第三章 DNA 复制(Replication of DNA)

bull DNA 复制一般特征bull参与 DNA复制的酶类bull DNA复制基本过程bull DNA复制的调控bull DNA损伤与修复

第一节 第一节 DNADNA 复制的一般特复制的一般特征征

一 DNA 的生物学功能1 储存遗传信息2 复制遗传信息3 表达遗传信息4 遗传变异

1962 Nobel Prize

Watson(Nature1953) Watson(Nature1953) 我们假设的特异的（碱基）配对方我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致

二二 DNADNA复制方式复制方式

全保留

半保留

分散式

DNA 如何进行复制

15NP0

P1

P2

P3P4

P0＋ P2

P0＋ P414N 15N14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958 PNAS

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

bull DNA 复制一般特征bull参与 DNA复制的酶类bull DNA复制基本过程bull DNA复制的调控bull DNA损伤与修复

第一节 第一节 DNADNA 复制的一般特复制的一般特征征

一 DNA 的生物学功能1 储存遗传信息2 复制遗传信息3 表达遗传信息4 遗传变异

1962 Nobel Prize

Watson(Nature1953) Watson(Nature1953) 我们假设的特异的（碱基）配对方我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致

二二 DNADNA复制方式复制方式

全保留

半保留

分散式

DNA 如何进行复制

15NP0

P1

P2

P3P4

P0＋ P2

P0＋ P414N 15N14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958 PNAS

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

第一节 第一节 DNADNA 复制的一般特复制的一般特征征

一 DNA 的生物学功能1 储存遗传信息2 复制遗传信息3 表达遗传信息4 遗传变异

1962 Nobel Prize

Watson(Nature1953) Watson(Nature1953) 我们假设的特异的（碱基）配对方我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致

二二 DNADNA复制方式复制方式

全保留

半保留

分散式

DNA 如何进行复制

15NP0

P1

P2

P3P4

P0＋ P2

P0＋ P414N 15N14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958 PNAS

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

Watson(Nature1953) Watson(Nature1953) 我们假设的特异的（碱基）配对方我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合式提示了遗传物质可能的复制机制每一条链均可作为合成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致成一条新链的模板就使子代双螺旋与母本完全一致

二二 DNADNA复制方式复制方式

全保留

半保留

分散式

DNA 如何进行复制

15NP0

P1

P2

P3P4

P0＋ P2

P0＋ P414N 15N14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958 PNAS

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

二二 DNADNA复制方式复制方式

全保留

半保留

分散式

DNA 如何进行复制

15NP0

P1

P2

P3P4

P0＋ P2

P0＋ P414N 15N14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958 PNAS

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

15NP0

P1

P2

P3P4

P0＋ P2

P0＋ P414N 15N14N 15N

Meselson-Stahl experiment

1958 PNAS

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

根据实验结果根据实验结果第一代第一代 DNADNA 仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能

DNA的半保留复制 Semiconservative Replication

DNA双链解开以单链做模板碱基互补原则各自合成一条链在新合成的DNA双链分子中一条是原来的老链一条是新链

第二代出现两条带一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能证明 DNA 只能是半保留方式进行复制

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

2 DNA复制的半不连续性复制时 DNA 链延伸可能有三种方式

1

2

3

1967 年日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生 100～ 1000bp 的短片段

没有从 3rsquo 5rsquo 延长DNA 链的聚合酶

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性

bull一条链连续合成称 主 导 链 Leading Strand 另一条链分段合成 称 随 从 链Lagging Strand

bull 原因 DNA双螺旋分子两条链方向相反新链合成的方向只能 5rsquorarr3rsquo一个方向合成

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3 DNA3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行形成两个复制叉

(Replication Fork )

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

概括概括bull半保留bull半不连续性bull双向性

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

第三节 参与第三节 参与 DNADNA 复制的酶类复制的酶类

参与 DNA 复制的酶或蛋白因子1 DNA 聚合酶 催化 DNA 的合成2 引物酶 起始 RNA 的合成3 连接酶 连接冈崎片段4 DNA 解链解旋酶5 DNA 结合蛋白

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

一 一 DNADNA 聚合酶聚合酶 (Polymerase)(Polymerase)

1956 年大肠杆菌 DNA 聚合酶 1959 Nobel Prize

（一） 作用机制 以 DNA做模板碱基互补配对催化 4种 dNTP之间形成磷酸二酯键从而延长 DNA链

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

Mg2+

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

bull在模板链上进行

bull不能从头合成在引物的 3rsquoOH端上延长

bull新链延长方向为 5rsquorarr3rsquo延长

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（二）（二）原核生物原核生物 DNADNA聚合酶聚合酶 bull 有 3种DNA 聚合酶 I II III bull 多功能酶bull 合成DNA 的活性 聚合酶作用 延长DNA链

bull 水解DNA 的活性 外切核酸酶活性 切除不配对碱基起校读作用

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

11 DNADNA 聚合酶 聚合酶 II

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 单链多肽蛋白质 分子量为 109KD性质多功能酶大亚基 5rsquorarr3rsquo 聚合酶活性 3rsquorarr5rsquo 外切酶活性小亚基 5rsquorarr3rsquo 外切酶活性 1000ntmin

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3rsquorarr5rsquo外切酶活性1048698 从游离 3rsquo－ OH 端切割 识别和消除不配对的核苷酸保证了 DNA 复制的忠实性

5rsquo－ 3rsquo外切酶活性 DNA 聚合酶 I 中的小亚基带有 5rsquo外切酶活性从双链 DNA的 5rsquo端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3rsquorarr5rsquo 外切活性示意图

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNA 聚合酶特有活性

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNADNA 聚合酶聚合酶 I I 在在 DNADNA 复制中所起的作复制中所起的作用用

bull 不是主要的复制酶bull RNA 引物的切除bull DNA 损伤的修复紫外线作用形成的 TT

二 聚体的切除bull 链置换 可能参与遗传重组bull 切口平移（ nick translation ） 探针标记

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

2 DNA2 DNA 聚合酶聚合酶 IIII

bull 不是复制酶主要在DNA修复中起作用无5rsquorarr3rsquo外切酶活性

5 DNA 聚合酶 I 的活性

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3 DNA3 DNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

1972 年发现催化效率高主要复制酶由 10种亚基组成 rsquo

（ 1 ）核心聚合酶 5rsquo－ 3rsquoDNA 聚合酶活性

3rsquo-5rsquo 外切酶活性控制 复制忠实性 核心酶的组建

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（ 2 ） 二聚体 构成滑动钳将全酶固定在 DNA 模板上提高合成速率（ 20秒 ----750 秒

（ 3 ） 复合物 2rsquo 协助 二聚体结合到 DNA

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

E coli DNA 聚合酶Ⅲ不对称二聚体

ε

ε

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNADNA 聚合酶 聚合酶 IIIIII

bull 形成不对称的二聚体与DNA双链结合后随链折叠 1800使后随链的物理方向与主导链一致同时催化两条链的复制

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3

5

3

5 3acute

5acute

3acute

5acute解链方向

领头链(leading strand)

后随链(lagging strand)

3acute

5acute

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNA 聚合酶 pol pol pol Ⅰ Ⅱ Ⅲ 亚基数目 1 ge7 ge10

5 primerarr3 prime 聚合酶活性 + + +

3 primerarr5 prime 外切酶活性 + + +

5 primerarr3 prime 外切酶活性 + - -聚合速度 ( 核苷酸 分 ) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000

持续合成能力 3-200 1 500 ge500 000

功能 切除引物 修复 修复 复制

大肠杆菌 3种 DNA 聚合酶性质比较

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（三） （三） 真核生物真核生物 DNADNA聚合酶聚合酶

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶 多亚基多功能酶bull 大亚基 DNA 聚合酶活性 100nt

次bull 小亚基引物酶活性合成 RNA bull 起始 DNA 的合成合成 RNA 引物和在

RNA3rsquo 羟基端合成一段 DNA

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNADNA 聚合酶聚合酶的作用的作用bull DNA 聚合酶的结构bull 多亚基组成bull P125 大亚基催化亚基含聚合酶和

外切酶活性bull P50 与增殖细胞核抗原 (PCNA) 结合相

关bull P66bull P12

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DNADNA 聚合酶聚合酶的功能的功能

bull 主要 DNA 复制酶 DNA 聚合酶活性延伸DNA 链

与 RFC和 PCNA 形成ldquo全酶rdquo在 RFC和PCNA 等的协同下促使 DNA 聚合酶的解离 DNA 聚合酶接替 DNA 聚合酶继续 DNA链的合成 ------- DNA 聚合酶向DNA 聚合酶的转换

bull 复制校正功能 3rsquo-5rsquo 外切核酸酶活性

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

bull DNA 聚合酶 主要功能 DNA 修复

bull DNA 聚合酶 γ 线粒体 DNA 复制

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

二真核生物二真核生物 DNADNA 聚合酶附属蛋白聚合酶附属蛋白

1 PCNA 增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen) DNA 聚合酶的附属蛋白参与 DNA 的合成类似二聚体

2 RFC 复制因子 C(Replication Factor C) 多亚基复合物 DNA 聚合酶的附属蛋白识别引物末端 参与链的延长类似复合物

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3 PRP1和 PRP2

Primer Recognition Protein

增加 DNA 聚合酶与模板－引物末端的亲和力增加 DNA 聚合酶的活性

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

PCR PCR 与与 Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶特性（ Taq DNA polymerase ）最初由 HAErlicH 从热泉中的细菌中出来1048729 性质具有 5rsquo－ 3rsquo 聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性1048729 耐热性此酶是一种耐热的依赖于 DNA的 DNA 聚合酶最适反应温度为 72－ 801048729 应用能以高温变性的靶 DNA 分离出来的单链 DNA为模板进行 DNA 的体外扩增－ PCR 反应

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

三 三 引物酶 引物酶 primaseprimase

DNA聚合酶不能引发 DNA新生链的合成只能在已存在的 DNA 链或 RNA 链上延长 DNA引物酶催化引物 RNA的合成

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

四四 连接酶 连接酶 ligaseligase bull 1967 年发现

bull 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成二个片段必须都与完整的模板链结合

bull 大肠杆菌的连接酶需NAD+真核细胞的连接酶需要ATP

bull 可连接双链 DNA中的单链切口 RNA-DNA杂交体双链单链切口不能连接双链 RNA中的单链切口

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

五 与五 与 DNADNA 解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶

（一） DNA 螺旋酶（ Helicase ） bull 催化双螺旋解旋和解链bull 需消耗 ATP

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（二）拓扑异构酶（ Topoisomerase)

bull DNA 回旋酶（ Gyrase ）bull 促进 DNA 双链的解开 需消耗 ATP bull 兼有内切酶和连接酶活性 可迅速使

DNA 两条链断开又接上 消除解链酶产生的拓扑张力当引入负超螺旋时需要由 ATP 提供能量 同复制有关

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（三）单链结合蛋白

bull DNA 单链结合蛋白（ Single Strand Binding protein SSB ）

bull 复制因子 A

bull 主要功能 与单链亲和力大稳定单链结构保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成有利复制进行

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

第二节 第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

复制子 复制子 RepliconReplicon

bull Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子 或者说单个复制起始点控制的 DNA 包含从起始位点到终止位点的全部 DNA

bull 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点

bull 终止位点 终止复制的位点bull 每个细胞周期启动复制一次

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

复制在特定部位起始 原核生物仅有一个起始部位 真核生物有多个起始部位

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

复制起始点复制子与复制叉复制起始点复制子与复制叉

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

半保留复制必须解决解开双螺旋的问题半保留复制必须解决解开双螺旋的问题

250Mb250Mb 的的 11 号染色体需要旋转号染色体需要旋转 250250 万次万次

DNA 拓扑异构酶解决了解开 DNA 双螺旋的问题

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

一 复制的起始（一）起始部位的序列特征

同位素标记显示复制起始在特定部位开始

复制起始点 origin ori

DNA 复制过程

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

1 M13 噬菌体的起始部位顺序特征

59bp的发夹结构

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

2 大肠杆菌 (OriC)的起始部位顺序特征

240bp 的唯一起始部位

2个区域 起始蛋白识别结合区 4个 9bp重复顺序 邻近的 AT富含区 3个 13bp重复顺序

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

大肠杆菌基因组复制起始部位

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

33 酿酒酵母酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征

A 含 ARS 一致序列（ ACS ）复制起始识别复合物结合

B 增加复制起始位点的效率

100－ 200bp

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

44 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒

bull 5211 5220 5230 5240 1 10 20 30

bull CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA

bull GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT

bull 反转重复序列 大 T 抗原结合部位 II AT 富含区

图 3-7 SV40 复制起始部位结构

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

复制起始位点特征复制起始位点特征bull 独特重复序列bull 起始结合蛋白识别bull AT富含序列有利于DNA 双链

解旋

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

55 起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）

bull 多个复制起始点有人发现任何大于 15kb的DNA就能自主复制

bull 起始不是随机的但未发现起始位点的特征序列

特征结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（二） （二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体（ X174 ）

bull priA 识别起始位点ATP酶活性bull priB 起始引发bull priC 起始引发bull DnaT 起始引发bull DnaB 起始引发bull DnaC 起始引发 与DnaB一起作用bull DnaG RNA引物合成

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

2 大肠杆菌bull DnaA 识别并结合于 oriC 区有 ATP 酶活性使 AT富含区解链促进 DnaB结合形成起始复合物

bull DnaB DNA螺旋酶有解旋和解链作用bull DnaC 运输DnaB形成起始复合物bull DnaG DNA复制引发酶合成引物bull Hu 促进复制复合物的形成bull 回旋酶 松弛正超螺旋促进单链DNA产生bull 单链结合蛋白 促进 DNA解链稳定单链 DNA

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

33 真核细胞（真核细胞（ SV40SV40 ））

bull 真核细胞（ SV40 ）的 DNA 复制至少需要 6 个蛋白因子参与bull T 抗原N 端为 DNA 结合区识别起始位点 C端具有螺旋 酶活性在 RFA 的协助下解开双链 SV40 编码bull RFA 人单链结合蛋白bull 拓补异构酶 I或 II 解开超螺旋 bull 复制因子 C（ replication facter C RFC ）形成起始复合物bull DNA 聚合酶 α- 引物酶复合物合成引物起始 DNA 合成

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

44 真核细胞（真核细胞（ YeastYeast ））

（ 1 ） ORC （ Origin Recognition Complex）

6 个亚基组成 在真核生物中相当保守特异识别 ARS （ Autonomously replicating sequence ）ORC1p ORC2p ORC4p 与 A 元件结合ORC5p与 B 元件结合结合过程需要 ATP

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（ 2 ） Cdc6Cdc18

（ 3 ）微染色体支持蛋白（ Minichromosome maintenance proteinsMCMp ）

与 DNA 发生周期性的作用与复制叉运动有关（ 4 ） Cdc45

与 DNA 复制起始位点相互作用

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

（三）复制的起始－－引发（ Priming ）

合成 RNA 引物的过程

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

单链结合蛋白 SSB与M13噬菌体单链 DNA结合在发夹结构前 6 bp处 RNA 聚合酶合成 20~30个碱基的 RNA 破坏发夹结构 SSB结合 DNA 聚合酶 III在 3rsquo－ OH 延长 DNA 链 DNA聚合酶 I水解 RNA并补平缺口连接酶连接

1M13噬菌体

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

priApriBpriC 识别起始点

在 DnaT帮助下DnaBDnaC 复合物结合形成前引发体

引发体

引发体可沿着DNA 链移动在合适的位点起始引物 RNA 的合成

引发体的装配只能在起始点引物合成可在多处引发体移动的方向与 DNA链延长的方向相反类似冈崎片段的合成

2 ФX174DNA

PASprimosome assembly site

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

3大肠杆菌

Hu 因子促进复合物形成

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

DnaA 结合OriC

富含 AT区解链

2DnaB-DnaC 复合物

DnaB 解链

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始

4 SV404 SV40

T 抗原识别起始点和解链

RFA 结合到单链 DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体

DNApol - 引物酶结合形成引发体

SV40 DNA 复制的起始