laporan praktikum biologi sel molekuler

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL MOLEKULER

Oleh

KURNIAWAN

NIM. P2BA09003

PROGRAM STUDI MAGISTER BIOLOGI

PROGRAM PASCA SARJANA

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2010

2

Laporan Praktikum Biologi Sel Molekuler S2 Biologi UNSOED 2010

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT sehingga penulis dapat

menyelesaikan penyusunan laporan praktikum biologi molekuler program studi S 2 Biologi

Universitas Jenderal Soedirman ini yang telah tertunda sekian lama.

Pada kesempatan kali ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada

Dosen Pengampu Mata Kuliah Biologi Sel Molekuler yang terdiri atas Dr. Hendro Pramono,

MS dan Ibu Alice Yuniati, Ph.D. Tidak lupa pula ucapan terima kasih penulis tujukan kepada

dua Asisten Praktikum Biologi Sel Molekuler yaitu Mas Farid Fatkhomi dan Arief Mulyanto

yang telah dengan penuh dedikasi mengarahkan kami dalam pelaksanaan praktikum ini.

Penyusunan laporan praktikum ini telah diusahakan sesuai dengan aturan penulisan

laporan yang telah ditetapkan baik tentang sistematika maupun isi laporan. Mengenai isi

laporan telah diupayakan sesuai dengan tujuan acara praktikum dengan didasarkan pada

berbagai sumber referensi yang relevan.

Akhirnya penulis berharap semoga laporan ini bisa memberikan sedikit manfaat bagi

studi biologi sel molekuler. Amin.

Purwokerto, Maret 2010

ttd

Penulis

3


LEMBAR PENGESAHAN

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

PROGRAM STUDI S 2 BIOLOGI

PROGRAM PASCA SARJANA

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

Oleh

KURNIAWAN

P2BA09003

Diajukan sebagai salah satu kelengkapan penilaian mata kuliah biologi sel molekuler

Disetujui dan disahkan

Pada tanggal .................................

Asisten Praktikum

................................

4


DAFTAR ISI

Kata Pengantar ....................................................................................................... 2

Lembar Pengesahan ............................................................................................... 3

Daftar Isi ................................................................................................................ 4

I. Isolasi DNA plasmid .................................................................................... 5

II. Pemotongan DNA plasmid ........................................................................... 11

III. Elektroforesis gel agarosa ............................................................................. 18

IV. Transformasi ................................................................................................. 26

Lampiran ................................................................................................................ 33

5


I. ISOLASI DNA PLASMID

1. Landasan Teori

Semua organisme tersusun atas sel – sel, yang merupakan struktur fungsional

terkecil dari suatu organisme. Berdasarkan jumlah sel penyusunnya, organism dapat

dibedakan atas organisme yang hanya terdiri atas satu sel (uniseluler) dan organisme

yang terdiri atas banyak sel (multiseluler) (Raven and Johnson, 1989).

Berdasarkan klasifikasi yang disampaikan oleh Carl Woese, organisme yang ada

di dunia ini dapat dikelompokkan atas tiga domain yaitu prokariotik, eukariotik, dan

archaea. Masing – masing domain ini memiliki ciri dan karakteristik yang spesifik yang

menjadi pembeda antara domain satu dengan yang lainnya.

Setiap sel baik itu prokariotik, eukariotik, maupun archaea mempunyai informasi

hereditas yang dikode oleh DNA. Eukariotik memiliki DNA berbentuk linier yang terdiri

atas segmen – segmen dan terikat dengan protein untuk membentuk kromosom yang

tersimpan di dalam nukleus. Berbeda dengan bentuk DNA eukariotik, DNA prokariotik

berbentuk sirkular untai ganda yang terletak di dalam sitoplasma (Raven and Johnson,

1989).

Bakteri merupakan salah satu organisme yang termasuk dalam kelompok

organism prokariotik sehingga memiliki DNA kromosom yang berbetuk sirkuler dan

terletak di sitoplasma. Selain memiliki DNA kromosom, bakteri ternyata juga memiliki

DNA sirkuler lain yang kemudian dikenal dengan sebutan plasmid. Plasmid merupakan

molekul DNA untai ganda berbentuk sirkuler yang terpisah dari DNA kromosom dengan

ukuran mulai dari beberapa ribu pasang basa sampai dengan 100 kilobasa (Lodish et all,

1995).

Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi

pertumbuhan dan kelangsungan hidup bakteri (Raven and Johnson, 1989). Tetapi gen –

gen tersebut berperan dalam menyandi sintesis protein yang memiliki resistensi terhadap

antibiotik. Nilai lebih lain yang dimiliki oleh plasmid adalah kemampuannya untuk dapat

ditransfer ke sel lain dan kemampuan untuk dapat memperbanyak diri sendiri

(www.en.wikipedia.org/wiki/Plasmid).

Melihat adanya kemampuan tersebut, maka para ahli sekarang telah menjadikan

plasmid sebagai salah satu vektor yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan.

Dalam teknologi ini, plasmid akan diberi perlakuan tertentu sehingga dapat membawa

gen – gen yang menyandi senyawa, produk, atau sifat tertentu untuk kemudian ditransfer

dari organisme satu ke organisme lainnya (Retnoningrum, 2010)

6


Lodish et al (1995) menyatakan bahwa plasmid merupakan salah satu materi

yang sangat diperlukan dalam teknologi DNA rekombinan. Oleh karena itu, pada

praktikum biologi sel molekuler ini sangat tepat dilakukan acara praktikum isolasi DNA

plasmid.

2. Tujuan

Tujuan dari acara praktikum kali ini adalah untuk melihat cara kerja isolasi

DNA plasmid pUC 19

3. Alat dan Bahan

3.1. Alat

1. Bunsen burner

2. Cawan petri

3. Freezer

4. Glove

5. Jarum ose

6. Erlenmeyer 100 ml

7. Microcentrifuges 5415D (Eppendorf)

8. Micropipette segala ukuran

9. Refrigerator

10. Shaker incubator

11. Spidol marker

12. Tip micropipette segala ukuran (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

13. Tube microsentrifuge

3.2. Bahan

1. Ampisilin

2. E. coli JM109 yang mengandung plasmid pUC19

3. Es batu

4. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair

5. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

4. Cara Kerja

1. Koloni tunggal bakteri E. coli JM 109 yang mengandung plasmid pUC19

dinokulasikan ke medium LB cair 25 ml kemudian diinkubasi semalam (16 jam) pada

suhu 37 oC di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm;

7


2. Kultur hasil inkubasi dimasukkan ke dalam beberapa tube microsentrifuge masing –

masing sebanyak 3 ml dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000

rpm) selama 5 menit sampai terbentuk pelet sel;

3. Pelet sel yang diperoleh diresuspensi dengan menambahkan 1 ml larutan STE ke

dalam tube microsentrifuge kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

(5000 rpm) selama 5 menit;

4. Pelet sel diresuspensi kembali (vorteks dan bolak – balik 4 – 6 kali) dengan

menambahkan 250 µl Buffer P1 dingin sampai homogen;

5. Suspensi ditambah dengan 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara

dibolak-balik sebanyak 4 – 6 kali sampai warnanya berubah menjadi biru;

6. Suspensi selanjutnya ditambah dengan 350 µl N3 dan diresuspensi kembali dengan

cara dibolak – balik sebanyak 4 – 6 kali sampai berwarna putih;

7. Tube microsentrifuge disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm (17,900 x g) selama

10 menit;

8. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam collection tube yang dilengkapi

dengan QIAprep spin column kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan

13.000 rpm (17,900 x g) selama satu menit;

9. QIAprep spin column diangkat dan cairan yang tertampung di dalam collection tube

dibuang kemudian QIAprep spin column dipasang kembali ke dalam collection tube;

10. QIAprep spin column dicuci dengan 500 µl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan

13000 rpm selama satu menit.

11. Cairan yang tertampung di dalam collection tube dibuang kemudian ke dalam

QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 µl buffer PE dingin dan dilakukan

sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama satu menit.

12. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang

untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.

13. QIAprep spin column dipindahkan ke tube microsentrifuge 1,5 ml baru dan ditambah

dengan 50 µl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000

rpm selama satu menit (elusi pertama).

14. QIAprep spin column dipindahkan ke tube microsentrifuge 1,5 ml yang lain dan

ditambah dengan 25 µl buffer EB. Tube microsentrifuge beserta QIAprep spin column

disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

15. Diperoleh DNA plasmid sebanyak 50 µl (elusi pertama) dan 25 µl (elusi kedua) yang

kemudian dicek dengan cara dielektroforesis dalam gel agarosa

8


5. Hasil dan Pembahasan

Teknologi DNA rekombinan pada dasarnya adalah pembentukan kombinasi

materi genetik baru melalui penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga

memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami duplikasi di dalam suatu sel

organisme lain yang bertindak sebagai sel inang (Susanto, 2008). Jadi, teknologi ini

merupakan upaya mengubah susunan gen dari suatu organisme dengan maksud untuk

mendapatkan organism yang memiliki keunggulan dan kelebihan dalam sifat – sifat

tertentu.

Dari pengertian di atas, kita dapat menemukan satu istilah penting yaitu vektor.

Istilah ini merujuk pada molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan

yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan

terjadinya replikasi dan ekspresi dari fragmen DNA asing tersebut (Susanto, 2008)

Telah disampaikan di atas, bahwa plasmid memiliki peran yang penting dalam

teknologi DNA rekombinan. Oleh karena itu, sangat perlu bagi kita untuk dapat

mengisolasi DNA plasmid dari suatu bakteri. Terdapat beberapa macam metode isolasi

DNA plasmid sampai saat ini, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,

alkaline lysis, dan enzymatic digestion (Devi dan Victor, 2009).

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan isolasi DNA plasmid dengan metode

mini preparation dalam kondisi basa (alkaline lysis). Proses isolasi ini dilakukan dengan

menggunakan miniprep kit yang diproduksi oleh Qiagen (Anonim, 2006).

Hasil isolasi DNA plasmid yang diperoleh kelompok kami menunjukkan kualitas

yang kurang bagus, hal ini ditunjukkan dengan kondisi pita yang tipis dan terfragmentasi

(lihat gambar 5.1; 10). Ternyata hal ini tidak terjadi dengan DNA plasmid yang diperoleh

kelompok lain (lihat gambar 5.1; 11), dimana pita DNA plasmid yang diperoleh

menunjukkan dua pita yang tajam dan utuh.

Keterangan :

1. DNA λ/HindIII

2. K1 (pUC 19/HindIII)

3. K2 (pUC 19/EcoRI)

4. K3 (pUC 19/PStI)


6. A1 (pUC 19/EcoRI)

7. A2 (pUC 19/PStI)

8. A3 (pUC 19/HindIII)

9. A4 (pUC 19 uncut)

10. K1 (pUC 19 hasil isolasi)


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Gambar I.5.1. Elektroforegram Isolasi DNA plasmid pUC 19

9


Dari gambar I.5.1. di atas memang terlihat bahwa DNA plasmid yang kita peroleh

sangat tipis dan mengalami fragmentasi. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya

kesalahan prosedur dalam penambahan jenis solution. Ketika praktikum berlangsung,

terjadi kekeliruan penambahan jumlah bufer P2 dari yang seharusnya hanya sebanyak

250 µl, tetapi dalam prakteknya kemarin kita menambahkan sebanyak 350 µl. Akibatnya,

penambahan solution selanjutnya (bufer N3) menjadi berkurang yaitu dari yang

seharusnya 350 µl menjadi 250 µl.

Di dalam protokol yang dikeluarkan oleh qiagen (Anonim, 2006) disebutkan bahwa

penambahan bufer P2 adalah sebanyak 250 µl, sedangkan untuk bufer N3 sebanyak 350

µl. Bufer P2 merupakan bufer yang berperan dalam proses pelisisan sel, dimana

kandungan bufer ini berupa sodium hidroksida (NaOH) dan sodium dedocyl sulphate

(SDS). Sodium hidroksida berfungsi untuk mendenaturasi DNA kromosom dan DNA

plasmid untai ganda menjadi untai tunggal, sedangkan SDS merupakan suatu detergen

yang akan membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid dan

komponen protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown (1991);

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Extraction.html)

Bufer N3 dari miniprep kit ini merupakan larutan netralisasi yang mengandung

guanidine hydrochloride dan asam asetat. Potasium asetat akan membentuk endapan yang

tidak larut dalam kompleks SDS/lipid/protein dan mampu menetralisasi sodium

hidroksida yang ada pada tahap sebelumnya untuk menciptakan kondisi pH yang netral.

Pada kondisi netral ini, DNA mengalami renature, dimana DNA kromosom akan terikat

dengan endapan kompleks SDS/lipid/protein, sedangkan DNA plasmid akan membentuk

untai ganda kembali dalam supernatan dan terhindar dari perangkap endapan

SDS/lipid/protein (Anonim, 2006). Selain itu, bufer N3 juga mengandung garam

berkonsentrasi tinggi yang berperan dalam denaturasi protein, DNA kromosom, dan sisa

– sisa sel sehingga akan menghasilkan larutan DNA plasmid murni dan berkonsentrasi

tinggi.

6. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum dan pembahasan di atas, maka dapat diambil

kesimpulan bahwa DNA plasmid berhasil diisolasi tetapi kualitasnya rendah (tipis dan

terfragmentasi) sebagai akibat dari kesalahan prosedur.

10


DAFTAR REFERENSI

Anonim. 2006. Qiaprep Miniprep Handbook second edition. www.qiagen.com. Diakses 20

Februari 2010

Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta.

Devi dan Victor. 2009. Laporan Praktikum Teknik Analisa DNA: Isolasi DNA Plasmid.

Fakultas Teknobiologi. Universitas Surabaya.

http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid. Diakses 30 januari 2010

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Extraction.html. Diakses 30 januari 2010

Lodish, H., D. Baltimore, A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, and J. Darnell. 1995.

Molecular Cell Biology. Scientific American Books. New York.

Raven, P.H. and Johnson, G.B. 1989. Biology second edition. Times Mirror/Mosby College

Publishing. Missouri.

Retnoningrum, D.S. 2010. Prinsip Teknologi DNA Rekombinan. Sekolah Farmasi Institut

Teknologi Bandung. www.download.fa.itb.ac.id. Diakses 30 Januari 2010

Susanto, A.H. 2008. Bab VIII. Dasar – Dasar Teknologi DNA Rekombinan.

http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/. Diakses 30 Januari 2010

.

11


II. PEMOTONGAN DNA PLASMID

1. Landasan Teori

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan

sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi

lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan

dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA).

Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada

tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan

DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut

endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing

strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian

dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain

yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

2. Tujuan

Tujuan dari acara praktikum kali ini adalah untuk melihat cara kerja pemotongan

DNA plasmid

3. Alat dan Bahan

3.1. Alat

1. Freezer

2. Glove


4. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf)

5. Spidol marker



8. Water bath tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

3.2. Bahan

1. BSA

2. Buffer E

3. Buffer H

4. ddH2O

12


5. DNA plasmid pUC 19

6. Es batu

7. Restriction enzyme of Hind III, EcoR I, Pst I

4. Cara Kerja

1. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan

DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi

dipersiapkan dalam beberapa tube microsentrifuge berukuran 1 ml, dengan

komposisi sebagai berikut

Tube (µl) No Komponen

1 (µl) 2 (µl) 3 (µl) 4 (µl) 5 (µl)

ddH2O 10,5 10,5 10,5 10,5 6

Buffer H 2,5 - - 2,5 -

Buffer E - 2,5 2,5 - -

BSA 0,5 0,5 0,5 0,5 -

DNA pUC 19 10 10 10 10 4

Enzim Hind III 1,5 - - 1,5 -

Enzim EcoR I - 1,5 - - -

Enzim Pst I - - 1,5 - -

Volume reaksi 25 25 25 25 10

2. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar dengan cara dispin menggunakan

microsentrifuge selama 1 – 2 detik dan setelah itu tube microsentrifuge diketuk –

ketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi;

3. Tube microsentrifuge diinkubasi selama 4 jam di dalam water bath bersuhu 37 oC;

4. Tube microsentrifuge dipindahkan ke dalam water bath bersuhu 70 0C selama 10

menit untuk inaktifasi enzim restriksi;

5. DNA pUC 19 hasil pemotongan dicek menggunakan elektroforesis gel agarosa;


Pada acara praktikum kali ini dilakukan pemotongan DNA plasmid pUC19 dengan

beberapa macam enzim restriksi yaitu enzim Hind III, EcoR I, dan Pst I sesuai dengan

reaksi restriksi di atas. Hasil pemotongan DNA plasmid kemudian dianalisis dengan cara

elektroforesis pada gel agarosa (gambar II.5.1.)

13


Keterangan :

1. DNA λ/HindIII

2. K1 (pUC 19/Hind III)

3. K2 (pUC 19/EcoR I)

4. K3 (pUC 19/Pst I)

Gambar II.5.1. Elektroforegram Pemotongan DNA plasmid pUC 19

Dari gambar di atas, dapat dilihat bahwa DNA plasmid yang dipotong

menggunakan enzim restriksi Pst I diperoleh satu fragmen yang cukup baik, meskipun

tidak terlalu tajam (lajur 4). Hasil yang lebih baik diperoleh untuk DNA plasmid yang

dipotong dengan enzim restriksi Hind III (lajur 2) dan EcoR I (lajur 3), dimana pita DNA

terlihat sangat tajam.

Pst I merupakan salah satu enzim restriksi endonuklease yang diperoleh dari

Providencia stuartii yang dapat memotong urutan basa DNA untai ganda dengan sisi

pengenalan CTGCA▼G/GACGT▲C (www.roche-applied-science.com;

www.promega.com; www.en.wikipedia.org/wiki/PstI). Enzim ini dapat digunakan untuk

memotong DNA bakteriofage lambda, DNA kromosom dan DNA plasmid bakteri

(www.promega.com).

Plasmid pUC 19 merupakan salah satu vektor kloning yang biasa digunakan dalam

penelitian – penelitian biologi molekuler (Puspitasari, 2008). Plasmid ini berukuran 2686

pasang basa dan memiliki tiga bagian utama yaitu gen resisten ampisilin, gen lac-Z yang

mengandung Multiple Cloning Site (MCS), dan Origin of Replication (ORI)

(www.en.wikipedia.org/wiki/pUC19)

1 2 3 4

5543 pb

5210 pb

23130 pb

9416 pb

6557 pb

4361 pb

4897 pb

14


Telah disebutkan di atas, bahwa plasmid pUC 19 memiliki gen lacZ yang

mengandung Multiple Cloning Site (MCS) yang berisi sisi pengenalan dari beberapa

macam enzim restriksi. Salah satu jenis enzim restriksi yang dikenali oleh plasmid ini

adalah enzim Pst I yang memiliki sisi pengenalan restriksi pada urutan basa nomor 435.

Gambar II.5.2. Struktur Plasmid pUC 19 (dikutip dari www.neb.com/nebecomm/tech.../restriction.../maps/pUC19_map.pdf)

Gambar II.5.3. Grafik Estimasi Ukuran Fragmen DNA Plasmid Hasil Restriksi

15


Hasil Perhitungan dengan menggunakan software microsoft office excel 2003

menunjukkan bahwa ukuran fragmen DNA plasmid yang telah dipotong menggunakan

enzim Hind III, EcoR I, dan Pst I berturut – turut adalah 4897 pb, 5210 pb, dan 5543 pb

(lihat gambar II.5.1). Penentuan ukuran fragmen DNA plasmid hasil restriksi ini di

dasarkan pada perbandingan jarak migrasi yang ditempuh oleh fragmen DNA plasmid

dengan fragmen DNA marka yang telah diketahui pada suatu gel agarosa hasil

elektroforesis. Menurut Brown, (1991) dinyatakan bahwa elektroforesis akan

memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya. Semakin kecil ukuran DNA, maka

semakin cepat migrasinya.

Dari hasil perhitungan ini terlihat bahwa ukuran fragmen DNA hasil restriksi

ternyata lebih besar dari ukuran DNA plasmid pUC 19. Adalah sesuatu yang tidak masuk

akal, bahwa ketika suatu untai DNA dipotong dengan enzim restriksi tertentu ternyata

hasil potongannya memiliki ukuran yang lebih besar dari ukuran DNA asal.

Terdapat beberapa uraian yang bisa digunakan untuk menjawab fenomena tersebut.

Hal ini didasarkan pada hasil studi, bahwa setiap enzim restriksi memiliki permintaan

yang spesifik agar proses restriksi dapat berlangsung optimal. Kondisi penyimpanan dan

pengujian ideal sangat diperlukan untuk mendukung aktivitas dan keakuratan fungsi

suatu enzim tertentu (www.promega.com).

Seperti halnya dengan sifat enzim pada umumnya, aktivitas dan stabilitas enzim

restriksi juga dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti suhu, pH, kofaktor, komposisi

garam, dan kekuatan ionik. Selain itu, jenis buffer, adanya kontaminan (DNA tipe lain,

nuclease, dan inhibitor), pelarut organic, detergen, dan chelating agent juga ikut

mempengaruhi aktivitas dan stabilitas enzim restriksi (www.promega.com).

Pst I merupakan salah satu enzim restriksi yang dalam penggunaannya perlu

ditambahkan buffer solution H agar dapat mencapai aktivitas optimal 100 %. Reaksi

restriksi DNA dengan Pst I biasanya menggunakan buffer H 10X sebanyak 2 – 2,5 ul

untuk volume total 25 ul. (www.promega.com; www.roche-applied-science.com). Pada

praktikum kemarin, untuk pada reaksi restriksi dengan Pst I, digunakan buffer solution E.

Penambahan buffer solution E pada reaksi restriksi dengan Pst I hanya mampu

memberikan persentase aktivitas sebesar 25 – 50 % saja (www.promega.de).

Kemungkinan lain yang bisa digunakan untuk menjelaskan fenomena ini adalah,

adanya perbedaan bentuk konformasi antara DNA plasmid hasil restriksi dengan DNA

plasmid asal. Brown (1991) menyatakan bahwa bentuk konformasi DNA plasmid dapat

mempengaruhi kecepatan migrasi molekul DNA pada gel agarosa. Secara umum, bentuk

konformasi DNA plasmid ada lima macam. Berikut adalah kelima bentuk konformasi

16


DNA plasmid yang diurutkan berdasarkan kecepatannya dalam bermigrasi pada gel

agarosa yaitu dari yang terlamban sampai yang tercepat.

a. Nicked open circular, merupakan DNA yang memiliki satu untai yang terpotong;

b. Relaxed circular, merupakan DNA yang kedua untainya sepenuhnya tidak terpotong

tetapi telah memiliki kemampuan untuk berelaksasi secara enzimatik;

c. Linear, merupakan DNA dengan ujung bebas dengan kedua untai yang telah

terpotong;

d. Supercoiled (covalently closed circular), merupakan DNA yang yang kedua untainya

sepenuhnya tidak terpotong dan dengan suatu bengkokan, maka akan menghasilkan

bentuk yang padat;

e. Supercoiled denatured, merupakan DNA yang mirip dengan supercoiled, tetapi

memiliki daerah yang tidak berpasangan yang membuatnya menjadi sedikit kurang

padat (www.en.wikipedia.org/wiki/plasmid).

Jadi, berdasarkan pengelompokan plasmid ini, dapat diperkirakan bahwa fragmen

DNA hasil restriksi kemungkinan hanya terpotong satu untai saja sehingga membentuk

konformasi nicked open sirkuler yang lambat dalam bermigrasi pada gel agarosa. Plasmid

dengan konformasi CCC (covalenly closed circular) memiliki kecepatan migrasi yang

lebih tinggi daripada plasmid dengan konformasi OC (nicked open circular) (Brown,

1991).

Pengukuran konsentrasi fragmen DNA plasmid pUC 19 yang dipotong dengan Pst I

dilakukan melalui perbandingan tingkat perpendaran dari pita DNA marka dengan pita

DNA plasmid. Menurut Nicholl (2008) dalam Fathkomi (2009), disebutkan bahwa

estimasi konsentrasi DNA dapat ditentukan melalui perbandingan tingkat perpendaran

DNA sampel dengan tingkat perpendaran DNA marka.

Hasil analisis menunjukkan bahwa fragmen DNA hasil restriksi dengan enzim Pst I

(lajur 4) memiliki tingkat perpendaran yang mirip dengan tingkat perpendaran dari pita

kedua DNA marka (lajur 1). Dari perhitungan secara matematis, diperoleh data bahwa

konsentrasi DNA plasmid hasil restriksi dengan Pst I adalah 5,714 ng/ul (lihat lampiran

1).

6. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, dapat diambil kesimpulan bahwa

pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi Pst I tidak berhasil dilakukan.

17


DAFTAR REFERENSI


Nicholl (2008) dalam Fathkomi. 2009. Konstruksi Perpustakaan Genom Dari Isolat Bakteri

TS 36 Menggunakan Vektor pUC 19. Skripsi. Fakultas Biologi Universitas

Muhammadiyah Purwokerto. Purwokerto.

Puspitasari, A. 2008. Fraksinasi Protein Bungan Kucing – Kucingan (Acalipha indica L) dan

Uji Aktivitas Terhadap pemotongan DNA pUC 19. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas

Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. 2008

www.roche-applied-science.com. Diakses 23 Februari 2010

www.promega.com. Diakses 23 Februari 2010

www.en.wikipedia.org/wiki/PstI. Diakses 23 Februari 2010

www.en.wikipedia.org/wiki/pUC19. Diakses 23 Februari 2010

www.neb.com/nebecomm/tech.../restriction.../maps/pUC19_map.pdf. Diakses 23 Februari

2010

www.promega.de. Diakses 23 Februari 2010

www.en.wikipedia.org/wiki/plasmid. Diakses 23 Februari 2010

18


III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

1. Landasan Teori

Elektroforesis merupakan suatu teknik yang digunakan di dalam laboratorium

untuk memisahkan suatu molekul tertentu (DNA) berdasarkan muatan dari molekul

tersebut (www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html#run). Elektroforesis gel

agarosa merupakan suatu metode yang digunakan dalam bidang biokimia dan biologi

molekuler untuk memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan ukuran

(http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis)

Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan mudah untuk dilakukan

jika dibandingkan dengan teknik – teknik lain yang serupa. Secara umum, elektroforesis

digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA

(Fatchiyah, 2006), estimasi ukuran molekul DNA hasil pemotongan dengan enzim

restriksi, analisis produk PCR, dan memisahkan DNA atau RNA genom hasil

pemotongan sebelum digunakan untuk Southern transfer atau Northern transfer.

Sampai saat ini telah dikenal dua macam elektroforesis yaitu elektroforesis gel

agarosa dan elektroforesis gel poliakrilamide. Elektroforesis gel agarosa memiliki sifat

sebagai berikut tenaga yang dibutuhkan relatif rendah, mempunyai laju pemisahan lebih

cepat, dapat memisahkan fragmen DNA antara 100 pb sampai 50 kb tergantung dari

konsentrasi gel agarosa yang digunakan, dan medan gerak biasanya horizontal. Berbeda

dengan elektroforesis gel agarosa, elektroforesis gel poliakrilamide memiliki sifat lebih

efektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5 pb sampai 500 pb, membutuhkan tenaga

yang relatif tinggi, ukuran perbedaan DNA yang terpisah mencapai 1 pb, pembuatannya

relatif lebih sulit karena biasanya digunakan poliakrilamide dengan resolusi yang relatif

tinggi, medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan.

Pada kesempatan kali ini, yang akan dipraktikumkan hanya sebatas pada

elektroforesis gel agarosa. Hasil yang dirunning hanya berupa hasil restriksi DNA

plasmid dengan beberapa macam enzim restriksi.

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa

digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk

memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa

(bp).

19


Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya,

makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan

dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen – fragmen molekul

DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya

dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet terhadap gel agarosa yang dalam

pembuatannya telah ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat

visualisasi DNA adalah dengan cara gel direndam di dalam larutan etidium bromid baru

kemudian dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

2. Tujuan

Tujuan dari acara praktikum elektroforesis gel agarosa ini adalah untuk melihat

cara kerja elektroforesis gel agarosa

3. Alat dan Bahan

3.1. Alat

1. Digital camera

2. Erlenmeyer 50 ml

3. Gelas Ukur 25 ml

4. Glove

5. Isolasi kertas

6. Kertas parafilm

7. Kompor gas

8. Lempeng asbes


10. Seperangkat alat elektroforesis



13. UV transiluminator

3.2. Bahan

1. Akuades

2. Bubuk agarosa

3. DNA marker (λ/HindIII)

4. DNA plasmid pUC 19 hasil isolasi (uncut)

5. DNA plasmid pUC 19 hasil restriksi (cut)

20


6. Etidium Bromide (EtBr)

7. Larutan buffer TAE 50X

8. Loading dye 6x

4. Cara Kerja

1. Membuat 250 ml larutan buffer TAE 1X dengan cara mencampurkan 5 ml TAE 50X

ke dalam 245 ml akuades;

2. Membuat gel agarosa 1 % dengan cara mencampurkan 0,2 g bubuk agarosa ke dalam

buffer TAE 1X hingga volume 20 ml yang kemudian dipanaskan di atas api sampai

homogen;

3. Angkat gel agarosa cair dan biarkan suhunya turun sampai ± 45 oC

4. Menyiapkan cetakan gel agarosa dengan cara menutup kedua ujung cetakan dengan

isolasi kertas dan pastikan isolasi melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing –

masing ujung cetakan;

5. Memasang sisir pencetak sumuran di dekat salah satu ujung cetakan;

6. Setelah suhu gel agarosa cair turun sampai ± 45 oC, tambahkan 1 µl etidium bromide

lalu kocok – kocok sampai homogen (PERHATIAN, selalu gunakan sarung tangan

karena ethidium bromide bersifat karsinogenik);

7. Gel agarosa cair dituang ke dalam cetakan yang telah disiapkan dan biarkan sampai

memadat;

8. Sisir pencetak sumuran diangkat dan isolasi yang menutupi kedua ujung cetakan

dilepas secara hati – hati;

9. Gel agarosa padat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis sehingga terendam

dalam larutan TAE 1X;

10. Disiapkan beberapa loading dye 6X masing – masing sebanyak 1 µl disepanjang

kertas parafilm berukuran ± 5 cm;

11. Masing – masing loading dye 6X dicampur dengan masing – masing 5 µl DNA

marker, DNA plasmid hasil isolasi (uncut), DNA plasmid hasil pemotongan (cut)

sampai homogen yang kemudian dimasukkan ke dalam sumuran – sumuran gel

agarosa secara urut sesuai dengan penomoran berikut :

Keterangan :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

21


1. DNA λ/HindIII



4. K3 (pUC 19/PStI)



7. A2 (pUC 19/PStI)





12. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis; (pastikan bahwa kabel

yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran, jika tidak maka posisi

baki / gel harus dibalik);

13. Tekan tombol power pada posisi angka 1, atur besarnya voltase dan setting waktu

running sesuai keinginan;

14. Tekan tombol run untuk menjalankan elektroforesis dan tunggu sampai terdengar

bunyi alarm yang menandakan eletroforesis telah selesai;

15. Tekan tombol power pada posisi angka 0 dan kemudian angkat gel agarosa dari

tangki elektroforesis;

16. Gel agarosa diletakkan di atas UV transluminator;

17. Tekan tombol power pada posisi angka 1 dan amati pita – pita DNA yang terdapat

pada gel agarosa;

18. Hasil visualisasi pita – pita DNA yang terlihat diambil gambarnya dengan

menggunakan digital camera


Elektroforesis gel agarosa merupakan suatu metode yang digunakan dalam bidang

biokimia atau biologi molekuler untuk memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan

ukuran. Pada praktikum kali ini, kita mencoba untuk melakukan elektroforesis terhadap

DNA plasmid pUC 19 hasil isolasi dari E. coli JM109, plasmid normal (uncut), dan

plasmid yang telah diberi perlakuan berupa pemotongan dengan beberapa macam enzim

restriksi seperti HindIII, EcoRI, dan PStI (cut). Sebagai pembanding, maka kita juga

menyertakan DNA marka yaitu DNA λ/HindIII untuk memudahkan kita nantinya dalam

22


menentukan ukuran – ukuran fragmen dari plasmid yang kita peroleh. Berikut adalah

gambaran secara jelas tentang hasil elektroforesis yang kita peroleh dalam praktikum.

Keterangan :

1. DNA λ/HindIII



4. K3 (pUC 19/PStI)



7. A2 (pUC 19/PStI)





Gambar III.5.1. Elektroforegram pUC 19 hasil isolasi dan hasil restriksi

Berdasarkan gambar hasil elektroforesis di atas, dapat kita ketahui bahwa hasil

elektroforesis tidak terlalu bagus. Hal ini tercermin dari adanya beberapa sumuran yang

pita DNAnya masih smear, tidak utuh, dan tidak terpisah secara jelas.

Dari beberapa referensi yang kita dapat, diketahui bahwa baik buruknya hasil

elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu :

1. Ukuran DNA

Semakin besar ukuran DNA, maka laju migrasi pada gel agarosa akan semakin

lambat. Hal ini terkait dengan adanya kesulitan bagi molekul – molekul DNA yang

berukuran besar untuk menembus pori – pori gel agarosa. Hal ini terjadi sebaliknya

pada molekul – molekul yang berukuran lebih kecil, dimana molekul ini akan

bergerak lebih cepat dalam menembus pori – pori gel agarosa. Sebagai akibatnya,

maka molekul – molekul DNA akan terpisah berdasarkan ukurannya, dan penentuan

ukuran DNA dapat dilakukan dengan membandingkan dengan DNA marka yang

dirun secara bersama – sama dalam satu gel. Menurut Fatchiyah, (2006), jarak migasi

molekul DNA pada gel merupakan laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah

pasangan basa.

2. Konsentrasi Gel Agarosa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

23


Penggunaan gel agarosa dengan konsentrasi yang berbeda akan menghasilkan

laju migrasi molekul – molekul DNA yang berbeda juga. Penentuan konsentrasi gel

agarosa yang akan digunakan harus memperhatikan ukuran molekul – molekul DNA

yang akan diruning. Umumnya, konsentrasi yang tinggi dari gel agarosa biasanya

digunakan untuk memfasilitasi pemisahan molekul – molekul DNA yang berukuran

kecil, sedangkan konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah, umumnya digunakan

untuk memisahkan molekul – molekul DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3. Bentuk Konformasi DNA

Laju migasi ternyata juga dipengaruhi oleh bentuk konformasi dari molekul

DNA. Sampai saat ini dikenal tiga macam bentuk atau konformasi molekul DNA

yaitu Super Helix Circular, Circular Opened, dan Linier. Meskipun ketiga bentuk

atau konformasi molekul DNA tersebut memiliki berat yang sama, tetapi laju migrasi

pada gel agarosa akan berbeda.

4. Kekuatan Tegangan

Hasil elektroforesis juga dipengaruhi oleh besar kecilnya sumber tegangan

listrik yang digunakan. Apabila tegangan yang digunakan dinaikkan, maka laju

migrasi dari fragmen – fragmen DNA yang berukuran yang lebih besar akan secara

proporsional bermigrasi lebih cepat daripada fragmen – fragmen DNA yang

berukuran yang kecil. Oleh karena itu, maka resolusi terbaik untuk fragmen –

fragmen DNA yang berukuran lebih dari 2 kb dapat dicapai dengan menggunakan

tegangan yang tidak lebih dari 5 volt per cm ke dalam gel. Yang dimaksud dengan

nilai cm ini merupakan jarak antara dua elektroda, dan bukan panjang gel.

5. Komposisi Buffer

Ada beberapa buffer berbeda yang telah direkomendasikan untuk elektroforesis

DNA, dan kebanyakan yang biasa digunakan adalah TAE (tris-acetate-EDTA) dan

TBE (Tris-borate-EDTA). Penggunaan buffer yang berbeda akan menyebabkan laju

migrasi yang berbeda pula. Hal ini disebabkan oleh adanya kekuatan ionic yang

berbeda dari kedua buffer tersebut. Buffer yang digunakan dalam elektroforesis tidak

hanya digunakan untuk menentukan nilai pH saja, tetapi juga berperan dalam

menyediakan ion – ion yang diperlukan untuk mendukung konduktivitas.

6. Komposisi Basa DNA dan Suhu

Komposisi basa – basa DNA dan suhu secara umum tidak terlalu berpengaruh

terhadap mobilitas dari molekul – molekul DNA. Umumnya elektroforesis dilakukan

pada suhu kamar dan akan stabil pada kisaran suhu 4 – 30 oC. Namun demikian,

perlu diperhatikan bahwa proses elektroforesis biasanya akan menghasilkan panas

24


sehingga suhunya di dalam chamber akan naik. Apabila kenaikan suhu ini terlalu

tinggi, maka ada kemungkinan molekul – molekul DNA yang sedang diruning akan

mengalami kerusakan. Selain itu gel agarosa juga dapat mengalami pelelehan pada

suhu di atas 90 oC.

7. Keberadaan Pewarna

Intercalating agent Ethidium bromide (EtBr) merupakan pewarna

berfluorescent yang biasa digunakan untuk mendeteksi asam nukleat. Sesaat setelah

EtBr ini ditambahkan ke dalam gel agarosa, maka akan terjadi pengikatan molekul

ini diantara sela – sela pasangan basa DNA.

Penambahan EtBr ke dalam gel agarosa dimaksudkan untuk memudahkan kita

dalam mengamati hasil elektroforesis karena hanya sedikit saja yaitu sekitar 1 ng

molekul DNA yang dapat dideteksi tanpa menggunakan EtBr. EtBr akan

menghasilkan perpendaran ketika dipaparkan di atas sinar UV. Namun demikian,

perlu diperhatikan bahwa EtBr dapat mengurangi mobilitas linier dari molekul –

molekul DNA sampai 15 % dan juga sifatnya yang karsinogenik atau zat mutagen

kuat.

6. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa

elektroforesis gel agarosa merupakan suatu teknik laboratorium yang digunakan untuk

memisahkan molekul – molekul DNA atau RNA berdasarkan ukurannya. Teknik ini

dalam penerapannya dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran DNA, konsentrasi gel

agarosa, bentuk konformasi DNA, kekuatan tegangan, komposisi buffer, komposisi basa

DNA dan suhu, serta keberadaan pewarna.

25


DAFTAR REFERENSI

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan Seluler

Departemen Biologi Universitas Brawijaya. Malang

http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis. Diakses 23 Januari 2010

http://www.life.illinois.edu/molbio/geldigest/electro.html#run. Diakses 23 Januari 2010

26


IV. TRANSFORMASI

1. Landasan Teori

Istilah transformasi pertama kali diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun

1928 yang pada saat itu sedang berusaha menemukan vaksin untuk melawan penyakit

pneumonia yang disebabkan oleh bakteri. Ketika itu beliau menemukan bahwa suatu

strain bakteri S. pneumoniae nonvirulen berubah menjadi virulen ketika terpapar dengan

S. pneumoniae yang virulen.

Transformasi merupakan salah satu jalan bagi bakteri untuk memperoleh DNA

asing selain konjugasi dan transduksi. Dalam bidang biologi molekuler, transformasi

sering didefinisikan sebagai perubahan genetik di dalam suatu sel yang dihasilkan dari

proses pemasukan, penggabungan genomik, dan ekspresi dari material genetik (DNA)

asing (wikipedia.en.org)

Dalam perkembangannya, istilah transformasi telah didefinisikan secara lebih luas

lagi yaitu pengambilan molekul DNA oleh setiap jenis sel tanpa memandang apakah

pengambilan molekul DNA tersebut menyebabkan adanya perubahan dalam sel yang

dapat dideteksi atau tidak dan objek dari transformasi ini tidak terbatas pada bakteri saja,

tetapi termasuk juga fungi, hewan, dan tumbuhan (Brown, 1991).

Transformasi memiliki arti penting dan sangat berguna dalam penelitian –

penelitian genetik bakteri di laboratorium terutama bagi pemetaan kromosom bakteri. Hal

ini terjadi karena frekuensi terjadinya transformasi antara dua gen pada waktu yang sama

merupakan petunjuk jarak antara gen – gen ini pada kromosom (Pelczar dan Chan, 1986).

2. Tujuan

Setelah mengikuti acara praktikum ini, mahasiswa diharapkan memiliki

pemahaman yang benar mengenai transformasi dalam pembelajaran biologi sel

molekuler

3. Alat dan Bahan

3.1. Alat

1. Cawan Petri

27


2. Digital camera

3. Drugalsky

4. Erlenmeyer

5. Jarum ose


7. Microsentrifuge 5415D (Eppendorf)

8. Shaker incubator

9. Thermometer



12. Water bath tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

3.2. Bahan

1. Es batu

2. Media LB agar + ampisilin

3. Media LB agar tanpa ampisilin

4. Media LB cair

5. Strain E. coli JM 109

4. Cara Kerja

1. Satu koloni kultur semalam strain E. coli JM 109 diinokulasikan ke media LB cair 25

ml dan selanjutnya diinkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125

rpm pada suhu 37 oC selama 16 jam (semalam);

2. Kultur strain E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam diinokulasikan ke media LB cair

25 ml dengan cara mengambil 250 µl kultur strain E. coli JM 109 ke dalam media

LB cair 25 ml (perbandingan volume media dan volume kultur 10:1) dan kemudian

diinkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120

menit (2 jam) pada suhu 37 oC;

3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tube

microsentrifuge dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000 rpm)

selama 5 menit;

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tube ditambahkan 500 µl CaCl2

dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g (5000 rpm)

selama 5 menit;

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tube ditambahkan 200 µl CaCl2 dingin,

diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tube

28


microsentrifuge, dua tube (nomor 1 dan 2) diinkubasi selama 2 jam dan 3 tube

lainnya (nomor 3, 4, dan 5) diinkubasi selama 16 jam;

6. Tube microsentrifuge hasil inkubasi 2 jam (tube nomor 1 dan 2), salah satunya (tube

nomor 1) ditambah dengan 10 µl plasmid pUC19 sirkuler, sedangkan tube lainnya

(tube nomor 2) tidak ditambah dengan plasmid;

7. Kedua tube tersebut selanjutnya diinkubasi di dalam es selama 20 menit dan

kemudian diberi kejut panas (heat-shock) dalam water bath bersuhu 42 oC selama 90

detik dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit;

8. Tube microsentrifuge ditambah dengan media LB cair dingin hingga volume 1 ml (±

800 µl) dan selanjutnya diinkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37 oC dengan

kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam;

9. Diambil masing – masing 100 µl kultur dari tube nomor 1 dan 2 untuk ditumbuhkan

ke dalam media agar cawan LB amphisilin dan masing – masing 50 µl dari tube

nomor 1 dan 2 untuk ditumbuhkan ke dalam media agar cawan LB tanpa amphisilin

dan hasil plating kemudian diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37 oC selama 16 jam;

10. Amati apa ada pertumbuhan koloni bakteri pada media LB amphisilin dan media LB

tanpa amphisilin, dan jika ada maka hitung jumlah koloninya


D C

A B

29


Keterangan :

A. Koloni bakteri E. coli JM 109 + pUC 19 pada medium agar cawan LB beramphisilin

B. Koloni bakteri E. coli JM 109 + pUC 19 pada medium agar cawan LB tanpa amphisilin

C. Koloni bakteri E. coli JM 109 pada medium agar cawan LB beramphisilin

D. Koloni bakteri E. coli JM 109 pada medium agar cawan LB tanpa amphisilin

Transformasi merupakan suatu proses pemindahan DNA bebas sel yang

mengandung sejumlah informasi DNA yang terbatas dari satu sel ke sel lainnya (Pelczar

dan Chan, 1986). Transformasi ini terjadi ketika suatu sel yang disebut dengan sel donor

mengalami lisis sel baik secara alamiah ataupun kimiawi dimana kandungan DNA yang

dimilikinya akan keluar sel dan akhirnya dapat diambil oleh sel lain yang disebut dengan

sel resipien sehingga terjadilah proses rekombinasi DNA.

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan transformasi terhadap strain bakteri E.

coli JM 109 dengan memasukkan plasmid pUC 19. Strain bakteri tersebut dimasukkan ke

dalam dua buah tube yang berbeda yaitu tube nomor satu yang ditambah dengan plasmid

pUC 19 dan tube nomor dua yang tidak ditambah apapun. Dari kedua tube tersebut

diambil masing – masing 100 µl untuk ditumbuhkan pada media agar cawan Luria

Bertani (LB) yang mengandung antibiotik amphisilin dan masing – masing 50 µl untuk

ditumbuhkan pada media agar cawan Luria Bertani tanpa antibiotik amphisilin.

Hasil praktikum menunjukkan bahwa strain yang berasal dari tube nomor satu

mampu tumbuh pada kedua media agar cawan LB baik yang mengandung antibiotik

amphisilin maupun tidak. Setelah di hitung jumlah koloni bakterinya, maka diketahui

bahwa pada media agar cawan LB yang mengandung antibiotik amphisilin terdapat 156

koloni bakteri sedangkan pada media agar cawan LB tanpa antibiotik amphisilin jumlah

koloni bakterinya tidak dapat dihitung (TBUD).

Hasil yang sama juga ditunjukkan untuk strain yang diambil dari tube nomor dua,

dimana strain ini mampu tumbuh pada kedua media agar cawan LB baik yang

mengandung antibiotik amphisilin maupun yang tanpa antibiotik amphisilin. Namun

demikian, jumlah koloni yang tumbuh pada media agar cawan LB yang mengandung

antibiotik amphisilin jumlahnya relatif lebih sedikit jika dibandingkan dengan strain dari

tube pertama yaitu hanya sekitar 11 koloni. Untuk media agar cawan LB yang tanpa

antibiotik amphisilin berhasil ditumbuhi oleh strain secara spreader sehingga tidak dapat

dihitung jumlah koloninya (TBUD).

Dari hasil praktikum ini, maka dapat diketahui bahwa proses transformasi yang

telah dilakukan mengalami kegagalan. Seharusnya pertumbuhan koloni bakteri pada

Gambar IV.5.1. Seleksi hasil transformasi pada dua medium LB berbeda

30


media agar cawan LB yang mengandung antibiotik amphisilin hanya terjadi pada strain

yang berasal dari tube pertama karena strain ini telah disisipi dengan plasmid pUC 19

yang memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media yang mengandung amphisilin,

sedangkan strain dari tube kedua seharusnya tidak mampu tumbuh pada media yang sama

karena strain ini tidak disisipi dengan plasmid pUC 19. Plasmid pUC 19 memiliki gen

penanda (marka) yaitu gen penyandi resistensi terhadap antibiotik ampisilin. Gen

penyandi ini akan mengeksploitasi enzim β-lactamase ke dalam plasma sel bakteri inang,

dimana enzim ini akan mengkatalisis proses hidrolisis cincin β lactam sehingga jika

proses transformasi berhasil, maka sel bakteri inang akan memiliki kemampuan untuk

hidup dan tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik amphisilin (Sambrook et

al, 1989 dalam Puspitasari, 2008).

Plasmid pUC 19 merupakan salah satu plasmid yang sering digunakan sebagai

vector cloning dalam sel inang E. coli. Molekul ini merupakan DNA untai ganda,

berbentuk sirkuler, berukuran kecil sekitar 2686 bp, dan memiliki jumlah salinan yang

tinggi. Plasmid ini juga membawa 54 bp multiple cloning site (MCS) polylinker yang

mengandung situs pengenal khusus untuk 13 jenis hexanucleotide-specific restriction

endonucleases yang berbeda.

Secara umum, plasmid pUC 19 memiliki tiga bagian fungsional yaitu the origin of

replication, gen resisten amphisilin,dan gen lac-Z. Dari ketiga bagian ini, gen lac-Z inilah

yang dapat digunakan dalam seleksi DNA insert dalam pembuatan DNA rekombinan.

Gen lac-Z merupakan gen yang menyandi pembentukan enzim β-galactosidase, yaitu

suatu enzim yang dapat memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Selain itu, gen

lac-Z juga memiliki polylinker cloning site yang terdiri dari sisi pengenalan terhadap

beberapa enzim restriksi.

Adanya kemampuan E. coli JM109 dari tube kedua yang mampu tumbuh pada

medium LB yang mengandung ampisilin kemungkinan disebabkan oleh adanya plasmid

pUC 19 yang masuk menyisip ke dalam sel inang. Menurut Mangunwardoyo, (2002),

disebutkan bahwa proses transformasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu suhu,

jumlah/ukuran DNA, lama perlakuan kejutan panas, cara pemberian kejutan panas,

adanya enzim eksonuklease, spesifikasi inang, kekuatan ion, konformasi dan konsentrasi

DNA.

pUC 19 termasuk ke dalam kategori plasmid yang berukuran kecil yaitu hanya

sekitar 2,6 kb. Namun demikian, plasmid ini memiliki kemampuan untuk melakukan

replikasi yang tinggi (high copy number) yaitu berkisar 500 – 7000. Adanya sifat seperti

ini telah memberikan keuntungan tersendiri dimana proses transformasi akan berjalan

31


lebih mudah karena umumnya akan lebih mudah dalam penanganan, lebih efektif untuk

kloning DNA, dan memiliki sisi penyisipan yang spesifik (Muladno, 2002 dalam

Puspitasari, 2008). Itulah mengapa plasmid pUC 19 dapat masuk menyisip ke dalam sel

inang E. coli JM109 pada tube kedua.

6. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, maka dapat diambil kesimpulan bahwa

proses transformasi pUC 19 ke dalam sel inang E. coli JM109 tidak berhasil dilakukan.

32


DAFTAR REFERENSI


http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial Transformation . Diakses 23 Januari 2010

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, 1986. Dasar _ Dasar Mikrobiologi Jilid I. Universitas

Indonesia. Jakarta.

Muladno, (2002) dalam Puspitasari. 2008. Fraksinasi Protein Bungan Kucing – Kucingan

(Acalipha indica L) dan Uji Aktivitas Terhadap pemotongan DNA pUC 19. Skripsi.

Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. 2008

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) dalam Puspitasari, A. 2008. Fraksinasi

Protein Bungan Kucing – Kucingan (Acalipha indica L) dan Uji Aktivitas Terhadap

pemotongan DNA pUC 19. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah

Surakarta. Surakarta. 2008

Mangunwardoyo, W. 2002. Transformasi Fragmen DNA Kromosom Xanthomonas

campestris ke dalam Escherichia coli. Makara Sains. Volume 6 No 1.

33


Lampiran 1. Estimasi Konsentrasi DNA plasmid pUC19

Keterangan : 1. DNA λ/HindIII

2. K1 (pUC 19/Hind III)

3. K2 (pUC 19/EcoR I)

4. K3 (pUC 19/Pst I)

Penghitungan konsentrasi pUC19 linier

1. Penghitungan berat total DNA marka (λ/HindIII)

Berat total = volume X konsentrasi DNA marka

= 5 ul X 50 ng/ul

= 250 ng

2. Penghitungan berat pita X pada DNA marka (λ/HindIII)

Berat pita X = X berat total

Berat pita ke-2 = X 250 ng

Berat pita ke-2 = 28,57 ng

3. Penghitungan konsentrasi pita pUC 19

Berat pita ke-2 ≈ berat pita pUC 19

Panjang pita X

Panjang total

5543 pb

48502 pb

1 2 3 4

Perpendaran sama

9416 pb

34


Konsentrasi pUC 19 = 28,57 ng/5 ul

= 5,714 ng/ul

Lampiran 2. Estimasi Ukuran Fragmen DNA Plasmid Hasil Restriksi

Base Pairs

(bp)

Distance

(mm) Log10 bp

Distance-

Unknown m*Distance y Value

Unknown

bp Value

23130 15 4.3641756 38 -1.0222 3.69 4897.78819

9146 26 3.9612312 37 -0.9953 3.7169 5210.74715

6557 31 3.8167052 36 -0.9684 3.7438 5543.70357

4361 42 3.6395861 37 -0.9953 3.7169 5210.74715

35 -0.9415 3.7707 5897.93524

35 -0.9415 3.7707 5897.93524

38 -1.0222 3.69 4897.78819

46 -1.2374 3.4748 2984.00812

47 -1.2643 3.4479 2804.78774

48 -1.2912 3.421 2636.33139

Documents

laporan praktikum biologi sel molekuler