ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО …...МУК 4.2.2872-11 . 3 ББК…. Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей

1

ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей

инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах

питания на основе ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией

Методические указания

МУК 4.2.2872-11

Издание официальное

Москва 2011

2

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации

4. 2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей

инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах

питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией


МУК 4.2.2872-11

3

ББК…. Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: Методические указания.–М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,, 2011. -… ...с. ISBN…. 1. Авторский коллектив:

Научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина, С.Ю.Батищева, И.Б.Быкова, А.В.Булахов, А.В.Ананьева),

ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ (В.И.Покровский, Г.А.Шипулин, А.Т.Подколзин, Т.А. Николаева). 2. Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому норми-рованию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благопо-лучия человека, протокол № ….от …………….2011. 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потре-бителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Россий-ской Федерации Г.Г.Онищенко ……………………………..2011 г. 4. Введены в действие с момента утверждения. 5. Введены впервые

БКК….

©Роспотребнадзор, 2011 © Федеральный Центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011

4

Содержание Содержание ..................................................................................................................................4 1. Область применения...............................................................................................................5 2. Определения, обозначения, сокращения ................................................................................5 3. Общие положения...................................................................................................................6 4. Сущность метода.....................................................................................................................7 5. Требования к выполнению анализов ......................................................................................8

5.3. Условия безопасного проведения работ .......................................................................... 8 5.4. Требования к подготовке персонала .............................................................................. 10 5.5. Условия выполнения измерений (детекции). ................................................................ 10

6. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды. ..............10 6.1. Аппаратура и инструменты ............................................................................................ 10 6.2. Лабораторная посуда и материалы.................................................................................... 12 6.3. Реактивы, питательные среды, дезсредства ......................................................................... 13 6.4. Тест-штаммы микроорганизмов .................................................................................... 16

7. Подготовка к проведению испытаний. .................................................................................17 7.1. Приготовление растворов и реактивов. ......................................................................... 17

7.1.1.Растворы и реактивы общего назначения ................................................................ 17 7.1.2. Растворы и реактивы предназначенные для выявления определенных групп патогенов............................................................................................................................ 17

7.2. Приготовление питательных сред.................................................................................. 18 8. Отбор и подготовка образцов к анализу...............................................................................22

8.1. Общие положения........................................................................................................... 22 8.2. Первичная обработка образцов пищевых продуктов и ................................................. 23 подготовка их к посеву в среды обогащения. ...................................................................... 23 8.3. Посев в среды обогащения ............................................................................................. 25 8.4. Подготовка образцов на средах для первичного обогащения к ПЦР-анализу............. 27 8.5. Подготовка штаммов бактериальных культур к ПЦР-анализу..................................... 28 8.6. Подготовка проб нативных пищевых продуктов к ПЦР-анализу................................. 29

9. Проведение анализа...............................................................................................................30 9.1. Экстракция ДНК из исследуемых образцов .................................................................. 30 9.2. Постановка контроля на жизнеспособность патогенных бактерий в исследуемых пищевых продуктах ............................................................................................................... 31

10. Проведение ПЦР..................................................................................................................31 11. Выдача результатов .............................................................................................................32 Библиографические ссылки. .....................................................................................................32 Приложение 1. ...........................................................................................................................34

5

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитар-ный врач Российской Федерации _____________________Г.Г. Онищенко

от 15 июня 2011 года Дата введения: с момента утверждения.

4.2. Методы контроля.

Биологические и микробиологические факторы

Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекцион-ных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гиб-

ридизационно-флуоресцентной детекцией


МУК 4.2.2872 -11 _____________________________________________________

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод ускоренного выявления (посредством ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией) в пищевых продуктах патогенных бактерий – возбудителей острых и хронических инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи (родов Salmonella, Shigella (в комплексе с энтероинвазивными E coli), вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, энтерогеморрагических веротоксигенных Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. видов C.jejuni, C.coli, C.lari, а также Listeria monocytogenes).

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Феде-ральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безо-пасности пищевых продуктов, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответ-ствующих исследований в установленном порядке.

2. Определения, обозначения, сокращения

ПЦР – полимеразная цепная реакция ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота РНК – рибонуклеиновая кислота FEP – детекция по «конечной точке» FRT – детекция в режиме «реального времени» ВКО – внутренний контрольный образец ОКИ – острые кишечные инфекции ТСБДЭ – триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом

6

ТСАДЭ – триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом ФБР – фосфатный буферный раствор ЗПВ – забуференная пептонная вода ЗФР – забуференный физиологический раствор

3. Общие положения.

3.1. Лабораторный контроль загрязнённости пищевых продуктов патогенными бакте-

риями с использованием традиционных культуральных методов анализа сопряжён с трудо-емкостью, длительностью. Даже в случае отрицательного результата требуется от 3-х до 7 дней для выдачи ответа. Этот срок увеличивается при идентификации изолятов биохимиче-скими и серологическими методами, что обусловливает проблемы при расследовании вспышек ОКИ и других заболеваний с пищевым путём передачи. Так, при вспышках шигел-лёза, занимающих ведущее место в структуре ОКИ пищевого происхождения в РФ, из-за низкой эффективности выделения возбудителя в чистой культуре из инкриминированных продуктов возникают значительные трудности при верификации инцидентов.

Наряду с этим, среди микробных контаминантов пищи получают всё большее рас-пространение возбудители новых и вновь возникших заболеваний с изменёнными свойст-вами, дополнительными факторами патогенности (по терминологии ФАО-ВОЗ «эмерд-жентные» патогены), такие как энтерогеморрагические E.coli (O157:H7 и другие серотипы) , Campylobacter jejuni, Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, Listeria monocytogenes. Культу-ральные методы зачастую не позволяют провести их чёткую дифференциацию от родствен-ных непатогенных штаммов, имеющих одинаковые фенотипические свойства. Это снижает достоверность результатов, осложняет оценку распространенности патогенов в пищевых продуктах, а также не гарантирует от необоснованных браковок продукции.

3.2. Существенно оптимизировать процедуры определения, сократить время иссле-дований и повысить специфичность позволяют новые технологии геномного анализа. Наи-более надёжным в последние годы признаётся анализ микробных нуклеиновых кислот и выявление специфичных участков ДНК, путём ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

3.3. Представленный в настоящих указаниях метод является альтернативным класси-ческому бактериологическому посеву и предусматривает ускоренное определение наличия или отсутствия ДНК, и соответственно, бактерий родов Salmonella, Shigella, вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, энтерогеморрагических Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. видов C.jejuni, C.coli, C.lari, Listeria monocytogenes в определенной массе (объеме) пищевого продукта, подвергнутого инкубации в жидких селективных питательных средах (при необходимости дополнительно прединкубации в неселективных средах).

3.4. Предварительная инкубация исследуемых продуктов в питательных средах явля-ется обязательным этапом анализа, обеспечивающим биологическое накопление возбудите-лей1.

3.5. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией также подлежит включению в комплексное тестирование подозрительных культур патогенных микроорганизмов, выде-

1 При наличии эпидемиологических данных о возможности массивного заражения пищевого продукта иско-мыми возбудителями и только в ходе расследования вспышек пищевых отравлений и инфекций допускается исследовать инкриминированные образцы нативных пищевых продуктов с целью получения предварительных данных о причинном агенте вспышки. При этом положительные результаты ПЦР-анализа нативных пищевых продуктов должны подтверждаться выделением возбудителя в культуре, а отрицательные результаты не должны интерпретироваться и не могут служить основанием для прекращения поиска возбудителя с предва-рительной инкубацией в питательных средах.

7

ленных из пищевых продуктов бактериологическими методами (согласно утвержденным в установленном порядке методам определения), с целью подтверждения их принадлежности к родам Salmonella, Shigella, Campylobacter (видов C.jejuni, C.coli, C.lari), Listeria (вида L. monocytogenes), энтерогеморрагическим E.coli и E.(Cr.) sakazakii в качестве дополнитель-ных к биохимическим и серологическим методам идентификации, в том числе в обязатель-ном порядке при:

- затруднениях идентификации Salmonella spp. – взамен расширенного набора биохи-мических тестов в случаях отсутствия агглютинации культуры с поливалентной диагности-ческой сальмонеллезной 0-сывороткой (А, В, С, D, E) и со смесью 0-сывороток редких групп при положительном результате стандартного набора биохимических тестов; при предполо-жительном результате в случае наличия агглютинации с сыворотками редких групп; при положительных результатах серологического исследования и нетипичных результатах био-химических тестов (отклонения по 2 и более признакам),

- идентификации энтерогеморрагических E.coli (O157:H7 и другие серотипы) - вза-мен расширенного набора биохимических тестов одновременно с подтверждением сероло-гической принадлежности к серогруппе 0157,

- идентификации L.monocytogenes - взамен расширенного набора биохимических тес-тов одновременно с определением наличия лецитиназной и β-гемолитической активности,

- идентификации других вышеперечисленных микроорганизмов при нетипичных ре-зультатах биохимических тестов (отклонения по 2 и более признакам).

3.6. Метод применяется для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля), скрининговых ис-следований для целей гигиенического мониторинга, санитарно-эпидемиологических экс-пертиз и оценок, санитарно-эпидемиологических расследований вспышек пищевых отрав-лений и инфекций с пищевым путем передачи, а также может быть использован для прове-дения производственного контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов.

4. Сущность метода

4.1. Принципом метода является выявление путём ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией последовательностей (фрагментов) ДНК, строго специфических для геномов бактерий родов Salmonella, Shigella, вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, веротоксигенных Escherichia coli, Listeria monocytogenes, термофильных Campylobacter spp. В основе ПЦР лежит многократное увеличение числа копий (амплификация) нуклеотидных фрагментов-мишеней ДНК, ферментом Taq-полимеразой в присутствии синтетических оли-гонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Гибридизация флуорес-центно-меченых олигонуклеотидных зондов, присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастани-ем флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала позволяет регист-рировать накопление специфического продукта амплификации.

4.2. Метод ускоренного выявления предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов пищевых продуктов в соответствующие неселективные и селектив-ные питательные среды, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, экстрак-цию (выделение) ДНК из культуральной жидкости2, амплификацию участка ДНК целевых бактерий со специфичными праймерами и гибридизационно-флуоресцентную детекцию ам-пликонов, осуществляемую в одном из двух вариантов: в режиме реального времени в ходе ПЦР (вариант FRT) либо после завершения амплификации (вариант FEP).

2 В случае исследования образцов нативных пищевых продуктов или бактериальных культур, выделенных из пищевых продуктов, - экстракция ДНК осуществляется из соответствующим образом подготовленных проб этих продуктов или чистых культур, выращенных на пластинчатых средах по п.п. 8.5.1.

8

При использовании варианта FEP детекция флуоресцентного сигнала осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора (по «конечной точке»), а при использовании варианта FRT – непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».

Выделение ДНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии внут-реннего контрольного образца (ВКО), используемого на всех этапах исследования, начиная с этапа экстракции ДНК.

Детекция амплифицированной ДНК целевого микроорганизма и ВКО проводится по самостоятельным раздельным каналам.

4.3 При положительных результатах обнаружения патогена жизнеспособность при-сутствующих в исследуемом продукте искомых микроорганизмов должна быть подтвержде-на бактериологическим посевом с соответствующим биохимическим и серологическим ти-пированием или ПЦР-анализом парных проб (прошедшей и не прошедшей культуральное обогащение) в режиме FRT.

4.3. Анализ осуществляется с применением коммерчески доступных комплектов реа-гентов, обеспечивающих амплификацию и детекцию ампликонов в одной пробирке, про-шедших регистрацию в РФ в установленном порядке после стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

5. Требования к выполнению анализов 5.1. Работа по выявлению бактериальных патогенов в пищевых продуктах должна

проводиться в лаборатории, выполняющей микробиологические и молекулярно-биологические (ПЦР) исследования и лицензированной на деятельность, связанную с ис-пользованием возбудителей инфекционных заболеваний 3-4 групп патогенности, с соблю-дением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроор-ганизмами 3-4 групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», а также дополнениями и изменениями к ним СП 1.3.2518–09 - «Дополнения и изменения №1 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (приложение), ГОСТ Р ИСО 7218-2008 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нук-леиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп пато-генности».

Исследуемые образцы пищевых продуктов следует рассматривать как инфекционно-опасные и организовывать их хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность ра-боты с микроорганизмами 3-4 групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитар-ных болезней».

5.2 Исследование осуществляется с применением описанных в настоящих указаниях методов культурального бактериологического анализа и коммерчески доступных ПЦР тест-систем с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, предна-значенных для применения в данной области и разрешенных к применению на территории РФ в установленном порядке. Для экстракции ДНК и ее детекции методом ПЦР должны применяться наборы реагентов, предусматривающие возможность использования внутрен-него контрольного образца, проходящего все этапы исследования и служащего для выявле-ния возможных ошибок при его проведении.

5.3. Условия безопасного проведения работ Процесс амплификации приводит к накоплению миллионов копий фрагментов ДНК,

специфичных для целевых организмов. При вскрытии ПЦР - пробирок, прошедших этап

9

амплификации в «чистых» зонах ПЦР лаборатории или в микробиологической лаборатории, продукты амплификации могут распространяться по лаборатории и обуславливать появле-ние ложно-положительных результатов исследований.

Для снижения риска распространения ампликонов и предотвращения контаминации необходимо соблюдать ниже перечисленные правила работы в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности»:

1) не открывать ПЦР-пробирки после амплификации, удалять отходы с продуктами ПЦР только в закрытом виде,

2) перед входом в рабочую зону снимать уже использованные перчатки. Заранее гото-вить новые перчатки, перед тем как покинуть рабочую зону,

3) сбрасывать наконечники с пипеток в пластиковый пакет и выносить его после каж-дого использования из рабочей зоны,

4) промывать рабочую зону после каждого использования дезсредством3, 5) для биологической защиты рабочей зоны использовать ультрафиолетовые облучате-

ли до и после работы в течение 15-30 мин, 6) деконтаминировать пипетки еженедельно согласно рекомендациям производителя

(121°С в течение 30 мин), 7) обрабатывать охлаждающие блоки в следующей последовательности: обработка дез-

средством2, ополаскивание водой и протирка сухой салфеткой перед размещением в холодильнике,

8) убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезсредства2, 9) утилизировать неиспользованные образцы и реактивы.

В случае обнаружения контаминации (положительный результат в ПЦР в гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией для отрицательного контрольного образца), вся рабочая зона должна быть подвергнута тщательной санитарной обработке. Для этого необходимо следовать перечисленным указаниям:

10) санитарную обработку проводить в перчатках, 11) протереть наружные поверхности раствором дезсредства2. Оставить жидкость на по-

верхности примерно на 10 мин, затем вытереть насухо одноразовыми салфетками. Затем протереть поверхности 70% этиловым спиртом. Облучить поверхности ульт-рафиолетом в течение ночи,

12) утилизировать все расходные материалы (наконечники для пипеток, растворы реа-гентов и т.д.), которые были извлечены из упаковок и частично израсходованы, пу-тем автоклавирования при 121°С в течение 30 мин,

13) очистить наружные поверхности всех используемых приборов и инструментов (ам-плификатор, пипетки и т.д.) с применением дезсредства и спирта,

14) простерилизовать пипетки и все использованные инструменты и приспособления, стойкие к автоклавированию, при 121°С в течение 30 мин или в соответствии с реко-мендациями производителей. При выполнении анализов также необходимо соблюдать требования техники безо-

пасности по ГОСТ 12.0.004-90, в том числе при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования пожарной безопасности ГОСТ 12.1.004-91 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на ам-плификатор, сушильный шкаф, центрифуги, в инструкциях по применению наборов реаген-

3 Дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»

10

тов (тест-системы) для экстракции ДНК и для выявления ДНК методом ПЦР с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией.

Необходимо избегать контакта компонентов наборов с кожей, глазами и слизистыми оболочками носа и рта; при попадании немедленно промыть пораженное место водой и об-ратиться за медицинской помощью.

5.4. Требования к подготовке персонала

Выполнение измерений может проводить только специально обученные специали-сты, способные после освоения техники ПЦР – анализа и приемов по эксплуатации аппара-туры, получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности. Персонал должен допускаться к работе в одноразовой лабораторной одежде (халат, шапочка, резиновые или пластиковые перчатки, маска, бахилы).

5.5. Условия выполнения измерений (детекции).

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях при: 1) температуре окружающего воздуха (20±5)°С, 2) атмосферном давлении (97±10) кПа, 3) относительной влажности (65±15)%.

Наборы реагентов (тест-системы) для экстракции ДНК и для выявления ДНК мето-дом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией должны применяться строго по назначению, согласно прилагаемых инструкций, и не использоваться по истечении срока годности.

6. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды.

6.1. Аппаратура и инструменты

Общего назначения

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН ± 0,01

ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильно- стерилизационный, позволяющий поддер-живать температуру в диапазоне от 50 до 200°С с погрешно-стью ± 2°С

Термостат суховоздушный с рабочей температурой 37˚С, рабочий диапазон от 20˚С до 60˚С, точность поддержания температуры ± 1°С.

Термостат суховоздушный с рабочей температурой 42˚С, рабочий диапазон от 20˚С до 60˚С, точность поддержания температуры ± 1°С.

Анаэробный инкубатор или настольная система для ана-эробного инкубирования

Баня водяная с подогревом , позволяющая поддерживать тем-пературу (37 ± 1)°С

Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддержи-вать температуру от 0 до 100°С

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический бинокулярный с увеличением

11

900х-1000х Стерилизаторы паровые медицинские ГОСТ 19569-89Е Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72

Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа «Микс-2», «Стомайкер» , «Максикатор»

Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) или лами-нарный шкаф класса биологической безопасности II тип А

Автоматическая станция для экстракции ДНК типа экстрактора NucliSENS® easyMAG® в комплекте

Компьютер, совместимый с программным обеспечением амплификатора/детектора, в комплекте с монитором, кла-виатурой, мышью, кабелем, компакт-дисками с информа-цией по эксплуатации и инструкциями по настройке при-бора

Аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость вращения 250 – 3000 мин -1.

Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13000 мин -1).

Термостат типа «ТЕРМО 24-15» для пробирок типа Эп-пендорф вместимостью 1,5 см3, диапазон температур от 15°С до 120°С – 2 шт

Автоматические дозаторы с переменным объемом дозирования (от 5 до 20 мм3 с шагом 0,01 мм3, с точностью ± 0,8% и от 20 до 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, с точностью ± 0,6%)

Диспенсер Распределительная емкость – объем 1-2,5 дм3 Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости

Насос вакуумный (водоструйный) Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше минус 16°С для хранения выделенных проб ДНК

ГОСТ 26678

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

Денситометр для бактериальных суспензий Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89 Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89 Скальпель хирургический, 15 см

ГОСТ 21240-89

Ложки столовые стальные Часы механические сигнальные ГОСТ 3145-84 Электроплитка ГОСТ 14919-83 Центрифуга, обеспечивающая 20000 х g Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)

При детекции FEP - «по конечной точке»: программируемый амплификатор

типа «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), «Gradient Palm Cycler»

12

(«Corbett Research», Ав-стралия), «MAXYGENE» («Axygen», США), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Bio-systems») или аналогич-ные по техническим ха-рактеристикам

флуоресцентный ПЦР-детектор

типа «AЛА-1/4» («Bio-San», Латвия), «Джин» («ДНК-Технология», Россия) или аналогич-ные по техническим ха-рактеристикам

одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР (плоская крышка, нестрипованные): а) объемом 0,2 см3 (для амплификаторов, адаптированных для ПЦР-пробирок 0,2 см3); б) объемом 0,5 см3 (для амплификаторов, адаптированных для ПЦР-пробирок 0,5 см3).

При детекции FRT - в режиме «реального времени»: программируемый амплификатор с системой детекции флуо-ресцентного сигнала в режиме «реального времени»

типа «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия), «Rotor-Gene Q» («Qia-gen», Германия), «iQ5» («Bio-Rad», США), «Mx3000P» («Stra-tagene», США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) или аналогич-ные по техническим ха-рактеристикам

одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР для ПЦР в реальном времени: а) на 0,2 см3 (плоская крышка, нестрипованные, для постановки в ротор на 36 пробирок) – для приборов с детекцией через дно пробирки; б) на 0,2 см3 (куполообразная крышка, для приборов с детекци-ей через крышку)

6.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага пергаментная Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81 Марля медицинская ГОСТ 9412-77

13

Колбы плоскодонные конические или круглые различной вместимости

ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82 Колбы стеклянные мерные плоскодонные вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 см3

ГОСТ 12738 – 77.

Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимо-стью 25, 100, 1000 см3

ГОСТ 1770 – 74.

Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вмести-мостью 0,2, 0,5, и 1,5 см3

Пробирки стрипованные для автоматического экстракто-ра ДНК

Микропипетки на 100-1000 мм3 с шагом 5,0 мм3, с точностью ± 0,5%

Наконечники одноразовые с фильтром для дозаторов с переменным объёмом дозирования от 5 до 20; от 20 до 200; от 200 до 1000 мм3; до 10 см3.

Штативы для микропробирок объемом 0,2, 0,5 см3 и 1,5 см3 (или в соответствии с используемыми комплектами реагентов)

Оптически прозрачные крышки для ПЦР-пробирок Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 ГОСТ 29227-91 Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82 Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75 Чашки биологические (Петри) стеклянные или одноразовые из полимерных материалов

ГОСТ 23932-90

Банки стеклянные широкогорлые на 250 см3 и 500 см3 с проб-ками (корковыми, ватно-марлевыми) или завинчивающимися крышками

Контейнеры стерильные из полимерных материалов с крыш-ками для отбора образцов

Спиртовки лабораторные стеклянные ГОСТ 23932-90 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100°С (цена деления шкалы 1°С)

ГОСТ 13646-68

Пакеты стерильные одноразовые для гомогенизаторов пери-стальтического типа

Пакеты газогенераторные для микроаэробного инкубиро-вания

Набор отраслевых стандартных образцов для визуальной оценки мутности микробных взвесей ОСО 42-28-85-04П

ГИСК им. Л.А. Тара-севича

Фильтры мембранные микроцеллюлозные №3 Система (аппарат) для мембранной фильтрации Стандарты Макфарланда №№ 1, 2, 3 Контейнер для сброса наконечников Петля бактериологическая калиброванная на 1 мм3 Одноразовые халаты, шапочки, маски, обувь или бахилы, одноразовые перчатки резиновые или латексные неопуд-ренные

6.3. Реактивы, питательные среды, дезсредства

14

Реагенты для проведения ПЦР

Комплект реагентов (набор) для выделения ДНК из ис-следуемого материала

ТУ 9398-003-01897593-2009 или аналогичный по техни-ческим характеристи-кам

Комплект реагентов (набор) для выделения ДНК/РНК из исследуемого материала

ТУ 9398-071-01897593-2008 или аналогичный по техни-ческим характеристи-кам

Комплекты реагентов (наборы) для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, обеспечивающие аналитическую чувствительность на уровне 1×103 ГЭ/см3 в отношении выявляемых фрагментов ДНК патогенных бактерий Cronobacter sakazakii, вероцитотоксигенных E.coli, Shigella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp. (видов C.jejuni, C.coli, C.lari) и Listeria monocytogenes, содержащие: - смеси олигонуклеотидных праймеров на участки ДНК бактерий и флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, комплементарных участкам амплифицируемых ДНК-мишеней; - полимеразу (TaqF), - смесь буфера и нуклеозидтрифосфатов, - ДНК-буфер, - положительные контрольные образцы этапа ПЦР со специфическими фрагментами ДНК искомых микроорганизмов и внутренним контрольным образцом, - отрицательный контрольный образец и внутренний неконкурентный контрольный образец этапа выделения, - минеральное масло для ПЦР.

силика магнитная в растворе для автоматизированной экстракции ДНК, NucliSens easyMAG Magnetic Silica

BioMerieux, Франция

буфер лизирующий для автоматизированной экстракции ДНК, NucliSens easyMAG Lysis Buffer


буфер для экстракции 1 для автоматизированной экстрак-ции ДНК, NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1






Питательные среды для обогащения микроорганизмов, приготовления бак-териальных взвесей и их компоненты:

15

стерильный фосфатный буфер с рН 7,2 ±0,1 для предвари-тельного неселективного обогащения бактерий E. (Cr.) sakazakii, стерильный изотонический 0,85 %-ный водный раствор хлори-да натрия для предварительного неселективного обогаще-ния бактерий E. (Cr.) sakazakii, среда Кесслер с глюкозой, бульон Мак-Конки с глюкозой, глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью,

по ГОСТ Р 52814-07, МУК 4.2.2428-08, ГOCT 26669-85, ГОСТ 29184-91

среда Кесслер с лактозой, лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, грам-негативный обогащающий бульон (GN-бульон) по Хайну,

по ГОСТ 30726-2001, ГОСТ Р 52816-07, МУК 4.2.992-00

селенитовая среда жидкая в модификации Лейфсона (се-ленитовый бульон), маннитный селенитовый бульон,

мясо-пептонный бульон или МПА с 1 % глюкозы, МПБ с 1 % глюкозы

по ГОСТ 29184-91, Инструкции о порядке расследования и проведе-ния лабораторных иссле-дований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых от-равлениях, М.-1975

забуференная пептонная вода для предварительного несе-лективного обогащения бактерий рода Salmonella, молоко сухое обезжиренное, среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон), питательная среда для накопления сальмонелл сухая (се-ленитовый бульон), Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон),

по ГОСТ Р 52814-07, МУ «Лабораторная диаг-ностика сальмонеллезов человека и животных, об-наружение сальмонелл в кормах, продуктах пита-ния и объектах внешней среды», М.-1990.

основа селективного бульона (Престона) для накопления кампилобактерий, основа селективного бульона (Дойла) для накопления кампилобактерий, кровь баранья дефибринированная стерильная, аэротолерантная добавка на основе натрия пировиноград-нокислого, железа (II) сернокислого, натрия метабисуль-фита, добавка антибиотиков для кампилобактерий-I (по Блэй-зер-Вонг), добавка антибиотиков модифицированная III (по Дойлу), добавка антибиотиков для кампилобактерий-IV, (по Пре-стону) модифицированная,

по МУК 4.2.2321-08

бульон Фрейзера для вторичного обогащения листерий, бульон Фрейзера для обогащения листерий, эскулин, железа аммонийного цитрат, литий хлористый, х.ч. или ч.д.а.,

МУК 4.2.1122-02

налидиксовая кислота, акрифлавина гидрохлорид (трипафлавин),

16

натрия гидроксид, хч,

гуанидина гидрохлорид, Sigma, США тритон Х-100, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), х.ч. ТУ 6-09-11-1721-83 трис-НСl, Sigma, США суспензия двуокиси кремния силикагель (SiO2), ацетон, х.ч., хлороформ водонасыщенный, ТУ 6-09-4263-76 2-меркаптоэтанол, х.ч. ТУ 6-09-08-1024-81. смесь газов 5%О2, 15% СО2 и 80% N2, х.ч. в баллонах, ацетон, хч, Вода деионизированная. ОСТ 11.029.003-80. Дезинфицирующие средства спирт этиловый ректификованный, ГОСТ Р 51652 – 2000 дезинфицирующие средства (0,2% раствор ДП-2Т, Дезо-лон и др.).

по МУ 1.3.1888-04 и СП 1.3.2322-08

Примечание. Допускается использование других реактивов, питательных сред и ди-агностических тест-систем, не хуже указанных выше, с аналогичными составом и техниче-скими характеристиками.

Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабаты-ваться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке; зарубежно-го производства – должны быть зарегистрированы в РФ и иметь международный сертифи-кат качества ИСО 9001:2008.

Использование диагностических тест-систем допускается после их регистрации в РФ в установленном порядке, после процедуры стандартизации относительно официально ут-вержденных методов анализа.

6.4. Тест-штаммы микроорганизмов

Listeria monocytogenes, типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам

паспортизированные и депониро-ванные в установленном порядке в ГИСК им. Л.А.Тарасевича

Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, типичный по куль-туральным, морфологическим и биохимическим свойст-вам


Сampylobacter jejuni, Сampylobacter coli, Сampylobacter lari, типичные по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам

паспортизированные и депониро-ванные в установленном порядке в ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск)

Salmonella typhimurium & enteritidis, типичные по культу-ральным, морфологическим и биохимическим свойст-вам


Shigella sonnei, типичные по культуральным, морфо-логическим и биохимическим свойствам


Примечание: Штаммы необходимо сохранять в лиофильно высушенном виде. При регулярном использовании допускается сохранять в полужидком агаре для бруцелл в про-

17

бирках с плотно притертыми пробками, в защищенном от света месте, при температуре (5±1)ºС с еженедельным пересевом.

7. Подготовка к проведению испытаний.

7.1. Приготовление растворов и реактивов. 7.1.1.Растворы и реактивы общего назначения

7.1.1.1. Изотонический 0,85%-й водный раствор хлорида натрия готовят в соответст-вии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, пита-тельных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

7.1.1.2. Растворы и реактивы для окраски микроскопических препаратов по Граму, растворы красителей (кристаллического фиолетового, генцианвиолета, метилвиолета, брил-лиантового зелёного, бромкрезолового пурпурного и др.), растворы гидроокиси натрия и соляной кислоты для нейтрализации высококислотных продуктов готовят в соответствии ГОСТ 10444.1 или по прописям, указанным на этикетках соответствующих препаратов промышленного производства.

7.1.1.3. Фосфатный буферный раствор (ФБР) с рН (7,2 ± 0,1) готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

7.1.1.3.1. ФБР: однозамещенный фосфорнокислый калий безводный, КН2РО4 - 0,45 г, двухзамещенный фосфорнокислый натрий безводный, Na2HPO4 - 5,34 г, дистиллированная вода 1000 см3.

Растворяют ингредиенты в дистиллированной воде в мерной колбе, доводят объём до метки, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,1) при температуре 25°C. Раствор разливают в широкогорлые колбы подходящей вместимости с учётом засеваемой навески продукта (например, 900 см3 при посеве 100 г об-разца). Стерилизуют при температуре (121±1,0)°С в течение 15 мин.

7.1.1.3.2. При добавлении к 1 дм3 ФБР хлористого натрия в количестве 9 г до стери-лизации получают фосфатный буферный 0,9% раствор NaCl.

7.1.1.4. Забуференную пептонную воду (ЗПВ) готовят в соответствии с нижесле-дующей прописью: пептон – 10 г, хлористый натрий – 5 г, двухзамещенный фосфорнокислый натрий 12-водный, Na2HPO4х12 Н2О – 9 г, однозамещенный фосфорнокислый калий, КН2РО4 – 1,5 г, вода – 1000 см3.

Растворяют ингредиенты в воде при нагревании, доводят объём до метки, устанавли-вают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,0±0,2) при температуре 25°C. Разливают в широкогорлые колбы и флаконы подходящей вместимости с учётом за-севаемой навески продукта (например, 225 см3 при посеве 25 г, 450 см3 при посеве 50 г об-разца и т.п.). Стерилизуют при температуре (121±1,0)°С в течение 15 мин.

7.1.2. Растворы и реактивы предназначенные для выявления определенных групп патоге-нов

7.1.2.1 ЗПВ с обезжиренным молочным порошком для неселективного обогащения при исследовании какао и какаосодержащих продуктов на содержание бактерий рода Sal-monella готовят в соответствии с нижеследующей прописью: перед стерилизацией в 1000 см3 ЗПВ добавляют 100 г обезжиренного молочного порошка.

7.1.2.2 Аэротолерантную добавку для селективных бульонов Престона и Дойла гото-вят в соответствии с нижеследующей прописью: натрий пировинограднокислый - 6,25 г, железо (II) сернокислое – 6,25 г,

18

натрий метабисульфит - 6,25 г, стерильная дистиллированная вода – 100 см3.

Растворить натрий пировинограднокислый в 10–20 см3 стерильной дистиллирован-ной воды, после растворения довести объем воды до 100 см3. Добавить железо (II) серно-кислое и натрия метабисульфит. Разлить в пробирки по 4 см3. Хранить в защищенном от света месте при температуре минус 20ºС не более 1 месяца. Раствор чрезвычайно чувстви-телен к воздействию света, после его добавления к питательным средам их необходимо со-хранять в защищенном от света месте.

7.2. Приготовление питательных сред

7.2.1. Среды сухие промышленного изготовления, аналогичные поименованным в п. 6.3., готовят согласно прописям, указанным на этикетках.

Допускается применение сред лабораторного приготовления из отдельных компо-нентов, в соответствии с нижеследующими п.п.:

7.2.2. Питательный агар с 1 % глюкозы и питательный бульон с 1 % глюкозы (МПА с 1 % глюкозы, МПБ с 1 % глюкозы) готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микро-биологическом анализе».

7.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (ТСБДЭ и ТСАДЭ) готовят в соответствии с нижеследующей про-писью (г/дм3): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый -3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар мик-робиологический (для ТСАДЭ) - 15,0.

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемеши-вают, устанавливают рН 7,3±0,2 и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Готовые сре-ды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8°С.

7.2.4. Среду Кесслер с глюкозой готовят в соответствии с нижеследующей прописью: пептон – 10 г, глюкоза – 2,5 г, желчь крупного рогатого скота сухая – 5 г (натуральная 50 см3), 1%-ный водный раствор кристаллического фиолетового (генцианвиолета, метилвиолета) – 2 см3, дистиллированная вода – 1000 см3. Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, доводят объём до 1 дм3, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,3±0,2) при температуре 25°C. Разливают в пробирки с по-плавками по 10 см3, автоклавируют при (114±1,0)°С в течение 20 мин.

7.2.5. Глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью готовят в соответствии с нижеследующей прописью: пептон – 10 г, глюкоза – 5 г, двухзамещенный фосфорнокислый натрий безводный, Na2HPO4 – 6,45 г, однозамещенный фосфорнокислый калий безводный, КН2РО4 – 2 г, желчь крупного рогатого скота сухая – 20 г (натуральная 200 см3), 0,5%-ный водный раствор бриллиантового зеленого – 3 см3, дистиллированная вода – до 1000 см3.

19

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, доводят объём до 1 дм3, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы он со-ставлял (7,2±0,1) при температуре 25°C. после чего повторно доводят до кипения. Разлива-ют в стерильные пробирки с поплавками по 10 см3.

7.2.6. Бульон Мак-Конки с глюкозой готовят в соответствии с нижеследующей пропи-сью: пептон – 20 г, глюкоза – 10 г, хлористый натрий – 5 г, желчь крупного рогатого скота сухая – 5 г (натуральная 50 см3), 1,0%-ный щелочной (в растворе гидроокиси натрия с концентрацией 0,02 моль/дм3) раствор бромкрезолового пурпурного – 1 см3, дистиллированная вода – до 1000 см3.

Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, доводят объём до 1 дм3, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,1) при температуре 25°C. Разливают в пробирки с по-плавками по 10 см3, автоклавируют при (121±1,0)°С в течение 15 мин.

7.2.7. Среду Кесслер с лактозой готовят в соответствии с нижеследующей прописью: пептон – 10 г, лактоза – 2,5 г, желчь крупного рогатого скота сухая – 5 г (натуральная 50 см3), 1%-ный водный раствор кристаллического фиолетового (генцианвиолета, метилвиолета) – 2 см3, дистиллированная вода – до 1000 см3. Компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объём до 1 дм3, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилиза-ции он составлял (7,2±0,1) при температуре 25°C. Разливают в пробирки с поплавками по 10 см3 или в колбы (флаконы) по 225 см3, автоклавируют при (115±1,0)°С в течение 20 мин.

7.2.8. Лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью готовят в соответствии с нижеследующей прописью: Ферментативный перевар казеина – 10 г, лактоза – 10 г, желчь крупного рогатого скота сухая – 20 г (натуральная 200 см3), 0,5%-ный водный раствор бриллиантового зелёного – 2,66 см3, дистиллированная вода – до 1000 см3. При нагревании растворяют компоненты в воде. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,2) при температуре 25°C. Разливают в пробирки с поплавками по 10 см3 или в колбы (флаконы) по 225 см3, автоклавируют при (121±1,0)°С в течение 15 мин. 7.2.9. Грам-негативный обогащающий бульон (GN-бульон) по Хайну готовят по про-писи, указанной на этикетке из сухой среды промышленного производства «GN Enrichment Broth асе.to HAJNA», Cat. №10756, фирма «MERCK», Германия или Cat. № М 242, фирма «Нi-Media», Индия.

7.2.10. Селенитовый бульон в модификации Лейфсона готовят в соответствии с ни-жеследующей прописью: кислый селенистокислый натрий (NaHSeO3) – 4 г, пептон – 5 г,

20

натрий фосфорнокислый однозамещённый безводный - 3 г, натрий фосфорнокислый двухзамещённый безводный – 7 г, лактоза – 4 г, вода дистиллированная – до 1000 см3.

Среду готовят из 2-х растворов. Раствор 1: смешивают компоненты и при нагревании растворяют в воде. Путём изменения количественные соотношений фосфатов устанавлива-ют рН 7,0±0,1. Разливают во флаконы или колбы по 100 см3, стерилизуют при (112±1)°С 30 мин. Раствор можно хранить в холодильнике 1-2 мес. Раствор 2: 10%-й раствор кислого се-ленистокислого натрия готовят ex tempore на стерильной дистиллированной воде. Перед началом посева в каждый флакон с 100 см3 раствора 1 добавляют по 4 см3 раствора 2. Готовую среду асептически разливают в стерильные пробирки по 10 см3 или в колбы (фла-коны) по 225 см3 и плотно закрывают пробками. Дальнейшей стерилизации не требуется.

7.2.11. Маннитный селенитовый бульон готовят в соответствии с нижеследующей прописью: пептон – 5 г, маннит -4 г, натрия фосфат – 10 г, кислый селенистокислый натрий – 4 г, вода дистиллированная – 1000 см3. В 1000 см3 дистиллированной воды добавить 4 г натрия селенистокислого кислого. После перемешивания добавляют остальные ингредиенты, вновь перемешивают при подог-ревании до полного растворения солей, разливают в колбы (флаконы) по 225 см3. Стерили-зуют текучим паром в течение 10 мин.

7.2.12. Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

Раствор 1: ферментативный гидролизат сои – 5 г, хлористый натрий – 8 г, двухзамещенный фосфорнокислый калий безводный, К2HPO4 – 0,2 г, однозамещенный фосфорнокислый калий безводный, КН2РО4 – 1,4 г, дистиллированная вода – 1000 см3. Компоненты растворяют в воде при нагревании до температуры 70°С. Раствор гото-вят за день до приготовления среды. Раствор 2: хлористый магний 6-водный (MgCl2 x 6H2O) – 400 г, вода дистиллированная – 1000 см3. Растворяют хлористый магний в воде, переносят в бутыль из темного стекла с при-тёртой пробкой и хранят при комнатной температуре. В виду гигроскопичности хлористого магния раствор следует готовить, используя вновь вскрытую упаковку реактива. Раствор 3: малахитовый зелёный оксалат – 0,4 г, вода дистиллированная – 100 см3. Готовят раствор, растирая малахитовый зелёный оксалат в ступке. Переливают в мерную колбу, доводят водой до метки. Хранят в бутылке из тёмного стекла не более 8 мес. Среду готовят, прибавляя к 1000 см3 раствора 1 100 см3 раствора 2 и 10 см3 рас-твора 3. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (5,2±0,2) при температуре 25°C. Разливают в пробирки по 10 см3, автоклавируют при (115±1,0)°С в течение 15 мин.

21

7.2.13. Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) готовят в соответст-вии с прописью, указанной в ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579-2002) «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella», Приложение В, п.4.

7.2.14. Селективный бульон Престона для накопления кампилобактерий готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

Основа среды: пептон – 10 г, мясной экстракт – 10 г, натрия хлорид – 5 г, вода – 920 см3. Растворяют основные компоненты в дистиллированной воде. При необходимости подогре-вают до кипения для полного растворения частиц. Устанавливают рН 7,5±0,2 с помощью 0,1 М HCl или 0,1 М NaOH. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут. Остужают до 45-50ºС.

Готовая среда: Перед использованием в 920 см3 бульона асептически добавляют: 70 см3 стерильной дефиб-ринированной крови барана; растворенное в 50%-ном растворе ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков для кампилобактерий IV (по Престону) и растворен-ное в стерильной дистиллированной воде содержимое двух флакончиков ростовой добавки для кампилобактерий или 4 см3 аэротолерантной добавки по п.7.1.4., тщательно перемеши-вают и разливают среду в соответствующие емкости, в количествах, необходимых для про-ведения исследования. 7.2.15. Селективный бульон Дойла для накопления кампилобактерий готовят в соответствии с нижеследующей прописью Основа среды: гидролизат казеина – 10 г, пептический перевар животной ткани – 10 г, дрожжевой экстракт – 2 г, глюкоза – 1 г, натрия хлорид – 5 г, натрия бисульфит – 0,1, натрия сукцинат – 3 г, L-цистеина гидрохлорид – 0,1 г, дистиллированная вода – 920 см3. Растворяют сухую основу порошка в дистиллированной воде (при использовании готовой основы указанного состава промышленного изготовления количество согласно прописи на этикетке). При необходимости подогревают до кипения для полного растворения частиц. Устанавливают рН (7,0 ± 0,2) при 25°С. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут. Остужают до температуры 45оС.

Готовая среда: Перед использованием в 460 см3 основы асептически добавляют 35 см3 стерильной дефиб-ринированной крови барана, а также растворенное в 5 мл 50%-ного раствора этанола со-держимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков модифицированной III (по Дойлу). Тща-тельно перемешивают и разливают в соответствующие емкости, в количествах, необходи-мых для проведения исследования. 7.2.16. Бульоны Фрейзера для предварительного селективного (первичного) обога-щения и селективного (вторичного) обогащения листерий готовят в соответствии с ниже-следующей прописью:

Основа среды*: ферментативный гидролизат казеина - 5,0 г,

22

пептон - 5,0 г, мясной экстракт - 5,0 г, дрожжевой экстракт - 5,0 г, натрий хлористый - 20,0 г, калий фосфорнокислый однозамещённый безводный - 1,35 г, натрий фосфорнокислый двухзамещённый безводный – 12 г, эскулин - 1,0 г, литий хлористый - 3,0 г, железо аммонийное цитрат - 0,25 г.

Растворяют компоненты в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемеши-вают, устанавливают рН (7,2±0,2) и автоклавируют при 121°С 15 мин. *) – допускается го-товить основу среды без добавления эскулина и цитрата железа аммонийного.

Готовые среды: В зависимости от предназначения среды перед употреблением к 1 дм3 основы бульо-

на Фрейзера асептически добавляют селективные компоненты, предварительно растворён-ные в 10 см3 стерильного раствора гидроокиси натрия с концентрацией 0,2 г/дм3, в количе-стве: 7.2.16.1. для предварительного селективного обогащения:

налидиксовая кислота - 10 мг, акрифлавина гидрохлорид – 12,5 мг.

7.2.16.2. для селективного обога-щения:

налидиксовая кислота - 20 мг, акрифлавина гидрохлорид - 25 мг.

Готовые среды разливают в стерильные колбы: бульон Фрейзера для предваритель-ного селективного обогащения - в объёмах, в 9 раз превышающих массу (объём) навески засеваемого продукта; бульон Фрейзера для селективного обогащения – по 90 см3, и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 6°С не более 3 недель. 8. Отбор и подготовка образцов к анализу.

8.1. Общие положения

8.1.1. Отбор образцов пищевых продуктов для исследований проводят в установлен-ном порядке согласно методам отбора проб по ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ Р ИСО 7218-2008 «Микробиология пищевых про-дуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологиче-ским исследованиям», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», Инструкции о порядке расследования и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях, М.-1975, а также в соответствии с требованиями норма-тивных и технических документов на конкретные виды продуктов.

8.1.2. От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в ко-личестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребитель-ской тары. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной отбирают точечные пробы с помощью стерильных инструментов из разных мест с различной глубины, включая поверхность, небольшими порциями (около 50 г), в ко-торых должны быть представлены все компоненты продукта. Пробы жидких и полужидких продуктов отбирают после тщательного перемешивания. Точечные пробы соединяют в объ-единённую пробу и перемешивают.

8.1.3. Общая масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования (200±50) г (см3). Допускается раздельное упаковывание и после-дующее исследование точечных проб.

23

8.1.4. Пробы, взятые для исследования, помещают в стерильные флаконы, банки с корковыми или ватно-марлевыми пробками или завинчивающимися крышками; пробы в потребительской таре – в новые пакеты из полимерных материалов или плотной бумаги.

Пробы сыпучих продуктов допускается отбирать в стерильные пакеты из нескольких слоёв плотной бумаги; суточные пробы блюд – непосредственно в той посуде, в которой они хранились в холодильнике.

Для анализа на наличие микроаэрофильных бактерий рода Campylobacter пробы твердых продуктов отбирают по МУК 4.2.2321-08 в стерильные газонепроницаемые пакеты, пробы жидких продуктов - в герметично закрывающуюся стерильную стеклянную посуду или иные ёмкости и приспособления, ограничивающие доступ кислорода.

8.1.5. Отобранные образцы пломбируют или опечатывают, маркируют в установлен-ном порядке.

8.1.6. Доставка образцов скоропортящихся продуктов в лабораторию осуществляют в термоконтейнерах при температуре не выше 6°С; замороженных продуктов – при темпера-туре, указанной в нормативной или технической документации на продукт. Анализ достав-ленных образцов проводят по возможности в кратчайшие сроки, но не более чем через 4 ча-са от момента отбора.

8.2. Первичная обработка образцов пищевых продуктов и подготовка их к посеву в среды обогащения.

8.2.1. Для предотвращения ингибиции или утраты жизнеспособности патогенной флоры, все манипуляции с пробами пищевых продуктов необходимо осуществлять с учётом биологических особенностей и чувствительности искомых патогенных бактерий к измене-ниям температуры, рН и редокс-потенциала, воздействию УФ, нагреванию, длительному хранению.

8.2.2. До проведения анализа пробы сохраняют в сухом защищенном от света месте, в том числе образцы скоропортящихся продуктов - при температуре (5±1)ºС, охлаждённых сырых мясных и рыбных продуктов - при температуре (2±2)ºС . После вскрытия упаковки пробы подвергают исследованию немедленно.

8.2.3. Подготовку проб проводят по ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», ГОСТ Р ИСО 7218-2008 «Микробио-логия пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям», а также в соответствии с действующими норматив-но-методическими документами на конкретные виды продуктов:

- пробы мяса, включая мясо птицы, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбас-ных изделий и других мясных продуктов – по ГОСТ Р 51448-99 (ИСО 31002-88) «Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований», ГОСТ 21237-75 «Мясо. Методы бактериологического анализа», ГОСТ Р 52675-2006 «Полуфабри-каты мясные и мясосодержащие. Общие технические условия», ГОСТ 9958-81 «Изделия колбасные и продукты из мяса», ГОСТ 9792-73 «Колбасные изделия и продукты из свини-ны, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц», ГОСТ 7702.2.0-95 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим испытаниям»;

- проб молока, молочных и молокосодержащих продуктов – по ГОСТ 3622-68 «Мо-локо и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию», ГОСТ Р 53430-2009 «Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа», ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приёмки. Методы отбора и подготовки проб к анализу»;

- проб рыбы, рыбных и морепродуктов – по ГОСТ 31339-2006 «Рыба, нерыбные объ-екты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб»;

24

- проб плодоовощной продукции – по ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки пло-дов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб»; быстрозамороженных и поверхно-стно-контаминированных плодоовощных продуктов по «Инструкции по микробиологиче-скому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции» (МЗ СССР 29.09.89);

- проб детского и диетического питания – по МУК 4.2.577-96 «Методы микробиоло-гического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов»;

- проб кремово-кондитерских изделий – по МУК 4.2.762-99 «Методы микробиологи-ческого контроля готовых изделий с кремом»;

- жировых продуктов – по ГОСТ Р 52179-2003 «Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля» и ГОСТ 30004.2-93 «Майонезы. Правила приёмки и методы испытаний» ГОСТ Р 52969-2008 Масло сливочное. Технические условия; ГОСТ Р 52971-2008 Масло топленое и жир молочный. Технические условия

- напитков – ГОСТ 6687.0-86 «Продукция безалкогольной промышленности. Прави-ла приемки и методы отбора проб». ГОСТ 30712-2001 «Продукты безалкогольной промыш-ленности. Методы микробиологического анализа»

- продуктов и блюд общественного питания – ГОСТ Р 50763-2007 «Услуги общест-венного питания. Продукция общественного питания, реализуемая населению. Общие тех-нические условия».

8.2.4. Замороженные продукты предварительно размораживают в защищенном от света месте при температуре (2±2)ºС в течение не более 18 часов, или в течение 1 часа в термостате при температуре (19±1)ºС.

Пробы жировых продуктов (топленое масло, молочный жир, спрэды, маргарины. кремы) расплавляют при температуре 40-45ºС на водяной бане, перемешивают до получе-ния однородной эмульсии; масло сливочное и мороженое - до сметанообразной консистен-ции.

8.2.5. Отобранные объединённые образцы доводят до однородной консистенции для суспендирования содержащихся в пробе микроорганизмов: жидкие и порошкообразные пе-ремешивают, твёрдые измельчают в перистальтическом или ножевом гомогенизаторе (при необходимости плотные пробы предварительно измельчают ножницами или добавляют оп-ределённые количества соответствующей среды для неселективного или селективного обо-гащения) с соблюдением требований асептики..

При исследовании на наличие микроаэрофильных бактерий рода Campylobacter про-дукт измельчают только в перистальтическом гомогенизаторе или в фарфоровой ступке, из-бегая активного перемешивания; жидкие продукты перемешивают круговыми движениями.

8.2.6. Из суспензии или гомогената готовят навеску необходимой массы в стерильной чашке Петри, в стерильном контейнере с крышкой или бюксе, на куске стерильного перга-мента4. Если нормативной документацией не предусмотрено иное, для пищевых продуктов и блюд массового потребления масса навески (объём) для анализа на патогены должна со-ставлять (25±0,1) г(см3), не менее. Величина навески для продуктов детского и диетическо-го питания находится в диапазоне от (25±0,1) – (300±1) г (см3) и должна определяться уста-новленными гигиеническими нормативами.

8.2.7. От подготовленной пробы жировых продуктов отбирают навеску не менее 50 г, которую центрифугируют при 10000 - 20000×g (12000 -16000 об/мин) в течение 1 мин при охлаждении (допускается проводить центрифугирование при температуре не выше 15°С). Удаляют асептически супернатант и слой жира, исследованию подвергают седимент (оса-док).

4 При отмеривании навески плотных продуктов должно учитываться количество добавленной при гомогениза-ции жидкости (среды для обогащения).

25

8.2.8. В кислых или кислотосодержащих (с рН<6,0) пищевых продуктах жидких для предотвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более рН при посеве доводят рН аналитической навески до (7,0±0,2) стерильными растворами гидроокиси натрия и соляной кислоты перед посевом; в высококислотных продуктах твёрдых - рН доводят до (7,0±0,2) после посева непосредственно в посевной жидкости. Измерения рН проводят в условиях асептики.

8.2.9. Приготовление объединенной пробы, навесок продукта и посев осуществляют в максимально короткие сроки.

8.3. Посев в среды обогащения

8.3.1. Для подращивания находящихся в пищевых продуктах патогенных бактерий и накопления их биомассы подготовленные по п.8.2. образцы засевают в жидкие питательные среды и инкубируют в соответствии с процедурами обогащения, предусмотренными утвер-ждёнными в установленном порядке методами исследований для конкретных микроорга-низмов.

Материалом для дальнейшего исследования в ПЦР служат пробы культуральной жидкости, представляющей собой биомассу искомых микроорганизмов с совокупностью образованных ими продуктов метаболизма в питательных средах для селективного обога-щения, полученную при оптимальных для данных микроорганизмов режимах инкубации.

8.3.2. Первичный посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Salmonella проводят в неселективную жидкую среду [5, 8] - ЗПВ (п.7.1.5.), подогретую до (37±1)°С, при соотношении навески продукта и среды 1 : 9, не менее. Например, навеску массой 25 г засевают в 225 см3 ЗПВ, 50 г – в 450 см3 ЗПВ и т.п. Инкубируют при этой тем-пературе (18±2) часа. При исследовании какао и какаосодержащих продуктов используют ЗПВ с обезжиренным молочным порошком (п.7.1.6.), в которую после 2 часов инкубации добавляют 0,5% водный раствор бриллиантового зелёного из расчёта 3,6 см3 на 1 дм3 ино-кулята. По истечении инкубации в ЗПВ проводят вторичное обогащение параллельно в двух жидких селективных средах: по п.7.2.12. (Раппапорта-Вассилиадиса с соей) и одной из двух сред по п.7.2.10. (селенитовом бульоне) или п.7.2.13. (Мюллер-Кауфман тетратионатном бульоне), для чего по 1 см3 инокулята в ЗПВ пересевают в 10 см3 каждой из указанных сред. Посевы в среде Раппапорта-Вассилиадиса с соей инкубируют при (41,5±1)°С 24 часа, в се-ленитовом бульоне и Мюллер-Кауфман тетратионатном бульоне при (37±1)°С 24 часа.

Допускается высевать образцы свежих пищевых продуктов, не содержащих субле-тально повреждённых бактерий рода Salmonella в результате сушки, замораживания, непо-средственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения, при соотноше-нии продукта и среды 1 : 9, не менее, при тех же режимах инкубации.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость среды Раппапорта-Вассилиадиса с соей и одной из двух сред - селенитового бульона или Мюллер-Кауфман тетратионатного бульона.

8.3.3. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Shigella проводят не-посредственно в среды селективного обогащения - селенитовый бульон в модификации Лейфсона (п.7.2.10.) и маннитный селенитовый бульон (п. 7.2.11.), используя соотношение 9 : 1 (среда : материал) по [6, 15]. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18 часов, не более. Дальнейшая инкубация может привести к ингибиции роста бак-терий рода Shigella, чувствительных к накоплению кислых продуктов метаболизма.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость обеих вышеуказан-ных селективных сред.

8.3.4. Первичный посев пищевых продуктов для неселективного накопления энтеро-геморрагических веротоксигенных E.coli, в том числе серотипа 0157:Н7, проводят анало-

26

гично посеву на бактерии рода Salmonella, при соотношении навески продукта и среды 1 : 9, засевая по 25 г пробы в 225 см3 неселективной жидкой среды ЗПВ по п.7.1.5., подогретой до (37±1)°С по [3, 14]. Инкубируют при этой температуре (18±2) часа.

По истечении инкубации в ЗПВ проводят вторичное обогащение, для чего по 1 см3 инокулята пересевают параллельно в пробирки с 10 см3 жидкой селективной среды с лакто-зой: Кесслер с лактозой по 7.2.7., лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью по п. 7.2.8., грам-негативный обогащающий бульон (GN-бульон) по Хайну по п. 7.2.9.

Молочные продукты подлежат посеву только в среду Кесслер с лактозой по 7.2.7. Посевы термостатируют при (37±1)°С в течение 18-24 час. Допускается высевать образцы свежих пищевых продуктов (мясопродукты сырые,

молоко-сырьё, цельномолочные продукты, в том числе творог, сыр, плодоовощные продук-ты), не содержащих сублетально повреждённых веротоксигенных E.coli в результате сушки, замораживания, непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обога-щения, при соотношении продукта и среды 1 : 9, не менее, при тех же режимах инкубации.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость любой из вышеука-занных селективных сред.

При необходимости подтверждения отсутствия веротоксигенных штаммов в массе продукта, в которой нормируется отсутствие E.coli (продукты и блюда общественного пи-тания, колбасы и мясопродукты ферментированные), посев производят по [3]. При этом подготовленные по п. 8.2. навески продуктов нормируемой массы или их соответствующие децимальные разведения в ЗПВ засевают непосредственно в пробирки с селективными сре-дами с лактозой по п.п.7.2.7. или 7.2.8. Посевы просматривают через 18-24 часа инкубации при (37±1)°С, отмечая образование кислоты и газа из лактозы (при отсутствии признаков роста инкубируют посевы ещё 24 часа), после чего используют для исследования в ПЦР.

8.3.5. Первичный посев пищевых продуктов для детей раннего возраста (молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей I года жизни, подлежащие контролю на наличие E. (Cr.) sakazakii согласно [13]) проводят в неселективные жидкие среды: ФБР (п.7.1.3.1.) или ЗПВ (п.7.1.5.), исходя из соотношения навески продукта и среды 1:10.

К навеске массой (300±1) г добавляют 2,7 дм3 неселективной среды, подогретой до (37±1)°С, термостатируют при температуре (37±1)°С в течение 18-24 часов.

По истечении инкубации в ФБР или ЗПВ проводят вторичное обогащение, для чего по 10 см3 суспензии пересевают в 90 см3 жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae – среду Кесслер с глюкозой (п.7.2.4.), или глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью (п.7.2.5.), или бульон Мак-Конки (п.7.2.6.). Посевы тер-мостатируют при температуре (37±1)°С в течение (22±2) часов.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость не менее чем из 2-х указанных выше питательных сред для селективного обогащения.

8.3.6. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Campylobacter про-водят непосредственно в среду селективного обогащения.

К необходимому количеству подготовленной по п.п. 8.1.4. и 8.2.5. пробы добавляют 9-кратный объем селективного бульона Престона (п.7.2.14.) или селективного бульона Дой-ла (п.7.2.15.). При исследовании жировых молочных продуктов седимент, приготовленный согласно п.8.2.7., предварительно растворяют в 10 см3 обогащающего бульона и добавляют к остальному объёму среды. Полученную взвесь инкубируют в течение 4 часов при 37°С (а в случае посевов замороженных продуктов или продуктов, которые хранились более 10 дней, – в течение 3 часов при температуре 32°С и 2 часов при 37°С). Далее температуру ин-кубации изменяют, и все посевы продолжают инкубировать в течение 18-24 часов при (42±1)°С.

27

Инкубация на всех этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях в соответ-ствии с [12].

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость любой из вышеука-занных селективных сред.

8.3.7. Первичный посев пищевых продуктов для накопления бактерий L.monocytogenes проводят в бульон Фрейзера для предварительного селективного обогаще-ния (п. 7.2.16.1.). Подготовленную навеску массой 25 г(см3) вносят непосредственно в 225 см3 среды, предварительно прогретой в течение 15 минут при температуре 45оС. Содержи-мое в колбе встряхивают круговыми движениями руки в радиусе 30 см. При необходимости анализа других масс (объёмов) продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1 : 9 по объему [4, 9].

Посевы термостатируют при (37±1)оС в течение (24±2) часов. В среде предобогаще-ния, содержащий эскулин и цитрат железа аммонийного, отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria, способных к гидролизу гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На среде без эскулина почернения не наблюдается.

После инкубации продукта в среде для первичного обогащения независимо от нали-чия или отсутствия признаков роста, в том числе почернения, пересевают 1,0 см3 суспензии в 10 см3 бульона Фрейзера для вторичного селективного обогащения листерий по п. 7.2.16.2., предварительно нагретого до температуры 41оС. Посевы термостатируют при тем-пературе (37±1)оС в течение (24±2) часов.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость среды (бульона Фрейзера) для вторичного селективного обогащения листерий.

Допускается использовать культуральную жидкость среды (бульона Фрейзера) для первичного селективного обогащения листерий при наличии в нём признаков роста (почер-нение, помутнение) без проведения этапа вторичного обогащения.

8.4. Подготовка образцов на средах для первичного обогащения к ПЦР-анализу 8.4.1. Подготовленные по п.п.8.3.2.-8.3.7. образцы используют для ПЦР-анализа сразу

после окончания инкубации. Для подтверждения жизнеспособности допускается однократ-ное замораживание (сразу после инокуляции в среду обогащения) и хранение образцов культуральной жидкости при температуре минус 20оС на время инкубации парного образ-ца.

8.4.2. При подтверждении жизнеспособности выявляемых патогенных микроорганиз-мов путём ПЦР-анализа в режиме реального времени (п.9.2.2.), параллельно с пробами, обогащаемыми в питательных средах, готовят контрольные образцы пищевых продуктов, не подвергающиеся инкубации.

Эти образцы после инокуляции подвергают замораживанию и сохраняют до момента исследования в ПЦР при температуре минус 20°С исследуя впоследствии одновременно с образцами, прошедшими подращивание. Инокуляты образцов, подлежащие подращиванию, направляют на инкубацию, как описано в п.п. 8.3.2.-8.3.7.

8.4.2.1. Пробы жидких продуктов тщательно перемешивают и инокулируют их равные объёмы в среды неселективного или селективного обогащения в соответствии с требова-ниями п.п. 8.3.2.-8.3.7.,

8.4.2.2. К пробам продуктов плотной консистенции на этапе гомогенизации по п.8.2.5. добавляют определённое количество соответствующей среды для конкретных искомых микроорганизмов, тщательно перемешивают. Из гомогената отбирают навеску необходи-мой массы, которую в условиях асептики разделяют на две равные части и засевают в соот-ветствующие требованиям п.п. 8.3.2.-8.3.7. объёмы питательных сред с учётом количества, добавленного при гомогенизации,

28

8.4.2.3. Образцы, подлежащие использованию для подтверждения жизнеспособности, непосредственно после инокуляции подвергают замораживанию и сохраняют до момента исследования в ПЦР при температуре минус 20°С. Инокуляты образцов, подлежащие под-ращиванию, направляют на инкубацию, как описано в п.п. 8.3.2.-8.3.7.,

8.4.2.4. Для исследований в ПЦР в режиме реального времени для подтверждения жизнеспособности одновременно используют инокуляты пищевых продуктов в питатель-ных средах для селективного обогащения, подвергавшиеся и не подвергавшиеся инкубации в термостате.

8.4.3. Стерильные образцы соответствующих сред для первичного обогащения должны сохраняться для использования в качестве отрицательных контрольных образцов исследо-вания методом ПЦР

8.5. Подготовка штаммов бактериальных культур к ПЦР-анализу

8.5.1. При идентификации культур, выделенных из пищевых продуктов согласно ут-

верждённым в установленном порядке методам исследований [3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 15], используют изолированные колонии, характерные для патогенных микроорганизмов, ука-занных в п.1.1., полученные на чашках с селективными агаризованными средами после со-ответствующего обогащения, в том числе для бактерий5:

- рода Salmonella – с ксилоза-лизин-дезоксихолатным агаром, висмут-сульфитным агаром, средой Плоскирева, Эндо, Левина, бриллиантовым зелёным агаром;

- рода Shigella – средой Плоскирева, дезоксихолат-цитратным агаром с лактозой и сахарозой, сальмонелла-шигелла (SS) агаром;

- вида E.(Cr.) sakazakii - фиолетово-красным желчным агаром с глюкозой (VRBG agar), средой Эндо;

- серотипа E.coli 0157:H7 - сорбитол E.coli 0157:H7 агаром, флуорокульт Е. coli 0157 :Н7 агаром, сорбитол Мак-Конки агаром (SMAC), средой Эндо;

- рода Campylobacter - селективным агаром Престона, угольным селективным агаром для кампилобактерий, колумбийским агаром;

- вида L.monocytogenes – ПАЛКАМ-агаром (полимиксин-акрифлавин-лития хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол агаром), оксфордским агаром, ПАЛ-агаром.

8.5.2. Не менее 3-х характерных колоний для бактерий родов Salmonella, Shigella, се-ротипа E.coli 0157:H7, вида L.monocytogenes отбирают с одной или нескольких указанных в п.8.4.1. селективных сред, производят посев штрихом на поверхность плотных питательных сред МПА или ТСАДЭ п. 7.2.3. в отдельных чашках Петри, или в пробирки с жидкими сре-дами (МПБ или триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом) и инкубируют в течение 18-24 часов при 37±1°С.

Изоляты, предположительно относящиеся к роду Campylobacter, засевают на по-верхность кровяного колумбийского агара или в бульон для бруцелл и инкубируют при 42±1ºС в течение 24-48 часов в микроаэрофильной атмосфере.

Изоляты, предположительно относящиеся к E.(Cr.) sakazakii, пересевают на поверх-ность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25°С в течение 72 часов.

8.5.3. При необходимости культуры могут быть представлены на исследование в пробирках на агаризованной среде в соответствии с СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хране-ния, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». В указан-ном случае производят проверку штамма на чистоту путём микроскопирования, пересевают

5 характерные признаки колоний на селективных средах учитывают в соответствии с описаниями в утвер-ждённых методических документах [3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 15]

29

в пробирки с жидкими средами (ТСБДЭ) или другими средами, предназначенными для обо-гащения данного патогена, и инкубируют в течение 24 часов при (37±1)°С.

8.5.5. Суточные культуры, полученные по п.8.4.2. на плотных питательных средах, , смывают с поверхности агара небольшим количеством стерильного физиологического рас-твора (или снимают петлёй) и переносят в стандартную пробирку. Концентрацию бактери-альных клеток в суспензии проверяют по оптическому стандарту МакФарланда, либо ден-ситометрически на приборах, откалиброванных также по шкале МакФарланда (плотность суспензии должна составлять не менее 1,5-2,0 ед. по шкале Макфарланда). При использо-вании отраслевого стандарта для визуальной оценки мутности ГИСК им.Л.А.Тарасевича расчетная концентрация клеток в пробе должна составлять не менее 107 кл./см3.

Аналогичным образом устанавливают плотность культур на жидких средах. Содер-жимое пробирки тщательно перемешивают на гомогенизаторе типа «вортекс» для получе-ния гомогенной суспензии.

Для исследований в ПЦР используют подготовленные указанным образом взвеси микроорганизмов или бульонные культуры, содержащие не менее 107 клеток/см3, которые подвергают дальнейшим манипуляциям для выделения ДНК. Подготовленные образцы ис-пользуют для анализа в тот же день.

8.6. Подготовка проб нативных пищевых продуктов к ПЦР-анализу 8.6.1. Образцы пищевых продуктов, предназначенные к исследованию в нативном

виде при расследовании вспышек пищевых бактериальных отравлений и инфекций с пище-вым путём передачи (в соответствии с п. 3.4.), подлежат первичной обработке в зависимости от консистенции: путём концентрирования (для жидких продуктов) или перевода в жидкую фазу с последующим концентрированием (для сухих или твёрдых продуктов) по [15, 11].

8.6.2. Концентрирование образцов жидкой консистенции объёмом до 50 см3 путём центрифугирования проводят в условиях асептики по одному из двух режимов:

а) одномоментно при 6000 об/мин в течение (18±2) минут, б) дробно при 1000 об/мин в течение 5 минут для осаждения крупных частиц и при

6000 об/мин в течение 15 минут. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку до-

бавляют 5 см3 фосфатного буферного 0,9% раствора NaCl (п.7.1.3.2.), ресуспендируют. Для проведения экстракции ДНК отбирают 1 см3 взвеси в отдельную пробирку; ос-

тавшаяся часть подготовленной пробы используется для посева на питательные среды. 8.6.3. Концентрирование образцов жидкой консистенции объёмом до 50 см3 фильт-

рацией проводят в 2 этапа: 1) для освобождения от крупных частиц во избежание засорения мембранных

фильтров - с использованием стерилизованных ватно-марлевых или бумажных фильтров, 2) через мембранные фильтры №3 с величиной пор 600-800 нм. Для фильтрования через мембранные фильтры используют предварительно просте-

рилизованные фильтровальные аппараты, подключенные к вакуумному насосу, или фильт-рующие устройства шприцевого типа соответствующей ёмкости. Перед началом фильтрования мембранные фильтры проверяют на отсутствие дефек-тов, и в случае необходимости двукратно кипятят в дистиллированной воде по 10-15 минут. С соблюдением правил асептики фильтры закрепляют в аппарате матовой стороной вверх. Фильтрование проводят дробно, пропуская через каждый фильтр не более 25 см3 жидкости, подвергнутой на 1 этапе фильтрации через ватно-марлевый или бумажный фильтр.

После окончания фильтрации, фильтрат удаляют, а все использованные фильтры пе-реносят в стерильную чашку Петри, бюкс, измельчают стерильными ножницами и залива-

30

ют 5-6 см3 стерильного изотонического раствора натрия хлористого для десорбции бакте-рий.

Из полученного смыва отбирают 1 см3 в отдельную пробирку для экстракции ДНК; оставшаяся часть подготовленной пробы используется для посева на питательные среды.

8.6.4. Пробы пищевых продуктов твёрдой консистенции и сухих переводят во взве-шенное состояние в жидкости для суспендирования содержащихся в них микроорганизмов. Для этого образцы массой 25-50 г в условиях асептики предварительно измельчают ножни-цами, растирают в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе при добавлении ФБР (п.7.1.3.1.) или стерильной деионизированной воды в соотношении 1 :10 или 1 : 5 для по-лучения 10-20% концентрации продукта. Доводят до гомогенного состояния.

Полученную суспензию отстаивают 3-10 минут для осаждения грубых частиц, жид-кую фазу центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут.

Если полученный осадок вязкий, из него отбирают 1 см3 для экстракции ДНК в от-дельную пробирку и не менее 2 см3 – для посева на питательные среды; если плотный – предварительно ресуспендируют в 0,2-0,5 см3 стерильной деионизированной воды.

8.6.5. Подготовленные по п.п. 8.5.2.-8.5.4. образцы хранению не подлежат и исполь-зуются для экстракции ДНК сразу после окончания пробоподготовки. .

9. Проведение анализа. Алгоритмы проведения исследований пищевых продуктов для обнаружения пато-

генных бактерий методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией приведены в Приложении №1.

9.1. Экстракция ДНК из исследуемых образцов

9.1.1. При работе в зоне подготовки и выделения нуклеиновых кислот из проб, со-держащих патогенные биологические агенты, необходимо строго соблюдать правила тех-ники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены: работают только в боксированном помещении или в боксе биологической безо-пасности II класса, используют одноразовые перчатки, используют и меняют при каждой операции одноразовые наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) обеззараживают в специальном контейнере с дезинфицирующим 0,2% раствором ДП-2Т.

9.1.2. Экстракция ДНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии неконкурентного внутреннего контрольного образца («ВКО») на основе рекомбинантной ДНК, для контроля правильности (точности) этапов выделения и амплификации ДНК.

9.1.3. В качестве отрицательного контроля («ОК») этапа экстракции ДНК из культу-ральной жидкости, используют стерильный образец питательной среды для обогащения ис-следуемого продукта, предварительно протестированный на отсутствие ДНК искомых пато-генных бактерий; из проб нативных продуктов - стерильный изотонический раствор натрия хлористого или ФБР для десорбции бактерий. При наличии спорных или невалидных ре-зультатов ПЦР используют ОК этапа выделения из набора реагентов.

9.1.4. Экстракцию ДНК из культуральной жидкости, взвесей микроорганизмов и бульонных культур, подготовленных по п.п. 8.3. и 8.5., проводят без дополнительной обра-ботки, применительно к используемым наборам реагентов и в соответствии с утверждён-ными в установленном порядке инструкциями [1, 2].

9.1.4.1. Для экстракции ДНК применяются коммерчески доступные комплекты реа-гентов на основе методов сорбции ДНК на силикагеле или преципитации ДНК в соответст-вии с инструкцией производителя при возможности их сочетания с комплектами реагентов для амплификационного этапа исследований.

31

Использование автоматических экстракторов нуклеиновых кислот допускается при наличии указаний в инструкции к прилагаемым комплектам реагентов на возможность их применения при анализе данного вида образцов.

Не допускается применение упрощенных методик экстракции ДНК на основе термо-коагуляции.

9.1.5. Допускается проводить экстракцию ДНК из проб нативных пищевых продук-тов по п. 9.1.4.1. настоящих МУК или по п.6.2. МУК 4.2.2304-07 [10]. При повышенном со-держании жиров перед экстракцией ДНК проводят дополнительную обработку пробы сус-пензией неполярных растворителей с водой для перевода содержащейся в пищевом продук-те ДНК в водную фазу, в которой и производится дальнейшая очистка.

9.2. Постановка контроля на жизнеспособность патогенных бактерий в иссле-

дуемых пищевых продуктах 9.2.1. При положительных результатах ПЦР-анализа образцов исследуемых натив-

ных пищевых продуктов и культуральной жидкости от посева пищевых продуктов в среды обогащения (обнаружение ДНК искомых патогенных бактерий) должна подтверждаться жизнеспособность выявленных микроорганизмов. Оценка жизнеспособности микроорга-низмов проводится параллельно с основным исследованием в обоих предусмотренных ва-риантах ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (FEP и FRT):

9.2.1.1. для образцов обогащённых пищевых продуктов: одновременно с отбором проинкубированной культуральной жидкости на экстракцию ДНК проводят её прямой по-сев в количестве 0,1 см3 на поверхность соответствующих пластинчатых селективно-дифференциальных сред, используемых для выделения патогенных бактерий, указанных в п.8.4.1., используют не менее 2-х видов сред из числа рекомендуемых;

9.2.1.2. для образцов нативных пищевых продуктов, исследуемых только при рассле-довании вспышек: одновременно с отбором исследуемой взвеси на экстракцию ДНК прово-дят её посевы:

а) на поверхность соответствующих пластинчатых селективно-дифференциальных сред, также как указано в п.9.2.1.1.,

б) в жидкую среду для селективного обогащения по п.п. 8.3.2.-8.3.7. по 0,1-1,0 см3 в 10 см3 соответствующих питательных сред. После инкубирования сред при соответствую-щих для данных микроорганизмов режимах инкубации производят пересев на поверхность соответствующих пластинчатых селективно-дифференциальных сред.

9.2.1.3. Посевы на плотных средах начинают просматривать через 16-18 часов, затем через 24 и 48 часов. При обнаружении роста характерных колоний (или газона культуры) их обрабатывают по п.8.4.5. и анализируют путём постановки ПЦР по п.10 или с использова-нием любых коммерчески доступных зарегистрированных в РФ тест-систем на принадлеж-ность к родам, видам, серотипам искомых патогенных бактерий. Допускается подтверждать принадлежность выделенных культур методами традиционного биохимического и сероло-гического типирования в соответствии с утверждёнными методами определения патоген-ных микроорганизмов в пищевых продуктах .

9.2.2. Оценку жизнеспособности патогенных бактерий при осуществлении варианта ПЦР в режиме «реального времени» (FRT) допускается проводить путём одновременного исследования двух образцов культуральной жидкости, подготовленных по п.8.3.9. Интер-претация и оценка результатов проводится по п.10.4. 9.2.3. При исследовании штаммов чистых культур по п. 8.4. подтверждение жизнеспособно-сти не требуется.

10. Проведение ПЦР 10.1. ПЦР для выявления ДНК патогенных бактерий (родов Salmonella, Shigella, вида

Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, энтерогеморрагических веротоксигенных Escherichia

32

coli, термофильных Campylobacter spp., Listeria monocytogenes) осуществляется с использо-ванием наборов реагентов (п.6.3.), обеспечивающих постановку любого их двух вариантов гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации – по конечной точке (вариант FEP) и в режиме реального времени (вариант FRT).

10.2. Постановка ПЦР для выявления ДНК бактерий родов Salmonella, Shigella, вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, энтерогеморрагических веротоксигенных Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. осуществляется по схемам и алгоритмам, рекомен-дованным производителем комплектов реагентов с обязательным применением внутренних контрольных образцов с этапа экстракции ДНК.

10.3. Для оценки жизнеспособности микроорганизмов может применяться ПЦР только в формате детекции продуктов амплификации в режиме реального времени (FRT).

10.4. Положительные результаты тестирования отрицательного контроля экстракции ДНК (стерильный образец использованной питательной среды для селективного обогаще-ния) могут быть связаны с загрязнением среды генетическим материалом тестируемого мик-роорганизма. В этом случае необходимо повторить исследование с этапа селективного обо-гащения с применением сред, не содержащих ДНК искомого микроорганизма, с дополни-тельным включением в панель в качестве отрицательного контроля выделения препарата ОКО из набора реагентов.

10.4. При оценке жизнеспособности целевого микроорганизма в пищевых продуктах сопоставляют результаты тестирования образцов, подвергавшихся и не подвергавшихся ин-кубации после посева на этапе пробоподготовки при оптимальной температуре для роста искомых патогенов (по п. 8.3.9.). Отставание сигнала по каналу JOE/HEX на 3 и более поро-говых цикла (Ct) для образца, не подвергавшегося инкубации (Ctне инк. – Ctинк.≥3), свидетель-ствует о наличии в продукте жизнеспособного микроорганизма.

11. Выдача результатов

11.1. Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно.

11.2. Заключение о присутствии искомых патогенных бактерий в исследованной массе (объёме) продукта выдают при получении положительного результата ПЦР (выяв-лении ДНК указанных микроорганизмов пробе) и подтверждения их жизнеспособности.

11.3. Заключение об отсутствии искомых патогенных бактерий в исследованной мас-се (объёме) продукта выдают при получении отрицательного результата ПЦР (невыявлении ДНК искомых микроорганизмов) при исследовании образцов пищевых продуктов, подверг-нутых инкубации в питательных средах, или положительного результата ПЦР (выявлении ДНК искомых микроорганизмов в пробе), но отрицательного результата по подтверждению жизнеспособности.

11.4. Заключение об отсутствии искомых патогенных бактерий в исследованном на-тивном продукте, исследуемом при расследовании вспышек, при получении отрицательного результата ПЦР (невыявлении ДНК искомых микроорганизмов), не выдаётся.

11.5. Заключение о принадлежности исследованных бактериальных чистых культур к искомым патогенным бактериям выдают при получении положительного результата ПЦР (выявлении ДНК указанных микроорганизмов в пробе).

Библиографические ссылки. 1. «Инструкция по применению комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического

материала «ДНК-сорб-B».-М.,2009 2. «Инструкция по применению комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клини-

ческого материала «РИБО-преп».-М.,2008 3. ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества

33

бактерий вида Escherichia coli» 4. ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий

Listeria monocytogenes» 5. ГОСТ Р 52814-07 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella» 6. Инструкция по расследованию 7. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплифика-

ции нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности»

8. МУК 1990 от С.Ш.Рожновой 9. МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria

monocytogenes в пищевых продуктах» 10. МУК 4.2.2304-07. Методы идентификации и количественного определения генно-

инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения 11. МУК 4.2.2305-07 «Определение генно-инженерно-модифицированных микроорганиз-

мов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном време-ни и ПЦР с электрофоретической детекцией»

12. МУК 4.2.2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых про-дуктах»

13. МУК 4.2.2428-08 «Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста»

14. МУК 4.2.992-00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишеч-ной палочки Е. coli 0157: Н7»

15. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руково-дство.- М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006, 288 с

34

Приложение 1. Схема: №1

Алгоритм проведения исследований с предварительным обогащением:

При получении данных о наличии в образце жизнеспособных патогенов, проводится

их выделение в чистой культуре. При необходимости ускоренной идентификации чистой культуры патогена возможно применение ПЦР исследований (п 8.3.9).

Результат анализа инку-бированного образца

Результат анализа замороженного образца

Интерпретация результатов

Положительный Положительный жизнеспособный возбудитель Положительный Отрицательный жизнеспособный возбудитель Отрицательный Положительный нежизнеспособный возбудитель Отрицательный Отрицательный возбудитель не выявлен

Подготовка образцов для посева на среды обога-

щения (п. 8.2); подготов-ка парных проб

Посев на среды Обогащения (п. 8.3)

Инкубация при рекомендованных (оптимальных) условиях

Подтверждение жизнеспособности па-тогена (замораживание образца при ми-нус 20°С при необходимости экспресс-оценки жизнеспособности микроорга-низма) п. 8.4.2

Исследование методом ПЦР (п.10.) Исследование

методом ПЦР (п.10.)

Отбор навески пищевого продукта для анализа (в условиях асептики) п. 8.1

35

Схема: №2 Алгоритм проведения исследований без предварительного обогащения:

Результат анализа инку-бированного образца

Результат анализа замороженного образца

Интерпретация результатов

Положительный Положительный жизнеспособный возбудитель Положительный Отрицательный нежизнеспособный возбудитель Отрицательный Положительный жизнеспособный возбудитель Отрицательный Отрицательный возбудитель не выявлен

Подготовка образцов для экстракции нуклеиновых кислот и посева на среды

обогащения (п. 8.6)

Инкубация при рекомендованных (оптимальных) условиях (п. 8.3)

Исследование методом ПЦР (п.10.)

Отбор навески пищевого продукта для анализа (в условиях асептики) п. 8.1

Documents

ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО …...МУК 4.2.2872-11 . 3 ББК…. Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей