barr body atau kromatin seks) dapat dilihat di sel perempuan.

Profase

Saat pembelahan dimulai, kromosom memadat dan kedua kromatid terlihat. Membran

nuklear menghilang. Sentriol adalah organel di luar nukleus yang membentuk spindle

untuk pembelahan sel; sentriol menduplikasi dirinya sendiri, dan kedua sentriol tersebut

bermigrasi ke kutub-kutub sel yang berlawanan.

Metafase

Kromososm bermigrasi ke bagian tengah sel, membentuk suatu garis yang menandai

piringan ekuatorial. Saat ini, kromosom-kromosom telah terkondensasi maksimal. Pada

tahap ini terbentuk spindle, suatu mikrotubulus protein yang menyebar dari sentriol dan

melekat pada sentromer.

Anafase

Pembelahan terjadi pada plane longitudinal dari sentromer. Kedua kromatid berpindah ke

sisi yang berlawanan dari sel karena kontraksi spindle.

Telofase

Pembelahan sitoplasma dimulai pada plane ekuatorial, berakhir dengan pembentukan 2

membran sel yang utuh. Kedua kelompok kromosom dikelilingi oleh membran nuklear

yang membentuk nuklei baru. Tiap strand DNA bertindak sebagai template, dan DNA

pada sel berlipat ganda

Meiosis

Meiosis adalah pembelahan sel yang membentuk gamet, masing-masing dengan jumlah

kromosom yang haploid. Meiosis memiliki 2 tujuan: reduksi jumlah kromosom dan

rekombinasi untuk mentransmisikan informasi genetik. Pada meisois I, kromosom

homolog berpasangan dan kemudian berpisah. Meiosis II mirip dengan mitosis, dimana

kromosom yang telah terpisah membelah dan bersegregasi menjadi sel baru.

4

Meiosis I

Profase

Lepoten Kondensasi kromosomZigoten Kromosom yang homolog berpasangan (sinapsis)Pakiten Tiap pasangan kromosom menebal untuk membentuk 4 strand. Pada tahap

ini dapat terjadi crossing over atau rekombinasi (pertukaran DNA antara

segmen-segmen homolog antara 2 dari 4 strand). Chiasmata adalah tempat

dimana crossover terjadi (dan dapat divisualisasikan). Pergerakan blok-blok

DNA ini adalah suatu metode untuk menciptakan keragaman genetik. Di sisi

lain, penyakit genetik dapat disebabkan oleh insersi of sequences saat

gametogenesis. Rekombinasi transposisional, yang menggunakan enzim

yang mengenali rangkaian asam nukleat spesifik, dapat menyebabkan

terjadinya insersi elemen genetik ke regio apapun pada kromosom. Metode

ini digunakan oleh virus (misalnya HIV) untuk mentransformasi sel host. Diploten Perpisahan longitudinal dari tiap kromosom

Metafase, Anafase, dan Telofase Meiosis I

Membran nuklear menghilang, dan kromosom berpindah ke bagian tengah sel. Satu

anggota dari tiap pasangan berpindah ke tiap kutub, dan sel membelah. Meiosis I sering

disebut sebagai pembelahan reduksi, karena produk yang dihasilkan memiliki jumlah

kromosom yang haploid. Pewarisan Mendel terjadi pada meiosis I. Crossover yang terjadi

sebelum metaphase menghasilkan kombinasi baru dari materi genetik, baik kombinasi

yang diinginkan maupun yang tidak diinginkan.

Meiosis II

Meiosis II mengikuti meiosis I tanpa adanya replikasi DNA. Pada oosit, meiosis II terjadi

setelah fertilisasi. Hasil akhirnya adalah 4 sel haploid.

*gambar*

3. Struktur dan Fungsi DNA

DNA adalah materi gen yang bertanggungjawab atas pengkodean pesan genetik

as transmitted melalui protein spesifik. Sehingga, DNA adalah molekul terpenting dalam

kehidupan dan merupakan mekanisme fundamental dari evolusi. Gen adalah segmen dari

5

DNA yang mengkode protein spesifik, bersama dengan rangkaian yang mengapit dan

menghalangi yang memiliki fungsi pengontrol dan regulator. Tiap molekul DNA memiliki

sebuah backbone gula deoksiribosa, sekelompok gula deoksiribosa identik berulang yang

terhubung melalui ikatan fosfodiester. Tiap deoksiribosa menempel secara urut (memberi

individualitas dan spesifisitas) pada satu dari empat asam nukleat, basa-basa nuklear

antara lain:

Purin : adenine atau guanine

Pirimidin : timin atau sitosin

Suatu nukleotida adalah dasar dari DNA. Nukleotida terdiri dari 3 komponen

utama: gula deoksiribosa, satu grup fosfat, dan satu basa asam nukleat. Linkage fosfat-

gula adalah asimetris; fosfornya berhubungan dengan 5-karbon dari satu gula dan dengan

3-karbon dari gula berikutnya. Sehingga, satu ujungnya adalah ujung 5 (5 prime),

sedangkan ujung lainnya adalah ujung 3 (3 prime). Menurut kesepakatan, DNA dan

rangkaian asam nukleatnya ditulis dari kiri ke kanan, dari ujung 5 ke ujung 3, sesuai arah

proses transkripsi. Ujung 5 membentuk ujung amino dari protein, sedangkan ujung 3

membentuk ujung karboksi dari protein.

DNA terdiri dari 2 strand deoksiribosa yang terpilin searah jarum jam satu sama

lain dalam suatu heliks ganda, dengan asam nukleat di dalamnya dan basa nuklear

berpasangan melalui hydrogen bonding, adenine dengan timin, dan sitosin dnegan

guanine. RNA berbeda dengan DNA karena RNA memiliki strand tunggal, gulanya adalah

ribose, dan timin digantikan oleh urasil.

*gambar*

*gambar*

Bagaimana suatu DNA sel, yang bila diuraikan berukuran hampir 2 meter, bisa

muat dalam satu sel? Watson dan Crick menemukannya saat mereka mengusulkan suatu

helix terpilin dengan dua strand, double helix. Seperti halnya sentimeter yang merupakan

ukuran panjang, pasangan basa (base pair: bp) adalah unit ukuran DNA. Pasangan

basanya adalah adenine-guanin atau sitosin-timin, asam nukleat dari satu rantai

berpasangan dengan asam nukleat dari rantai lain yang berhadapan. Sehingga, satu

fragmen DNA diukur dari jumlah pasangan basa, misalnya suatu fragmen 4.800-bp

(fragmen 4,8 kb). Diperkirakan bahwa kita memiliki 3,2 milyar bp DNA, dan hanya

sebagian kecil yang mengkode protein.

6

DNA tidak terdapat dalam sel sebagai molekul telanjang. Rantai nukleotida

membungkus suatu inti protein (histon) untuk membentuk nukleosom. Nukleosom

berkondensasi menjadi banyak band yang dikenali dalam preparasi karyotipe. Kondensasi

ini adalah mekanisme penting lain untuk mengemas struktur DNA yang panjang ke dalam

sebuah sel. Banyak protein lain berhubungan dengan DNA serta penting untuk struktur

dan fungsinya.

Proses replikasi DNA dimulai dengan pemisahan double-stranded DNA helix

(heliks DNA helai-ganda), diawali dengan berbagai tahapan oleh aksi enzim. Saat DNA

asli membuka menjadi template strand, DNA polymerase mengkatalisasi sintesis strand

(helaian) duplikat baru, yang membentuk ulang suatu heliks ganda dengan tiap-tiap strand

asli (ini disebut replikasi). Sehingga, tiap molekul turunan mengandung salah satu strand

dari orangtuanya. Diperkirakan bahwa molekul DNA asli yang didapatkan pada zigot yang

sudah difertilisasi harus digandakan sebanyak kira-kira 1015 kali sepanjang masa hidup

manusia. Kecepatan dan ketepatan sangatlah penting. Dengan menggabungkan presisi

dan sistem koreksi, kesalahan-kesalahan yang mempengaruhi fungsi protein gen

sangatlah jarang.

*20 asam amino dalam protein*

Homeobox adalah suatu rangkaian DNA, yang dipertahankan sepanjang evolusi,

yang megkode suatu rangkaian yang terdiri dari 60 asam amino, disebut homeodomain.

Produk protein homeodomain berfungsi sebagai faktor transkripsi dengan cara berikatan

dengan DNA. Homeobox mempengaruhi fungsi jaringan spesifik yang penting untuk

pertumbuhan dang perkembangan embrio.

Genom Manusia

Genom dari tiap spesies terdiri dari serangkaian DNA pada semua kromosom. Ada

3,2 milyar pasangan basa pada tiap haploid genom manusia; pada double-stranded helix

DNA, ada 6 milyar nukleotida, dan terdapat sekitar 30.000-35.000 gen, unit fungsional

terkecil dari informasi yang diturunkan. Gen bertanggungjawab atas hanya sekitar 2%

DNA manusia. Walaupun sekilas terlihat amat rumit, namun seluruh bahasa genetik ditulis

hanya dengan 4 huruf: A, C, G, dan T (U pada RNA). Terlebih lagi, bahasa tersebut

terbatas pada hanya 3-letters words, kodon. Pada akhirnya, seluruh pesan genetik

terfragmentasi menjadi 23 pasang kromosom. Dengan 4 nukleotida, dan 3 kelompok

bacaan, ada 64 kombinasi yang mungkin. Semua organisme hidup menggunakan kode

7

ini. Genom berubah hanya karena kombinasi baru yang diturunkan dari orangtua atau

karena mutasi.

*kode genetik mRNA*

Struktur dan Fungsi Gen

Susunan linear dari banyak gen membentuk suatu kromosom. Suatu gen tersusun dari

sebuah segmen DNA yang mengandung exon-exon (kodon pengkode) yang dipisahkan

oleh intron (kodon non-coding). Pola intron-exon cenderung dipertahankan selama

evolusi. Gen alfa- dan beta-globin dipercaya muncul 500 juta tahu yang lalu, dengan intron

pada lokasi yang sama dengan saat ini.

Exon

Segmen gen yang mengandung produk mRNA yang mengkode protein spesifik.

Intron

Segmen gen yang tidak terdapat di RNA matur,sehingga tidak mengkode protein.

Kodon

Suatu rangkaian 3 basa pada RNA atau DNA yang mengkode asam amino

spesifik; kodon triplet.

Dengan beberapa pengecualian, dipercaya bahwa satu gen yields hanya satu

protein. Bagaimanapun, melalui suatu mekanisme yang disebut alternative splicing,

30.000-35.000 gen manusia dapat memproduksi lebih dari 100.000 protein. Seperti yang

telah disebutkan di atas, intron tidak ditranslasikan menjadi produk protein. Hanya

rangkaian DNA pada exon yang ditranskripsikan menjadi mRNA lalu ditranslasikan

menjadi protein. Bagaimanapun, variasi (alternative splicing) dapat menciptakan protein

yang berhubungan.

*gambar*

Gen juga termasuk rangkaian pengapit yang penting untuk transkripsi gen. Area

yang akan menginisiasi aksi DNA (misalnya pengikatan DNA dengan kompleks hormone-

reseptor) disebut regio enhancer. Area dimana transkripsi dimulai disebut regio promoter.

Hanya sedikit rangkaian nukleotida yang relative pendek yang merupakan promoter,

misalnya rangkaian T-A-T-A-A, atau TATA box, dan rangkaian C-C-A-A-T, atau CAT box.

Situs promoter (tempat berikatan untuk RNA polymerase dan beberapa kofaktor)biasanya

dekat dengan awal regio pengkode pada gen. Situs enhancer lebih besar daripada

8

promoter dan dapat berlokasi dimana saja, bahkan di tempat yang jauh dari gen, namun

biasanya terletak di ujung. Pada ujung 3, suatu rangkaian pengkode biasanya tersedia

untuk ekor polyadenin (poly-A) yang umum bagi kebanyakan molekul mRNA (messenger

RNA)

Situs enhancer mengikat protein-protein (protein regulator) yang bertindak sebagai

sinyal untuk meregulasi ekspresi gen dengan cara meningkatkan atau menekan terjadinya

pengikatan RNA polimerase di regio promoter. Ini adalah salah satu cara untuk

menciptakan fungsi seluler yang unik. Misalnya, suatu jaringan target hormon dapat

merespon suatu hormon karena hormon tersebut memiliki reseptor protein spesifik yang

bila berikatan dengan hormon akan berikatan dengan situs DNA enhancer. Protein

spesifik (disebut faktor transkripsi) berikatan dengan situs enhancer dan mengaktivasi

transkripsi. Regulasi transkripsi gen biasanya melibatkan rangkaian DNA pada regio

upstream dari sebuah gen

3 kodon (UAG, UAA, UGA) disebut kodon stop, karena kodon-kodon tersebut

secara spesifik menghentikan translasi RNA menjadi protein (seperti titik pada akhir suatu

kalimat). Sebaliknya, open reading frame adalah suatu rangkaian panjang pasangan-

pasangan basa di antara 2 kodon stop; sehingga suatu open reading frame mengkode

rangkaian asam amino dari produk protein. Menemukan dan mengidentifikasi open

reading frame merupakan langkah penting dalam analisis rangkaian DNA karena

rangkaian panjang seperti itu biasanya hanya ditemukan pada gen yang aktif.

Ekspresi gen terdiri dari tahap-tahap berikut: transkripsi DNA menjadi RNA,

pengolahan RNA untuk memproduksi mRNA fungsional dengan splicing out (menyatukan)

intron, translasi mRNA pada ribososm menjadi rantai peptida, dan pemrosesan protein

struktural menjadi bentuk fungsional.

Transkripsi

Transkripsi adalah sintesis mRNA strand-tunggal dari suatu gen (DNA strand-

ganda). Rangkaian asam amino protein dikodekan pada DNA oleh kodon; satu asam

amino dikode oleh tiap kodon, suatu triplet yang terdiri dari 3 basa asam nukleat. RNA

polimerasi membentuk mRNA dengan membaca strand DNA (strand antisense) yang

melengkapi RNA; sehingga RNA merupakan duplikat dari strand DNA lain (strand sense),

yang juga disebut strand komplementer molekul DNA (ingat, perbedaan yang penting yaitu

timin pada DNA digantikan oleh urasil, dan ribosa menggantikan deoksiribosa pada RNA).

9

Komplementaritas molekuler adalah konsep yang sulit sekaligus mudah

dimengerti. Aspek yang mudah dari konsep ini adalah bahwa satu hal mirip dengan yang

lain. Bagian yang sulit adalah kebutuhan untuk memahami dan memvisualisasikan bahwa

molekul komplementer tidak identik dengan template nya, namun lebih seperti tempat di

mana template masuk, dan molekul komplementer keluar. Sehingga, strand-strand dari

heliks ganda tidaklah identik. Tiap strand DNA memiliki struktur komplementer, sedikit

banyak, satu template positif dan satu template negatif, masing-masing saling

menetapkan satu sama lain. Tiap strand bertindak sebagai template untuk DNA

komplementernya (pada proses replikasi) atau untuk RNA komplementernya (pada proses

transkripsi). Sheingga, mRNA disintesis dari template negatif (strand antisense) agar

memiliki struktur yang sama dengan template positif (strand sense). Ilmuwan biologi

molekuler harus berpikir dalam 3 dimensi!

Transkripsi dimulai pada upstream start site, dimana kedua strand dari heliks-

ganda berpisah. Proses ini berlanjut secara downstream, mengkopi salah satu strand

hingga mencapai kodon spesifik yang memberi pesan untuk berhenti. Sintesis RNA

berlanjut dengan penambahan suatu rantai panjang adenin, yaitu ekor poli-A; ini adalah

regio tak-tertranslasi yang dipercaya menstabilisasi RNA dengan mencegah degradasi.

Setelah transkripsi gen, RNA berpindah ke sitoplasma dimana regio intron dipotong, dan

exon bergabung (RNA splicing) untuk memproduksi suatu molekul RNA yang utuh dan

matur. Awal dan akhir tiap exon dan intron memiliki rangkaian yang bila dikopi ke RNA

dapat memerintah enzim untuk menghilangkan bagian yang menghalangi. Hampir semua

intron diawali dengan GU dan diakhiri dengan AG (GT dan AG pada intron DNA). Intron

memiliki panjang bervariasi; satu intron dapat berukuran lebih panjang dari produk akhir

RNA. Molekul RNA matur memiliki tambahan pada salah satu ujungnya (capping, dengan

penambahan nukleotida termodifikasi, 7-metil guanosin) untuk melindungi terhadap

ribonuklease (RNase) dan pada ujung yang lain, sebuah ekor poliadenin (ekor poli-A)

ditambahkan (selain penambahan faktor stabilisasi). Kedua ujung tersebut tidak ditranslasi

pada ribosom.

*gambar*

*gambar*

Faktor Transkripsi

Faktor transkripsi adalah protein yang berikatan dengan elemen regulator pada

RNA (enhancer dan promoter), sehingga mempengaruhi ekspresi gen. Reseptor hormon

10

steroid adalah faktor transkripsi. Transkripsi gen dan mRNA dapat distimulasi atau

diinhibisi melalui interaksi langsung dengan DNA. Faktor transkripsi dapat lebih jauh

berinteraksi dengan faktor-faktor lain (koaktivator dan korepresor, juga disebut protein

adapter) untuk memproduksi efek-efek kooperatif. Aktivitas protein-protein tersebutt juga

dapat dipengaruhi oleh fosforilasi yang dipicu oleh sinyal dari reseptor di permukaan sel

(sering kali growth factor). Konsep yang penting adalah untuk melihat hasil akhir aktivitas

hormonal dan ekspresi gen sebagai refleksi dari konteks seluler, yaitu sifat dan dan

aktivitas faktor transkripsi seperti yang dipengaruhi oleh protein adapter intrasel spesifik.

Hal ini menjelaskan bagaimana agen-agen yang mirip (dan faktor transkripsi yang mirip,

misal reseptor estrogen) dapat memiliki aksi yang berbeda di jaringan yang berbeda

Translasi

mRNA berpindah dari kromosom tempatnya disintesis ke ribosom di sitoplasma,

dimana ia memimpin penyusunan asam amino menjadi protein (translasi). Tiap sel

memiliki proteome yang khas namun dinamis dan selalu berubah. Proteome adalah

kumpulan protein yang unik untuk sel tersebut. Asam amino dibawa ke dalam proses

translasi melalui molekul tRNA (travel RNA) spesifik. Rangkaian spesifik 3 basa pada

salah satu akhir dari tRNA bersifat komplementer terhadap kodon yang mengkode asam

amino spesifik. Ikatan pada area ini dengan kodon mRNA menempatkan asam amino

spesifik di ujung yang lain ke susunan protein yang tepat. Asam amino ditempatkan satu

per satu ketika molekul tRNA membaca template RNA, dimulai dari ujung asam amino dan

berakhir pada ujung karboksi. Proses ini dimulai pada triplet AUG pertama dan terus

berlanjut hingga mencapai kodon stop (UAA, UAG, atau UGA), dimana mRNA gugur dari

ribosom dan berdegenerasi. Rangkaian linear spesifik dari asam amino dispesifikkan

dengan pengkodean genetik; pada gilirannya, rangkaian ini menentukan bentuk 3-

dimensional protein, struktur berlipat yang penting untuk fungsi.

*gambar*

Ekspresi akhir dari suatu gen mungkin tidak berakhir dengan proses translasi.

Pemrosesan protein lebih jauh (post translasional) terjadi, misalnya glikosilasi

(gonadotropin) atau cleavage proteolitik (konversi pro-opiomelanocortin menjadi ACTH).

hal-hal tersebut disebut modifikasi epigenetik.

Mekanisme yang memproduksi protein dari gen mirip di seluruh dunia biologis. Hal

ini berarti pengetahuan penting tentang fungsi manusia bisa didapatkan dengan

11

mempelajari organisme sederhana, dan mikroba dapat dibuat untuk memproduksi protein

manusia.

Mutasi

Banyak gen yang memiliki berbagai bentuk, disebut alel. Perubahan pada

rangkaian DNA yang menyebabkan perubahan yang merugikan pada stuktur atau fungsi

protein disebut mutasi. Substitusi adalah perubahan pada satu basa asam nukleat.

Substitusi pada kodon bisa menyebabkan inkorporasi asam amino yang salah menjadi

protein, memicu perubahan atau hilangnya fungsi. Insersi atau delesi asam amino dapat

disebabkan oleh splicing RNA yang improper. Karena redundansi yang besar pada kode

genetik (banyak kodon triplet yang mengkode asam amino yang sama, dan hanya ada 20

asam amino), tidak semua substitusi menghasilkan efek. Contoh klinis dari substitusi basa

tunggal (mutasi titik) adalah mutasi sabit, di mana timin menggantikan adenine pada gen

beta-globin. Bila regio DNA yang homolog mengalami kesalahan barisan, crossover bisa

terjadi, menyebabkan delesi dan insersi (adisi). Mutasi nonsense adalah substitusi satu

basa sehingga diproduksi kodon stop, memotong produk protein. Delesi dan insersi dapat

melibatkan satu basa saja, hingga seluruh exon, atau gen maupun beberapa gen.

Rekombinasi atau pertukaran materi genetik biasanya terjadi pada meiosis. Perubahan

hanya pada perbatasan regio pengkode dan non-pengkode pun dapat memicu mRNA

yang abnormal.

Abnormalitas Kromosomal

Abnormalitas Numerik

Abnormalitas numeric biasanya karena nondisjunction, suatu kegagalan berpisah

saat anafase, baik pada mitosis maupun meiosis. Aneuploid adalah jumlah kromosom

yang bukan kelipatan jumlah haploid, misalnya monosomi (45,X Sindrom turner) atau

trisomi (trisomi 13 Sindrom Patau, trisomi 18 Sindrom Edwards, trisomi 21 Sindrom Down,

47,XXY Sindrom Klinefelter). Mosaikisme mengindikasikan adanya satu atau lebih sel

dengan karyotipe berbeda, biasanya muncul karena nondisjunction pada mitosis awal

(kegagalan 2 kromosom berpasangan untuk berpisah). Poliploid, kelipatan dari jumlah

haploid kromosom, adalah penyebab signifikan dari keguguran spontan

Abnormalitas Struktural

12

Abnormalitas struktural biasanya disebabkan oleh kerusakan kromosom karena

radiasi, obat, atau virus. Abnormalitas yang dihasilkan bergantung pada penyusunan

kembali bagian-bagian yang rusak. Sehingga, pada translokasi ada pertukaran material

di antara 2 atau lebih kromosom nonhomolog. Translokasi yang seimbang berhubungan

dengan tidak adanya materi genetik yang bertambah atau berkurang, dan individu

semacam itu adalah carrier translokasi.

Defek Gen-Tunggal

Defek gen-tunggal disebabkan oleh mutasi pada gen spesifik. Mutasi tersebut

ditransmisikan sesuai hokum pewarisan Mendel: autosom dominan, autosom resesif, X-

linked resesif, dan X-linked dominan yang jarang. Selain itu, kelainan gen-tunggal dapat

ditransmisikan oleh pewarisan gen mitokondrial, imprinting (hasil cetakan) maternal atau

paternal, disomi (mewarisi kedua pasang kromosom dari satu orangtua), dan pengulangan

eksesif (suatu fenomena dimana terjadi pengulangan 3 pasangan basa yang lebih dari

biasanya).

Autosom Dominan

Transmisi tidak berhubungan dengan jenis kelamin individu, serta berperngaruh

pada anak homozigot dan heterozigot (hanya perlu 1 alel abnormal). Dengan 2 orangtua

heterozigot, tiap anak berisiko 75% terkena. Dengan 1 orangtua heterozigot, tiap anak

berisiko 50% terkena. Efeknya sangat bervariasi. Contoh kelainan autosom dominan

adalah Huntington disease, neurofibromatosis, dan Sindrom Marfan. Efek dari gen

dominan abnormal dipengaruhi oleh penetrance, yaitu derajat ekspresi gen dominan.

Penetrance komplet, berkebalikan dengan penetrance inkomplet, bermakna bahwa gen

selalu diekspresikan dan selalu memproduksi fenotip yang dapat dikenali.

Autosom Resesif

Kondisi ini hanya diekspresikan secara fenotip pada homozigot (semua alel harus

abnormal). Pada ornagtua heterozigot, tiap anak berisiko 25% untuk terkena dan 50%

risiko menjadi carrier. Contoh penyakit autosom resesif adalah fibrosis sistik, penyakit sel

sabit, dan hyperplasia adrenal karena defisiensi 21-hidroksilase.

13

Imprinting Genomik

Imprinting genetik mengindikasikan pengaruh menetap pada fungsi genom karena

kontribusi orangtua laki-laki dan perempuan. Misalnya, perkembangan plasenta sebagian

besar dikontrol oleh gen yang diturunkan secara paternal. Sehingga, mola hidatidosa

memiliki karyotipe normal, namun semua kromosomnya diturunkan dari pihak ayah.

Struktur plasenta tidak didapatkan pada teratoma ovarium, suatu tumor yang hanya

memiliki kromosom yang diturunkan secara maternal. Percobaan pada alam dan

percobaan pada binatang mengindikasikan bahwa kontribusi maternal terhadap genom

lebih penting untuk perkembangan embrio. Pada kondisi autosom resesif tertentu,

ekspresi, keparahan, dan usia onset dipengaruhi oleh jenis kelamin orangtua yang

mewariskan gen atau kromosom mutan.

4. Teknik dalam Biologi Molekuler

Enzim yang memecah ikatan fosfodiester dan memotong molekul DNA menjadi

fragmen-fragmen adalah endonuklease; suatu enzim restriksi (endonuklease restriksi)

hanya memotong pada tempat yang memiliki rangkaian asam nukleat spesifik. Enzim

restriksi ditemukan pada bakteri dimana enzim tersebut membentuk mekanisme

pertahanan untuk memotong (lalu menginaktivasi) DNA asing (dari virus yang menginvasi)

yang diperkenalkan ke sel bakteri. Sebagai bagian dari mekanisme protektif tersebut,

bakteri juga memiliki metilase yang memetilasi situs pengenalan pada DNA native,

mengarahkan aksi enzim restriksi ke DNA asing yang belum termetilasi. Bakteri yang

berbeda memiliki enzim restriksi yang berbeda-beda dengan sasaran aksi yang spesifik.

Enzim restriksi memotong DNA menjadi bagian-bagian (fragmen restriksi), mulai

dari banyak fragmen kecil hingga beberapa fragmen besar, tergantung jumlah nukleotida

pada rangkaian pengenal. Mereka dinamai sesuai dengan organisme dan strain asalnya.

Kombinasi fragmen-fragmen restriksi, gabungan 2 potongan DNA, membentuk DNA

rekombinan.

DNA polimerase adalah enzim yang membawa satu nukleotida tunggal ke

molekul DNA. DNA polimerase dapat membentuk DNA hanya bila ada template DNA;

DNA yang disintesis akan bersifat komplementer terhadap template tersebut. RNA

polimerase dapat membuat RNA juga hanya jika ada template DNA.

14

Deoksiribonuklease (DNAase) dapat menghilangkan nukleotida. Dengan

menggabungkan treatment DNAase dengan aksi DNA polimerase, nukleotida radiolabeled

dapat dikenalkan pada molekul DNA, menghasilkan DNA probe. Suatu DNA probe dapat

dibandingkan dengan antibody yang digunakan dalam imuno assay. Antibodi tersebut

spesifik dan mengenali hormon yang berlawanan. DNA probe secara spesifik mendeteksi

rangkaian DNA.

Reverse transciptase adalah DNA polimerase yang dependen RNA. Disebut

reverse transcriptase karena arus informasinya dari RNA ke DNA, kebalikan dari arus

yang biasanya. Enzi mini memungkinkan penggandaan molekul RNA apapun menjadi

DNA single-strand; DNA semacam itu disebut DNA komplementer karena ia adalah

cerminan dari mRNA. DNA probe komplementer terbatas hanya membaca exon (ingat

bahwa intron excised dari RNA), sehingga probe-probe tersebut hanya membaca area

yang besar.

DNA dan RNA adalah molekul bermuatan, sehingga akan berpindah dalam medan

listrik. Fragmen dapat dianalisis dengan gel (agarose atau polyacrylamide) elektroforesis,

fragmen terbesar paling lambat berpindah. By convention, gel tersebut dibaca dari atas ke

bawah, dengan fragmen terkecil berada di bawah.

Analisis Southern Blot

DNA awalnya didenaturasi untuk memisahkan kedua strand, dicerna oleh enzim restriksi

untuk memproduksi fragmen-fragmen lebih kecil yang dimasukkan ke gel elektroforesis.

Metode Southern blot, dinamakan sesuai penemunya E.M Southern, menentukan ukuran

fragmen. Fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis. Gel elektroforesis

ditempatkan di kertas saring tebal yang ujungnya direndam di larutan tinggi-garam.

Membran khusus (nitroselulosa) ditempatkan di atas gel, dan di atasnya diberi setumpuk

handuk kertas yang diberi beban. Larutan garam naik ke kertas saring; larutan tersebut

naik melalui aksi kapiler melewati gel, membawa DNA bersamanya. DNA dibawa ke

membrane nitroselulosa dimana ia berikatan. Larutan garam tetap bergerak dan diserap

handuk kertas. Membran nitroselulosa lalu membentuk replika pola elektroforesis asli.

DNA difiksasi ke membrane dengan pembakaran temperature-tinggi atau dengan sinar

UV. Probe (bagian kecil DNA) yang telah dilabeli spesifik lalu dapat dihibridisasi.

Hibridisasi adalah a specific probe anneals to its complementary sequence (suatu

penguatan spesifik terhadap rangkaian komplementernya). Fragmen-fragmen dengan

15

rangkain ini akhirnya diidentifikasi dengan autoradiografi. Probe fluoresens dapat

dimanfaatkan setelah aktivasi dnegan sinar laser, memungkinkan pemeriksaan kualitatif

dan kuantitatif dengan komputer.

Northern blotting merujuk pada pemrosesan RNA, disebut Northern karena RNA

adalah kebalikan dari DNA. RNA yang telah diekstrak dipisahkan dengan elektroforesis

dan ditransfer ke membrane selulosa seperti pada Southern blotting untuk hibridisasi

dengan DNA komplementer. Northern blotting digunakan misalnya untuk menentukan

apakah stimulasi hormon dari protein spesifik di suatu jaringan dimediasi oleh mRNA.

Elektroforesis untuk memisahkan protein disebut Western blotting, dan antibodi

digunakan untuk proses identifikasi hibridisasi. Seperti Northern blotting, Western blotting

menguji ekspresi gen, bukan hanya keberadaan suatu gen. Istilah Northern (utara) dan

Western (barat) menunjukkan kelucuan yang disengaja (hal yang jarang dalam sains)

sebagai respon terhadap Southern blotting. Hibridisasi tanpa elektroforesis dengan

menempatkan setetes ekstrak sel langsung di kertas saring disebut dot atau slot

blotting.

Hibridisasi

Saar 2 strand komplementer DNA ber-reasosiasi, prosesnya disebut hibridisasi.

Hibridisasi membuat area spesifik DNA dapat dipelajari menggunakan radiolabeled DNA

probe yang spesifik (suatu rangkaian komplementer). Membran nitroselulosa yang

diproduksi setelah Southern blotting pada awalnya diberi perlakuan untuk memblok

binding site nonspesifik. Membran tersebut lalu dihibridisasi dengan probe yang telah

dilabeli. Lokasi probe lalu diidentifikasi dengan autoradiografi (untuk radiolabeled probes)

atau dengan metode kolorimetri. Rangkaian probe menentukan rangkaian pada tempat

ikatan. Kapanpun 2 produk bersifat komplementer, hibridisasi akan terjadi, Sehingga, DNA

komplementer dapat dihibridisasi menjadi template mRNA nya.

Hibridisasi in situ adalah teknik di mana probe DNA atau RNA yang telah dilabeli

ditempatkan langsung pada slide jaringan atau sel. Sepotong DNA yang telah diklon dan

dilabeli dengan marker fluoresens dapat digunakan; metode ini disebut FISH

(fluorescence in situ hybridization). Regio yang berhubungan dengan DNA yang telah

diklon akan bersinar di bawah iluminasi fluoresens kecuali regio tersebut telah dihapuskan

dari salah satu kromosom. Beberapa sindrom mikrodelesi telah ditemukan dengan teknik

FISH, misalnya Sindrom Prader-WIlli.

16

Teknologi Microarray Chip

Metode ini mendeteksi ekspresi gen, menguji ribuan gen secara simultan. DNA

klon komplementer dihibridisasi dengan DNA komplementer berlabel yang disiapkan dari

jaringan. Jika jaringan tersebut mengekspresikan sebuah gen, sinyal berlabel dapat

dengan mudah diamati. Produksi kepingan gen spesifik memunginkan teknik ini untuk

mencari mutasi dan polimorfisme. Microarray gene chip adalah serangkaian display fisik

dari DNA yang dapat secara simultan mengidentifikasi ribuan produk mRNA unik pada

sampel heterogen. Proses yang sangat otomatis ini dapat menunjukkan perbedaan

ekspresi gen sebagai respon dari berbagai stimulus atau kondisi.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR adalalah teknik amplifikasi (relatif cepat) fragmen kecil atau area dari DNA

menjadi cukup besar untuk dapat dianalisis dengan metode elektroforesis dan blotting.

Teknik ini menghasilkan sejumlah besar kopian rangkaian DNA spesifik tanpa harus

melakukan kloning. Rangkaian DNA yang akan diamplifikasi harus diketahui. Marker

spesifik (sekuens pendek yang disintesis dari DNA yang berkoresponden dengan tiap

ujung rangkaian yang akan diamati) dipilih dan akan delineate regio DNA yang akan

diamplifikasi. Rangkaian ini disebut “primer”. Sampel DNA, primer, dan sisa nukleotida

tunggal bebasnya diinkubasi dengan DNA polimerase.

Tahap pertama termasuk pemisahan DNA ke strand-strand tunggalnya melalui

denaturasi dengan panas (92 C); lalu temperatur diturunan (40 C), menyebabkan primer

menempel ke regio komplementernya pada DNA. Temperatur lalu dinaikan menjdi 62 C,

dan DNA polimerase kemudia mensintesis strand baru yang diawali dan diakhiri di primer,

membentuk DNA double-strand baru. Mengulangi siklus tersebut berulang kali (dengan

mengganti-ganti temperature reaksi) akan mengamplifikasi jumlah DNA yang tersedia

untuk diamati (lebih dari 1 juta kali); peningkatannya terjadi secara eksponensial.

Sehingga, DNA dapat dianalisis dari satu sel saja, dan gen dapat divisualisasikan melalui

blotting tanpa probe berlabel.

Karena proses ini memerlukan pemanasan dan pendinginan bergantian, DNA

polimerase yang resisten panas adalah suatu keuntungan. Masalah ini terpecahkan

dengan penemuan DNA polimerase (Taq polimerase) pada mikroorganisme (Thermus

aquaticus) yang termofil (mikroba air panas) dan ditemukan pada mata air panas

17

Mushroom Pool di Taman Nasional Yellowstone. Polimerase temperatur-tinggi ini

memungkinkan otomatisasi proses di atas.

Teknik PCR telah memungkinkan dilakukannya studi terhadap jumlah DNA yang

sangat kecil dari jaringan atau cairan tubuh apapun. Sindrom Down dapat didiagnosis dari

beberapa sel fetal yang diambil dari darah ibu. Hal yang khususnya menakjubkan adalah

amplifikasi sejumlah kecil DNA terdegradasi dari spesies yang telah punah dan jarang

yang diawetkan di museum. DNA dari fosil telah berhasil diamplifikasi dan dirangkai

(misalnya dari tanaman magnolia berusia 18 juta tahun). Metode ini juga memungkinkan

indentifikasi gen melalui ekspresi mRNA nya. RNA adalah template untuk amplifikasi

dengan awalnya mengubahnya menjadi DNA komplementer. PCR digunakan untuk

mendeteksi mikroba, menyediakan hasil dalam jangka waktu jam, bahkan pada

keberadaan obat-obatan antimikroba. Metode ini bisa mendeteksi bakteri yang tidak bisa

diisolasi melalui teknik kultur.

Kloning DNA

Kloning berarti mengisolasi gen dan mengkopinya. DNA library adalah kumpulan

molekul DNA yang didapatkan dari metode cloning. DNA library komplementer adalah

counterpart (lawan) DNA dari mRNA yang diisolasi dari sel atau jaringan tertentu. DNA

komplementer telah diproduksi untuk lebih dari 70% gen manusia dan tikus. Dimulai

dengan mRNA, pencarian gen yang diinginkan dapat difokuskan (alih-alih mencari di

semluruh genom). Library semacam itu dibuat dengan menggunakan reverse

transcriptase. Molekul DNA lalu dapat dimasukkan ke vektor yang sesuai (dijelaskan di

bawah ini) dan replika molekul akan dapat diproduksi. Menggunakan probe, dapat dipilih

DNA komplementer yang sesuai dengan gen yang diinginkan (ingat bahwa DNA

komplementer hanya mengandung exon). Kloning DNA adalah produksi banyak kopian

identik dari fragmen DNA spesifik. Kloning juga dapat dilakukan menggunakan PCR.

Seperti yang disebutkan di atas, kloning DNA komplementer berfokus pada counterpart

DNA dari mRNA; cloning DNA genom, menggunakan restriction endonuclease, mengkopi

DNA pada gen. Kloning juga dapat digunakan untuk membuat kopian multipel dari probe

atau fragmen DNA yang tidak diketahui.

Jika rangkaian asam amino tidak diketahui, prosesnya dapat dilakukan secara

berkebalikan. Setelah produk protein spesifik diketahui, dapat diproduksi antibodi terhadap

18

protein tersebut. Saat DNA komplementer dimasukkan ke vektor tertentu, produksi protein

dapat diidentifikasi menggunakan antibodi; sehingga fragmen DNA akan dapat diisolaso.

Vektor adalah suatu entitas dimana DNA asing dapat dimasukkan. Vektor dan

DNA asing dimasukkan ke sel host; sel host memproduksi baik vektor maupun DNA asing.

Vektor pertama adalah plasmid bakteri, suatu molekul DNA sirkuler (minikromosom) yang

terdapat di sitoplasma bersama dengan DNA kromosomal bakteri. Perlu diperhatikan

bahwa plasmid membawa gen yang mengkode resistensi terhadap antibiotic. Hal ini

memungkinkan sel bakteri yang mengandung plasmid untuk dipilih oleh treatment

antibiotikyang tepat. Vektor plasmid juga telah dikembangkan sehingga memungkinkan

pemilihan melalui warna. Berbagai strain bakteri telah dikembangkan, masing-masing

untuk kegunaan spesifik.

Disrupsi DNA plasmid dengan enzim restriksi, diikuti inkorporasi DNA asing

dengan DNA ligase, memproduksi molekul DNA plasmid (DNA rekombinan yang

mengandung DNA asing) yang dapat direplikasi. Vektor plasmid dapat memasukkan

fragmen DNA asing hingga seukuran 10 kb. Pencernaan fragmen DNA dengan enzim

restriksi melepaskan fragmen DNA yang diinginkan, yang lalu dapat dipulihkan kembali

melalui elektroforesis.

Vektor yang lain adalah bakteriofag (atau phage), yaitu virus yang menginfeksi dan

bereplikasi dalam bakteri. Bakteriofag dapat menggabungkan DNA yang lebih besar,

hingga 20 kb. Kloning DNA dengan vektor bakteriofag memiliki dasar yang sama dengan

vektor plasmid. Fragmen yang lebih besar dari DNA asing dikloning menggunakan vektor

kosmid, yang secara artificial memproduksi kombinasi phage dan vektor plasmid.

Fragmen yang sangat besar, hingga 1000 kb, dapat diklon menggunakan kromosom

artificial yeast. Metode ini dapat digunakan pada gen utuh.

Langkah-langkah dasar kloning

1. Memilih sumber DNA: baik DNA genomik ataupun DNA komplementer.

2. Membuat fragmen DNA menggunakan restriction endonuclease.

3. Memasukkan fragmen ke dalam vektor.

4. Memperkenalkan vektor ke bakteri.

5. Mengumpulkan DNA klon untuk membuat library.

6. Mengecek library untuk menemukan rangkaian yang diinginkan. Metode yang bisa

dilakukan termasuk penggunaan probe nukleotida komplementer untuk fragmen yang

19

menghibridisasi, deteksi protein spesifik yang diproduksi menggunakan antibodi terhadap

protein tersebut, atau dengan memeriksa fungsi protein.

Model Binatang Knockout

Model binatang untuk fungsi gen menggunakan metode “knocking out” (mengeluarkan)

gen tertentu. Pada demonstrasi yang berteusterang namun penting, dapat ditentukan

apakah suatu gen dan proteinnya penting bagi kehidupan, atau bagi suatu fungsi

(misalnya kehamilan).

5. Identifikasi Gen

Untuk mengklon seluruh gen yang produk proteinnya diketahui, dibuat suatu library

DNA komplementer. Fragmen DNA spesifik diidentifikasi dengan menghubungkannya

pada protein. Saat telah teridentifikasi, seluruh gen dapat dipilah menggunakan DNA

komplementer tersebut, menunjukkan intron dan exon nya. Strategi lain adalah dengan

mensintesis suatu probe oligonukleotida, mendasarkan rangkaiannya pada rangkaian

asam amino yang telah diketahui pada produk protein (dari rangkaian peptidanya,

rangkaian DNA yang mengkode protein tersebut dapat diprediksikan. Metode ini dapat

digunakan pada potongan peptide yang relatif kecil. Semakin banyak gen yang diklon,

frekuensi kodon untuk asam amino tertentu dapat diketahui. DNA komplementer dapat

diklon tanpa membuat library dengan menggunakan PCR untuk mengamplifikasi DNA

komplementer yang dibuat dari mRNA oleh reverse transcriptase. Rangkaian genom yang

saling tumpang tindih dapat diklon, menggunakan sepotong DNA dari masing-masing

produknya, untuk menyusuri suatu kromosom secara sistematik untuk mencari suatu gen;

ini disebut chromosome walking.

Seluruh proses sequencing (pencarian rangkaian) dapat dilakukan oleh komputer,

bahkan pencarian open reading frames juga bisa dilakukan oleh komputer. Begitu

rangkaian fragmen DNA telah teridentifikasi, komputer dapat menggunakan database

DNA dan protein untuk memprediksi rangkaian, recognition site, translasi protein, dan

homologi dengn rangkaian-rangkaian yang telah diketahui. Ilmuwan kemudian dapat

memilih ukuran fragmen restriksi untuk kloning. Begitu suatu gen telah dianalisis, gen

tersebut harus dibandingkan dengan gen pada disease state. Jika mutasinya berukuran

besar, maka dapat dideteksi dengan Southern blotting. Gangguan minor membutuhkan

20

perbandingan rangkaian DNA, yang dapat dilakukan menggunakan amplifikasi rantai

polimerase untuk memproduksi rangkaian gen spesifik dalam jumlah yang bisa diamati.

Suatu gen yang produk proteinnya tidak diketahui dapat dilokalisir menjadi suatu

kromosom spesifik dengan studi yang melibatkan penyusunan kembali kromosom dan

analisis linkage. Penyakit-penyakit spesifik berhubungan dengan perubahan karyotipe.

Sehingga, kromosom spesifik dapat ditargetkan untuk lokalisasi gen. Analisis linkage

memanfaatkan polimorfisme ukuran panjang fragmen restriksi.

Polimorfisme DNA

Southern blotting mengungkapkan pola spesifik dari band yang merefleksikan

variasi panjang fragmen DNA yang diproduksi oleh aksi enzim restriksi. Suatu situs

spesifik dapat menunjukkan mutasi dengan adanya pola yang berbeda (panjang fragmen

DNA yang berbeda pada Southern blotting dikarenakan perbedaan rangkaian).

Perbedaan-perbedaan dalam rangkaian DNA ini disebut polimorfisme panjang fragmen

restriksi (polimorfisme nukleotida-tunggal), atau secara sederhana disebut polimorfisme,

biasanya merupakan variasi yang benign. Berikut ini merupakan variasi yang umum;

genom manusia memiliki sekitar 10 juta polimorfisme, dan lebih dari 3 juta telah

teridentifikasi. Suatu polimorfisme bisa bentindak sebagai marker genetik untuk gen yang

penting secara medis. Polimorfisme diatur oleh Hukum Pewarisan Sifat Mendel, dan bila

kebetulan polimorfisme teridentifikasi pada pasien dengan penyakit tertentu, transmisi

penyakit tiu dapat dipelajari. Polimorfisme, yang berhubungan dengan penyakit secara

kebetulan, dapat digunakan untuk mempelajari penurunan penyakit tersebut jika gennya

tidak diketahui. Polimorfisme bertindak seperti bendera yang menandari area spesifik

pada kromosom. Metode studi ini membutuhkan DNA dari minimal 1 individu yang terkena

dan sejumlah DNA anggota keluarganya untuk melacak adanya polimorfisme, baik

dengan Southern blotting (untuk rangkaian yang panjang) atau dengan PCR (terbaik untuk

rangkaian pendek). Korelasi marker genetik (polimorfisme) dan fenotip juga melibatkan

haplotype (mirip dengan polimorfisme namun rangkaian nukleotidanya lebih panjang,

bahkan kumpulan beberapa polimorfisme).

Minisatelit adalah bentuk dari polimorfisme. Gen berkumpul di area acak di

sepanjang kromosom yang dipisahkan oleh rangkaian panjang DNA non-pengkode.

Minisatelit adalah area non-pengkode dari DNA yang berulang dalam jumlah yang

bervariasi, jumlah yang bervariasi tersebut disebut tandem repeat sequence (rangkaian

21

tandem berulang), terdistribusi di sepanjang kromosom manusia. Area-area tersebut

dapat diikuti oleh probe DNA, menyediakan suatu fingerprint bagi individu spesifik.

Keunikan ini diaplikasikan pada kedokteran forensik. Mikrosatelit, seperti namanya, lebih

kecil daripada minisatelit. Biasanya mikrosatelit mengandung repetisi dari hanya 2

nukleotida. Polimorfisme DNA saat ini berjumlah ribuan dan memungkinkan pemetaan

genetik dengan presisi yang bagus.

Proyek Genom Manusia

Seluruh gen manusia secara kolektif disebut genom. Dimulai pada 1990, tujuan

dari Proyek Genom Manusia Internasional adalah untuk merangkai 3,2 milyar pasangan

basa dari genom manusia, suatu tujuan yang tercapai dalam bentuk draft pada 2001 dan

mencapai 99% rangkaian yang sebenarnya pada 2003, lebih dari dua tahun lebih awal

dari yangh dijadwalkan, 50 tahun setelah publikasi Watson dan Crick. Jumah gen (30.000-

35.000) lebih sedikit dari perkiraan sebelumnya. Kurang dari 2% dari genom manusia

mengkode protein; sehingga, sisanya adalah sumber yang kaya bagi sejarawan evolusi

dan merupakan target untuk memicu perubahan genetik. Jumlah gen pada kromosom

spesifik bervariasi; kromosom yang dipengaruhi oleh trisomi, kromosom 13,18,dan 21,

memiliki jumlah gen paling sedikit. Rangkaian DNA pada genom manusia dapat di

download di:

www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human

Peta garis keturunan genetik dapat bertindak sebagai dasar untuk menemukan

lokasi penyakit dan untuk mengintegrasi sequencing genetik dengan fungsi biologis. Tidak

lama lagi, kita akan memiliki CD personal yang berisi blueprint genetik lengkap milik kita

sendiri.

Departemen Energi AS menjalankan suatu website yang menyediakan informasi

dasar dan link ke situs lain menyangkur proyek genom manusia:

http://www.ornl.gov

Lokasi kromosomal dari gen yang bertanggungjawab terhadap produksi hormon

telah dipetakan. Dari rangkaian DNA klon, rangkaian asam amino dapat diprediksi. Tiap

produk protein dari suatu gen mewakili diagnosis potensial atau target terapeutik. Dan

tentu saja, kelainan yang diturunkan akan menjadi subyek karakterisasi, dan akhirnya

terapi gen. Bagaimanapun, bahkan setelah suatu gen telah teridentifikasi dan terpetakan

secara genetik, karakterisasi penuhnya masih sulit dan memakan banyak waktu.

22

Pemahaman penuh tentang kelainan yang melibatkan interaksi dari berbagai gen akan

menjadi lebih rumit.

Namun, kemajuan molekuler tidak dapat dihindari. Di masa depan, kedokteran

preventif akan berupa prediksi. Dengan mengetahui konstitusi genetik seseorang,

screening yang tepat dan intensif dapat diarahkan ke kondisi predisposisi. Pengetahuan

semacam ini juga akan membutuhkan pertimbangan sosial dan politik. Bayangan tentang

penghindaran pernikahan dan kehamilan karena perpaduan predisposisi genetik yang

buruk tidaklah jauh. Masyarakat telah mengembangkan panduan mengenai penggunaan

informasi ini: oleh individu, oleh para pekerja, oleh organisasi kesehatan, dan oleh

pemerintah. Kemajuan ilmu harus sejalan dengan pendidikan publik dan professional agar

pengetahuan ini dapat diterima dengan baik.

Genomik dan Proteomik

Genomik mengacu pada seluruh proses yang terlibat pada Proyek Genom

Manusia, deskripsi lengkap dari rangkaian genetik, dan lebih jauh lagi mengindikasikan

studi ekspresi gen, terutama menggunakan teknik microarray dengan kepingan gen.

Bagaimanapun, genomik tidak akan mengungkapkan keseluruhan cerita. Produk protein

dari ekspresi gen terganggu pada proses translasi dan juga karena modifikasi

posttranslasional seperti glikosilasi, metilasi, dan fosforilasi. Oleh karena itu, cerita

lengkapnya membutuhkan proteomik, suatu studi tentang produk akhir yang fungsional

secara biologis, yaitu protein sel atau jaringan. Baik genomik maupun proteomik

dibutuhkan untuk memahami fisiologi, diagnosis penyakit, dan untuk mendesain obat baru.

Identifikasi protein membutuhkan pemisahan protein dengan elektroforesis, pencernaan

protein besar menjadi protein yang lebih kecil, pengukuran kandungan asam amino

dengan spektrofotometri massa, dan identifikasi spesifik dari protein melalui perbandingan

dengan database komputer. Setelah itu, baru profil massa protein dari sel normal dan

abnormal dapat dibandingkan.

6. Aplikasi Klinis

Tantangan dalam kedokteran modern adalah untuk membuat pemahaman klinis

tentang koleksi data yang sangat banyak dari proyek genom. Pemahaman tentang fungsi

23

gen dan protein tidak diragukan lagi akan menjadi sesuatu yang mempercepat kemajuan

manusia.

Diagnosis molekuler dari kelainan genetik hanya membutuhkan sedikit sampel

DNA yang didapatkan dari sel apapun yang berinti, misalnya sel darah putih atau sel

epitel. PCR yang dilakukan dengan mesin otomatis memungkinkan diagnosis DNA yang

cepat dengan menggunakan materi yang diamplifikasi dari satu sel tunggal. Hal ini adalah

keuntungan yang penting dalam analisis genetik prenatal dan dalam penentuan jenis

kelamin dan diagnosis preimplantasi. PCR memungkinkan diagnosis DNA dari sel tunggal

yang diambil dari embrio yang difertilisasi in vitro.

Diagnosis molekuler dibatasi oleh prevalensi perubahan genetik heterogen.

Dengan kata lain, banyak kelainan melibatkan mutasi yang berbeda pada orang yang

berbeda. Sebaliknya beberapa kelainan (misalnya penyakit sel sabit) selalu melibatkan

perubahan yang sama. Pada fibrosis sistik, 70% pasien (dari keturunan Eropa Utara)

memiliki delesi 3 basa yang sama, sedangkan 30% sisanya memiliki mutasi yang sangat

heterogen. Lebih jauh lagi, diagnosis molekuler ditantang oleh kebutuhan untuk bukan

sekedar untuk menemukan perubahan kecil pada gen, namun juga untuk membedakan

perubahan penting dengan variasi yang benign (polimorfisme). Metode berdasar-PCR

yang cerdas telah dikembangkan untuk screening cepat dan deteksi dari mutasi.

Signifikansi dari mutasi yang terdeteksi membutuhkan segregasi mutasi dengan penyakit

yang telah diidentifikasi dalam keluarga.

Setidaknya satu tipe defisiensi growth hormone diwariskan dalam pola autosom

resesif. Kloning DNA growth hormone yang besifat komplementer terhadap mRNA nya

memungkinkan dilakukannya lokalisasi gen groeth hormone. Gen growth hormone terletak

di suatu cluster yang termasuk juga di dalamnya gen untuk human placental lactogen.

Cluster gen ini memiliki unit-unit DNA yang homolog dan rentan mengalami rekombinasi,

yang memicu delesi pada satu kromosom dan duplikasi pada kromosom lainnya.

Mekanisme yang mirip terjadi pada produk protein lain yang diatur oleh gen-gen dalam

cluster, misalnya globin.

Produksi protein komersial dari gen yang diklon lalu dimasukkan ke bakteri

meningkat dengan cepat. Produksi insulin (yang pertama) dan growth hormone adalah

contohnya. Glikosilasi tidak terjadi pada sistem bacterial, sehingga produksi komersial dari

glikoprotein rekombinan membutuhkan sel mamalia dalam prosesnya. Hal ini telah

dicapai, dan saat ini gonadotropin rekombinan telah tersedia. Gen untuk gonadotropin-

24

releasing hormone pada lengan pendek kromosom 8 telah berhasil diisolasi dan diklon.

Teknologi molekuler penting untuk karakterisasi inhibin, hormon folikular ovarium yang

menghambat sekresi FSH. Gen inhibin telah sequenced dan ditemukan bahwa gen

tersebut homolog dengan gen untuk hormon antimullerian. Subunit alfa yang umumnya

terdapat di gonadotropin, TSH, dan hCG telah dilacak hingga ke gen yang telah diisolasi,

sequenced, dan dilokalisir pada kromosom 6.

Insersi gen asing ke dalam embrio menghasilkan hewan transgenik. Gen asing

yang dimasukkan akan terdapat di berbagai jaringan, dan bila hewan tersebut fertil maka

akan diturunkan. Ada banyak aplikasi untuk hewan transgenik. Hewan transgenik

menyediakan model binatang untuk penyakit keturunan dan tumor ganas serta

menyediakan sarana untuk melakukan eksperimen terapi gen. Perpindahan gen baru atau

gen yang terganggu adalah metode penting untuk mempelajari fungsi gen. Tanaman

transgenik bahkan dapat dikembangkan untuk dapat memproduksi obat baru, dan

pengenalan gen yang resisten serangga mungkin akan menyelesaikan permasalahan

kontminasi insektisida.

Genom manusia memiliki banyak gen yang berpotensi menyebabkan kanker. Gen

lain memiliki kemampuan untuk memblok keganasan. Kanker adalah penyakit genetik

dimana tumor dapat dikatakan klonal; semua selnya terkait secara genetik. Onkogen,

yang ditemukan pada virus-virus tumor, adalah gen yang mengubah pertumbuhan sel

menjadi abnormal dengan mengkode protein yang terlibat dalam transduksi sinyal,

terutama transmisi pesan-pesan pengatur pertumbuhan. Ada banyak onkogen dan

berbagai jalur aksi, semuanya menyebabkan suatu kondisi proliferative. Mutasi yang

mengaktivasi gen-gen tersebut memicu aktivitas protein yang independen terhadap sinyal

atau memicu aktivitas pada tempat dan waktu yang salah. Yang perlu digarisbawahi

adalah pemicuan pertumbuhan persisten (oleh onkogen yang terganggu).

Pada sel normal juga terdapat antionkogen, gen supresi pertumbuhan yang harus

diinaktivasi sebelum tumor bisa tumbuh. Kerentanan turunan terhadap kanker juga

disebabkan oleh mutasi pada gen supresor tumor. Meskipun aktivasi onkogen adalah efek

dominan, mutasi supresor tumor adalah resesif serta dapat dibawa dan ditransmisikan,

namun tidak aktif selama berpasangan dengan antionkogen normal.

Oleh karena itu, kanker adalah penyakit genetik, namun regulasi pertumbuhan

normal melibatkan suatu sistem kompleks yang membutuhkan waktu yang lama untuk

overcome. Selama periode tersebut, teknologi DNA rekombinan mungkin telah dapat

25

mencapai diagnosis yang cukup awal untuk dapat disembuhkan. Pengetahuan tentang

onkogen spesifik yang terlibat dalam tumor tertentu juga menawarkan kemungkinan-

kemungkinan terapeutik. Misalnya, suatu antimetabolit dapat menempel ke antibodi untuk

suatu onkogen dan menargetkan sel-sel kanker.

Biologi molekuler mengubah baik diagnosis maupun terapi. DNA virus dan bakteri

dapat diidentifikasi. Proses PCR otomatis dapat memproduksi pola elektroforetik yang

dapat dibaca secara otomatis. Dengan teknik ini, molekul tunggal dari DNA human

papillomavirus dapat dideteksi di antara 10.000 atau lebih sel manusia. Saat ini beberapa

ratus tes genetik telah digunakan di klinik.

Kesalahan produksi protein endogen dapat dibenahi dengan cara menggantikan

mekanisme yang bermasalah. Ada 2 strategi: pengenalan sel asing yang memproduksi

protein yang hilang, atau penggantian gen yang cacat (atau lebih tepatnya penambahan

DNA komplementer yang telah dibenahi). Sehingga, kelainan gen-tunggal resesif secara

potensial amenable to terapi gen, begitu juga dengan penyakit seperti kanker dan infeksi.

Terapi gen secara luas didefinisikan sebagai penggunaan mesin seluler pasien sendiri

untuk memproduksi agen terapeutik. Suatu gen yang diantarkan ke sel dapat

menggantikan gen yang defektif atau hilang atau dapat juga memproduksi protein dengan

efek yang diinginkan. Bagaimanapun, bidang ini masih sangatlah baru.

Panduan spesifik untuk terapi gen yang telah dikembangkan membutuhkan

beberapa tinjauan. Salah satu kelas terapi manusia adalah penggunaan vektor retroviral

untuk mentransfer gen marker ke sel manusia yang telah dikultur yang kemudian akan

dikembalikan lagi ke pasien. Misalnya, hal ini akan memungkinkan pelacakan limfosit yang

menginfiltrasi tumor, hepatosit donor, atau killer T cell yang spesifik untuk HIV. Gen-gen

tersebut juga dapat diciptakan untuk menyediakan suatu fungsi pada pasien dengan

kelainan turunan gen-tunggal. Kelas lain dari terapi melibatkan transfer dari gen yang

mengkode faktor-faktor yang menghancurkan sel tumor, misalnya tumor necrosis factor

atau interleukin. Vektor retroviral adalah virus yang telah dibuat sedemikian rupa sehingga

tidak akan ada protein viral yang dapat dibuat oleh sel yang terinfeksi vektor tersebut.

Sehingga, replikasi dan penyebaran virus dapat dicegah, namun transfer gen ke sel yang

sedang bereplikasi bisa tetap terjadi. Metode transfer lain yang sedang dikembangkan

termasuk penggunaan vektor adenovirus dan DNA plasmid.

6. Referensi

26

7. Sumber-sumber Online

27