10.1. PRINCIPI I FUNKCIONISANJE - kelm.ftn.uns.ac.rs · 10. BIOSENZORI 251 Transdjuser (detektor, senzor) je drugi strukturni deo svakog biosenzora. To je makroskopski pretvara~ jednog

1010 BIOSENZORI BIOSENZORI

10.1.10.1. PRINCIPI IPRINCIPI IFUNKCIONISANJEFUNKCIONISANJE

10.1.1. 10.1.1. Opti pojmoviOpti pojmovi

Definicija. U irem smislu biosenzor je element koji pretvarabioloki doga|aj u elektri~ni signal. U uèm, tehni~kom smislu,biosenzor je element sa biolokim materijalom koji omoguavapretvaranje koncentracije odre|ene, prirodne ili veta~ke,(bio)hemijske komponente u kompleksnom te~nom analitu uelektri~ni ili opti~ki signal.

Istorijski razvoj. Biosenzori su napravljeni po analogiji sasenzorima biolokih procesa u ìvim organizmima. Imitacija je zasadslabija u odnosu na uzor jer prirodni procesi jo uvek nisu dovoljnodobro izu~eni. Kopiranjem prirode i primenom enzima, proteina,bakterija, ìvotinjskog i biljnog tkiva dobijena je nova klasa mernihure|aja za kontinualno praenje razli~itih parametara metabolizmakao to su: glukoza, urea, glutamin, holesterol, nistatin i dr.

Prvi biosenzor napravili su Klark (L.C.Clark) i Lajons(C.Lyons) 1962. godine. Sluìo je za merenje koncentracije glukoze ukrvi. Namera je bila da se delovanjem enzima u membrani glukozatransformie u produkt koji se moè detektovati pomou pH ilikiseoni~ne elektrode. Dalji napredak ostvaren je 1967. godineizgradnjom enzimske elektrode polimerizacijom gela na minijaturnojkiseoni~noj elektrodi. Klju~ni rezultat (1970) ostvario je R.Bergveldkada je uspeo da integrie enzimsku membranu na poluprovodni~kojosnovi i napravi jon−osetljivi tranzistor ISFET (Ion Sensitive FieldEffect Transistor). Posle toga su na FET, termistor, pijezoelektrik,opti~ki kabl i druge elektronske komponente dodavani

250 SENZORI TE^NOSTI I GASOVA

biomolekularni slojevi sa ciljem integracije biosenzorskih ~ipovarazli~ite namene.

Upotreba biosenzora prisutna je u mnogim oblastima. Prvikomercijalizovani senzori enzimskog tipa razvijeni su u biomedicini.To su glukozni biosenzor za analizu eera i uree u krvi pridijagnosticiranju dijabetesa, laktozni biosenzor za odre|ivanje naporamiia i biosenzor sa ureom i kreatinom za kontrolu funkcije bubrega.Enzimski biosenzori imaju veliku primenu i u prehrambenoj industriji:glukozni biosenzor koristi se u kontroli fermentacije, laktozni zakontrolu kvaliteta vina i jogurta, a etanolski za odre|ivanje koli~inealkohola u alkoholnim piima.

Biosenzori se koriste za dobijanje kontinualne informacije ostanju ìvotne sredine, vode za pie, u detekciji organofosfornihjedinjenja koji nastaju trovanjem bojnim otrovima, u detekciji virusai bakterija, toksi~nih agenasa i dr.

Struktura. Biosenzor se sastoji od dva osnovna funkcionalnadela, bioreceptora i transdjusera (slika 10.1). Bioreceptor jebioprijemnik sa izrazito selektivnim centrima za identifikacijuanalita koji omoguavaju molekularno prepoznavanje i odre|enutransformaciju analita. Lokalne biohemijske modifikacije u pravilu sevre pomou odabranog imobilisanog enzima tako to se analittransformie u produkt koji se onda detektuje transdjuserom. Uliteraturi se osim termina bioreceptor ~esto sree selektor ili polimer.Selektor isti~e na~in funkcionisanja, a biopolimer vrstu materijala odkojeg je bioreceptor napravljen.

Slika 10.1. Struktura biosenzora

10. BIOSENZORI 251

Transdjuser (detektor, senzor) je drugi strukturni deo svakogbiosenzora. To je makroskopski pretvara~ jednog oblika energije udrugi pomou kojeg se detektuje produkt biohemijske modifikacije ikonvertuje u elektri~ni signal. Da li e transdjuser bitipotenciometrijska ili amperometrijska elija, tranzistor, termistor,ultrazvu~ni SAW−senzor, kapacitivni ili opti~ki senzor zavisi od tipabiohemijske modifikacije.

Spoj B/T, veza izme|u bioreceptora i transdjusera je kriti~nata~ka u mernom lancu. Nije uvek jednostavno napraviti niskoomskuvezu i zato ona predstavlja mesto gde se superponiraju stranaelektri~na polja. Problem postaje izraèniji u situaciji kada se morajuupotrebiti relativno duì kablovi za povezivanje sa udaljenimpoja~ava~em ili impedantnim rastavlja~em. Zato se prilikomprojektovanja biosenzora posebna pa`nja posveuje integracijireceptora i elektronskih kola senzora.

Elektronska kola su realizovana silicijumskom tehnologijom,naj~ee tehnikom fotolitografije. Primena fotolitografije pokazala sekorisna ne samo zbog integracije potrebne elektronike ve i zbogmogunosti jednostavnog oblikovanja elektroda i deponovanjamembrana sa imobilisanim biomolekulima. Pomou tehnikanagrizanja dodaju se potrebni kanali i upljine. Kombinacijom ovihdveju tehnika razvijen je veliki broj senzora za merenje u realnomvremenu, ali i biosenzorskih sistema sa vie senzora u jednom ~ipu.

Kombinovanjem razli~itih bioreceptora i transdjusera mogueje napraviti raznovrsne senzore. Strukturne komponente biosenzoramoraju biti kompatibilne da bi se na izlazu dobio adekvatan porastelektri~nog signala. Na primer, nije mogue upotrebititermometrijski transdjuser ako je biohemijska modifikacija analitabez promene entalpije. Pojedine kombinacije su produktivnije ijednostavnije za realizaciju. Danas su u praksi najvie zastupljenepotenciometrijske ili amperometrijske elije sa enzimima. Na trìtusu tako|e prisutne kombinacije enzima i poluprovodnika (tranzistorISFET), dok se ostale kombinacije primenjuju uglavnom uistraìva~kim laboratorijama (tabela 10.1).

10.1.2. Klasifikacija biosenzora10.1.2. Klasifikacija biosenzora

Bioreceptori se grade na odgovarajuoj tankoslojnoj,membranskoj podlozi u koju se ugra|uju prirodni mikroorganizmi,tanki slojevi ìvotinjskog i biljnog tkiva ili biopolimeri. Biopolimeri


su sinteti~ki makromolekuli sa odli~nim selektivnimkarakteristikama − u tom pogledu to su danas najbolji materijali.Loa osobina biopolimera je podlo`nost termi~koj i hemijskojdegradaciji. Klasifiikacija biosenzora izvodi se prema tipubioreceptora, a vrsta upotrebljenog transdjusera sluì za klasifikacijuunutar tog tipa, kao to je to predstavljeno u tabeli 10.1. Osnovnitipovi bioreceptora su: enzimi, mikroorganizmi, re`njevi i organele,antitela, jonofori i hemireceptori.

∗ istraìvanje, ∗∗ istraìvanje i razvoj, ∗∗∗ komercijalna primena

Tabela 10.1. Kombinovanje bioreceptora i transdjusera

Enzimski biosenzori su najrasprostranjeniji. Kada je biore-ceptor enzimskog tipa, enzimi vezuju supstrat i svojim kataliti~kimdelovanjem pomaù njegovo pretvaranje u produkt. Kao mera ovogprocesa moè da se uzme koncentracija (potronja) supstrata,generisanje produkta ili potronja kofaktora, koji se prate pomou

10. BIOSENZORI 253

elektrohemijskih transdjusera − potenciometrijskih ili amperome-trijskih. Kao mera enzimske aktivnosti moè da posluì toplota kojase osloba|a pri kataliti~koj reakciji (prati se kao temperatura pomoutermistora) ili promena indeksa loma svetlosti, apsorpcije ilirefleksije (prati se pomou opti~kih transdjusera).

Imunosenzori rade sa bioreceptorima na bazi imobiliziranihantitela (antiagensi, imunoagensi, imunoreceptori). Antitelo Ab usenzoru spaja se sa svojim supstratom koji se naziva antigen Ag ujedan kompleks AbAg sa odre|enim fizi~kim osobinama:Ab+Ag↔AbAg. Prilikom spajanja menja se masa, dielektri~nakonstanta ili indeks prelamanja to se meri pomou SAW,kapacitivnog ili opti~kog transdjusera. Odziv transdjusera moè da sepobolja izazivanjem odre|ene hemijske reakcije. To se naj~ee radimarkiranjem antigena enzimom koji katalizuje produkciju spojevapogodnih za detekciju pomou elektrohemijskog transdjusera.Umesto enzima kao medijatori, posrednici izme|u imunolokih ielektrohemijskih reakcija koriste se i nosioci jona, tzv. jonofori.Jonofor se hemijski spaja sa konjugatom antitelo−antigen i pri tomedolazi do promene povrinskog potencijala koji se detektujepotenciometrijskim transdjuserom.

Mikroorganizmi i elije (bakterije, gljivice, virusi, elijskiorganizmi) su prirodni bioreceptori za koje su karakteristi~neznatno sloènije reakcije sa supstratom. Tipi~an primer subakterioloki senzori kod kojih se gasovi CO2, NH3 ili O2 nastali kaoreazultat metaboli~kih reakcija izme|u ispitivanog supstrata iodre|ene bakterije mere prigodnim transdjuserom − elektrodom pH,

2Op , 3NHp ili 4NHp . Imobilizacija mikroorganizama obi~no se vri na

samom transdjuseru.

Re`njevi tkiva i organele sluè za gradnju vrlo stabilnihbioreceptora. Naime, tanki slojevi ìvotinjskog ili biljnog tkiva sudobri izvori enzima u prirodnom okruènju. Osetljivost ovakvihbioreceptora poveava se ugradnjom antimikroorganizamskih agenasakoji smanjuju uticaj mikroorganizama.

Organele kao lisozomi, hloroplasti, mitohondrie i mokrokozmesu bioloki materijali koji ne sadrè jedan enzim ve ~itave enzimskesisteme koji omoguavaju direktno povezivanje sa amperometrijskimtransdjuserom.


Hemireceptori su elijske membrane osetljive na hemijskestimulanse. Promene koje nastaju su reverzibilne i mogu se pratitielektrohemijskim transdjuserima. Poseban tip hemireceptora suneuroreceptori.

10.1.3. Funkcionalne karakteristike10.1.3. Funkcionalne karakteristike

Selektivnost (supstratna specifi~nost) je sposobnost biosenzorada reaguje samo na odre|eni spoj u prisustvu drugih spojeva.Uobi~ajeno je u biohemiji da se komponenta analita ~ija se koncentra-cija meri naziva supstrat, jer sluì kao podloga za biohemijskereakcije sa enzimima ili kao hranljiva sredina za mikroorganizme.Postoji veliko mnotvo razli~itih supstrata, pa je supstratnaspecifi~nost senzora od fundamentalne va`nosti.

U biolokim sistemima selektivnost se tuma~i kao prepozna-vanje oblika, tzv. biomolekularno prepoznavanje. Supstrat S imaodre|enu prostornu konfiguraciju i prilikom spajanja, na primer, saenzimom E u kompleks ES mora da postoji podudardnost prostornestrukture supstrata i enzima. Kaè se da molekuli supstrataodgovaraju molekulima enzima kao „klju~ u bravu“ (slika 10.2.a). Naprimer, selektivnost enzima je izuzetno visoka i omoguavadiferencijaciju sloènih stereoskopskih spojeva kao to su L iD−amino kiseline i dr.

Situacija prikazana na slici 10.2.a ematski prikazuje dvemolekule S i E u vakuumu. Realno biosenzor radi u te~noj sredini, ato zna~i da e molekule vode reagovati i povezati se sa S i E (slika10.2.b). Ovaj proces poznat je kao hidratacija. Spajanjem S i E ukompleks SE poveava se broj slobodnih molekula vode, odnosno utermodinami~kom smislu poveava se entalpija ∆S>0 i smanjujeslobodna energija sistema ∆G<0. To je osnova hidrofobne veze kojomse objanjava selektivnost, prepoznavanje odre|enog supstrata uimunohemijskim i biokataliti~kim reakcijama. Treba uo~iti dabiosenzori rade u vodenoj sredini i da hidrofobna veza ima klju~nizna~aj u procesu molekularnog prepoznavanja, te da je upravo zatobiosenzore veoma teko primeniti u nevodenim sredinama, na primeru detekciji gasova.

Proporcionalnost je linearna promena amplitude izlaza ∆a uzavisnosti od promene ulaza ∆m ili fizi~kog parametra indukovanogprisustvom supstrata:

10. BIOSENZORI 255

a) b)

Slika 10.2 Princip biomolekularnog prepoznavanja: a) spajanje molekula uvakuumu, b) hidrofobna veza

mSa ∆=∆ , (10.1)

gde je S=∆a/∆m osetljivost biosenzora u okolini merene vrednosti.Ukoliko se veli~ina m meri posredno, jedna~ina (10.1) dobijarazli~ite oblike. Na primer, u slu~aju potenciometrijskog senzoraamplituda izlaza je saglasno Nernstovom zakonu proporcionalnalogaritmu koncentracije:

)(log cSa ∆=∆ . (10.2)

Proporcionalnost je svojstvo biosenzora koje zavisi od biore-ceptora i od transdjusera.

Merljivost je sposobnost biosenzora da rezultat hemijskereakcije u bioreceptoru moè da transformie pomou postojeihtransdjusera u odgovarajui elektri~ni ili opti~ki izlazni signal. Utabeli 10.1 navedeni su tipi~ni transdjuseri koji se upotrebljavaju ugradnji biosenzora, zavisno od tipa reakcije i supstanci koje seosloba|aju ili utroe.


10.210.2.. TEHNIKE MOLETEHNIKE MOLEKULARNOGKULARNOGPREPOZNAVANJAPREPOZNAVANJA

10.2.1. Bioafinitet10.2.1. Bioafinitet

Hemijska detekcija pomou organskih materijala po principu„klju~ u bravu“ tipi~na je za imunogene reakcije atitelo−antigen.Selektivnost antitela zasniva se na specifi~nom prostornomrasporedu njegovih molekula na mestu spajanja sa antigenom. Ovageometrijska realizacija principa „klju~ u bravu“ poznata je kaobioafinitet. Principijelna struktura imunosenzora i prepoznavanjaorganskih molekula data je na slici 10.3.a. Inkorporiranje organskihmolekula prati se pomou transdjusera koji detektuju promenumase, kapacitivnosti ili temperature.

Prostorno modeliranje. Tipi~ni molekuli sa biofinitetom sukaliksareni, aromati~ni ugljovodonici sa kaveznom (prstenastom,cikli~nom) kristalnom strukturom koja se sastoji od vie spojenihbenzenovih prstenova. Kaliksareni inkorporiraju i vezuju za sebemanje organske molekule. Na slici 10.3.b prikazana je supramole-kularna struktura antitela t−bu−kaliks(4)aren u povrinskoj reakcijisa gasom perhloretilen C2Cl4.

a) b)

Slika 10.3. Imunosenzor: a) struktura, b) bioafintet

10. BIOSENZORI 257

Kavezna struktura kaliksarena moè da se modifikuje tako tose atom u benzenovom prstenu zamenjuje nekim drugim atomom iliradikalom R, ~ime se omoguava prepoznavanje sloènijih molekula.Na slici 10.4 prikazani su tipi~ni radikali koji se dodaju kaliksare-nima sa kaveznom strukturom od ~etiri, odnosno est benzenovihprstenova.

Slika 10.4. Sloèni kaliksareni i tipi~ni radikali

Kovalentne veze. Osim jednostavnog hemijskog modeliranjaprostornog rasporeda pomou kaliksarena, veliku primenu ima itehnika kovalentnog vezivanja kavezne grupe za zlatnu podlogu Aupreko atoma sumpora S kao mosta. Na slici 10.5 prikazan jeresorcin(4)aren spojen za Au preko S, struktura koja se stavlja kaopovrinski sloj na senzore sa odli~nim selektivnim svojstvima premaperhloretilenu C2Cl4.

10.2.2. Enzimsko (biokataliti~ko) prepoznavanje10.2.2. Enzimsko (biokataliti~ko) prepoznavanje

Enzimi su makromolekule sa proteinskom strukturom velikemolekulske mase. Sastoje se od komponente: proteinske (apoenzim) ineproteinske, prosteti~ke grupe (koenzim, aktivni centar). Enzimiimaju izrazitu sposobnost molekularnog prepoznavanja zahvaljujuitome to kataliti~ki deluju samo na odre|enu reakciju, odnosno naodre|eni supstrat koji u~estvuje u toj reakciji. Supstratskaspecifi~nost enzima zasniva se na prostornoj podudardnosti enzima isupstrata po principu „klju~ u bravu“. Struktura supstrata mora bititakva da atomi supstrata mogu da reaguju najmanje u tri ta~ke safunkcionalnim grupama enzima. Mesta interakcije na enzimunazivaju se centar, podru~je aktivnosti. Centar aktivnost je uvekmnogo manji u odnosu na ukupni molekul enzima, a u njegovomstvaranju glavnu ulogu imaju neproteinski delovi enzima:niskomolekularne grupe (koenzimi) i jonski kofaktori (jonofori).


Selektivnim prepoznavanjem supstrata S na aktivnomcentru enzima E stvara se kompleks enzim−supstrat ES u kome seodvija hemijska reakcija, odvaja produkt reakcije P i regenerieenzim: S+E↔ES→P+E. Aktivni centar enzima naj~ee nije unapred

10. BIOSENZORI 259

fiksiran ve se dinami~ki formira. Re~ je o dinami~kim, indukovanimreceptorskim vezama: supstrat se najpre slabo veè za enzim, a ondase delovi enzima pomi~u i omoguavaju reaktivnim grupama da sepribliè odgovarajuim atomima supstrata koji tek tada odgovarajuenzimu po principu „klju~ u bravu“. Priprema tankoslojne osnove sabioreceptorskom strukturom visoke molekulske teìne je ozbiljantehnoloki problem. Mehanizam indukovanog prilago|avanjaomoguava da se ovaj problem rei sintezom potrebne biolokefunkcije pomou strukture niè molekulske teìne koja predstavljakopiju centra prepoznavanja.

Medijatori i molekularno prepoznavanje. Kataliti~kodelovanje aktivnih centara enzima detektuje se kao elektrohemijskapromena na odgovarajuoj elektrodi. Podrazumeva se da postojiodgovarajui put za prenos naelektrisanja od aktivnog centra doelektrode. U pitanju je „molekulsko oì~enje“ pomou medijatora.

Medijatori su spojevi koji sluè za regeneraciju koenzimauklju~enih u enzimsku kataliti~ku redoks−reakciju. Pokretljivostkoenzima je ~esto mala, naro~ito u pastama i gelovima koji se nanosekao podloga na elektrodu, pa je tada neophodan medijator za transportnaelektrisanja. Medijator treba da ima sledee osobine:

• brz i reverzibilan prenos naelektrisanja;

• stabilnost u oksidovanoj i redukovanoj formi;• inertnost u odnosu na druge sadràje u rastvoru, naro~ito uodnosu na kiseonik;

• nezavisnost od vrednosti pH rastvora;

• netoksi~nost u in−vivo aplikacijama.

Postoji veliki broj razli~itih na~ina da se pomou medijatoraprenese naelektrisanje od aktivnog centra kao unutranje elektrodedo makroskopske vanjske elektrode (slika 10.6).

Mobilni medijator. Najprostija varijanta prenosa naelektrisanjaodnosi se na mobilni, slobodni medijator kakvi se nalaze u rastvorima.Medijatori u rastvoru mogu da budu sasvim nezavisne slobodne ~esticekoje u kontaktu sa aktivnim centrom enzima primaju naelektrisanjei prenose ga do elektrode, ili da se vezuju za druge slobodne ~estice urastvoru koristei ih kao „prevozno sredstvo“ do elektrode (slika10.6.a).


Pokretljivost medijatora moè biti ograni~ena. Medijator je tadapri~vren za elektrodu sa dovoljno dugom i fleksibilnom vezom kojamu omoguava slobodno kretanje − takvo da moè da dosegne enzim,

10. BIOSENZORI 261

preuzme naelektrisanje i da ga prenese do elektrode. Isti efekatpostiè se kada je medijator pri~vren na enzimu (slika 10.6.a).

Fiksirani medijatori se primenjuju u pastama i gelovima kojise nanose kao enzimska podloga na povrini elektrode. Najpoznatijimedijator takvog tipa je ferocen (organski poluprovodnik), koji jedovoljno hidrofoban da se moè uklju~iti u karbonske paste iadsorbovati na povrini grafitne elektrode. Njegov oksidovani oblik,ferocinijum jon, je relativno rastvorljiv u vodi i zato se elektroda saferocenom ne sme dugo dràti u rastvoru.

Medijatori su fiksirani naj~ee u polimerskoj mreì gdeformiraju lance za prenos naelektrisanja po sistemu „elektronskihreleja“. Prenos naelektrisanja po ovom principu odvija se i u slu~ajukada je enzim u direktnom spoju sa elektrodom a medijatoriu~estvuju u modifikaciji enzima (slika 10.6.b).

Provodna matrica dobija se pomou organskih soli upolimeru. Najpoznatije soli dobijaju se iz N−metil fenazina (NMP+),tetracijanokvinodimetana (TCNQ−) i tetratijafulvalena (TTF+).Poseban tip provodne matrice ima se kod kompozitne elektrode nakojoj se nalazi pasta sa enzimom i ~esticama ugljenika kaomedijatorom (slika 10.6.c)

Provodni polimeri formiraju duge lan~ane strukture kojepodseaju na ì~ani provodnik (slika 10.6.d). Odatle je i nastaonaziv molekulsko oì~enje za prenos naelektrisanja pomoumedijatora.

Direktni prenos naelektrisanja dobija se kada je enzim nanetdirektno na elektrodu. Elektron koji se prenosi je ili iz aktivnogcentra enzima sa metalom M ili iz dela enzima C koji je doìveopromenu koja mu omoguava da transportuje elektron od centra Mdo elektrode (slika 10.6.e).

10.2.3.10.2.3. Transmembransko prepoznavanjeTransmembransko prepoznavanje

Membrane imaju veliki zna~aj za ìve elije jer uklju~ujumnoge biomolekularne funkcije. Pojedine funkcije pokazale su sekorisne u gradnji biosenzora. Upotrebljavaju se prirodne membraneod agara (gel od morskih algi) ili kalogena (vezivna ìvotinjska


tkiva), a tako|e i membrane od veta~kih materijala namenjenih zadijalizu i filtraciju.

Selektivna svojstva membrane bitna za molekularnoprepoznavanje ogledaju se u razli~itim mehanizmima proputanjasupstrata − odatle je i nastao naziv trensmembransko prepoznavanje.Enzimi u kanalima membrane deluju na jedan od tri sledea na~ina(slika 10.7.a):

• transportuju odre|ene supstrate kroz kanal;

• vezuju analit na povrini membrane i proputaju samo odre-|eni supstrat;

• reaguju sa analitom i proputaju produkte reakcije.

a) b)

Slika 10.7. Transmembransko prepoznavanje: a) principi, b) merenjekoncentracije laktoz-permeaze na osnovu faktora pH

Simultani transport laktoze i protona vodonika H+ primer jereagovanja sa analitom i proputanja produkta reakcije (slika 10.7.b).Laktoza i protoni H+ prolaze kroz kanale dvoslojne membranedebljine 450 nm gde deluje enzim laktoz−permeaza. Odnos laktoze iprotona H+ na ulazu je 1:1, a nakon prolaska kroz membranu ireakcije u kanalu taj se odnos menja. Koncentracija laktoze uprostoru izme|u membrane i transdjusera meri se detekcijompH−faktora u tom prostoru. Kao transdjuser moè da posluìpogodna mikroelektroda ili tranzistor ISFET.

10. BIOSENZORI 263

10.2.4. ]elije i organizmi10.2.4. ]elije i organizmiPrepoznavanje molekula velike molekulske teìne (otrovi,

droge, lekovi) pomou celih elija, ìvotinjskih i biljnih tkiva,neuroreceptora i hemireceptora zasniva se na specifi~nimbiohemijskim i metaboli~kim reakcijama koje se u njima odvijaju.Razmere centra prepoznavanja ovde su najmanje 10 µm − to je mnogovie od 10 nm kolika je veli~ina centara na bazi bioafiniteta, enzimskogili transmembranskog prepoznavanja. Osim toga, veza izme|u ovakovelikih funkcionalnih jedinica i osnove na kojoj se pravi elektroda(transdjuser) je nestabilna, to je ograni~avajui faktor za veuprimenu.

Tipi~ne reakcije bitne za prepoznavanje su transformacija ivezivanje supstrata (slika 10.8.a). Poseban problem detekcijetransmembranskog signala izvan elije je vezivanje elije hemijskimvezama za osnovu. Osnovni elementi koji u~estvuju u formiranjuveze prikazani su na slici 10.8.b.

a) b)

Slika 10.8. ]elijski biosenzor: a) princip, b) vezivanje elije za osnovu

10.310.3.. ENZIMSKI BIOSENZORIENZIMSKI BIOSENZORI 10.3.1.10.3.1. Osobine enzima Osobine enzima

Kataliti~ke osobine enzima bitne za funkcionisanje biosenzorarazmatrane su u prethodnim poglavljima. Zato e ovde biti re~i odrugim, tako|e va`nim osobinama enzima.


Klasifikacija. Enzimi se grupiu u est familija, zavisno odtipa reakcije koju kataliziraju:

• oksidoreduktaze, katalizuju redoks−reakcije;

• transferaze, katalizuju reakcije prenosa oksidnih grupa sajedne supstance na drugu;

• hidrolaze, katalizuju hidroliti~ke reakcije;

• lijaze, katalizuju razgradnju;

• izomeraze, katalizuju reakcije izomerizacije, tj. intermole-kulsko preure|ivanje;

• ligaze, katalizuju sinteti~ke reakcije.

Osnovne grupe enzima koje se primenjuju u gradnji biosenzoradate su tabeli 10.2.

ENZIM REAKCIJA TIPI^NI SUPSTRAT

OKSIDOREDUKTAZA PROIZVODNJA H2O2 GLUKOZA, FRUKTOZA,ALKOHOL, HOLESTEROL

DEHIDROGENAZA POTRO[NJA NADH ALKOHOL, GLUKOZA,LAKTAT, MALAT,GLUTAMAT, ALDEHIDI

DEAMINAZA PROIZVODNJA NH4− UREA, AMINI, AMINO

KISELINA

Tabela 10.2. Tipi~ni enzimi u gradnji biosenzora

Imenovanje. Pojedini enzimi dobijaju ime koje se sastoji oddva dela: imena supstrata i imena enzimske grupe koji ukazuje naprirodu reakcije. Na primer, enzim koji katalizuje oksidaciju glukozenaziva se glukoz−oksidaza (GOD) i ima molekulsku masu 186000.

Faktori koji uti~u na aktivnost enzima su koncentracijavodonikovih jona, temperatura, vla`nost, jonizujue zra~enje ihemijska delovanja.

Eksperimentalno je utvr|eno da svi enzimi imaju maksimalnuaktivnost pri odre|enoj vrednosti pH supstrata. Veina enzima imapH−optimum u neutralnom ili slabo kiselom podru~ju, sa manje ilivie izraènim maksimumom, sa uìm ili irim intervalom vrednostipH u kome je aktivnost maksimalna (slika 10.9.a).

Sa porastom temperature poveava se kineti~ka energijamolekula, pa se enzimske reakcije ubrzavaju. Poveanje aktivnosti

10. BIOSENZORI 265

enzima ide do odre|enog maksimuma, a sa daljim porastomtemperature (iznad 40 − 50 °C) aktivnost opada zbog denaturacije −promene prirode enzima. Niske temperature, ispod 10 °C, uti~u nasmanjivanje brzine enzimskih reakcija, a ispod 0 °C enzimskaaktivnost u pravilu sasvim prestaje. Proizvo|a~i biosenzorapreporu~uju rad biosenzora u okolini radne temperature 25−30 °C.

Jonizujua zra~enja dezaktiviraju enzim, zavisno od vrste iprimljene doze zra~enja. Istovremeno delovanje jonizujueg zra~enja ismanjenje temperature vee je od sume njihovih parcijalnihdelovanja.

Delovanje vla`nosti je raznoliko jer je ponaanje enzima usuvim i vla`nim uslovima potpuno razli~ito. Mogue je da vlagadeluje razarajue na suvi enzim, ali mogue je i da ga ba vlaga titiod oteenja. U tom smislu potrebno je konsultovati uputstvoproizvo|a~a.

Reagovanje supstrata sa pojedinim komponentama iliproduktima u analitu uti~e na ta~nost merenja. êsta je pojava dapojedini joni u analitu vezuju metal koji se nalazi u molekuluenzima. Ovo ireverzibilno smanjenje aktivnosti ozna~ava se kaotrovanje, inhibicija enzima. Na primer, jon HSO3

− ili SO3− blokira

prakti~no sve enzime (odli~an konzervans). Suprotan efekat imajuaktivatori, komponente analita koje poveavaju aktivnost enzima.

a) b) c)

Slika 10.9. Aktivnost enzima: a) uticaj faktora pH, b) promena koncentracijesupstrata i produkta sa enzimom niske aktivnosti, c) promena koncentracije

supstrata i produkta sa enzimom visoke aktivnosti

Uticaj aktivatora i inhibitora moè se otkloniti poveanjemkoncentracije enzima u aktivnom sloju. Ova pojava moè lako da seobjasni praenjem profila koncentracije supstrata [S] i koncentracijeprodukta [P]. Kada enzim u membranskom sloju koji se nalazi na


povrini transdjusera ima malu aktivnost, tada po~etnakoncentracija supstrata [S]0 postepeno opada kako supstrat difundiraprema transdjuseru a raste koncentracija produkta (slika 10.9.b). Nakontaktnoj povrini sa transdjuserom ove koncentracije imajuvrednost [S]K, odnosno [P]K. U svakoj ta~ki sloja je [S]+[P]=[S]0, a nakontaktnoj povrini koncentracija produkta je uvek manja odpo~etne koncentracije supstrata, [P]K <[S]0, jer sav supstrat nijetransformisan u produkt: [S]K≠0.

Kada aktivni sloj membrane sadrì imobilizirane enzime visokeaktivnosti, tj. poveane koncentracije, tada se supstrat vrlo brzo ucelosti pretvori u produkt na delu sloja ~ija je debljina manja odukupne debljine membrane (slika 10.9.c). Ostatak sloja je „mrtvazona“ za koju je karakteristi~no [S]K=0 i [P]K=[S]0=const, pa inhibitoriili aktivatori u tom delu vie nemaju uticaja. Prema tome,poveanjem koncentracije enzima moè se otkloniti neèljeni uticajinhibitora.

10.3.2. Tehnike imobilizacije enzima10.3.2. Tehnike imobilizacije enzima

Imobilizacija. Enzimi su u prirodnim uslovima, u eliji, nanekoj podlozi i odvojeni me|usobno polupropusnim membranama.Kada su enzimi izdvojeni iz elije ili kada su u pitanju veta~kienzimi, oni se obi~no nalaze u odre|enom rastvoru gde se meaju itako postaju nestabilni. Metode imobilizacije omoguavajurastvorenim enzimima da budu to bliè prirodnim uslovima tako tose njihovi molekuli u~vrste za nerastvorljivu podlogu i zadràvaju uograni~enom prostoru. Podloga treba da je nerastvorljiva, da nereaguje sa analitom, da je temperaturno stabilna i mehani~kiizdr`ljiva. Podloga i metoda imobilizacije biraju se u zavisnosti odkarakteristika enzima.

Smatra se da je kriti~na ta~ka u gradnji biosenzora proizvodnjadovoljno ~vrste membranske podloge sa imobiliziranim enzimom injena adhezija na povrinu transdjusera.

Fizi~ka adsorpcija je reverzibilno vezivanje enzima za ~vrstepodloge kao to su staklo, kvarc, kaolinit, silika−gel, karbonska pastaod ugljene praine i dr. (slika 10.10.a). Ovom metodom dobijaju serelativno slabe veze izme|u enzima i podloge.

Fizi~ko uklapanje (physical entrapment) velikih molekulaenzima u poliakrilamidne gelove onemoguava njihovu difuziju urastvor, ali zato mali molekuli supstrata lako dolaze do enzima (slika

10. BIOSENZORI 267

10.10.b). Prvi put ovaj metod je primenjen u gradnji enzimskeelektrode: u tanki sloj poliakrilamidnog gela stavljen je enzimglukoz−oksidaza i onda ovako pripremljen sloj pri~vren za plasti~numembranu kiseoni~ne elektrode.

a) b) c)Slika 10.10. Imobilizacija enzima: a) adsorpcija, b) uklapanje, c) kovalentno

vezivanje

Metoda fizi~kog uklapanja je relativno jednostavna: rastvorenzima i rastvor monomera dobro se izmeaju da se dobijeravnomeran koagulat, zatim se izvri polimerizacija u prisustvuodre|enog rastvora za umreàvanje i na kraju se obave filtracija isuenje. Prakti~ni problemi u primeni ove metode javljaju se zbogreakcije enzima sa organskim rastvara~em ili koagulatorompolimera, pa enzim menja svoju prirodu ili aktivnost. U tom smislurazvijene su razli~ite modifikacije metode. Na primer, mnogo boljirezultati dobijaju se pomou celuloznog triacetata 3−7% koji sepotopi u rastvor odgovarajueg polimera. Kao rastvara~ primenjujuse mravlja kiselina i voda u omeru 90:10. Polimerski rastvor se zatimizdvoji na staklenu podlogu i izvri koagulacija potapanjem u vodi nasobnoj temperaturi. Tako formirana èlatinasta membrana debljine200−500 µm odvaja se od stakla i potapa u vodeni rastvor odgovara-jueg enzima na temperaturi od 5 °C. U toku 48 h enzim difundira umembranu, a onda se vri brzo suenje u vakuumu. Osuenamembrana se pre upotrebe opere rastvorom fosfata da bi seodstranili molekuli enzima adsorbovani na povrini, tj. molekuli kojise nisu uklopili u strukturu membrane.

Interesantna modifikacija fizi~kog uklapanja je inkapsulacija.To je postupak kojim se mikroskopska kapljica rastvorenog enzimaoklapa tankom polupropusnom membranom u organskom rastva-


ru~u. Mikrokapsule se mogu povezivati me|usobno ili za podlogutako da se dobije potrebna mreàsta struktura.

Popre~no spajanje je proces u kome se pomou bifunkci-onalnog ili viefunkcionalnog agensa stvara veza izme|u istih ilirazli~itih enzima i proteina, tako da se dobija netopljivi spoj znatnovee molekulske mase.

Najpoznatiji dvofunkcionalni agens je glutaraldehid pomoukojeg se mogu imobilizirati mnogi enzimi i proteini. GlutaraldehidOCH−(CH2)3−CHO ima na svojim krajevima dve aldehidne grupeCHO koje reaguju sa amino grupom NH2 enzima E ili proteina P.Rezultat reakcije su derivati analogni [ifovim (Schiff) bazama:

E NH2 + OCH−(CH2)3−CHO + H2N P (10.3)

E N=CH−(CH2)3−CHO=N P (10.4)

Kovalentna imobilizacija enzima je hemijska metodavezivanja enzima za ~vrstu polimersku podlogu (slika 10.10.c). Prvose elektrohemijskim postupkom deponuje sloj provodnog polimera,naj~ee polipirola. Ovaj polimer se posredstvom odabranog agensamodifikuje tako da stvara stabilne kovalentne veze sa enzimom, nasli~an na~in kao to se stvaraju popre~ne veze izme|u enzima.

Elektromagnetska imobilizacija enzima na ~vrstu podlogutransdjusera vri se pomou elektromagnetskog polja. Magnetske~estice koje nose, na primer, enzim glukoz−oksidazu imobiliziraju sena membrani kiseoni~ne elektrode primenom elektromagnetskogpolja odre|ene ja~ine. Polje se generie u solenoidu ~ija se strujaregulie tako da se dobije homogena distribucija magnetskih ~esticana povrini membrane. Homogenizacija je zavrena ~im prestanehaoti~no kretanje ~estica, tj. ~im se stabilizuju magnetske veze.Fizi~ko uklapanje enzima pomou elektromagnetskog polja imazna~ajne prednosti jer se isklju~ivanjem polja enzim odvaja i na iste~estice kao nosioce vezuje se drugi enzim.

10.3.3. Principi rada10.3.3. Principi rada

Enzimski senzor je kombinacija transdjusera i enzimskogsloja prilago|enog za merenje koncentracije odre|enog supstrata

10. BIOSENZORI 269

Enzimska reakcija transformie supstrat u produkt: S+E↔ES→→P+E, koji se detektuje pomou odgovarajueg transdjusera. Uskladu sa ovom definicijom struktura i rad enzimskog senzora uoptem slu~aju ematski se moè predstaviti kao na slici 10.11.a,b.

Inhibicija enzima. U irem smislu definicija enzimskogsenzora podrazumeva da se moè meriti koncentracija bilo kojesupstance koja uti~e na brzinu enzimske reakcije. Ovo se posebnoodnosi na inhibitore, supstance koje ko~e enzimsku aktivnost. Na~indelovanja inhibitora bitan je za rad senzora.

Slika 10.11. Princip rada enzimskog senzora: a) ema, b) osnovna, noninhibi-cijska enzimska reakcija, c) kompetitivna inhibicija, d) nekompetitivna

inhibicija, e) nonkompetitivna inhibicija

Kompetitivna (konkurentna) inhibicija ozna~ava da inhibitor Ireaguje sa aktivnim centrom enzima E u konkurenciji sa supstratomS, to se moè predstaviti ematski kao na slici 10.11.c, odnosnozapisati na sledei na~in:

EI

I

PEESSE

↓

++→↔+

(10.5)


U ovoj konkurenciji preovla|uje S ili I, zavisno od toga ~ija jekoncentracija vea. Me|utim, kada je [S]>>[I], tada je ~esto [S] poapsolutnoj vrednosti suvie veliko, pa se postavlja pitanje merenjamalih koncentracija supstrata.

Nekompetitivna inhibicija se javlja kada inhibitor ne reaguje sasupstratom S ve sa kompleksom ES, kao to je predstavljeno na slici10.11.d, odnosno zapisano u obliku:

ESI

I

PEESSE

↓

++→↔+

(10.6)

Nekompetitivna (nekonkurentna) inhibicija deluje slabo primalim koncentracijama supstrata jer je tada i koncentracijakompleksa ES mala. Kada je [S] vee, tada je i [ES] vee, pa jedelovanje I izrazitije.

Nonkompetitivna inhibicija se javlja kada izme|u I i S nemakonkurencije u reakciji sa E, pa je delovanje nekonkurentnoginhibitora pribli`no isto i za male i za velike koncentracije [S]. Ovo jepredstavljeno na slici 10.11.e, odnosno zapisuje se u obliku:

ESI

I

PEESSE

↓

++→↔+

(10.7)

10.3.4. Potenciometrijski enzimski senzori10.3.4. Potenciometrijski enzimski senzori

Enzimska elektroda je biosenzor koji je napravljen odelektrohemijskog senzora (transdjusera) na kome se nalazibioreceptorski sloj sa imobiliziranim enzimom. Reakcija supstrata ienzima stvara produkt koji se meri potenciometrijskom iliamperometrijskom metodom.

Potenciometrijska metoda se zasniva na merenju razlikepotencijala izme|u radne i referentne elektrode, pri ~emu je tarazlika u funkciji merene koncentracije odre|enog supstrata. Ta~nije,ta razlika je proporcionalna logaritmu koncentracije − saglasnoNernstovom zakonu. Potenciometrijski biosenzori primenjuju se za

10. BIOSENZORI 271

merenje koncentracije sledeih organskih jedinjenja: uree, glukoze,amino−kiselina, glutaminata (miina belan~evina), malata (sojabukove kiseline), tirosina (proizvod tiroidne `lezde), penicilina,adenosina (proizvod odre|enih `lezda prilikom upale), acetilholina(neurotransmiter), tekih metala (kobalt, srebro, ìva)hidrogen−peroksida i razli~itih otrovnih reagenasa.

Konstrukcija svih potenciometrijskih enzimskih senzorasli~na je senzoru uree koji e detaljno biti razmotren. Sutina je da seza dati analit odabere najpovoljniji materijal za izradu membrane, dase u membrani imobilizira enzim koji e da podràva reakciju toganalita, te da se tako pripremljena enzimska membrana aplicira navrh potenciometrijske elektrode. Koja e to elektroda biti zavisi odprodukta kataliti~ke reakcije koji se prati, a ~ija je koncentracijaproporcionalna analitu. Naj~ei produkti reakcije su kiseline, ~ije sekoncentracije mere pH−elektrodom ili gasovi CO2, NH3, NH4 i H2O2,~ije se koncentracije mere elektrodama

2COp ,3NHp ,

4NHp i Fp .

Potenciometrijski senzor uree jedan je od prvih enzimskihsenzora uopte. Urea je mokrana kiselina O=C(NH2)2 koja nastajekao metaboli~ki proizvod azotnih jedinjenja. Ova kiselina i njene solisu nerastvorljive u vodi, a nalaze se u krvi i mokrai. U medicini jemjerenje koncentracije uree veoma va`no jer se time indicirataloènje njenih soli u obliku kamenca u bubrezima ili na zidovimakrvnih sudova.

Urea se pomou enzima ureaze raspada na CO2 i NH3:

32ureaza

222 NHCOOH)NH(CO + →+= . (10.8)

Aktivna oblast enzima je pH≈7, tako da produkti enzimskereakcije (10.8) disosuju:

++↔+ HHCOOHCO -322 (10.9)

−+ +↔+ OHNHOHNH 423 , (10.10)

odakle proizilazi da se koncentracija uree moè odrediti pomoupotenciometrijskih gasnih elektroda,

2COp , 3NHp , pH ili

2Op .

Na primeru biosenzora uree moè se uo~iti da u reakcijiu~estvuje uvek isti enzim (ureaza) ali da ima vie razli~itihprodukata, pa je mogunost izbora elektrode vea.


Potenciometrijski senzor uree sa enzimskom CO2-elektrodom je kombinacija bioreceptorskog sloja sa imobiliziranomureazom i Klarkove, odnosno Soveringhausove CO2−elektrode (slika10.12.a). CO2−elektroda se zasniva na svojstvu ugljendioksida CO2 daformira ugljenu kiselinu H2CO3 koja disosuje: CO2+H2O↔H2CO3↔↔HCO3

−+H+, tako da je u ravnote`nom stanju parcijalni pritisak

2COp proporcionalan koncentraciji H+, odnosno pH−faktoru. Kada se

elektroda prekrije enzimskim slojem, CO2 koji je nastao u enzimskojreakciji difundira kroz hidrofobnu membranu od veta~ke gume iliteflona, gde zatim disosuje u internom (pufer) rastvoru NaHCO3.Rezultujua promena pH detektuje se pomou staklene elektrode.Stati~ka karakteristika

2Op utvr|uje se kalibracijom − njen linearni

deo je u oblasti 3⋅10−4−10−2 M uree. Na slici 10.12.b vidi se da pove-anje koncentracije imobilizirane ureaze doprinosi veoj osetljivostienzimske elektrode.

a) b)

Slika 10.12. Enzimska pCO2-elektroda: a) konstrukcija, b) stati~kakarakteristika, sa koncentracijom enzima kao parametrom

Potenciometrijski senzor uree sa enzimskom NH3-elektrodom. Elektroda za merenje

3NHp istovetna je po konstrukciji

sa CO2−elektrodom, s tim to se umesto NaHCO3 kao interni rastvorupotrebljava NH4Cl. Ureaza je ovde vezana direktno za hidrofobnumembranu pomou glutaraldehida ~ime se smanjuje vreme odziva do1,5 min.

Potenciometrijski senzor uree sa enzimskom pH-elektrodom. Na vrh klasi~ne staklene pH−elektrode osetljive najone H+ stavlja se gel od poliakrilamidnog polimera ilimetaakrilamid−poliakrilamidnog kopolimera (slika 10.13.a).Upotrebljavaju se i metalne, antimonske elektrode, koje su poznate

10. BIOSENZORI 273

po malim dimenzijama, sa vrhom na kome se nalazi membrana saimobiliziranom ureazom (slika 10.13.b). Za ovu namenu tako|e seprimenjuju mikroelektrode za merenje pH napravljene u tehnicitankog filma.

Potenciometrijski senzor uree sa enzimskom NH4-elektrodom. Ureaza je imobilizirana fizi~kim uklapanjem upoliakrilamidni gel koji se u tankom sloju stavlja na vrh staklenejon−selektivne elektrode osetljive na jone NH4

−. Kod ovakvihelektroda mogu je uticaj jednovalentnih jona H+, K+ i Na+ nata~nost, te se stoga posebna pa`nja posveuje izboru internograstvora.

Na kraju, u vezi sa potenciometrijskim senzorima eree moè seistai da gasne elektrode

2COp i 3NHp omoguavaju direktno merenje

koncentracije uree zahvaljujui hidrofobnoj membrani koja jepropustljiva samo za te gasove, za razliku od staklenih elektroda pHi

4NHp koje su osetljive na uticaj jednovalentnih jona.

Slika 10.13. Potenciometrijski senzor uree: a) konstrukcija sa pH-elektrodom, b)konstrukcija sa metalnom elektrodom

Potenciometrijski biosenzor tekih metala. Prisustvotekih metala M dovodi do izdvajanja proteina iz enzima E i njegovedenaturacije. Pri malim koncentracijama ovi metali vezuju se uenzimu za karbolne grupe =C=O ili tiolne grupe −SH i na taj na~insmanjuju aktivnost enzima, tj. deluju kao inhibitori. Na primer,stvaranje kompleksa prilikom vezivanja metala za tiolnu grupu moèse prikazati kao reakcija:

E−SH + M+↔ E−SM +H+, (10.11)


odakle se vidi da je fiksiranje tekog metala u funkciji pH.

Na slici 10.14.a prikazan je vremenski odziv sa imobiliziranomureazom. Senzor je najpre potopljen u rastvor bez prisustva tekihmetala, tj. kada je koncentracija inhibitora nula: [I]=0. Zatim jeelektroda redom potapana u rastvor sa odre|enom koncentracijom[Co2+], [Ag+] i [Hg2+]. Vreme odziva je relativno brzo, 1−2min, ali jevreme deaktivacije (regeneracije) enzima veoma sporo. Zato se poslesvakog merenja senzor potapa u rastvor specifi~nog deaktivatora − uovom slu~aju to su KI, (NH4)2S i etilen−diamin−tetraacetatna kiselina(EDTA). Nakon regeneracije enzima senzor je spreman za novomerenje. Treba primetiti da senzor daje sumarni odziv kada je urastvoru istovremeno prisutno vie tekih metala.

a) b)

Slika 10.14. Karakteristike potenciometrijskih biosenzora: a) vremenski odziv na tekemetale, b) stati~ke karakteristike za tri pesticida

Potenciometrijski biosenzori pesticida. Pesticidi susinteti~ka hemijska sredstva kojima se unitavaju biljne i ìvotinjsketeto~ine. Primena pesticida, naro~ito onih koji sadrè fosfatnajedinjenja, ima i velikih nedostataka jer deluju otrovno na ljude iìvotinje. Organofosforna jedinjenja reaguju kao inhibitori na enzimacetilholinesterazu (AChE) ili butirilholinesterazu (BuChE) iformiraju kompleks fosforil−enzim, pa je promena faktora pH merakoncentracije pesticida.

Jedan te isti senzor moè da meri prisustvo razli~itih pesticida,a za svaki se utvr|uje odgovarajua ba`darna karakteristika (slika10.14.b). Karakteristika je prikazana u procentima inhibicije: veakoncentracija pesticida vie inhibira enzim i smanjuje izlazni napon.

10. BIOSENZORI 275

Deaktivacija enzima je spora, sli~no kao i kod senzora kojima seprati prisustvo tekih metala, pa se primenjuju posebni regeneratori.Iz tih razloga automatski sistemi koji analiziraju koncentracijupesticida u otpadnim vodama ili u zemljitu u sutini radediskontinuirano. Tako|e, senzor daje sumarni izlaz kada je prisutnovie razli~itih pesticida.

Na sli~an na~in rade i potenciometrijski biosenzori koji mereukupnu koncentraciju toksi~nih reagenasa. Izlaz senzora predstavljasumarni efekat reagenasa na jedan te isti enzim, na primer AChE,imobiliziran u membrani senzora.

10.3.5. Amperometrijski enzimski senzori10.3.5. Amperometrijski enzimski senzori

Amperometrijska metoda zasniva se na merenju ja~inestruje u elektrohemijskoj eliji (transdjuseru) pri konstantnomnaponu napajanja, pri ~emu je ja~ina struje proporcionalnakoncentraciji elektroaktivnih ~estica oksidovanih ili redukovanih naradnoj elektrodi. Druga elektroda je referentna.

Kada se na vrh elektrohemijske elije stavi enzimskamembrana, dobija se amperometrijski biosenzor. Za njih jekarakteristi~no da postoji potronja produkta kataliti~ke reakcije.Produkt P se kree difuzijom prema povrini elektrode gde je [P]=0,kada je struja izme|u dveju elektroda najvea, tj. osetljivost merenjamaksimalna. Difuzija, protok produkta moè se ograni~itipolupropusnom membranom ili delovanjem enzima. U prvom slu~ajuslabo propusna membrana omoguava merenje visokih koncentracija,odnosno jako propusna membrana omoguava merenje slabihkoncentracija. U drugom slu~aju membrana moè biti izrazitopropusna, ali je difuzija ograni~ena kataliti~kom reakcijom uenzimskom sloju.

Amperometrijsko merenje podrazumeva da je supstratelektroaktivan, tj. da moè da oksiduje ili da redukuje. Osnovnafunkcija enzima E je da omogui da se elektrohemijski neaktivansupstrat S transformie u aktivni produkt P:

,i QnePEPSEES ↔±+→↔+ − ,i QnePEPSEES ↔±+→↔+ − (10.12)

U redoks reakciji znak + ozna~ava redukciju, a − oksidacijuprodukta. Broj elektrona n uklju~enih u redoks−proces predstavljapromenu stanja od vrednosti u stacionarnom stanju, koja je rezultat


provodnosti produkta u tom stanju i priklju~enog napona izme|uradne i referentne elektrode. Ova promena direktno je proporci-onalna koli~ini disosovanih ~estica produkta na povrini radneelektrode. Konstanta proporcionalnosti odre|uje se kalibracijom. Dabi se o~uvala neutralnost produkta, o~igledno je da predavanjeelektrona na jednoj elektrodi (redukcija) mora biti praenoprimanjem elektrona (oksidacijom) na drugoj elektrodi.

Enzim moè biti imobiliziran u membrani, sli~no kao kodpotenciometrijskih senzora, ili direktno na povrini elektrode gdedeluje kao „elektrokatalizator“ koji omoguava razmenu elektrona napoluprovodni~koj elektrodi.

Amperometrijski biosen-zor glukoze je genere~ki senzorovog tipa. Ima veliku primenu umedicini pri odre|ivanju nivoaeera u krvi pacijenata. EnzimGOD, glukoz−oksidaza, je imobilizi-ran na povrini elektrode u akril-amidnom gelu debljine 25−50 µm.Njegova namena je da kataliti~kipodràva oksidaciju glukoze uglukonsku kiselinu i vodonik−

−peroksid H2O2 (slika 10.15):

Koncentracija glukoze moè da se meri:

• amperometrijski, praenjem potronje kiseonika koja jeproporcionalna brzini enzimske reakcije ili praenjem kon-centracije vodonik−peroksida (H2O2);

• potenciometrijski, praenjem glukozne kiseline kao produkta~ija prisutnost funkcija pH.

Amperometrijski senzor glukoze sa pO2-elektrodom.Kiseonik u enzimskom sloju je neutralan, a ne u jonizovanom obliku.Me|utim, pri konstantnom potencijalu koji je jednak redukcionompotencijalu od 600 mV/SCE (u odnosu na standardnu kalomelovuelektrodu) deava se reakcija

OHOglukoza 22 22OH kiselinaglukonskaGOD (10.13)

10. BIOSENZORI 277

−→++ OH44eO2HO -22 , (10.14)

koja omoguava da se parcijalni pritisak kiseonika prati kao funkcijastruje u vanjskom kolu.

a) b)

Slika 10.16. Amperometrijski biosenzor glukoze sa pO2-elektrodom: a) igli~astakonstrukcija, b) kalibracione krive

Za merenje parcijalnog pritiska kiseonika primenjuju seminijaturne elektrode

2Op , Klarkove elektrode sa Pt−katodom i

Ag/AgCl−anodom (slika 10.16.a). Na dnu se nalazi membrana saimobiliziranim enzimom GOD. Hidrofobna membrana proputakiseonik i zadràva sve druge elektroaktivne ~estice spre~avajuinjihov uticaj na elektrodni potencijal. Elektrodni potencijal na katodiredukuje kiseonik i koncentracija kiseonika unutar elije pada. Savanjske strane membrane, u analitu, parcijalni pritisak kiseonika jekonstantan, pa se uspostavlja gradijent koji podràva tok kiseonikaprema katodi. Taj tok proporcionalan je gradijentu, odnosnokoncentraciji kiseonika u analitu. Tok ima malu vrednost jer jeograni~en difuzionim procesom, pa je stoga i vremenska konstantamerenja relativno velika − oko jedne minute.

Imobilizacijom glukoz−oksidaze u membrani jedan deokiseonika se troi u enzimskoj reakciji oksidacije glukoze, a drugi deodifundira kroz membranu do katode gde se redukuje. Kako jepovrina katode mala, moè se zaklju~iti da se kiseonik najvie troiu enzimskoj reakciji. Brzina ove reakcije je funkcija koncentracije, tj.parcijalnog pritiska kiseonika i zato od njegove po~etne vrednosti uanalitu zavisi odziv senzora. Time se ujedno objanjava pojava da se


poveava detekcija glukoze sa poveanjem parcijalnog pritiskakiseonika (slika 10.16.b).

Ograni~avanje potronje kiseonika. Za pravilno merenje bilo bineophodno da se osigura konstantna vrednost parcijalnog pritiskauzimanjem uzorka vee zapremine. To ~esto nije mogue, pa seograni~avanje prekomerne potronje kiseonika, tj. odràvanjekonstantne vrednosti njegovog parcijalnog pritiska, naj~ee postièistovremenom imobilizacijom dva enzima: glukoz−oksidaze i katalaze.Kataliti~ka reakcija glukoze tada je:

22katalaza

22

22GOD

22

1/2OOHOH

OH kiselina glukonska OHOglukoza

+ →

+ →++

(10.15)

Da bi se spre~ilo prekomerno oduzimanje kiseonika u analitu,Pt−katoda pravi se od ìce pre~nika 10−25 µm. Enzimska dekompo-zicija vodonik−peroksida vraa polovinu kiseonika nazad u analit, paje njegova potronja tako dvaput manja. Dobra strana primenekatalaze nije samo smanjenje potronje kiseonika ve i potpunaeliminacija H2O2 koji postepenodegradira GOD.

Diferencijalni spoj. Da bi izlazsenzora glukoze zavisio samo od pot-ronje kiseonika usled enzimske reak-cije, a ne i od elektrohemijske reakcijekiseonika na katodi, primenjuje sediferencijalni spoj dveju jednakih

2Op −elektroda, s tim da je u membrani

jedne imobiliziran enzim a druga je bezenzima (slika 10.17. Kada bi obeelektrode bile bez enzima, njihovi izlazibili bi jednaki: i1=i2. Zbog prisustvaglukoze dolazi do enzimske reakcije naaktivnoj elektrodi, pa je koli~inakiseonika koja stiè do njene katodemanja:

( ) 2E1 iiii −−=∆ , (10.16)

10. BIOSENZORI 279

tj. izlaz zavisi samo od potronje kiseonika usled enzimske reakcijekoja je proporcionalna koncentraciji glukoze. Princip diferencijalnogmerenja sa uspehom se primenjuje kod merenja razli~itih supstrata.

Senzor glukoze sa merenjem koncentracije H2O2 zasnivase na elektrodi koja ima sli~nu konstrukciju kao

2Op −elektroda

prikazana na slici 10.16.a. Razlika je to se umesto hidrofobnemembrane koristi hidrofilna koja proputa H2O2 do Pt−elektrode nakojoj H2O2 elektrohemijski oksiduje:

−+ ++↔ e2H2OOH 222 . (10.17)

Ovde je Pt anoda jer se nalazi na pozitivnom potencijalu+0,6V/SCE u odnosu na standardnu kalomelovu elektrodu.

Poseban problem kod merenja koncentracije glukoze na osnovuH2O2 je osetljivost na kiseonik koji je rezultat enzimske reakcije, ali idegradirajue delovanje H2O2 na enzim GOD.

Direktna oksidacija oksidaze −− primena kofaktora. Jedanod na~ina eliminacije uticaja kiseonika na ta~nost merenja jeupotreba kofaktora, kao to je FAD (flavin−adenalindinukleoid), kojise vezuje za aktivni centar enzima GOD. Posle oksidacije FADegzistira u redukovanom obliku FADH2 i vraa se ponovo uoksidovani oblik FAD u prisustvu kiseonika:

)GOD(FADH kiselina

glukonskaGOD(FAD)glukoza 2+→+ (10.18)

(10.19)

Koncentracija glukoze proporcionalna je samo glukonskojkiselini, tj. faktoru pH, jer je zavisnost od O2 eliminisana zahvaljujuireoksidaciji FADH2.

Direktna oksidacija oksidaze −− primena medijatora. Uamperometrijskom na~inu rada elektron kofaktora prenosi se naelektrodu ako je enzim rastvorljiv. Tada kofaktor, na primer FAD,moè da ostvari kontakt sa elektrodom. Me|utim, kako je kofaktorvezan za aktivni deo imobiliziranog enzima, naj~ee je potrebanmost za prenos naelektrisanja − mobilni medijator. Medijator M jemolekul manje molekulske teìne od enzima i zato moè u

( ) ( ) .2222 OHFADGODOFADHGOD +→+


oksidovanom obliku Moks da prodre u unutranjost enzima gde mukofaktor predaje elektron i redukuje ga u oblik Mred. Medijator Mred

prenosi ovo naelektrisanje do elektrode i poprima ponovo oblik Moks.Ove dve reakcije zapisuju se na sledei na~in:

( ) ( ) oksoks2 MH2FADGODM2FADHGOD ++→+ + (10.20)

−+ → eanoda 2MM oksred . (10.21)

Kao to je poznato, za prenos elektrona naj~ee se koristikiseonik. Me|utim, zbog varijacija parcijalnog pritiska kiseonika uanalitu moè doi do greaka u merenju koncentracije glukoze ukrvi. Koncentracija glukoze u krvi zdravog ~oveka je 4−6 mM, alimoè da bude i vea od 30 mM. S druge strane, parcijalni pritisakkiseonika u krvi je oko 2,2 mM i nedovoljan je da oksiduje svuglukozu u krvi. Pomou medijatora ovi problemi uspeno se reavaju.Tipi~ni medijatori su heksacijanoferat(III), derivati kvinona, derivatiferocena i fenacinijum joni. Oksidovani oblik ferocena je ferocinijumjon.

Direktna oksidacija oksidaze na elektrodi. Primenamedijatora kao akceptora je relativno jednostavna, ali postojezna~ajna ograni~enja jer medijatori deluju toksi~no na enzim i lakoprelaze u analit poto nisu fiksirani za membranu. Danas se mnogoeksperimentie sa direktnim prenosom elektrona sa enzima naelektrodu. Sutina je da se u enzimsku membranu stavljaju provodnesoli donorsko / akceptorskog tipa kao to je TFT/TCNQ

a) b)

Slika 10.18. Direktna oksidacija enzima GOD: a) joni TTF-/TCNQ+, b)konstrukcija elektrode

10. BIOSENZORI 281

(tetratijafulvalinijum/tetracijanokvinodimetanoid). To su jedvarastvorljive soli, ali dovoljno da se uspostavi posredovanje u prenosunaelektrisanja (slika 10.18.a).

Amperometrijski senzor glukoze pravi se od paste TTF/TCNQ iPVC sa dodatkom organskog rastvara~a THF (tetrahidrofuran), kojase deponuje na Pt−elektrodu u obliku diska (slika 10.18.b). Ovakopripremljen senzor potapa se u rastvor GOD i drì izvesno vreme dokse ne postigne imobilizacija. Posle evaporacije organskog rastvara~a,na vrhu senzora dobija se tanka jon−osetljiva membrana.

Mikroglukozni senzori u tehnici tankog sloja prave se kaokombinacija amperometrijskog H2O2 transdjusera i membrane saimobiliziranim enzimom. Po~etna osnova je standardni Si−vaferdebljine 300 µm i otpornosti 5Ω (slika 10.19.a). Oksidacijom natemperaturi 1000 °C u atmosferi suvog kiseonika na njemu seformira izolacioni sloj SiO2 debljine 1 µm. Postoksidaciono u~vri-vanje SiO2 provodi se na temperaturi 1000 °C u atmosferi azota utrajanju od 10 min. Zatim se deponuje pasivni sloj silicijum−nitrida(Si3N4) debljine 0,1 µm ~ija je namena da titi osnovu od hemijskogprocesa kojim se nanose Au−kontakti. Radi poboljanja adhezijeelektroda za podlogu prvo se na temperaturi od 250 °C u vakuumskojkomori deponuje sloj hroma ili titanijuma debljine 20 nm, pa tekonda sloj zlata debljine 60 nm. Ovako tanke Cr−Au elektrodepodlo`ne su delaminaciji i prekomernom zagrevanju usled Dùlovogefekta, pa se zato deponuju neto deblje elektrode: oko 1 µm. @eljenioblik elektroda postiè se litografskim postupkom, nagrizanjempomou rastvora KI/I2 (KI:I2:H2O=20:5:22). Izme|u elektrodadeponuje se sloj negativnog fotorezista Ta2O5 koji podràva razmenuelektrona sa vodonikom.

Opisana struktura radi kao senzor H2O2. Zaista, na eksperi-mentalno odre|enom cikli~nom voltamogramu uo~ava se da zapriklju~eni napon od 1,1 V izlaz raste i dostiè stacionarnu vrednostod 0,3 µA, pribli`no za jedan minut.

Nakon to se Au−kontakti o~iste acetonom od tragovafotorezista, nanosi se tanki sloj polimera. Polimer se formiraelektrohemijskom polimerizacijom, tj. cikli~nom promenom naponaizme|u elektroda, na primer od −0,2 V do +0,8 V. Tipi~ni polimeri supolianilin i polipirol. Ovako pripremljen senzor H2O2 sa formiranom


membranom potapa se u rastvor enzima GOD. Enzim se imobiliziraelektrohemijski cikli~nom promenom napona ili se nakon odre|enogvremena senzor vadi iz rastvora i sui.

a) (b)

Slika 10.19. Tehnologija tankog filma: a) transdjuser H2O2 za senzor glukoze,b) senzorski niz

Na slici 10.19.b prikazan je biosenzor za istovremeno merenjekoncentracije glukoze, uree i triglicerida. Sva tri senzora napravljenasu tehnikom tankih slojeva, na sli~an na~in kao to je detaljnoobjanjeno za senzor glukoze. Elektrode su interdigitalne („~ealj u~ealj“). êtvrti senzor sluì kao referentna elektroda. Ukupnedimenzije ovog multisenzora su 7×5mm.

10.4.10.4. SENZORI SASENZORI SAELEKTROLITI^KIM GEJTOMELEKTROLITI^KIM GEJTOM

10.4.1.10.4.1. Princip radaPrincip rada

Strukture EOS. Ako se metalni gejt MOS−komponenteizostavi i omogui kontakt sa elektrolitom, dobijaju se senzori sastrukturom elektrolit−oksid−poluprovodnik (EOS). Oksid je naj~eeSiO2 i sluì kao izolator izme|u elektrolita i poluprovodnika.

10. BIOSENZORI 283

Prema debljini oksidnog sloja razlikuju se strukture EIS(d>5 nm) i EiS (d<5 nm). Naelektrisanje jona na kontaktuelektrolit−oksid deluje na elektri~ne karakteristike poluprovodnika.Mogue je da se oksid sasvim izostavi i tada je poluprovodnik udirektnom kontaktu sa elektrolitom (d=0), odnosno dobija se senzorsa strukturom ES.

Izme|u elektrolita i oksida dodaje se jon−osetljivi sloj na komeu zavisnosti od koncentracije odre|enih jona u elektrolitu nastajepotencijal koji uti~e na elektri~no polje u poluprovodniku. Uglavnomse radi o jonima vodonika H+, kalijuma K+ i natrijuma Na+, odnosnore~ je o merenju pH, pK ili pNa. Razvijeni su i slojevi osetljivi na jonesloènih organskih spojeva.

Potencijal jon-selektivnog sloja meri se u kombinaciji saelektronskim komponentama na bazi efekta polja. Tako su nastalisenzori ISFET (ion sensitive FET), kondenzator EISCAP ili ICD (ioncontrolled diode) i dr.

Standardni tranzistor sa efektom polja (FET, field−effecttransistor) napravljen je na supstratu p−Si tako da na gornjoj straniima dve zone sa ja~e dopiranim poluprovodnikom n+−tipa. Ove dvezone ozna~avaju se sa sors (S, source) i drejn (D, drain). Struktura jeprekrivena izolacionim slojem SiO2 na kome je naparivanjem nanetatankoslojna alumijumska elektroda koja se ozna~ava sa gejt (G, gate).Gejt je deponovan na povrini izme|u sorsa i drejna. Preko sorsa idrejna tako|e su napareni metalni kontakti (slika 10.20.a). Na tajna~in gejt i poluprovodni~ki supstrat sa izolatorom izme|u njihformiraju kondenzator sa upravljivom kapacitivnou. Zato se ovajtip tranzistora FET ozna~ava kao MOSFET (metal−oxide−−semiconductor FET) ili IGFET (isolated gate FET).

Supstrat i sors su spojeni na masu, a gejt−sors i drejn−sorsnaponi ozna~eni su sa VG i VD. Kada se na gejt priklju~i pozitivninapon VG u odnosu na sors, elektroni koji su manjinski nosiocinaelektrisanja u supstratu bivaju privu~eni prema granici saizolatorom gde postaju veinski nosioci. Ova inverzija tipapoluprovodnika izme|u sorsa i drejna manifestuje se u jednoj uskojzoni, n−kanalu. Napon VG svojim poljem deluje na irinu kanala imenja njegovu provodnost upravljajui tako strujom kroz tranzistor


ID. MOSFET moè da se pravi i na osnovi od n−Si − tada su sors idrejn p+−tipa a kanal p−tipa.

a) b)

Slika 10.20. MOSFET: a) struktura, b) stati~ke karakteristike

Izlazna struja. Osnova za uspostavljanje zavisnosti izme|ustruje ID i napona VG i VD je prora~un gustine pokretnih elektronakao prenosilaca naelektrisanja u n−kanalu. U nezasienom podru~ju(VD<VG−VT, ili alternativno: VG>VD+VT) struja se opisuje jedna~inomoblika:

( )

−−µ= 2

DDTGOXD V21

VVVLW

CI , (10.22)

gde je µ pokretljivost elektrona u kanalu, COX kapacitivnostizolatora (oksida) po jedinici povrine, W/L odnos irine i duìnekanala, a VT napon praga (threshold voltage) koji je funkcijanapona izravnavanja VFB (flat−band voltage), naelektrisanja QB ukanalu i razlike potencijala ϕF u Fermijevim nivoima dopiranog i~istog silicijuma:

FOX

BFBT 2

CQ

VV ϕ+−= . (10.23)

U zasienom podru~ju (VD>VG−VT, ili alternativno: VG<VD+VT)struja ostaje konstantna i ima vrednost:

( )2TGOXD VV

L

WC

2

1I −µ= . (10.24)

10. BIOSENZORI 285

Zasieno i nezasieno podru~je tranzistora MOSFET (IGFET)prikazani su na na slici 10.20.b u funkciji parametra VG koji sesukcesivno poveava za 1V po~ev od VG=VT+1 do VG=VT+4 .

MOSFET kao senzor moè da se upotrebi na razli~ite na~ineza merenje koncentracije, zavisno od toga koji se parametar ujedna~ini (10.22) ili u (10.23) menja. Takvi senzori ozna~avaju se kaoCHEMFET, hemijski osetljivi FET−ovi.

Kada se preko oksida stavi jon−selektivni sloj, dobija se ISFET,a kada je u tom sloju enzim kao katalizator dobija se ENFET,enzimski FET. Karakteristi~no je da ovi senzori imaju odvojen gejtod oksidnog sloja tako da je omoguen kontakt sa elektrolitom. Iz tihrazloga elektronsko kolo na slici 10.20.a mora biti zatvoreno pomoureferentne elektrode.

Opta strukturna ema senzora sa elektroliti~kim gejtom moèse predstaviti sledeom principijelnom emom (slika 10.21):

Slika 10.21. Principijelna ema selektivnog EOS senzora

Metalni kontakt referentne elektrode moè da se tretira kaogejt kod standardnog MOSFET−a, odnosno jedna~ine (10.22)−(10.24)mogu se upotrebiti za opisivanje rada CHEMFET senzora. Ipak, zata~niji prora~un treba uneti izvesne modifikacije jer napon izravna-vanja VFB zavisi od potencijala ϕ0 koji nastaje na kontaktu elektrolitai oksida a menja se saglasno Nernstovoj jedna~ini.

10.4.2. ISFET sa klasi~nom membranom10.4.2. ISFET sa klasi~nom membranom

Klasi~na mebrana. Od 1970. kada je prvi put napravljen,nastale su mnogobrojne varijacije ISFET−a koje se razlikuju prematipu jon−selektivnog sloja. Jon−selektivni sloj u najprostijem slu~ajupravi se kao membrana, kompaktni tankoslojni prekriva~ preko SiO2

izolatora (slika 10.22.a). Obi~no je od poroznog stakla ili posebnoprepariranog PVC−a, sa odre|enom poroznou, sli~no kao kod


konvencionalne jon−selektivne elektrode. Debljina membrane je1−100 µm, a potencijal ima pribli`no Nernstov odziv.

a) b) c)

Slika 10.22. ISFET: a) struktura, b) karakteristika IDS (VDS ), c) karakteristikaVGS (pH)

Potencijal se meri FET−om koji radi u oblasti zasienja (slika10.22.b). Stati~ka karakteristika zavisi od geometrije i strukturekanala sors−drejn, materijala od kojeg je napravljen jon−selektivnisloj i procesnih uslova. Pri konstantnom priklju~enom naponu nagejtu VG = const ukupni napon gejt−sors VGS menja se samo usledelektrohemijskog povrinskog potencijala na gejtu ψ0, koji zavisi odvrednosti pH elektrolita. Prema tome, kao stati~ke karakteristikemogu se uzeti IDS(VDS) sa VGS kao parametrom ili VGS(pH) (slika10.21.b,c).

Vreme odziva t5−90% klasi~nog ISFET senzora je relativno veli-ko. Na primer, za pNa−ISFET sa membranom od natrijum−alumini-jum−silikatnog stakla (10−11%Na2O+10−20%Al2O3+70−80%SiO2)vreme odziva je 50−10 ms, a za pCa−ISFET ~ak 300 s.

10.4.3. ISFET sa dielektri~nom membranom10.4.3. ISFET sa dielektri~nom membranom

Dodatni sloj izolatora. Kada se na izolator gejta od oksidaSiO2 tehnikom evaporacije, rasprivanja ili hemijskim deponovanjemnanese dodatni izolator (silicijum−nitrit Si3N4, tantal−pentoksidTa2O5 ili aluminijum−trioksid Al2O3), dobija se jon−osetljivi slojdebljine 40−200 nm. ISFET sa ovakvim slojem postaje senzorosetljiv na jone vodonika sa odli~nim karakteristikama: osetljivost40−60 mV po dekadi, stabilan rad (drift 0,1−1 mV/dan), velika brzina

10. BIOSENZORI 287

odziva (t5−90%=10−15 ms za pH−ISFET sa Si3N4, odnosno t5−90%=2−5 msza pH−ISFET sa slojem Ta2O5.

Slika 10.23. ISFET sa dodatnim slojem od Si3N4: a) pogled odozgo i presek, b)gumena izolacija od elektrolita

Prakti~na realizacija. Na slici 10.23 prikazan je ISFET napoluprovodni~koj osnovi od n−Si, sa slojem oksida SiO2 (35 nm) uzoni gejta preko kojeg je stavljen dodatni sloj od Si3N4 (40 nm).Kontakti su napravljeni od aluminijuma, a celi ~ip − osim otvora nagejtu − zatien je gumom od elektrolita.

Priklju~ci sa prednje strane senzora moraju biti izolovaniod elektrolita. Pokazalo se da to nije jednostavno napraviti jerte~nost prodire do elektronskih delova senzora kroz pore izolatoraod epoksida ili silikonske gume ili kroz pore na adhezionomsastavu izolatora i senzora. Smatra se da upravo neadekvatnatehnika zatite ograni~ava brì razvoj i primenu ISFET senzora.Jedan od na~ina reavanja ovog problema je pravljenje kontakatasa sorsom i drejnom sa zadnje strane senzora − kroz telo senzora(slika 10.24). Senzor je izveden u CMOS tehnici, sa osnovom odn−Si i aluminijumskim priklju~cima deponovanim u p+−oblasti.Elektri~na veza od sorsa (n+) i drejna (n+) ostvarena je pomoutankoslojnog provodnika TiSi2. Preko njega je deponovan hemijskipasivan niskotemperaturni oksid SiO2, a onda osetljivi pH−sloj od


Al2O3. Pored merne elektrode na prednjoj strani senzora jeporozna membrana minijaturne referentne pH−elektrode odAg/AgCl ìce. Interni rastvor KCl sasvim male zapremine, svega1 µl, omoguava dvonedeljni rad senzora u mernoj sredini. Zaprimenu u biomedicinskim merenjima razvijen je kateter kojipored opisane pH−elije ima i senzor pritiska sa ~etiri pijezorezistoraspojena u puni merni most. Na slici 10.24 prikazani su izgled ikonstrukcija takvog katetera. Ukupan broj priklju~aka na

DREJNGEJT

SORSREFERENTNAELEKTRODA

MEMBRANA SAPIJEZOREZISTORIMA

a)

p+

n

Al-KONTAKT

p+ p+

n n n

n+ n+

Al O32TiSi2

SiO2 SiO2 SiO2 SiO2

POROZNASTAKLENAMEMBRANA

MEMBRANASENZORAPRITISKA

PREDNJASTRANA

ZADNJA STRANA

KCl

REFERENTNA pH ELEKTRODA−

pH ISFET− SENZOR PRITISKA

n

OSNOVA

b)

PREDNJASTRANA

ZADNJASTRANA

Ag/AgCl

p

Slika 10.24. Senzor pH+p: a) vanjski izgled, b) konstrukcija

p

10. BIOSENZORI 289

kateteru je sedam: ~etiri su za senzor pritiska, dva za pH−ISFET ijedan za referentnu pH−elektrodu.

10.4.4. ISFET sa hemijski modifikovanom membranom

Silanizacija. Direktnim hemijskim promenama na oksidu,odnosno na membrani, postiù se sjajni rezultati u pogledustabilnosti i selektivnosti senzora. Primena hemijske metode uskoje povezana sa razvojem novih materijala.

Jedan od naj~eih postupaka hemijske modifikacije izolatoragejta SiO2 provodi se silanizacijom, tj. kalemljenjem silana na SiO2.Silan je spoj u kome su atomi silicijuma povezani sa organskimgrupama. U pripremnoj fazi SiO2 se hidratie, impregnira vodom dabi se na povrini dobile hidroksilne grupe OH. Glavna faza jedodavanje monofunkcionalnog reagensa koji sa OH−grupama stvarasiloksan veze ≡Si−O−Si≡, to se moè zapisati na sledei na~in:

Na povrini nakalemljenog silana je grupa X od koje zaviseselektivna svojstva membrane. Grupa X reaguje sa katjonima K+,Ni2+, sa katjonima tekih metala (Cd2+, Ag+, Hg2+), a ispituju se imogunosti interakcije sa anjonima. Na primer, koncentracija Ag+

meri se zahvaljujui njihovoj reakciji sa CN−grupama γ−cijanopro-pilendimetila(dimetilamina):

10.4.5. ISFET sa polimerskom membranom10.4.5. ISFET sa polimerskom membranom

pH-osetljivost. Osnovni problem u primeni ISFET senzora sahemijski modifikovanim oksidom u zoni gejta je to pored osetljivosti


na merene jone postoji i osetljivost na jone vodonika. To je zbog togato silanizacija nije obuhvatila sve hidroksilne jone, koji uelektrohemijskoj reakciji generiu dominantni potencijal u pore|enjusa potencijalom X−grupa u nakalemljenom silanu. Kada se gejtpresvu~e tankom polimerskom membranom (∼100 nm),pH−osetljivost se smanjuje. Na primer, tipi~na karakteristikaISFET−a sa perilenskim gejtom ima osetljivost 28 mv/pH za pH<4(slika 10.25.a). Za pH>4 osetljivost je svega 1,5−3mV/pH i u tompodru~ju ISFET je prakti~no referentna elektroda (REFET).

a) b)Slika 10.25. ISFET sa perilenskim gejtom: a) tipi~na karakteristika, b)

integrisani pH−senzor ISFET/REFET

Konstrukcija. Zbog malih dimenzija REFET moè da senapravi na istom supstratu kao i pH−osetljivi ISFET. Tako su nastaliintegrisani pH−senzori kao kombinacija ISFET/REFET (slika10.25.b). Ova kombinacija je u diferencijalnom spoju radi eliminacijetemperature. Senzor nema vanjsku referentnu elektrodu − elektri~nikontakt sa elektrolitom ostvaruje se posredstvom tzv.pseudoreferentne elektrode od plemenitog metala, naj~ee od zlata.

Priprema membrane. Za razliku od tradicionalnePVC−membrane (gejta), polimerska se pravi fotohemijskom ilitermi~kom obradom in situ, tj. u toku gradnje senzora na licu mesta.Posle zavrene silanizacije dodaje se monomer koji prilikomfotopolimerizacije naraste, reaguje sa povrinskom grupom X i veèse kovalentnom vezom za silan:

10. BIOSENZORI 291

Dodavanjem specijalnih spojeva, naj~ee makrocikli~kih etera~iji molekuli sluè kao jonofori, polimerska membrana postajeosetljiva na odre|enu vrstu jona. U porozni polimer jonofori seutiskuju po nekom rasporedu, kao u matricu (slika 10.26.a). Kako jena spoju polimera i SiO2 zaostalo nereagovanih hidroksilnih grupa,senzor ima i izvesnu pH−osetljivost. Kada se na to mesto stavime|usloj od hidrogela, spre~ava se difuzni prolaz gasova i smanjujeneèljena pH−osetljivost.

Hemijska modifikacija. Jon−neosetljiva membrana od perilenai sli~nih materijala sluì kao osnova za hemijsku modifikaciju idobijanje dosad najboljih ISFET senzora u pogledu selektivnosti iosetljivosti. Na slici 10.26.b prikazan je pK−ISFET osetljiv na jonekalijuma (K+), napravljen sa perilenom i molekulima makrocikli~kogetera (benzo−18−kruna−6). Procedura deponovanja perilenskog slojana Si3N4 sli~na je kao kod pravljenja pH−REFET−a. Modifikacijaperilena provodi se u dve etape. Prvo se povrinske karboksilnegrupe hloriu:

Hlorisanje se provodi radi efikasnije imobilizacije etera pomouamidske veze:

OHOHOH

+ (CH O) Si CH3 −3 2 2 2CH CH X−

OOO

− − −H CH CH X2 2 2Si CMONOMER

hν

(10.27)

OOO

− − −H CH CH2 2 2Si C POLIMER

MEMBRANA SANAKALEMLJENIMSILANOM

(10.28)DODAVANJEMONOMERAFOTOPLIMERIZACIJOM

−

MEMBRANA SAPOLIMEROM (10.29)


Debljina jon−selektivnog sloja odre|ena je dimenzijamamakrocikli~kih molekula pri~vrenih kovalentnom vezom za perilen,pa ISFET ima male dimenzije (do 1 µm), brz odziv (0,1 s), malunestabilnost (0,1−1 mV/dan za prvih deset dana, a naredni mesec

dana nula), te dobru osetljivost (30−50mV/pK).

a) b)

Slika 10.26. Perilenski gejt: a) jonofori utisnuti u perilensku matricu, b)jonofori nakalemljeni na povrini perilena

10.4.6. ENFET10.4.6. ENFET

Kada je u membrani tranzistora FET imobiliziran enzim,dobija se ENFET − enzimski FET. U membrani se odvija enzimskareakcija, a zatim joni produkta formiraju elektri~no polje koje sedetektuje pomou ISFET−a na kome je aplicirana enzimskamembrana.

Kada je enzimska membrana primenjena na potenciometrijskojelektrodi, tada se potencijal mora meriti pomou kola ~ija je ulaznaimpedansa (∼1012 Ω) mnogo vea od velike impedanse membrane.Kod ISFET, odnosno ENFET senzora unutranji elektrolit i

10. BIOSENZORI 293

unutranju elektrodu zamenjuje poluprovodni~ki kontakt (kanalFET−a) na kome je osetljivi element, tj. membrana. Ovaj kontakt imamalu impedansu i integrisan je u odgovarajue kolo za o~itanjepotencijala.

10.4.7. Merne eme sa ISFET senzorima10.4.7. Merne eme sa ISFET senzorima

Integracija savremenih hemijskih senzora sa analognimmernim kolima omoguila je razvoj mikroelektronskih hemijskihsenzora koji su u odnosu na klasi~ne prethodnike izdr`ljiviji, manji ipogodniji za masovnu proizvodnju i primenu. Dobijeni su i boljimetroloki parametri zbog temperaturne kompenzacije, linearizacije iimpedantne prilago|enosti izlaznog signala. Na izlaz senzora mogueje dodati kola za brzo multipleksiranje i uz minimalani porast cenekotanja ostvariti sloèna obrada signala (elektronski nos i jezik).

Integrisani ISFET. Prva integrisana elektronska emanapravljena je za par REFET/ISFET prikazan na slici 10.25.b. Uemi nema vanjske referentne elektrode jer je kontakt saelektrolitom ostvaren pomou elektrode od plemenitog metala (slika10.27.a). Par REFET/ISFET radi u diferencijalnom spoju i izlaznisignal je:

)( 210 IIRE −= . (10.32)

Potpuno integrisani mikroelektronski hemijski senzorproizveden je 1985. i nosio je oznaku Eµ358A (slika 10.27.b).Elektronska ema projektovana je tako da par ISFET i FET3 radi uidenti~nim termi~kim i elektri~nim uslovima. Sors tranzistora FET1i sors FET2 spojeni su na diferencijalni poja~ava~ A1, a njegov izlazna poja~ava~ A2. Ako je ukupno naponsko poja~anje poja~ava~a A,tada je izlazni napon:

)( 30 VVAE −= , (10.33)

gde su V i V3 ekvivalentni naponi gejta za ISFET i FET3. Izlazninapon E0 je povratnom spregom doveden na gejt FET3, E0, pa jeV3=E0, odnosno izlaz (10.33) ima oblik:

VAA

E10 +

= . (10.34)

Ako je ukupno poja~anje A dovoljno veliko (A>100), to nijeteko ostvariti, posle smirivanja prelaznog procesa izlazni napon je


proporcionalan merenoj koncentraciji jona. Tada su naponi nagejtovima posmatranog para ISFET i FET3 jednaki: V=V3, a to zna~ida su i njihove struje drejna jednake. Prema tome, svaka nesta-bilnost, uklju~ujui i temperaturnu, koja se pojavi u ovim strujamabie potisnuta diferencijalnom poja~ava~kom emom kao zajedni~kajednosmerna komponenta, a rezultat je da izlaz ne zavisi odtemperaturnih varijacija ve samo od elektrohemijskih pojava uelektrolitu. Na primer, kada se ~ip izloì cikli~koj promenitemperature 22 °C→72 °C→22 °C, temperaturna nestabilnost je svega25 µV/°C.

a) b)

Slika 10.27. Integrisani hemijski senzor: a) REFET/ISFET u diferencijalnomspoju, b) principijelna ema ~ipa Eµ358A

10.4.8. Senzori sa minimalnim slojem oksida10.4.8. Senzori sa minimalnim slojem oksida

EiS senzori imaju strukturu elektrolit−oksid−poluprovodnik,a dobijaju se kada je debljina sloja oksida d<5 nm (slika 10.28.a).Poluprovodnik se bira zavisno od jona ~ija se koncentracija meri. Naprimer za jone vodonika primenjuju se silicijum, oksid cinka (ZnO),oksid talijuma (Ta2O5) i oksid iridijuma (IrxOy), a za jone HS−

kadmijum−sulfid (CdS). Tipi~na osetljivost merenja pH je−32mV/pH.

ES senzori imaju strukturu elektrolit−poluprovodnik jer jekod njih oksid potpuno izostavljen (slika 10.28.b). Time je omoguenneposredan kontakt sa analitom. Osetljivost na merenje pH je−59mV/pH.

10. BIOSENZORI 295

Senzori EiS i ES imaju dobru osetljivost, ali im je karakte-ristika dosta nestabilna. To je glavni ograni~avajui faktor zaprimenu ovih jednostavnih senzora.

a) b)

Slika 10.28. Manje upotrebljavani senzori sa elektroliti~kim gejtom: strukturaEiS, b) struktura ES

10.5.10.5. MIKROBIOLO[KI SENZORIMIKROBIOLO[KI SENZORI 10.5.1. Uvod10.5.1. Uvod

Mikroorganizmi (bakterije, gljivice, virusi) su znatno vei odenzima i zato se mogu bez oteenja i relativno jednostavnoimobilizirati fizi~kim uklapanjem u pore membrane. Tipi~an primersu mikrobi (bakterije) koji se uklapaju u membranu od gela (agar,poliakrilamid) ili filterske i dijalizne materijale sa porama ~iji jepre~nik oko 0,2 µm. Posle razvoja bakterija na odre|enoj hranljivojpodlozi, elije se sakupljaju i ispiraju u pufer rastvorima da bi seeliminisali sastojci koji su sluìli za rast mikroorganizama. Fizi~kouklapanje provodi se meanjem sa gelom, odnosno vakuumskimusisavanjem u pore mikroporoznih membrana. Tako pripremljenamembrana se odràva u odre|enom rastvoru na niskoj temperaturi(∼4 °C) da bi se o~uvala enzimska aktivnost bakterija.

Fabrikacija mikrobiolokog senzora dovrava se neposrednopre primene: membrana se aplicira na transdjuser kojim se pratikoncentracija komponente koja u~estvuje u metaboli~kimreakcijama. Tipi~an primer su bakterioloki senzori kod kojih segasovi CO2, NH3 ili O2 nastali kao rezultat metaboli~kih reakcijaizme|u ispitivanog supstrata i odre|ene bakterije merepotenciometrijskom ili amperometrijskom elektrodom pH, 2Op ,


3NHp ili 4NHp . Elektrode 2COp , 3NHp i 2Op su pogodnije za primenu

u rastvorima jer ve imaju teflonsku hidrofobnu membranu (slika10.29.a).

Metaboli~ke reakcije mikroorganizama osnova su merenjakoncentracije holesterola, etanola, fenola, nikotinske kiselinenistatina i dr.

Primena mikrobilokih senzora ograni~ena je zbog nedo-voljne pouzdanosti i slabe reproducibilnosti. Osim toga, mikroorga-nizmi sadrè vei broj razli~itih enzima koji podràvaju razli~itereakcije, pa je analiti~ka interpretacija rezultata veoma teka.

10.5.2. Tehnika bakteriolokh senzora10.5.2. Tehnika bakteriolokh senzora

Bakterioloki senzori primenjuju se za merenje etanola(bakterija Acetobacter xylinium imobilizirana u celulozi), etanol−−metanola (bakterija Trichosporon brassicae adsorbovana naceluloznoj membrani), fenola (bakterija Trichosporon cutaneumimobilizirana u dijaliznoj membrani), glukoze (bakterija Escherichiacoli imobilizirana u agaru) i dr.

Bakterioloki senzor etanola zasniva se na oksidaciji kojanastaje u metaboli~koj reakciji bakterije Acetobacter xilynium:

OHCOOHCHOOHCHCH 23223 + →+ . (10.35)

Ova oksidacija prati se pomou elektrode 2Op . Vreme odziva

senzora je 2 min, a opseg merenja 0,1−3 mM.

Bakterioloki senzor cisteina zasniva se na konverzijicisteina u piruvat i gasove NH3 i H2S, pri ~emu je konverzija rezultatenzimskog potencijala bakterije Proteus morganii koja sadrì enzimcistein−desulfidrazu:

SHNHpiruvatcistein 23zadesulfidra-cistein ++ → . (10.36)

Bakterioloki senzor naftalena. Policikli~ni aromati~niugljovodonici predstavljaju najveu grupu kancerogenih spojeva kojise dugo zadràvaju u povrinskom sloju zemlje i zaga|uju okolinu.Izvesne bakterije imaju sposobnost da degradiraju ove opasne

10. BIOSENZORI 297

materije. Degradaciju prati respiratorna aktivnost bakterija ipotronja kiseonika, to se detektuje pomou O2−elektrode. Naftalen(C10H8) je kancerogeni spoj dobro rastvorljiv u vodi (do 30 mg/l) iuvek prisutan u zaga|enom zemljitu. Bakterije Sphingomonas iPseudomonas fluorescens razgra|uju naftalen.

a) b)

Slika 10.29. Bakterioloki senzor naftalena: a) struktura, b) kalibracione krive

Bakterioloki senzor naftalena je amperometrijski senzor nabazi bakterije Sphingomonas ili Pseudomonas fluorescens koje suimobilizirane u poliuretanski hidrogel kao matricu. Naamperometrijsku O2−elektrodu koja se sastoji od Pt−katode pre~nika0,5 mm i AgAgCl referentne anode najpre se stavlja membrana M2sa imobiliziranim bakterijama (slika 10.29). Preko ove membranestavljena je tanka kapilarna membrana M1 debljine 10 µm i saporama pre~nika 0,6 µm. Takva membrana proputa gasove, alizadràva vodu. Promena struje meri se pri konstantnom naponu od−0,8 V u odnosu na AgAgCl. Senzor ima osetljivost od 3 nA/mg⋅l uopsegu 0,01−3mg/l, brzinu odziva 3−5min i rok trajanja senzora oko20 dana.

10.610.6.. IMUNOSOENZORIIMUNOSOENZORI 10.6.110.6.1. . UvodUvod

Imunosenzori rade na principu biomolekularnog prepozna-vanja koje proizilazi iz specifi~nih veza izme|u antitela i antigena.Imunoloke reakcije su specifi~ne jer je promena potencijala veoma


mala, nema oslobo|enih produkata i nema potronje supstrata. Ovepromene se detektuju odgovarajuim transdjuserom. Pomouimobiliziranog antigena meri se koncentracija antitela u analitu, amoè da bude i obrnuto: pomou imobiliziranog antitela detektuje seantigen.

Najva`nija karakteristika imunosenzora je kapacitet konti-nualne detekcije. To je sposobnost senzora da u brzim ciklusimaobnavlja veze sa analitom, ili sposobnost da prati promene u analituu duèm vremenskom periodu bez regeneracije bioreceptora.

Imobilizacija antitela. Antitela su robusni proteini koji seimobiliziraju kovalentnim vezama. Direktna imobilizacija primenjujese na grafitnoj elektrodi. Takva elektroda se najpre elektrohemijskioksiduje u rastvoru azotne kiseline i kalijum−bihromata da bi sedobile hidroksilne grupe na koje se onda vezuju antitela prekokarbamida. Razli~ite varijante direktne imobilizacije ostvarene sufizi~kom adsorpcijom antitela na tankoslojnim elektrodama od zlata isrebra.

Tehnika imobilizacije antitela u acetilceluloznim membranamasli~na je imobilizaciji enzima u perilensku membranu ISFET−a, kojije prikazan na slici 10.26. Na primer, membrana od brom−cetilcelulozepotopi se u rastvor heksametilen−diamina (NH2(CH2)6NH2), a onda urastvor diepoksi−butadiena,

H2C−CH−CH−CH2,

da bi se dobile epoksi−grupe , koje reaguju sa antitelompreko veznog agensa, amino−grupe −NH2 (slika 10.30.a). Na krajuse membrana opere u rastvoru etanolamina koji blokira nereagovaneepoksi−grupe.

Imobilizacija antigena. Antigeni se imobiliziraju na sli~anna~in kao enzimi i antitela kada imaju proteinsku strukturu.Antigeni koji nemaju proteinsku strukturu koriste jonofore − nosiocejona za spajanje sa elektrodom. Tipi~an primer je klasi~naPt−elektroda preko koje je nanet sloj epoksi−smole pomean sagrafitom koji ima ulogu internog rastvora. Na vrhu imunosenzora jesmesa PVC−a rastvorenog u tetrahidrofuranu, 10mg/ml antigenaDNP (dinitrofenol) i 15% trioktil−acetata (slika 10.30.b).

OO=C−C= O

10. BIOSENZORI 299

a) b)

Slika 10.30. Imunosenzor: a) imobilizacija antitela u membrani, b) imobilizacijaantigena

Imobilizacija smese sa bioafinitetom provodi se na membra-nama od polimera. Na primer, kopolimerizacijom 1,8−diamino−40−−amino−metiloktana sa triacetatom celuloze dobija se polimerskamembrana koja se potapa u rastvor smese ovalbumina i2[(4−hidroksilfenol)azo]benzoatna kiselina (HABA). Smesa sekovalentno vezuje za membranu pomou karbamida.

10.6.2. Tehnika imunosenzora10.6.2. Tehnika imunosenzora

Imunoloke veze nastaju u reakcijama izme|u antitela iantigena. Kao to je istaknuto, to su specifi~ne reakcije jer jepromena potencijala mala, nema stvaranja produkta niti potronjesupstrata. Mali potencijal teko se meri direktno, pa se pribegavanamernom izazivanju hemijskih reakcija koje e taj potencijalpoja~ati, omoguiti stvaranje merljivog produkta ili potronjusupstrata.

Najpoznatije su metode enzimskog ozna~avanja, odnosnostvaranja sprege imobiliziranog imunoagensa i enzima koji kata-lizira komplementarnu reakciju imunolokoj. Takva enzimskareakcija daje vei potencijal, osloba|a produkt ili troi supstrat. Zatose ovaj mehanizam ponekad ozna~ava kao enzimsko poja~avanje.Druga grupa metoda posrednog praenja imunolokih reakcijazasniva se na primeni prenosilaca jona (jonofora) kao medijatoraizme|u imunolokih i elektrohemijskih reakcija.


Zavisno od tipa transdjusera koji se koristi za detekcijupromena u namerno izazvanoj hemijskoj reakciji postoje razli~ititipovi imunosenzora: elektrohemijski, optoelektronski, polupro-vodni~ki, ultrazvu~ni i dr.

Elektrohemijski imunosenzori su potenciometrijskog iliamperometrijskog tipa. Kod potenciometrijskih meri se razlikapotencijala izme|u imunoreaktivne i referentne elektrode (strujaizme|u elektroda jednaka je nuli), a kod amperometrijskih meri sestruja izme|u ove dve elektrode kada je na njih priklju~enkonstantan napon. Mereni napon i merena struja proporcionalni suimunohemijskoj reakciji izme|u antitela i antigena.

Na primer, kada se elektroda od titanijumske ìce na kojoj jedirektno imobilizirano antitelo anti−HCG (humani gonadotropinzametka) potopi u rastvor HCG, 3,3 µg/ml, dobija se napon od 3 mVu odnosu na referentnu elektrodu.

Optoelektronski imunosenzori zasnivaju se na opti~kojdetekciji interakcije antitelo−antigen. Imunoagens se imobilizira napogodnom delu opti~kog kabla gde je omoguena interakcijaantitelo−antigen, tako da se mogu pratiti promene koje nastaju.Naj~ee se primenjuje imobilizacija antitela na vrhu opti~kog kablakojim se dovodi opti~ki zrak iz izvora. U interakciji sa fluorescentnimantigenom menja se intenzitet zra~enja koje se povratnim opti~kimvlaknom dovodi na fotoprijemnik. Mogue strukture senzoraprikazane su na slici 9.5 i 9.6.

Na ovaj na~in napravljen je senzor za merenje koncentracijebenzopirena. Benzopiren ima svojstvo da pod delovanjemfluorescentnog zra~enja daje fluorescentni produkt − antigenbenzopirentetraol (BPT). Antigen BPT reaguje sa antitelomanti−BPT koje je imobilizirano na vrhu opti~kog kabla. U toj reakcijinastaje kompleks antitelo−antigen i to god je vie antigena vezanobie vei intenzitet fluorescentne svetlosti koja se detektuje nafotoprijemniku.

Poluprovodni~ki imunosenzori su kombinacija bioreceptorasa imunoagensima i poluprovodni~kog senzora, naj~ee tranzistoraFET. Tako se dobija IMFET (immuno−FET).

Jedan od prvih senzora ovoga tipa napravljen je za merenjekoncentracije antitela VDRL (venereal disease research laboratory)Najpre se antigen kardiolipin imobilizira u tanku PVC membranu

10. BIOSENZORI 301

koja se onda stavlja na metalni gejt FET−a. Antitelo VDRL je proteinsa izvesnim naelektrisanjem koji se prenosi na kompleks antigen−−antitelo to se detektuje pomou FET−a.

Pijezoelektri~ni imunosenzori. Usled formiranja komple-ksa Ag−Ab poveava se masa pijezokristala, odnosno smanjuje senjegova rezonantna frekvencija. Za kvarcni pijezokristal u te~nostipromena frekvencije ima oblik:

( )QQ2/3

0ff ρπµηρ−=∆ , (10.37)

gde su: f0 frekvencija oscilovanja suvog kristala, η i ρ viskoznost igustina te~nog analita, µQ i ρQ modul elasti~nosti i gustina kvarca.

Na povrini kvarca imobilizira se antitelo u tankom slojupoliakrilamida. Tako se, na primer, imobilizira anti−IgG. Opadanjerezonantne frekvencije detektuje se ~im se injektuje rastvor kojisadrì antigen IgG (imunoglobulin G). Na sli~an na~in mogue jedetektovati i izvesne mikroorganizme: pijezokristal sa imobiliziranimantitelima anti−Candida smanjuje svoju rezonantnu frekvenciju uprisustvu patogenog mikroba Candida albicans kada je njegovakoncenteracija u intervalu 106−5⋅108 elija/cm3.

SAW imunosenzori zasnivaju se na modifikaciji ultrazvu~nogsenzora sa povrinskim talasima SAW (slika 10.31). Osnova je odpijezokeramike LiTaO3 na kojoj su dve tankoslojne staze za kanjenje(1,4×3mm): merna i referentna. Tankoslojne elektrode ultrazvu~nogpredajnika i prijemnika nanete su naparivanjem hroma (15 nm) izlata (85 nm). Oblik elektroda je „~ealj u ~ealj“. Izme|u staza jedeponovan sloj platine koji sluì kao otporni~ki senzor temperature.Kontakti i oì~enje senzora izolovani su silikonskom gumom zbogprovodnosti analita.

Usled adsorpcije mase na mernoj stazi menja se vreme preletaultrazvu~nog signala u odnosu na vreme preleta istog takvog signalau referentnoj stazi. Razlika je vreme kanjenja τ koje iznosi sveganekoliko nanosekundi, pa se meri posredno preko faznog pomakaφ=2πfτ, pri konstantnoj i visokoj rezonantnoj frekvenciji f (115MHz).

Jedan od prvih senzora ovoga tipa razvijen je za merenjekoncentracije antigena IgG (imunoglobulina). U povrinskom slojumerne i referentne staze imobilizirana su antitela anti−IgG pomouproteina A na zlatnoj podlozi. Analit se injektuje u pufer−rastvor koji


u zatvorenom sistemu cirkulie sa konstantnim protokom(0,5 mL/min) preko kontaktne povrine senzora. Poveanje maseusled spajanja antitela i antigena daje fazni pomeraj od ∼10°prilikom ubacivanja analita koncentracije od 2 µg/µL. Naredneinjekcije analita mogue su sve do potpunog zasienja senzorskogsloja, a zatim je neophodna regeneracija. Sli~an senzor napravljen jeza merenje koncentracije humanog seruma albuminuma (HSA) nabazi veze HSA/anti−HAS.

Slika 31. SAW imunosenzor

Enzimsko ozna~avanje je povezivanje imobiliziranogimunoagensa i enzima. Prvi korak je da se imobilizira antitelo namembrani transdjusera koji moè da prati reakciju enzima sa kojimje ozna~en antigen. Imunosenzor se zatim potapa u rastvor u kome jepoznata koncentracija enzimski ozna~enog antigena a nepoznatakoncentracija slobodnog, neozna~enog antigena.

Izme|u ozna~enog i neozna~enog antigena postoji konkurencijakada je u pitanju povezivanje sa antitelom. Kada bi u analitu biosamo ozna~eni antigen, on bi popunio sve veze sa antitelima,enzimska aktivnost bila bi najvea i prouzrokovala najveegenerisanje kiseonika ~ija se koncentracija prati pO2−elektrodom(slika 10.32.a). Me|utim, neozna~eni antigen, zavisno od svojekoncentracije, formira kompleks Ab−Ag i smanjuje aktivnost enzima(slika 10.32.b). Zato je kod svih imunosenzora sa kompetitivnimna~inom rada izlaz obrnuto proporcionalan koncentraciji merenoganalita.

10. BIOSENZORI 303

Da bi se izmerila koncentracija vezanog, enzimski ozna~enogantigena, neophodno je da se senzor prvo opere i onda doda supstratsa kojim reaguje enzim i osloba|a odre|enu koli~inu kiseonika.Imunosenzor na ovoj etapi radi ustvari kao enzimska elektroda. Zanovo merenje senzor je spreman nakon regeneracije u pufer rastvorukoji razgra|uje kompleks Ab−Ag.

a) b)

Slika 10.32. Imunosenzor: a) elektroda sa imobiliziranim antitelima spregnutimsa ozna~enim antigenima, b) kompetitivno formiranje kompleksa Ab−Ag

Primer imunosenzora sa kompetitivnim na~inom rada je senzoralbumina, belan~evine u krvi. Kod ovog senzora je u membraniimobilizirano antitelo anti−HSV (humani serum albuminum).Antigen albumin ozna~en je katalazom, enzimom ~ije se delovanjedetektuje pomou pO2−elektrode. Ozna~eni i neozna~eni albuminkompetitivno reaguju sa anti−HSV, pa je izlaz inverznoproporcionalan merenoj koncentraciji albumina. Na sli~an na~innapravljeni su imunosenzori za dijagnozu trudnoe na bazi merenjakoncentracije humanog gonadotropina zametka (HCG), imunosenzorza dijagnozu kancerogenih oboljenja na bazi merenja koncentracijealfa−fotoproteina i dr.

Imunosenzor sa magnetskim transdjuserom. Imunoagensikoji sadrè feromagnetske elemente (gvo`|e, nikal, gadolinijum)imaju feromagnetska svojstva. Merenje magnetske permeabilnostitakvih imunoagenasa moè se realizovati direktno, stavljanjemanalita u kalem koji je uklju~en u Maksvelov most (slika 10.33.a).Bilnji protein konkanavalin koristi se kao centar prepoznavanja jerse za njega vezuje analit po principu bioafiniteta, odnosno uklapanja


bez razmene elektrona. Zato se konkanavalin imobilizira na nosiocuod sefarina koji sluì kao izmenjiva~ jona.

Imunoagensi koji nisu feromagnetski tako|e mogu da sedetektuju pomou magnetskog transdjusera. Potrebno je da seanalit ozna~i feromagnetskim markerom, tako da se prilikomspajanja sa imobiliziranim centrom formira sendvi~ centar−−analit−marker (slika 10.33.b). Mogue je primeniti i kompetitivnina~in detekcije izme|u neferomagnetskog analita i feromagnetskekomponente, koja je takva po svojoj prirodi ili je ozna~enapomou magnetskog markera (slika 10.33.c).

Magnetski transdjuser je Maksvelov most koji meriinduktivnost kalema L sa velikim faktorom dobrote, Q=ωL/R>10,(slika 10.33.d). Kada je u kalemu analit relativne magnetskepermeabilnosti µr, induktivnost kalema menja se na sledei na~in:

lAN

L2

0rµµ= , (10.38)

gde su: µ0=4π⋅10−7 H/m magnetska permeabilnost vakuuma, Apovrina popre~nog preseka kalema, N broj navoja i l duìna kalema.Most se napaja iz oscilatora naponom od 2 Vpp, frekvencije 200 kHz,

10. BIOSENZORI 305

a balansiranje se postiè pomou potenciometara R1=10 kΩ iR3=100 Ω. Kalem ima duìnu 11 mm, pre~nik 10 mm i 30 navoja.Vrednosti svih elemenata dati su na slici. Kada je most u ravnoteì,tada su L4=R2R3C1 i R4=R2R3/R1, a izlazni napon se preko diferen-cijalnog poja~ava~a i ispravlja~a vodi na finalnu obradu.

LITERATURA

1. T.M.Canh: „Biosensors“, Chapman&Hall, London, 1993.

2. T.Matsuo, H.Nakajima: „Parylene−gate ISFET and chemical modification ofits surface with crown ether compounds“, Sensors&Actuators, Vol.9, No.2(115−123), 1986.

3. E.J.R.Sudhölfer, P.D. van der Wall, M.Skowronska−Ptasinska, A. van derBerg, D.N.Reinhoudt: „Ion−sensing field−effect transistor“, Sensors&Actuators, Vol.17, No.1&2 (189−194), 1989.

4. P.BataiUard, P.Clechet, N.Jaffrezic−Renault, X.G.Kang: „The preparation ofCHEMFET selective gates by thin silica layer grafting and their behaviour“,Sensors&Actuators, Vol.17, Nos.1&2 (3−26), 1989.

5. W.Göpel: „Ultimate limits in the miniaturization of chemical sensors“,Sensors&Actuators, Vol.56, Nos.1&2 (83−105), 1996.

6. P.Bergveld: „Exploiting the dynamic properties of FET−based chemicalsensors“, Journal of Physics E, Scientific Instrumentation, No.22 (678−683),1989.

7. P.Bergveld: „Sensors and actuators, Twente“, Sensors&Actuators, Vol.17,Nos.1&2 (203−208), 1989.

8. P.Bergvald: „The future of biosensors“,Sensors & Actuators, Vol.56, No.1−2,(65−73), 1996.

9. P.Bergvald, A.van den Berg, P.D.van deder Wal, M.Skowronska-Ptasinska,E.J.Sudhölter, D.N.Reinhoudt: „How electrical and chemical requirementsfor REFETs may coincide“, Sensors & Actuators, Vol.18, No.3&4 (309−329),1989.

10. H.Huang, P.K.Dasgupta, Z.Genfa: „A pulse amperometric sensor for themeasurement of atmospheric hydrogen peroxide“, Analytical Cehemistry,Vol.68 (2062−2066), 1996.

11. R.P.Buck: „Expanding technology for sensor design and fabrication“,Electrohemica Acta, Vol.36, No.2 (243−251), 1991.

12. L.S.W.Birch, A.P.F.Turner, R.E.Ashby: „An inexpensive on−line alcoholsensor for fermentation monitoring and control“, Process and Biochemistry,april 1987 (37−42), 1987.


13. H.Sangodkar, S.Sukeerthi, R.S.Srinivasa, R.Lai, Q.Contractor: „A biosensorarray based on polyianiline“, Analitytical Chemistry, Vol.68., No.5(779−5783), 1996.

14. A.König, C.Zaborosch, A.Muscat, K.D.Vorlop, F.Spener: „Microbial sensorsfor naphtaline using Sphingomonas sp. B1 or Pseudomonas fluorescensWW4“, Applied Microbiology and Bitechnology, No.45 (844−850), 1996.

15. W.Welsch, C.Klein, M. von Schickfus, S.Hunklinger: „Development of asurface acoustic wave immunosensor“, Analytical Chemistry, Vol.68, No.13(2000−2004), 1996.

16. C.B.Kriz, K.Radevik, D.Kriz: „Magnetic permeability measuremenrt inbioanalysis and biosensors“, Analytical Chemistry, Vol.68, No.11(1966−1970), 1996.

17. S.S.M.Hassan, N.M.H.Rizk: „Miniaturized graphite sensors doped withmetal−bathophenanthroline complexes for the selective potenciometricdetermination of uric acid in biological fluids“, Analyst, Vol.122 (815−819),1997.

18. M.Behizad, R.H.Cumming, F.J.Rowell, T.T.Salsbury, I.W.Stewart: „Safety inbiotechnology: The use of biosensors for the detection of hazardousbiochemical in air“, Process and Biochemistry, august 1989 (126−132), 1989.

19. E.Kempe, W.Schallenberger: „Measuring and control of fermentationprocesses, part I“, Process and Biochemistry, december 1983 (7−12), 1983.

20. M.M.Meyerhoff, B.Fu, E.Bakker, J.H.Yun, V.C.Yang: „Polyion−sensitivemembrane“, Analytical Chemistry News & Features, march 1996 (168−175),1996.

21. L.Campanella, M.Tomassetti, M.P.Sammaritano: „Enzyme−entrapingmembranes for enzyme sensors“, Sensors & Actuators, Vol.16, No.3(235−247), 1989.

22. E.Tamiya, I.Karube, S.Hattori, M.Suzuki, K.Yokoyama: „Micro glucosesensors using electron mediators immobilized on a polypyrrole−modifiedelectrode“, Sensors & Actuators, Vol.18, No.3/4 (297−307), 1989.

23. H.ElYamani, C.T.Minh, M.A.Abdul, D: „Automated system for pesticidedetection“, Sensors & Actuators, Vol.15, No.2 (193−198), 1988.

24. B.Liu, R.Hu, J.Deng: „Fabrication of an amperometric biosensor based onthe immobilization of glucoze oxidase in a modified molecular sievematratix“, Analyst, Vol.122. (821−826), 1997.

Documents

10.1. PRINCIPI I FUNKCIONISANJE - kelm.ftn.uns.ac.rs · 10. BIOSENZORI 251 Transdjuser (detektor, senzor) je drugi strukturni deo svakog biosenzora. To je makroskopski pretvara~ jednog