Актуальные вопросы детекции возбудителей заболеваний с фекально-

оральным механизмом передачи

ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора

Подколзин А.Т., Шипулин Г.А.

Особенности лабораторного мониторинга возбудителей заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи

Пациент НосительФакторы передачи

1. Детекция2. Типирование

Восприимчивоезвено

Вопросы для обсуждения

1. Детекция биопатогенов- Выбор технологии- Выбор инструмента

2. Оценка идентичности изолятов- Выбор метода

3. Типичные ошибки

Практическая доступность перспективных технологий детекции биопатогенов

Next generation sequencing(высокопроизводительное секвенирование)

Масс-спектрометрия(MALDI-TOF MS, IBIS Biosciences)

Амплификационные биочипы(детекция биопатогенов)

Point-of-care (РОС)-тесты(тесты у постели пациента)

Иммунологические и неамплификационные биочипы

Классическое секвенирование

Real-time PCR

Критерии оптимального выбора инструмента

1. Наличие и адекватный ассортимент доступных диагностикумов

2. Экономическая целесообразность (стоимость приборов, расходных материалов, диагностикумов, обучения специалистов)

3. Открытость системы (потенциальная демонополизация поставок расходных материалов и диагностикумов)

4. Наличие адекватного сервисного обслуживания

5.Регистрация на территории РФ

Сопоставление себестоимости лабораторных методов детекции вирусных агентов ОКИ в РФ (2010г)

Тест-система Стоимость тест-системы

Кол-во тестов

Стоимость 1 иссл-я (RUR)

Стоимость выявления 1

патогена (RUR)

Amplified IDEIA Astrovirus (ПЦР) 731 (EUR) 96 317,5 317,5R Biopharm Norovirus (ИФА-АГ) 696 (EUR) 96 302,3 302,3Vegal Astrovirus (ИФА-АГ) 135 (EUR) 30 187,7 187,7DRG Adenovirus (ИФА-АГ) 316,8 (EUR) 96 137,6 137,6Savyon Rotavirus (иммунохроматография) 3424 (RUR) 25 137,0 137,0Savyon Adenovirus (иммунохроматография) 3424 (RUR) 25 137,0 137,0Seramun Astrovirus (ИФА-АГ) 240 (EUR) 96 104,3 104,3Vegal Rotavirus (ИФА-АГ) 69 (EUR) 30 95,9 95,9Seramun Rotavirus (ИФА-АГ) 207 (EUR) 96 89,9 89,9Амплисенс Rotavirus grA(ПЦР-форез + экстракция НК) 3400 (RUR) 50 82,5 82,5Вектор Бест Аденовирус (ИФА-АГ) 7844 (RUR) 96 81,7 81,7Вектор Бест Ротавирус (ИФА-АГ) 7844 (RUR) 96 81,7 81,7Savyon Rotavirus/Adenovirus (иммунохроматография) 3712 (RUR) 25 148,5 74,2

Амплисенс Rotavirus grA/Astrovirus/Adenovirus grF (ПЦР-FL+ экстракция НК) 8446 (RUR) 50 183,4 61,1Savyon Rotavirus (ИФА-АГ) 107 (EUR) 96 46,5 46,5Аквапаст Ротавирус (ИФА-АГ) 2100 (RUR) 48 43,8 43,8Изоген Rotavirus (ПЦР-форез+ экстракция НК) 4120 (RUR) 100 57,0 41,2Амплисенс ОКИ скрин (ПЦР-FL+ экстракция НК) 9744 (RUR) 50 209,4 29,9

Соответствие методов выявлении патогенов целям исследований (на примере ротавирусов гр А)

Пациенты с манифестной инфекцией

Пациенты с бессимптомной инфекцией

Концентрированныеобразцы из окружающей среды

Продукты питания

Все методы (МАНК, ИФА-АГ, культуральные методы, иммунохроматография)

МАНК, культуральные методы. ИФА-АГ, иммунохроматография - риск ложнонегативных результатов

МАНК, культуральные методы. ИФА-АГ , иммунохроматография - неприменимы

Культуральные методы? МАНК- риск ложнонегативных результатов. ИФА-АГ- неприменимы

до1012

104 - 106

102 - 105

Минимальная инфицирующая доза

Специализированные диагностические тесты для детекции биопатогенов в ООС

Комплекты реагентов для детекции бактериальных патогенов в ООС

- Амплисенс Shigella spp EIEC FL- Амплисенс EHEC O157H7 FL- Амплисенс Listeria monocytogenes FL- Амплисенс Salmonella spp FL- Амплисенс Campylobacter spp FL- Амплисенс Cronobacter (E sakazakii) FL

этап культурального обогащения

(проводится в соответствии с требованиями действующих

ГОСТ и СП)

Основные требования к прикладным методам генетического типирования биопатогенов

- Достаточная разрешающая (дифференцирующая) способность

- Стабильность маркеров для эпидемиологических исследований

- Воспроизводимость (этапов анализа, учета результатов и интерпретации)

Основные методы генетического типирования биопатогенов

Вирусныеагенты

Бактериальныеагенты

Секвенирование вариабельных участков генома (отличаются от используемых в диагностических тест-системах)

Могут использоваться без выделения чистой культуры

Мультилокусное секвенирование-типирование (MLST)

Требуют выделения чистой культуры

- Риботипирование- Электрофорез в пульсирующем поле (PFGE)- Оценка полиморфизма длин фрагментов амплификации (AFLP)- Методики амплификации повторяющихся элементов переменной копийности (MLVA)

Методы генетического типирования

Стабильность маркеров для эпидемиологических исследований

Кол-во изолятов S.Enteritidis из

очага (n)

Генотип характерный для очага

Плазмидный тип (n)

PFGE-тип (n)

MLVA-тип (n)

Очаг№ 5 (9)1 (4)2 (4)3 (1)

2 (9) 4 (9)

Очаг№ 6 (3)1 (5)2 (3)

3 (3) 6 (3)

Очаг№ 1 (8)1 (1)6 (1)5 (6)

1 (8) 2 (8)

Пример из практикиИзоляты, выделенные в одном очаге различались по наличию низкомолекулярных плазмид.

Низкомолекулярные плазмиды являются эпидемиологически нестабильным маркером что отражается в их потере или приобретении бактериальной клеткой из-за влияния факторов окружающей среды в короткий по эпидемиологическим меркам промежуток времени, в т.ч. в период формирования очага групповой заболеваемости или изоляции культур.

!

Типовые казусы

(к вопросу о здравом смысле)

Примеры нецелевого использования диагностических инструментов

зима 2010 – поиск ротавирусов в снегу (как потенциального источника поступления ротавирусов в реку, из которой проводится водозабор)

РФ 2010 – плановое тестирование молочной продукции на содержание ротавирусов в период сезонного подъема заболеваемости

РФ 2010 – применение ИФА-АГ для выявления ротавирусов в воде

Примеры нецелевого использования диагностических инструментов

Псевдотипирование

Нецелевое секвенирование

Применение методов амплификации со случайными праймерами (RAPD – ПЦР) - внутрилабораторный уровень невоспроизводимости

Попытки установить серотиповую принадлежность энтеровирусов (определяемую геном капсида – VP1) на основе секвенирования 5’ UTR (мишень в диагностических тест-системах)

В качестве заключения…

Лабораторные методы детекции биопатогенов в факторах передачи – важный, но ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ инструмент в руках эпидемиолога.

Принципы доказательной медицины успешно реализуются при использовании косвенных - статистических методов анализа эпидемиологических данных, доказывающих роль факторов передачи в развитии заболеваемости.

Благодарю за внимание!

Контактная информация:«Референс-центр по мониторингу возбудителей острых кишечных инфекций»111123, Россия, г.Москва, ул. Новогиреевская, 3а+7(495) 974 96 46.