BAB I

PENDAHULUAN

A. Dasar Teori

Isolasi DNA

Sebelum membahas mengenai isolasi DNA, ada baiknya kita sekilas membahas

DNA itu sendiri. Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling

penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi

genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA

dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional

maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen

(Campbell dkk. 2004: 221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme

prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai

DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot

terletak dalam sitoplasma.

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick.

Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh

Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur

DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai

polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai

berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’

merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan

gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan

kedua basa nitrogen.

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula

pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom

oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin

terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis,

yaitu timin dan sitosin.

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut

dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup.

Fungsi-fungsi tersebut adalah:

Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup,

Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan

molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi

DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri.

DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada

mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat

berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari

protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA juga dijumpai

pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang

dinamakan plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi

kehidupan bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam

lokasi hidupnya.

Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa.

Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri

tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua

plasmid tereplikasi.

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya

ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk

memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang

mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan

akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu

supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115).

Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen

dari campuran.

Terdapat sejumlah tujuan dari isolasi DNA, antara lain:

Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui

teknik Hibridisasi Southern

Isolasi DNA genomik dalam rangka  pembuatan pustaka genomik.

Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,

Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur

perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas

DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut:

Kemurnian

Panjang DNA

Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim

Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung

Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk

berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.

Isolasi DNA pada Tanaman

Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ

tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya

terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan

ekstraksi DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan

tanaman khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer

yang ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah

penghilangan enzim penghambat-polisakarida.

Sebagai contoh dari isolasi DNA tanaman adalah isolasi DNA tanaman pisang.

Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang adalah penggerusan

atau homogenasi daun pisang dengan penambahan nitrogen cair. Fungsinya adalah untuk

mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan. Hal ini

dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur. Selanjutnya

dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan

membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan nitrogen

cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak.

Kemudian dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60 derajat C selama

60 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan

sentrifugasi sampel dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat

C. hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi

pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa supernatan berwarna hijau sedangkan

pelet berwarna putih kehijauan.

Supernatan yang telah diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan

larutan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk

mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat

melarutkan protein, lipid dan molekul lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan

didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Setelah pencampuran,

homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi homogenasi.

Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan

kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat C. hasil yang didapatkan

adalah supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau

jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian

diambil supernatan pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform:Isoamyl

Alkohol untuk presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi.

Untuk memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti

nitrogen cair atau buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14

M NaCl) steril, Fenol: Chloroform: IsoamylAlkohol (PCI) = 25: 24: 1; Chloroform:

Isoamilalkohol (PCI) = 24 : 1, 7.5 M Ammonium acetate,Etanol Absolut, Etanol 70 %,

TE Buffer pH 8. EDTA merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam

atau ion-ion bermuatan di-positif seperti Ca2+ dan Mg2+ sehingga komponen-komponen

di membran terluar sel akan terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat.

Pada prosedur ekstraksi yang telah dilakukan ini digunakan fenol-kloroform yang

berfungsi sebagai pendenaturasi protein. Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi

karena molekul ini tidak larut didalam pelarut organik seperti fenol-kloroform.

Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol. Hal ini berfungsi

sebagai penghilang fenol-kloroform. Sebab apabila fenol-kloroform masih berada di

dalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau

enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler.

Hasil yang didapatkan dari presipitasi CI akan terbentuk kembali supernatan dan

pelet pada eppendorf, kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan

ditambahkan dengan amonium nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan

menghilangkan kontaminan. Hasilnya diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam

larutan jernih tersebut. Kemudian dilakukan inkubasi selama satu malam untuk

optimalisasi presipitasi.

CTAB memiliki fungsi yang sama seperti SDS, yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid

dari membran sel. SDS adalah sejenis deterjen yang mampu mengemulsi lipid.

Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol absolut dan amonium nitrat dan

diketahui filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali untuk mendapatkan

pelet DNA. Setelah supernatan dibuang, selanjutnya ditambahkan etanol 70% untuk

presipitasi lanjutan. Kemudian dilakukan sentrifugasi sampai didapatkan pelet DNA

Pelet DNA yang didapatkan kemudian dikering anginkan. Gambar di bawah

merupakan cara isolasi DNA pada bibit gandum.

Isolasi DNA pada Darah

Isolasi DNA tak hanya bisa dilakukan untuk tanaman atau buah-buahan saja, tapi

juga bisa dari darah, berikut cara kerjanya:

Tahap-tahap utama dalam isolasi DNA darah adalah:

Menghancurkan membran sel.

Disosiasi protein sel.

Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya.

Darah merupakan jaringan ikat khusus yang mempunyai elemen-elemen berupa sel

darah, trombosit, dan substansi interseluler cair, yaitu plasma darah.

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik

dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini

dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan

melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang

berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub

positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap

massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan

dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati

dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA.

J enis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai

fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion

kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem

pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat

terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion,

pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh

medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju

perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut

bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan

untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk

memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri

massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-

metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)

yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau

asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan

biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara

akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan

jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam

nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah

agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.

Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu

kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah

menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat

yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya

berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida

digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein

didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat

protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar

molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna

"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul

sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium

bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom

radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah

proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-

pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-

molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama,

yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau

penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat

digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-

elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada

lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan

ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran

molekul.

Perangkat elektroforesis gel

Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR menggunakan primer mikrosatelit. Berkas (band)

mendatar merupakan sekumpulan DNA yang setiap kolomnya bergerak dengan kecepatan

berbeda. Semakin pendek DNA semakin cepat bergerak.

B. Latar Belakang

Isolasi DNA

Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ

manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging, dan sisik ikan. Pada

individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis

jumlah dan ukuran yang sama.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan

metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan

isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi

sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali

pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam

nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya

DNA tidak sensitif oleh enzim retriksi dan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan

PCR.

Pada praktikum ini, kami mencoba untuk melakukan isolasi DNA dari tanaman

dengan menggunakan jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan di atas,

misalnya menggunakan daging buah atau tanaman jenis sayuran.

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan

listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,

bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi

makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada

gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi

dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga

untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang

digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak

dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini

menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel

electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik

yang besarnya tergantung pada Ph dan komposisi medium dimana molekul biologi

tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan

positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai

dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul – molekul berdasarkan muatannya.

C. Prinsip Kerja

Isolasi DNA

Prinsip dasar dari isolasi DNA adalah pendenaturasian protein yang masih menempel

pada kromosom oleh kloroform. Dan DNA yang dihasilkan akan dielektroforesis dan juga

di amplifikasi di PCR.

Elektroforesis

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh

medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju

perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut

bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan

untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik 11mmune11tive untuk

memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri

massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau 11mmune-blotting yang merupakan metode-

metode karakterisasi lebih lanjut.

D. Tujuan

Isolasi DNA

Melakukan isolasi DNA dari berbagai tanaman.

Memahami prinsip kerja dalam Isolasi DNA tanaman

Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA.

Elektroforesis

Untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul

DNA atau RNA.

BAB II

METODE KERJA

A. Alat dan Bahan

Alat

1. Mikropipet berbagai ukuran

2. Pipet berukuran

3. Tabung 1,5 ml

4. Tips mikropipet berbagai ukuran

5. Saringan

6. Gelas kimia

7. Sendok

8. Penangas

9. Vorteks

10. Mini sentrifuga

11. Blender/Lumpang

Bahan

1. Buffer ekstraksi ( 100 mM Tris-HCl, pH 8; 50 mM EDTA; 500mM NaCl,CTAB 2%

2. Potasium asetat 5 M

3. SDS 20%

4. Kloroform: Isoamil alkohol ( 24 : 1 )

5. Alkohol 100% ( pa )

6. TE ( 10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA pH8 )

7. Buah Stroberi

8. CTAB 2%

B. Langkah Kerja

1. Mengambil daging buah sebanyak 50 gram.

2. Menghancurkan daging buah dengan menggunakan blender.

3. Menampung daging buah yang telah halus.

4. Memasukan ke dalam tabung 1,5 ml daging buah yang telah dihaluskan sebanyak 0,1 ml atau

100 µl.

5. Menambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total sampel.

6. Menambahkan SDS 20% sebanyak 20 µl.

7. Menghomogenkan dengan alat vortex selama 5 detik.

8. Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 65°C selama 20 menit.

9. Menambahkan 100 µl 5 M Potasium asetat.

10.Menghomogenkan dengan cara membolak-balikan tabung sebanyak 50x.

11.Menyimpan dalam wadah berisi es selama 10 menit.

12.Mensentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit.

13.Pindahkan fasa atas ke dalam tabung 1.5 ml yang baru, jangan sampai endapan terbawa.

14.Menambahkan kloroform: Isomil alcohol (24:1) sebanyak ½ x volume total sampel.

15.Menghomogenkan sampel dengan cara membolak-balik tabung sebnayak 50x.

16.Mensentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit.

17.Memindahkan fasa atas kedalam tabung baru.

18.Menambahkan alcohol 00% (-20°C) sebanyak minimal 2 x volume total sampel.

19.Mensentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit.

20.Membuang alcohol dengan hati-hati, agar endapan DNA tidak terbuang.

21.Cuci dengan alcohol 70% 1x, kemudian keringkan sampel pada oven dengan suhu 50°C

selama 10 menit, atau hingga endapan mongering.

22.Melanutkan endapan DNA denan TE sebanyak 30 µl.

23.Menyimpan sampel pada suhu 4°C, biarkan minimal selama 24 jam agar DNA dapat terlarut

dengan sempurna.

24.DNA yang diperoleh akan di elektroforesis dan juga di amplifikasi dengan alat PCR.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Hasil Isolasi DNA Buah StroberryElektroforesis Agarose

B. Pembahasan

Isolasi DNA bertujuan untuk mengenal dan mempraktekkan teknik dalam melakukan isolasi DNA dari tanaman dan DNA jaringan / sel hewan. Pada praktikum kali ini kami melakukan teknik isolasi DNA pada daging buah dari tumbuhan stroberry. Isolasi DNA memiliki beberapa

tahapan, yaitu isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam

larutan, purifikasi, dan presipitasi. Sedangkan prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi

DNA yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan

substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal

sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih

ringan akan terletak di atas.

Pada praktikum yang kami lakukan setelah sebanyak 1,5 ml daging buah strobery

yang telah dihaluskan dimasukan ke dalam tabung, kemudian ditambahkan buffer

ekstraksi dan sodium dodesil sulfat (SDS), penambahan larutan tersebut berfungsi sebagai

larutan pelisis yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selanjutnya

tabun dihomogenkan dengan vorteks agar campuran larutan dapat menyatu dengan

DNADNA

Marker DNA

ekstrak daging buah. Lalu larutan diinkubasi untuk mengoptimalkan kerja enzim yang

sangat dipengaruhi oleh temperatur. Proses selanjutnya yaitu pemberian Potasium asetat

(tahap presipitasi). Potasium asetat ini jika berikatan dengan protein mengakibatkan

terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga

menyebabkan protein mengendap, kemudian divortex yang bertujuan untuk

menghomogenkan larutan. Penambahan kloform isoamil asetat berfungsi untuk

mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom. Kemudian tabung

dihomogenkan hingga terlihat adanya benang-benang putih DNA yang membentuk

gumpalan. Setelah itu disentrifuge, DNA akan tampak sebagai butiran putih kecil, dan

supernatan dibuang. Selanjutnya butiran DNA genom dicuci dengan penambahan

alkohol. kemudian disentrifuge dan supernatannya dibuang. Lalu alkohol dibuang denga

hati-hati agar endapan (butiran DNA) tidak ikut terbuang. Dari hasil yang kami dapatkan

mengenai isolasi DNA ini, sampai pada tahap akhir kami melihat DNA buah stroberry

dapat diisolasi dengan terbentuknya benang-benang putih DNA yang membentuk

gumpalan.

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Prinsip kerja dari

elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam

hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-

partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug &

Cummings 1994: A-6). 

Pada prkatikum selanjutnya kami mengetahui proses elektroforesis DNA melalui

demonstrasi yang disampaikan dan melihat hasil elektroforesis DNA tersebut dengan

bantuan sinar UV. Pada praktikum ini digunakan gel agarose untuk memisahkan

(separation), dan purifikasi DNA. Gel aagrose yang telah ditambahkan Etidium bromida

(EtBr) dituangkan ke dalam cetakan gel dan dibiarkan mengeras. Sampel DNA bisa

dimasukkan (loading) dalam sumur (well) gel yang kemudian bisa terpisah dengan

menggunakan arus listrik. Sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel

yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-

molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub

listrik sesuai dengan muatannya.

Hasil elektroforesisi ini dapat diamati dengan bantuan sinar UV. Dari pengamatan

yang dilakukan kami melihat terbentuknya pita-pita DNA yang terdiri atas beberapa line

dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Dengan membandingkan masing-masing

fragmen/ pita dengan posisi pada pada DNA marker dapat diketahui Perkirakan ukuran

masing-masing fragmen/pita tersebut.

C. Jawab Pertanyaan

Isolasi DNA

1. Amati warna larutan, warna endapan, jumlah lapisan pada setiap tahapan isolasi DNA.

Tulis dan gambarkan tabung hasil pengamatan pada setiap tahapan!

Jawab : Secara umum jenis larutan yang digunakan pada proses isolasi DNA berwarna

bening. Berikut ini gambaran hasil pengamatan dari tiap tahapan :

2. Hitunglah jumlah senyawa yang dimasukkan pada tahapan kerja nomor 5, 14, dan 18!

Jawab :

Tahap kerja nomor 5 : menambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume sampel

atau sebanyak 0,4 µl.

Tahap kerja nomor 14 : menambahkan campuran klorofom dengan isoamil alkohol

sebanyak ½ volume total sampel atau sebanyak 200 µl.

T.7 T.12

T.16

T.4

Sampel

T.17

Sampel

T.6

SDS

Buffer Ekstraksi

Sampel

T.13

Sampel

T.9

Sampel

Potasium asetat

T.14

Sampel

Klorofom : isoamil alkohol

T.19

Gumpalan DNA

T.18

Sampel

Alkohol 100%

Tahap kerja nomor 18 : menambahkan alkohol 100% sebanyak 2 x volume total

sampel atau sebanyak 900 µl.

3. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam proses isolasi DNA!

Jawab :

Senyawa yang digunakan dalam proses isolasi DNA yaitu :

a. Buffer ekstraksi yang mengandung :

Tris-Hcl ( Thromethamine HCl) dan NaCl yang berfungsi sebagai buffer

untuk menjaga pH 8. Selain itu NaCl berfungsi untuk menjaga struktur

double helix DNA.

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), yang dapat mengikat ion metal,

sehingga menghambat kerja enzim nuklease.

Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) untuk menghilangkan

polisakarida. (Sumber : http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods)

b. Sodium dodecyl sulfate (SDS) yang merupakan detergen untuk melisis dinding

sel dan mendenaturasi protein.

c. Potasium assetat merupakan senyawa pengikat debris sel dan protein untuk

membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-protein-debris

sel.

d. Kloroform : isoamil alkohol (24:1) untuk memdenaturasi protein pada

kromosom.

e. Alkohol 100% untuk menggumpalkan DNA yang telah lepas dari sel.

Elektroforesis

1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis Anda!

Jawab :

DNA pada hasil elektroforesis yaitu bagian pita yang berwarna putih dari gambar.

2. Mengapa DNA anda hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV? Jelaskan!

Jawab :

Ultraviolet digunakan untuk mengecek keberadaan DNA hasil elektroforesis. DNA

yang telah berikatan dengan etidium bromida akan berpendar pada saat disinari

oleh UV. ( Sumber : http://www.ehow.com/how-does_5246239_dna-electrophoresis-method.html )

3. Apakah etidium bromide? Bagaimana cara kerja etidium bromide dalam proses

pewarnaan DNA?

Jawab:

Etidium bromida merupakan zat pewarna DNA yang akan menyebabkan

fluoresensi DNA saat disinari oleh UV. Etidium bromida akan berikatan dengan

bagian basa dari DNA dan menyebabkan transmisi sinar UV menjadi dapat dilihat. (Sumber : http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html )

BAB IV

KESIMPULAN

Isolasi DNA

Isolasi DNA dapat dilakukan dengan tahapan yang telah disebutkan sebelumnya. Tahapan-

tahapan pada isolasi DNA bertujuan untuk mengeluarkan DNA dari dalam inti sel tanpa

adanya zat lain selain DNA, yang pada akhir proses isolasi dapat terlihat gumpalan DNA

tersebut.

Pada setiap tahapan digunakan berbagai jenis larutan, yaitu :

a. Buffer ekstraksi yang mengandung :

Tris-Hcl ( Thromethamine HCl) dan NaCl yang berfungsi sebagai buffer untuk

menjaga pH 8. Selain itu NaCl berfungsi untuk menjaga struktur double helix DNA.

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), yang dapat mengikat ion metal, sehingga

menghambat kerja enzim nuklease.

Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) untuk menghilangkan

polisakarida. (Sumber : http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods)

b. Sodium dodecyl sulfate (SDS) yang merupakan detergen untuk melisis dinding sel dan

mendenaturasi protein.

c. Potasium assetat merupakan senyawa pengikat debris sel dan protein untuk membentuk

senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel.

d. Kloroform : isoamil alkohol (24:1) untuk memdenaturasi protein pada kromosom.

e. Alkohol 100% untuk menggumpalkan DNA yang telah lepas dari sel.

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan

memisahkan DNA menurut berat jenisnya. Apabila pita hasil elektroforesis semakin luas

menandakan DNA telah menjadi potongan-potongan kecil, dimana potongan kecil tersebut

akan berjalan lebih cepat menuju elektroda positif dibandingkan potongan DNA yang lebih

besar. DNA memiliki muatan negatif sehingga akan bergerak menuju elektroda positif saat

di elektroforesis. Pita DNA hasil elektroforesis dapat dilihat melalui penyinaran dengan

menggunakan sinar UV, karena adanya etidium bromida sebagai pewarna DNA yang

menyebabkan flouresensi

LAMPIRAN GAMBAR

Vortexpenyimpanan di dalam es

Hasil isolasi DNA

http://clearlyexplained.com/culture/

health/electrophoresisgel.jpg

Penyinaran hasil elektroforesis

DNA di bawah sinar UV

www.siumed.edu

Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (PAGE)

Ultraviolet transiluminator

DAFTAR PUSTAKA

http://biologi.blogsome.com/2009/11/02/isolasi-dna/

http://www.macnature.com/2010/02/isolasi-dna-referensi-terpercaya.html

http://www.biotech.wisc.edu/Outreach/posterhandoutcollection/dnaextractionhandout.jpg

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif

http://isolasidna.blogspot.com/

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis_gel

http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular

http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods

http://www.ehow.com/how-does_5246239_dna-electrophoresis-method.html

http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html