LYNN EL HADDAD

CARACTERISATION DES PHAGES DE STAPHYLOCOCCUS A UREUS

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie pour l'obtention du grade de Maîtrise es Sciences (M. Sc.)

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE, DE MICROBIOLOGIE ET DE BIO-INFORMATIQUE

FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2010

Lynn El Haddad, 2010

Résumé Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène des animaux et de l'homme causant

plusieurs symptômes chez ceux-ci. De plus, elle est responsable d'intoxications

alimentaires liées à l'ingestion de nourritures contaminées par des entérotoxines

staphylococciques. Avec l'émergence de souches staphylococciques résistantes aux

.antibiotiques, l'utilisation de phages virulents est maintenant envisagée comme alternative

pour lutter contre les souches pathogènes de S. aureus.

Au cours de ce projet, un nouveau phage virulent (LH1) a été isolé à partir d'échantillons

de lait cru. L'utilisation de ce dernier et du phage K dans du lait UHT a montré qu'ils sont

capables d'éliminer les souches de S. aureus mais que leur activité lytique est inhibée dans

le lait cru par un composé encore inconnu. La présence de deux gènes codant pour la

toxine leucocidine de Panton-Valentin dans le génome du phage LH1 compromet son

utilisation comme agent de biocontrôle dans les applications alimentaires et médicales.

Finalement, un arbre phylogénétique a été créé en comparant et regroupant 54 génomes de

phages différents de S. aureus disponibles dans GenBank en plus de deux nouveaux phages

isolés incluant LH1.

L'avancement des connaissances sur des phages de S. aureus pourrait favoriser leur

utilisation dans la prévention ou le contrôle des intoxications alimentaires.

11

Abstract Staphylococcus aureus can cause a range of illnesses in animals and humans. In cases of

food poisoning, this is mostly due to the ingestion of heat-labile enterotoxins produced by

S. aureus, leading to nausea, diarrhea, vomiting, and abdominal cramps. Virulent phages

could be used to eliminate these bacteria in milk products thereby reducing the risks of

food contamination and improving food safety.

In this work, a new virulent S. aureus phage, named LH1, was isolated from raw milk

samples. The use of phages LH1 and K in UHT milk showed that they were effective in

reducing S. aureus counts. However, both phages were inhibited in raw milk. Furthermore,

the analysis of the genome of LH1 showed the presence of two genes coding for the

Panton-Valentine leukocidin toxin compromising its use as a biocontrol agent. In parallel,

54 S. aureus complete phage genomes available in GenBank in addition to two newly

isolated phages were analyzed and classified using the MEGA 4.1 and the DOTTER

softwares.

The advances in the field of S. aureus bacteriophages may lead to the reduction of the

occurrence of infections and with this, control food poisoning.

Ill

Avant-Propos En août 2008, j 'ai quitté mon pays, le Liban. J'ai dit au revoir à ma famille, à mes amis et à

la vie que j'avais. Voyageant vers un pays inconnu, j'avais peur; peur de ce qui m'attend,

de ce que je vais endurer. Et c'est au début du mois de septembre que je me suis

familiarisée avec la vie étudiante et la vie sociale au Canada. L'accueil, l'hospitalité et la

gentillesse de tout le monde m'a donné de l'énergie pour réussir. Je voudrais remercier du

fond du cœur tous ceux qui m'ont aidé, de loin ou de près, à la réalisation de mon projet de

maîtrise.

Merci Dr Sylvain Moineau, vous avez mis toute votre confiance en moi et vous m'avez

encouragé tout au long de ma maîtrise. Sans votre soutien et vos conseils, je ne serai pas ce

que je suis devenue aujourd'hui.

Merci aux membres du comité aviseur; Dr Michel Frenette et Dr Steve Labrie. Vos

suggestions et vos commentaires m'ont été précieux.

Je voudrais de même remercier tous mes collègues au laboratoire : Denise, Manuela,

Geneviève, Mourad, Josiane, Julie, Simon, Alfonso, Jeannot, Sih.am, Marie-Ève, Audrey,

Maxim et Rym. Je vous embêtais chaque jour avec mes nombreuses questions! Mais

sachez qu'elles m'ont aidé à avcincer mon projet et ont élargi mon sens de l'apprentissage

et mon esprit scientifique.

Merci au Programme Canadien de Bourse de la Francophonie et à l'ACDI pour leur

soutien financier, leur présence ainsi que le suivi fourni tout au long des études et de

l'intégration.

Je remercie aussi mes plus fidèles amies, Rana et Geneviève. Geneviève, tu es toujours

restée à mes côtés. Et c'est grâce à ta gentillesse, ta bonté, ta merveilleuse amitié et ton

adorable famille que j 'ai pu réussir. Rana, tu représentes pour moi la grande sœur que je

n'ai jamais eue. Notre amitié s'est renforcée durant ces deux années et a fait naître un

sentiment de fraternité incontournable et indestructible.

IV

Je voudrais aussi remercier mes frères Nicolas et Alain et ma sœur Léa. Nous avons

partagé pleins de moments de joie et de succès ensembles qui seront gravés dans ma

mémoire à jamais. Sachez que rien, même pas les distances qui nous séparent, ne pourront

remplacer ou effacer ces souvenirs merveilleux.

Je remercie du fond du cœur mes parents, Paula et Sami. Vous êtes toujours restés à mes

côtés et dans mes pensées que ce soit au Liban ou à Québec. Vous m'avez immergé de

bonté, de confiance et d'amour. Vous m'avez appris à être aimable, modeste, généreuse,

confiante, forte et toujours positive. C'est grâce à vous que je suis devenue la femme que je

suis aujourd'hui. Je vous dédis ce mémoire qui représente une très petite portion de ma

gratitude envers vous.

Je remercie de tout mon cœur mon copain Georges. Tu as cru en moi et tu m'as encouragé

tout au long de ma maîtrise. Tu m'as donné la force et la confiance pour l'achever avec

progrès et succès. Je te dédis ce mémoire accompagné de trois mots : Forever and Always.

Et enfin, j'offre ce mémoire à toute ma famille et mes amis. C'est grâce à vous tous que je

termine ma maîtrise avec plein d'inoubliables moments de joie, de bonheur, de réussite et

d'amour.

Bonne lecture!

Progress lies not in enhancing what is, but in advancing toward what will be.

-Kahlil Gibran-

A toutes les personnes que j'aime et A mon pays le Liban,

VI

Table des matières Résumé i Abstract ii Avant-Propos iii Liste des figures viii Liste des tableaux x Liste des abréviations xi 1. Introduction 1 1.1. Staphylococcus aureus 1

1.1.1. Caractéristiques générales 1 1.1.2. Milieux de culture pour l'isolement et l'identification de S. aureus 3 1.1.3. Problématique de S. aureus 5 1.1.4. Facteurs de virulence de S. aureus et leur régulation 6 1.1.5. Intoxications alimentaires staphylococciques 9 1.1.6. Solutions envisagées pour la prévention et le contrôle de S. aureus 11

1.2. Les bacteriophages 13 1.2.1. Historique 13 1.2.2. Classification des phages 14 1.2.3. Phages de S. aureus 17

1.2.3.1. Gasification génomique des phages de S. aureus 17 1.2.4. Cycle de multiplication des phages 21 1.3. Applications des phages de S. aureus 25

1.3.1. Thérapie par phages 26 1.3.2. Applications alimentaires des phages de S. aureus 27 1.3.2.1. Test de l'activité des phages dans le lait 27 1.3.2.2. Utilisation de phages isolés du lait cru et production de cocktails de phages 31

1.4. Problématique à l'étude et objectifs de recherche 32 2. Matériel et méthodes 34 2.1. Objectif 1: Isolement de phages de S. aureus à partir d'échantillons de lait cru 34 2.2. Objectif 2: Caractérisation du nouveau phage isolé 35

2.2.1. Observation des phages en microscopie électronique 35 2.2.2. Spectre lytique du nouveau phage 36 2.2.3. Séquençage d'ADN 37

2.3. Objectif 3: Comparaison du phage isolé aux autres phages de S. aureus 38 2.3.1. Profils de restriction du génome de phages de S. aureus 38 2.3.2. Spectre lytique des phages 39 2.3.3. Test d'adsorption des phages à des cellules de S. aureus 39 2.3.4. Analyse bioinformatique des génomes de phages 40

2.4. Objectif 4: Utilisation des phages pour éliminer les souches de S. aureus dans différents types de laits 41

2.4.1. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait UHT 41 2.4.2. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait cru 43

3. Résultats 44 3.1. Objectif 1: Isolement de phages de S. aureus à partir d'échantillons de lait cru 44 3.2. Objectif 2: Caractérisation du nouveau phage isolé 44

3.2.1. Observation des phages en microscopie électronique 44

vu

3.2.2. Spectre lytique du phage LH1 45 3.2.3. Génome du phage LH1 46

3.3. Objectif 3: Comparaison du phage isolé aux autres phages de S. aureus 50 3.3.1. Profils de restriction du génome de phages de S. aureus 50 3.3.2. Spectre lytique des phages 50 3.3.3. Test d'adsorption des phages à des cellules de S. aureus 52 3.3.4. Analyse bioinformatique des génomes de phages 52

3.4. Objectif 4: Utilisation des phages pour éliminer les souches de S. aureus dans différents types de laits 58

3.4.1. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait UHT 58 3.4.2. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait cru 61

4. Discussion 62 4.1. Caractérisation du phage LH1 62 4.2. Comparaison des phages de S. aureus au phage LH1 63 4.3. Activité du phage LH1 dans différents types de lait contaminés par S. aureus 66 5. Conclusion et perspectives 68 6. Bibliographie 70

vin

Liste des figures

Figure 1. Photographie de Staphylococcus aureus observée en microscopie électronique à

balayage 2

Figure 2. Milieu Baird Parker inoculé avec une souche de S. aureus et comparaison avec

un milieu non inoculé 4

Figure 3. Milieu Mannitol Salt Agar inoculé avec une souche de S. aureus et comparaison

aux colonies de S. epidermidis et à un milieu non inoculé 5

Figure 4. Structure d'une cellule de S. aureus 7

Figure 5. Représentation schématique du système agr 8

Figure 6. Représentation schématique des principales familles de bacteriophages 14

Figure 7. Caractéristiques morphologiques et génomiques des phages caudés 15

Figure 8. Analyse comparative des séquences nucléotidiques des génomes de phages de S.

aureus 18

Figure 9. Arbre protéomique des phages appartenant à la famille des Siphoviridae 19

Figure 10. Étapes des cycles des bacteriophages : cycles lytique et lysogénie 21

Figure 11. Structure des acides téichoïques 22

Figure 12. Voie d'assemblage des protéines structurales des phages caudés 24

Figure 13. Micrographies prises par microscopie électronique à balayage 28

Figure 14. Micrographies de lait cru et de lait traité à haute température 30

Figure 15. Représentation graphique de la concentration bactérienne de S. aureus en

fonction de la densité optique 42

Figure 16. Image en microscopie électronique du phage LH1 45

Figure 17. Alignement du génome des phages LH1, 3A, 42e et 47 49

Figure 18. Profils de restriction obtenus avec EcoRV du génome de onze phages

caractérisés 50

Figure 19. Image en microscopie électronique du phage QW 54

Figure 20. Arbre phylogénétique comparant les séquences nucléotidiques des génomes de

phages de S. aureus 55

Figure 21. Analyse comparative des séquences nucléotidiques des génomes de phages de

S. aureus 56

IX

Figure 22. Analyse comparative des séquences nucléotidiques des génomes de phages de

S. aureus appartenant à la famille des Podoviridae 57

Figure 23. Représentation graphique du logarithme de la concentration bactérienne de

S. aureus en fonction du temps dans du lait à UHT 58

Figure 24. Représentation graphique du logarithme de la concentration des phages K et

LH1 en fonction du temps dans du lait à UHT 59

Figure 25. Représentation graphique du logarithme de la concentration du phage K et de

S. aureus 01 fonction du temps dans du lait à UHT 60

Figure 26. Représentation graphique du logarithme de la concentration du phage LH1 et de

S. aureus 01 en fonction du temps dans du lait à UHT 60

Figure 27. Représentation graphique de la concentration phagique de K et LH1 en fonction

du temps dans les laits UHT et cru 61

Figure 28. Identification d'au moins neuf groupes génétiquement différents de phages de

S. aureus 65

Liste des tableaux

Tableau 1. Classification des phages de S. aureus selon les bases de données de NCBI... 16

Tableau 2. Les différentes souches de S. aureus disponibles au laboratoire et leur

provenance 36

Tableau 3. Liste d'amorces utilisées pour l'assemblage des contigs de l'ADN du nouveau

phage isolé 37

Tableau 4. Onze phages caractérisés dans cette étude, leur provenance et leur souche hôte

de S. aureus 38

Tableau 5. Les génomes de phages de staphylocoques disponibles dans GenBank 40

Tableau 6. Caractéristiques des cadres de lecture ouverts du génome du phage LH1 47

Tableau 7. Spectre lytique des onze phages étudiés sur 32 souches de S. aureus 51

Tableau 8. Pourcentage d'adsorption des phages aux souches mutantes de S. aureus

01-P68et01-QW 52

Tableau 9. Caractéristiques des cadres de lecture ouverts du génome du phage QW 53

XI

Liste des °c ADN

agr

AIP

ARN

ARNm

ATP

BIM

CMRSA

D.O.

db

Dig

DNase

EDTA

FDA

GC

gP HCI

ICTV

kb

kDa

Lan

LTA

MAPAQ

MDa

MeLan

ml

abréviations Degré Celsius

Acide DésoxyriboNucléique

Gène régulateur accessoire (accessory gene regulator)

Peptide autoinduit (Auto Inducing Peptide)

Acide RiboNucléique

Acide RiboNucléique messager

Adenosine Triphosphate

Mutant résistant aux bacteriophages (Bacteriophage-Insensitive Mutants)

Souche canadienne de Staphylococcus aureus résistante à la méthicilline

(Canadian Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus)

Densité Optique

Double brin

Digoxigénine

DésoxyriboNucléase

Acide ethylene diamine tétr.aacétique (EthyleneDiamineTetraacetic Acid)

L'administration américaine des denrées alimentaires et des médicaments

(Food and Drug Administration)

Ratio des nucleotides G et C par rapport aux nucleotides A et T

Produit de gène (Gene Product)

Acide chlorhydrique

Le comité international de la taxonomie des virus (International Committee

on Taxonomy of Viruses)

Kilob.ase

KiloDalton

Lanthionine

Acide lipotéichoïque (LipoTeichoic Acid)

Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec

MégaDalton

Méthyllanthionine

Millilitre

Xll

mm Millimètre

MM Masse Moléculaire

mmol (mM) Millimolaire

MOI Multiplicité d'infection (Multiplicity Of Infection)

MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MSSA Souche de Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline (Methicillin-

Sensitive Staphylococcus aureus)

NaCl Chlorure de Sodium

NAG N-Acétyl-Glucosamine

NAM Acide N-Acétyl-Muramique

NCBI National Center Biotechnology Information

nm Nanometre

OatA O-acétyltransférase

ORF Cadre de lecture ouvert (Open Reading Frame)

pb Paire de bases

PBP2a Protéine 2a liée à la pénicilline (Penicillin-Binding Protein 2a)

PCR Réaction en chaîne par polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PEG PolyEthylene Glycol

pH Potentiel d'Hydrogène

pi Point isoélectrique

PLR Protéine de Liaison au Récepteur

PTA Acide phosphotungstique (PhosphoTungstic Acid)

P/V Poids/volume

RNase RiboNucléase

SARM Souche de Staphylococcus aureus résistante à la Méthicilline

sb Simple brin

SD Shine-Dalgarno

TAE Tampon de Tris-acétate contenant de l'EDTA

TSB Bouillon tryptone au soja (Trypticase Soy Broth)

UA Acétate d'uracyle (Uracyl Acetate)

UFC/UFP Unités Formatrices de Colonies/Unités Formées de Plages de lyse

Xlll

UHT Ultra Haute Température

Ml Microlitre

UV Ultraviolet V Volt

1. Introduction 1.1. Staphylococcus aureus

1.1.1. Caractéristiques générales

Staphylococcus aureus est une bactérie omniprésente chez l'homme, les animaux ainsi que

dans l'aliment. Le nom de « Staphylococcus » a été attribué en 1882 à un regroupement de

cocci causant un grand nombre de maladies pyogenes chez l'humain. Ces bactéries ont été

isolées et analysées par le chirurgien écossais Sir Alexander Ogston en 1880. Il fut

démontré que les microorganismes dérivés de pus prélevés d'un abcès humain

provoquaient les mêmes symptômes et des lésions pyogenes chez une souris (82). De plus,

il a remédié à la maladie en inactivant les staphylocoques par des traitements thermiques et

au phénol. Le genre Staphylococcus a été séparé de celui de Micrococcus par Evans en

1957. Ces deux organismes donnent des colonies opaques, blanches, orange ou jaune sur

gélose au sang. Tout deux sont des bactéries à Gram positif et catalase positive (82).

Cependant, ils sont physiologiquement distincts de par leur capacité à croître en condition

anaérobique et à fermenter le glucose (16). En effet, le genre Staphylococcus est capable de

fermenter le glucose et de produire de l'acide lactique sous conditions anaérobiques

contrairement au métabolisme respiratoire aérobique strict du genre Micrococcus (43, 82,

97).

Le genre Staphylococcus regroupe plus de 40 espèces classées, entre autres, en fonction de

leur capacité à coaguler le plasma de lapin (50). L'espèce aureus est coagulase positive et

comprend deux sous-espèces : aureus et anaerobius. Celles-ci présentent des différences

au test de la catalase, de la (3-glucosidase, de la pigmentation des colonies, de la présence

du monosaccharide N-acétylglucosamine de la surface bactérienne et de l'utilisation du

mannose, lactose et trehalose (92).

S. aureus est l'espèce de staphylocoque la plus pathogène aussi bien chez l'homme que

chez les animaux (111). Ce staphylocoque est non-motile et se présente en coques de 0,5 à

1,5 pm de diamètre associés en paires ou en grappes. Sa morphologie peut être observée à

la figure 1.

Figure 1. Photographie de Staphylococcus aureus observée en microscopie électronique à balayage (10 000X) (tirée de la librairie d'image de la santé publique au centre de contrôle et de prévention des maladies aux États-Unis (CDC))

C'est une bactérie anaérobie facultative et elle est également mésophile, ayant une

température optimale de croissance à 37 °C. Sa tolérance à de grands intervalles de

température, de pH et aux concentrations élevées de chlorure de sodium (jusqu'à 20 %) la

diffère des autres bactéries et favorise sa croissance et sa propagation dans plusieurs

milieux et environnements (9). Les bactéries compos.ant cette espèce sont

chimioorganotrophes et donc, elles ont besoin de sources organiques pour produire de

l'énergie. Elles fermentent aussi plusieurs sucres tels que le fructose, le glucose, le

galactose, le mannose, ou bien des alcools comme le mannitol ou encore des acides

organiques tels l'acétate et des acides aminés comme l'arginine (34).

Le ratio en G + C du génome de cette bactérie est faible et est de 32,8 % (45). Une

recherche dans la base de données publique GenBank® du site NCBI montre qu'il existe 21

souches de staphylocoques dont le génome séquence est disponible et parmi lesquelles 14

appartiennent à l'espèce aureus. La plupart de celles-ci sont des souches résistantes à la

méthicilline qui sont considérées importantes à sequencer et analyser. La taille de ces

génomes est environ de 2000 kb.

1.1.2. Milieux de culture pour l'isolement et l'identification de S. aureus

Afin d'identifier et d'isoler S. aureus, des milieux de culture sélectifs et différentiels sont

souvent utilisés. Un milieu sélectif encourage la croissance des organismes désirés en

inhibant les autres alors qu'un milieu différentiel permet une discrimination basée sur une

propriété physiologique comme la fermentation des sucres.

Il existe un milieu de culture sélectif pour S. aureus et il se nomme Baird-Parker. Ce milieu

a été développé par Baird Parker en 1962 après avoir trouvé que S. aureus est capable

d'hydrolyser 5 % du jaune d'œuf dans un milieu de gélose au sang (Difco). Les colonies de

S. aureus contrairement aux autres espèces de staphylocoques, étaient entourées de zones

claires (15). Les colonies de S. aureus obtenues sur ce milieu sont noires, brillantes et

convexes, de 1 à 5 mm de diamètre. Elles possèdent également une mince bordure blanche

entourée d'un halo clair de 2 à 5 mm de large. Le milieu Baird-Parker contient du jaune

d'œuf, du pyruvate ainsi que des agents sélectifs dont la tellurite, la glycine et le chlorure

de lithium qui jouent un rôle dans l'inhibition de la flore secondaire (9, 16). L'hydrolyse de

la lipovitelline (la protéine du jaune d'œuf la plus abondante) donne naissance à une zone

claire autour de la colonie. De plus, S. aureus peut réduire la tellurite contenue dans le

milieu Baird-Parker en tellure qui donne un précipité noir observable au centre des

colonies et permet leur sélection. Un halo opaque apparaît dans la zone claire après 48

heures d'incubation et est due à l'activité de la lécithinase (Figure 2).

Figure 2. Milieu Baird Parker inoculé avec une souche de S. aureus et comparaison avec un milieu non inoculé (Difco™).

Un deuxième milieu est utilisé pour isoler d'une façon sélective et différentielle les

souches de S. aureus. Il s'agit du milieu Mannitol Salt Agar ou MSA. Celui-ci contient

7,5 % de NaCl inhibant la croissance des bactéries à l'exception des staphylocoques, ce qui

le rend sélectif pour les staphylocoques. D'autre part, alors que la plupart des espèces de

staphylocoques sont capables de croître à de hautes concentrations de sels, seul S. aureus

peut fermenter le mannitol. Le milieu MSA est également différentiel puisqu'il contient un

indicateur de pH nommé rouge de phénol. À bas pH, ce dernier colore en jaune les colonies

qui fermentent le mannitol comme celles de S. aureus et garde en orange ou rouge les

autres colonies (33, 104) (Figure 3).

Figure 3. Milieu Mannitol Salt Agar inoculé avec une souche de S. aureus (colonies jaunes) et comparaison aux colonies de S. epidermidis (colonies rouges) et à un milieu non inoculé (Difco™).

1.1.3. Problématique de S. aureus

S. aureus est l'une des rares bactéries présentant une résistance à l'action du lysozyme.

Ceci contribue fortement à sa persistance et sa capacité à coloniser la peau et les

muqueuses que ce soit chez l'homme ou l'animal (20). Le lysozyme est une muramidase

qui clive la liaison entre les résidus d'acide N-Acétyl-Muramique (NAM) et N-Acétyl-

Glucosamine (NAG). Il est produit par plusieurs tissus humains (muqueuses, tractus

respiratoire et intestinal) et est présent dans le sérum, la salive, la sueur, ainsi que dans les

larmes. C'est une enzyme de défense importante produite suite à l'augmentation de son

titre par infection et à son induction par les cellules phagocytaires et épithéliales (19, 20).

La résistance de S. aureus à cette enzyme est causée par deux facteurs; le haut degré de

reticulation de la couche de peptidoglycane (liaisons transversales donnant un polymère

tridimensionnel) et la production de la protéine OatA ou O-acétyltransférase. Cette dernière

est responsable de l'acétylation du carbone situé à la position 6 du NAM portant l'acide

téichoïque(18, 19).

S. aureus appartient à la microflore normale des narines, du vagin, du pharynx, des

aisselles et de la peau (73). Cependant, lorsque les staphylocoques adhèrent aux tissus ou

traversent dans la circulation sanguine de l'hôte, des infections apparaissent conduisant à

des pathologies diverses comme des infections de la peau, des muqueuses et des viscères

ainsi que les septicémies. Celles-ci sont dues à la production de facteurs de virulence par S.

aureus (voir section 1.1.4). D'autres pathologies sont causées par un seul type de toxine

comme le syndrome de la peau ébouillantée dû à l'exfoliatine, le syndrome de choc toxique

dû à la toxine TSST-1 et les toxi-infections alimentaires dues aux entérotoxines (111). Ces

dernières, contrairement aux autres toxines et facteurs de virulence causent

l'empoisonnement de l'individu ingérant un aliment contaminé par celles-ci. Le

mécanisme par lequel les entérotoxines pénètrent le corps via l'intestin et causent les

symptômes d'intoxication alimentaire est cependant peu connu jusqu'à présent (17).

1.1.4. Facteurs de virulence de S. aureus et leur régulation

La virulence de S. aureus provient de l'action combinée de différentes composantes de la

surface bactérienne ainsi que de la sécrétion de toxines et d'enzymes multiples (59). Les

facteurs de virulence de S. aureus peuvent être répartis en trois catégories fonctionnelles :

ceux qui aident à l'adhésion de la bactérie aux cellules et tissus, ceux qui contribuent aux

lésions tissulaires et à la propagation de l'infection et enfin, ceux qui protègent la bactérie

contre le système immunitaire de l'hôte (13). En tout, il existe plus de 40 protéines de

surface et extracellulaires identifiées dans les souches de S. aureus. Quelques unes sont

schématisées à la figure 4 (73). Les protéines associées à la surface, dont la protéine A et

les adhésines, sont illustrées dans la figure de la page suivante. Ces protéines ont la

capacité de fixer les anticorps, la fibronectine, le collagène et l'élastine et donc de conférer

à la bactérie une résistance à la phagocytose et d'améliorer son adhésion aux cellules de

l'hôte. De plus, la coagulase (Figure 4) cause une coagulation du plasma sanguin et donc la

formation de thrombus obturant le vaisseau sanguin (111). Une autre enzyme, la 0-

lactamase est à la base de la résistance de S. aureus aux antibiotiques appartenant à la

famille des P-lactames (Figure 4). L'enzyme hydrolyse l'anneau P-lactame et inactive la

molécule de pénicilline (72). S. aureus peut produire des toxines protéiques dont la toxine

a, la toxine du choc toxique TSST-1 et les entérotoxines dont l'entérotoxine B

schématisées dans la figure de la page suivante (Figure 4).

Cell-wall- Repeats Ligand-binding anchoring domain domain

Figure 4. Structure d'une cellule de S. aureus. (A) protéines de surface et toxines sécrétées. (B) et (C) surface de S. aureus montrant l'enzyme P-lactamase responsable de la résistance aux antibiotiques appartenant à la famille des P-lactames (B) et la structure d'une protéine de surface appelée dumping factor (facteur d'agglutination) (C) (73).

Le génome de S. aureus contient des gènes codant pour des toxines, pour des protéines de

surface ainsi que pour la résistance aux antibiotiques. Ceci augmente sa virulence et lui

confère aussi une résistance à plusieurs familles d'antibiotiques dont les P-lactames

(pénicilline, méthicilline), les glycopeptides (vancomycine), les quinolones, les

aminoglycosides (gentamycine) et les oxazolidinones (72).

Les facteurs de virulence sont également régulés par des gènes différents. Le gène agr

(accessory gene regulator) est le plus étudié. Celui-ci induit l'expression des gènes codant

pour des protéines extracellulaires dont les entérotoxines et réprime les gènes codant pour

des protéines de surface, et ce, en fonction de la densité et de la croissance bactérienne (13,

26, 59, 73). Le gène agr est constitué de deux unités transcriptionnelles transcrites par les

deux promoteurs P2 et P3 (Figure 5).

EXTRACELLULAR FLUID S Agr inducing peptide

Activation of P2 and P3

ïid

I agr transcript. RNAII

Regulator of virulence gene expression

Figure 5. Représentation schématique du système agr. Figure tirée d'Arvidson et al, 2001 (13).

Le transcrit généré à partir de P2 contient quatre gènes appelés agrB, D, CctA. Les gènes

agrB et agrD produisent l'AIP (Auto Induced Peptide). Ce dernier va se lier au domaine

cytoplasmique de la protéine AgrC qui va se phosphoryler et transférer un groupe

phosphate à la protéine AgrA. Celle-ci va activer la transcription des promoteurs P2 et P3.

Le transcrit produit à partir du promoteur P3 est l'ARN III, la molécule effectrice du

régulon agr. Elle active la transcription des gènes encodant pour les protéines sécrétées et

inhibe celle des gènes encodant pour les protéines de surface et coagulase. Ceci semble être

en relation avec la concentration bactérienne. En effet, lorsque le nombre de bactéries est

moindre comme dans la circulation sanguine, la transcription du gène agr est inactivée

donc la bactérie aura un phénotype adhésif dû à l'expression élevée des protéines de

surface. D'un autre coté, dans un abcès par exemple, la concentration importante de

bactéries va activer la transcription du gène agr conduisant à la production d'enzymes et de

toxines (13, 26, 59).

Un deuxième opéron contrôle de la même façon l'expression des facteurs de virulence. Il

s'agit de l'opéron sarA qui code pour la protéine SarA. Cette dernière est une activatrice de

l'opéron agr. C'est une protéine qui se lie à l'ADN au niveau de régions conservées riches

en bases azotées A et T. Elle se lie aux régions des promoteurs P2 et P3 de l'opéron agr et

augmente par ce fait le taux d'ARN III modifiant donc la synthèse des différents facteurs

de virulence. Elle peut se lier directement aux régions conservées des promoteurs des

différentes protéines de surface et exoprotéines (26).

1.1.5. Intoxications alimentaires staphylococciques

Par la diversité et la quantité de ses gènes de virulence, 5. aureus est l'une des causes

majeures des intoxications alimentaires. Cette bactérie peut croître dans plusieurs aliments

dont le lait, la crème, le beurre, les salades, le fromage, le jambon ainsi que d.ans les

saucisses (68). La présence de cette bactérie dans les différents types d'aliments est, entre

autres, le résultat d'une mauvaise manipulation de ceux-ci durant le processus de

fabrication, de stockage, de transport et de distribution (2). C'est à partir d'une

concentration de IO5 UFC/g d'aliment (80) que certaines souches de S. aureus peuvent

produire une concentration significative d'entérotoxines. Celles-ci causent des nausées,

vomissements, diarrhées, crampes abdominales, des maux de tête, des crampes

musculaires, des variations de la pression artérielle et même dans de très rares cas, la mort

de la personne par entérotoxicose (17). Les symptômes apparaissent 1 à 6 heures après

l'ingestion d'à peine 100 nanogrammes d'entérotoxines (17, 48).

Les intoxications alimentaires staphylococciques font l'objet d'une charge sociale

considérable en termes de coûts d'hospitalisations, de baisses d'heures de travail, de

productivité, etc. (83). De ce fait, les coûts de toutes les toxi-infections atteignent 152

milliards de dollars annuellement aux États-Unis (103). Au Canada, on note une perte

annuelle de 3,8 milliards de dollars suite aux intoxications alimentaires dont 171 millions

sont reliées aux produits laitiers (108). On suspecte 76 millions de malades, 325 000

hospitalisations et 5 200 morts chaque année dû à des maladies d'origine alimentaire aux

États-Unis (CFSAN, 2002). S. aureus est responsable de 16 millions de ces maladies et de

17 100 hospitalisations en France (68) tout comme en Amérique du Nord (CDC, 2007).

Dans l'industrie laitière, le lait cru constitue l'une des sources de contamination par S.

aureus. Dans une étude faite en 2006, 50 % à 60 % des élevages canadiens ont obtenus des

résultats positifs concernant la présence de S. aureus dans leur lait et 12 % des mammites

(infections des mamelles chez les vaches) au Canada sont causées par S. aureus (89). En

10

effet, selon l'étude de Normanno et a l , 38,4 % des échantillons de lait cru testés sont

contaminés par des staphylocoques à coagulase positive en Italie (83). De plus,

l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2000) a attribué, en 1999, 25 des 149

intoxications alimentaires staphylococciques à la consommation de fromages de lait cru en

France ainsi que 3 de 13 ont été reportées en Italie (52).

Les entérotoxines sont des protéines solubles dans l'eau et dans les solutions salines. Elles

appartiennent à la famille des exotoxines pyrogènes staphylococciques et streptococciques.

Ces toxines comprennent, entre autres, les toxines du syndrome de choc toxique (TSST),

les exfoliatines A et B, un groupe d'exotoxines streptococciques pyrogènes ainsi que les

entérotoxines staphylococciques (68). Ces toxines gastrointestinales puissantes et ces

superantigènes stimulent la prolifération des cellules T non spécifiques. Les gènes codant

pour les entérotoxines sont encodes par des prophages ou un phage défectif (phage tempéré

mutant ne pouvant plus s'exciser), le chromosome, des plasmides et des îlots de

pathogénicité (localisés sur le chromosome bactérien ou sur un plasmide) (68).

Présentement, on compte 11 entérotoxines, nommées SEA à SEJ avec trois sous-types de

SEC (9, 17).

Les caractéristiques les plus dangereuses des entérotoxines proviennent du fait qu'elles

sont fortement stables et résistantes à la chaleur ainsi qu'à la plupart des enzymes

protéolytiques comme la pepsine et la trypsine (68). Selon Anderson et al. (11),

l'entérotoxine staphylococcique A (SEA) demeure active après un traitement de 28

minutes à 121 °C et de 15 minutes à 127 °C. SEA est la toxine la plus fréquemment

impliquée dans les intoxications alimentaires (14, 32). D'un autre côté, SEB peut être

détruite par digestion de la pepsine à pH 2 indiquant que la réponse des toxines aux divers

traitements peut varier (21). La stabilité des entérotoxines à la chaleur semble être

dépendante du milieu, du pH, de la concentration de sels et de d'autres facteurs

environnementaux (11). Toutefois, les entérotoxines peuvent être éliminées après

stérilisation si elles sont présentes en petites quantités (68). Lors de la production de

fromages par exemple, elles peuvent même être soutirées avec le lactosérum (80).

11

1.1.6. Solutions envisagées pour la prévention et le contrôle de S. aureus

Ne pouvant pas g.arantir que les aliments, et plus particulièrement le lait et ses dérivés,

soient dépourvus d'entérotoxines, le nombre de S. aureus doit être contrôlé. Cette bactérie

est capable de croître dans le lait puisqu'elle possède, entre autres, des systèmes de

transport phosphotransferase et permeases lui permettant d'utiliser le lactose (34). Afin

d'inhiber la croissance de cette bactérie dans le lait et ses dérivés tout en maintenant la

biodiversité et l'écologie microbienne de l'environnement, plusieurs options ont été

examinées.

L'une des solutions envisagées est l'utilisation de cultures bactériennes protectrices dont

les bactéries lactiques. Ces dernières peuvent influencer la croissance de S. aureus en

modifiant physiquement et chimiquement l'environnement. Elles peuvent sécréter des

bactériocines comme la nisine et la pédiocine ou du peroxyde d'hydrogène ayant un effet

bactéricide à une concentration de l'ordre de 0,6 mmol. La compétition pour les nutriments

et le ratio (bactéries lactiques/S. aureus) peuvent aussi affecter la croissance de cette

dernière dans le milieu laitier (34). De plus, selon Even et a l (47), les bactéries lactiques

ont la possibilité de réduire le potentiel pathogène de S. aureus en modulant l'expression

de ses facteurs de virulence. Mais ceci n'est pas un fait général puisque l'expression de

l'entérotoxine A a augmenté avec l'ajout de bactéries lactiques (47). Cependant,

l'utilisation de culture bactérienne protectrice n'est pas souhaitable dans tout type

d'aliment.

Une autre solution est le traitement thermique des aliments lors de leur fabrication. En

effet, la pasteurisation du lait est efficace pour éliminer S. aureus (69) mais ceci n'empêche

pas une recontamination de l'aliment par des porteurs sains de S. aureus (106).

D'un autre côté, l'utilisation des huiles essentielles s'est avérée efficace pour lutter contre

les souches de S. aureus. En effet, la méthode de l'aromatogramme a révélé que la

croissance de S. aureus est inhibée par presque 40 huiles essentielles issues de plusieurs

plantes dont Cinnamomum cassia, Cinnamosma fragrans, Eucalyptus citriodora,

Eucalyptus dives, Eugenia caryophyllata et autres (42). Cependant, plusieurs huiles

essentielles sont à l'origine de réactions allergiques, d'irritation et de toxicité. De plus,

12

l'utilisation d'huiles essentielles change les propriétés organoleptiques des aliments (28).

Pour ce qui est de leur utilisation dans le lait, leur mécanisme d'action et leurs effets dans

celui-ci ne sont pas encore compris et peuvent résulter en un usage inapproprié des huiles

essentielles (29).

L'utilisation d'endolysines est également documentée dans la littérature scientifique (24,

85, 88). Celles-ci sont des enzymes muréolytiques encodées par le génome de

bacteriophages et synthétisées à la fin du cycle lytique pour lyser la cellule hôte et libérer

de nouveaux virions. Elles ciblent les liaisons de peptidoglycanes à la surface bactérienne.

Les endolysines sembleraient être utiles dans le biocontrôle des produits laitiers et avoir un

bon potentiel antimicrobien dans la prévention et le traitement d'infections causées par S.

aureus. En effet, l'endolysine a une activité antibactérienne rapide et puissante in vitro et in

vivo (24). Elle est active contre une bactérie (Gram positif seulement) indifféremment de sa

sensibilité aux antibiotiques. La probabilité de développer une résistance aux endolysines

est faible. L'endolysine d'un phage de S. aureus est uniquement active contre une même

espèce ou des espèces apparentées. Ainsi, elle a un spectre restreint approprié pour son

usage dans la biopréservation des produits laitiers. De plus, les endolysines dérivées de

phages isolés à partir d'un environnement laitier co-évoluent avec leur hôte et peuvent

donc spécifiquement cibler les souches de S. aureus trouvées dans ce même

environnement. Cependant, la possibilité de libération de différents composants pro-

inflammatoires pendant la lyse bactérienne, les coûts élevés liés à la production et à la

purification de l'endolysine ainsi que sa faible stabilité dans une matrice alimentaire, rend

leur utilisation limitée pour l'instant (24).

Les endolysines purifiées du phage H5 (appartenant à la famille des Siphoviridae) isolé du

lait cru (51, 88) et du phage K (appartenant à la fiamille des Myoviridae) (85), ont été

obtenues et testées contre différentes espèces de staphylocoques. L'endolysine du phage

H5 s'est avérée capable d'inhiber la croissance de S. aureus dans le lait pasteurisé. Son

activité lytique est efficace à pH 7,0 et à 37 °C Celle-ci est perdue à un pH inférieur à 5 et

à de hautes températures arrivant jusqu'à 72 °C (88). Pour ce qui est de l'endolysine du

phage K, celle-ci présente un spectre large à l'intérieur du genre Staphylococcus. Elle a

13

inhibée une variété d'espèces de staphylocoques isolées d'infections bovines et humaines y

compris les souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline (85).

Finalement, une autre option est maintenant considérée, celle de l'utilisation de phages

complets comme d'éventuels agents de biocontrôle dans les denrées alimentaires.

1.2. Les bacteriophages

1.2.1. Historique

Les bacteriophages sont des virus infectant uniquement les bactéries. Ce sont des parasites

intracellulaires obligatoires. Ils ont été co-découverts par Frederick William Twort et Félix-

Hubert d'Hérelle. En 1915, Twort a constaté que les colonies de microcoques devenaient

vitreuses et transparentes à cause d'un agent filtrable et infectieux. Puis, en 1917, d'Hérelle

a montré qu'après incubation toute la nuit, la turbidité de la culture bactérienne avait

disparu laissant place à une solution limpide. De plus, il a constaté une absence de

croissance bactérienne sur boîte de Pétri déduisant ainsi que la cause derrière ceci était

probablement un virus filtrable, parasite de bactéries. Il lui donna le nom de bacteriophage

(46).

C'est en 1922 que les premiers travaux sur le traitement des infections à staphylocoques

avec des phages ont été rapportés. Ces travaux ont été publiés par Gratia lors d'une étude à

Bruxelles (56). Cependant, la phagothérapie a été abandonnée dans le monde occidental

avec la découverte de la pénicilline en 1945 (72). Mais c'est avec l'apparition des souches

bactériennes staphylococciques résistantes aux antibiotiques dans les années 1960 que

l'antibiothérapie a été remise en question (77).

Les phages sont présents partout sur notre planète. Ils se retrouvent dans les océans, le sol,

l'eau potable et la nourriture (63). En 1989, un groupe norvégien a surpris la communauté

scientifique lors de la publication d'un rapport révélant une haute concentration de phages

dans les eaux côtières, les lacs et les océans (22). En effet, les phages seraient les entités

biologiques les plus abondantes sur Terre avec une population totale estimée à plus de 1030

phages (5, 36, 63, 120). L'avènement du microscope électronique a favorisé la mise en

14

place de la première classification de phages en 1943 par Ernst Ruska (6). La classification

de phages contemporaine est dérivée de celle de Bradley proposée en 1967 (25). À ce jour,

plus de 5 500 phages ont été examinés en microscopie électronique (6) et les plus

importants sont conservés au centre de référence Félix d'Hérelle (http://www.phage,

ulaval.ca/).

1.2.2. Classification des phages

La classification de phages, mise à jour par 1TCTV (International Committee on

Taxonomy of Viruses), inclut présentement un ordre, celui des Caudovirales (qui

comprend tous les phages caudés ou portant une queue), 14 familles officiellement

reconnues (6) et 37 genres (49). Ces 14 familles en plus de 5 autres non classées jusqu'à

présent sont illustrées à la figure 6.

ssDNA

O dsDNA

99 9 Myovialdaa)

Cor tkov i r id i» Ttet iv i r ic l i i Podov.rida» SH1

Siphoviridat

P l U f i u v i r i d M Gtobulovirtdae'

O o Fi»a>lk>virld»a- Sd t t r p rov t ru *

Lipothrlxvlrldae

GutUvt- idM Ampu l l i v I r ldM

■Blc iud jv i r .d i» '

ssRNA dsRMA

O Cy&tovir fdK

Figure 6. Représentation schématique des principales familles de bacteriophages (6).

Les phages sont principalement classés d'après leur morphologie et la nature de leurs

acides nucléiques (3, 7, 98). La plupart des phages sont constitués d'ADN double brin. Une

15

minorité possède de l'ADN simple brin, de l'ARN double brin ainsi que de l'ARN simple

brin. Les phages peuvent être à symétrie cubique, filamenteuse, pléomorphique ou binaire.

Ceux ayant une symétrie binaire et possédant une queue prennent le nom de phages caudés

et appartiennent donc à l'ordre des Caudovirales. Ce dernier est très abondant et diversifié.

Il contient 96 % de tous les phages connus jusqu'à présent (6). Les phages caudés

proviennent de toutes les régions et environnements du monde. La plupart ont été isolés

dans les cultures bactériennes d'importance industrielle ou médicale comme les

entérobactéries, les lactocoques, les streptocoques et les staphylocoques (4). L'ordre des

Caudovirales est divisé en trois familles : Myoviridae, Podoviridae et Siphoviridae. Celles-

ci ont des propriétés morphologiques et génomiques différentes (6) (Figure 7).

O

Al

Myoviridae Siphoviridae 3 morphotypes

Cl cz

Podoviridae 2 morphotypes

Morphologie de la queue et de la

capside

Longue queue contractile,

capside et queue séparés par un

cou

Longue queue non contractile (capside

icosaédnqueou allongée dépendant

du morphotype)

Petite queue non contractile (capside

icosaédnqueou allongée dependant

du morphotype) Taille du génome 100 000 pb 50 000 pb 10 000pb

Figure 7. Caractéristiques morphologiques et génomiques des phages caudés.

Ces phages ont 3,5 milliards d'années comparativement aux virus d'animaux et de

végétaux qui dateraient de 700 millions d'années (8). Donc, les phages caudés ont

apparemment eu plus de temps pour se diversifier et se différencier. Cette diversification

peut être causée par l'accumulation des mutations ponctuelles, les réarrangements intra

génomiques (deletions, duplications, inversions et transpositions), les recombinaisons et les

co-infections avec d'autres phages (échange de segments génétiques) (8).

16

1.2.3. Phages de 5. aureus

Les phages de Staphylococcus aureus appartiennent tous à l'ordre des Caudovirales. Il

existe présentement 54 génomes de phages de S. aureus séquences dans la banque de

données publique GenBank du « National Center for Biotechnology Information » (NCBI)

(Tableau 1).

Tableau 1. Classification des phages de S. aureus selon les bases de données de NCBI

Myoviridae Podoviridae Siphoviridae Non classifies

K,G1, 44AHJD, phil 1, phi 12, phi 13,187,2638 A, 37,3 A, P954, PT1028,

Twort 66, P68, 42E, 55,77, 80alpha, phiPV83, CNPH82, ROSA,

SAP-2 EW, PHI5, PVL, phiETA, phiETA2, phi2958PVL,

phiETA3, phiMRl 1, phiMR25, phiN315, phiPVL-CN125,

phiNM, phiNM3, phiPVL108, phiSLT, tp310-l,tp310-2,

phiSauS-IPLA35, phiSauS-IPLA88, 53, 29,

47, 52A, 69, 71, 85, 88,92,96, X2

tp310-3

Toutefois, trois de ces génomes ne sont pas des phages de S. aureus. En effet, les phages

PHI5 et CNPH82 sont des phages de Staphylococcus epidermidis (40) et le phage Twort

est un phage de S. hyicus (113). Cependant ces phages partagent une identité génomique

élevée avec les phages de S. aureus. Le phage Twort partage 51 à 52 % d'identité

génomique avec les phages GI et K de S. aureus respectivement (64).

Les séquences nucléotidiques complètes des phages lyriques P68 et 44AHJD sont les

premières de S. aureus à avoir été publiées (116). En se basant sur leur morphologie, la

taille de leur génome, la similarité des produits de leurs gènes et le type d'infection, les

phages caudés P68 et 44AHJD sont regroupés dans la famille des Podoviridae. L'analyse

comparative des génomes complets des phages P68 (18 227 pb) et 44AHJD (16 784 pb) a

montré qu'une deletion de 1 440 nucleotides semble s'être produite dans le génome du

phage 44AHJD. Alternativement, une insertion pourrait avoir eu lieu aux positions 10 091

et 11 531 du génome de P68 (116).

17

D'autre part, une autre étude comparative a été réalisée sur le génome des phages tempérés

phil 1, phi 12 et phi 13 (60). Ceux-ci ont un génome variant de 42 000 à 45 000 pb et

contiennent 90 cadres de lecture dont environ 50 partagent de l'homologie avec des gènes

connus ou des gènes de d'autres phages de S. aureus. Récemment, les génomes de deux

nouveaux phages mutants, phiIPLA35 et phiIPLA88, ont été examinés et comparés à ceux

des phages phil 1 et phi 12. Ces premiers sont les dérivés virulents de deux phages isolés du

lait cru. L'analyse bioinformatique de ces deux nouveaux mutants a révélé que la structure

des génomes des phages phiIPLA35 (45 344 pb) et phiIPLA88 (42 526 pb) ressemble à

celle des phages phil2 et phil 1 respectivement (53). Une colinéarité de ces séquences a été

observée presque tout au long du génome. En effet, le phage phiIPLA35 est un

Siphoviridae de morphotype B2 possédant une longue queue non contractile et une capside

allongée tout comme les phages phi 12, 47, 3A, 42E, phiSLT, entre autres. Une plus faible

identité génomique est observée en comparant les génomes des phages phiIPLA88 et

phill. De manière générale, la séquence nucléotidique des gènes tardifs de ces deux

phages est plus conservée que celle des gènes précoces (53).

Le génome du phage virulent et polyvalent K a également été analysé en détails (87).

Celui-ci appartient à la famille des Myoviridae avec un génome de 127 395 pb et 118

cadres de lecture. Il est intéressant de souligner que le génome de ce phage ne contient

aucun site GATC le rendi t donc insensible aux enzymes de restriction qui reconnaissent

et clivent cette séquence. De plus, ses gènes structuraux sont hautement homologues à ceux

du phage A511 de la bactérie Listeria suggérant l'existence d'un transfert horizontal entre

les genres de bactéries. L'analyse du génome du phage K montre que celui-ci n'appartient

à aucun groupe déjà défini. Il est très faiblement apparenté aux Podoviridae PZA-like et

aux prophages plasmidiques de Borrelia burgdorferi (87). Ceci permet de le mettre dans un

groupe taxonomique distinct des autres (87).

1.2.3.1 Classification génomique des phages de S. aureus

Dans une étude réalisée par Kwan et a l , 27 phages de S. aureus ont été regroupés suivant

leur identité génomique en utilisant, entre autres, le logiciel DOTTER (Figure 8). Les

18

auteurs ont conclu que ces phages se divisent en trois grandes classes selon la taille de leur

génome: la classe I comprend les Podoviridae avec les phages 66, 44AHJD et P68. Le

phage PT1028 est génétiquement unique bien qu'il appartienne à la famille des

Podoviridae. La classe II rassemble les Siphoviridae et se divise en trois grands groupes A,

B et C. Le phage 2638A est aussi unique ne pouvant pas être apparenté à aucun des trois

groupes. D'un autre côté, les phages 187 et 77 ayant des similarités avec tous les phages de

Siphoviridae sont difficiles à classer. Et enfin, la classe III réunit les phages K, GI et Twort

appartenant à la famille des Myoviridae. Cette étude a donc identifié neuf groupes

distincts : un groupe de phages appartenant à la famille des Myoviridae, deux groupes de

phages appartenant à la famille des Podoviridae dont un groupe est formé uniquement du

phage PT1028 et six groupes de phages appartenant à la famille des Siphoviridae dont trois

d'entre eux comprennent les phages 187, 77, 2638A respectivement (64).

Podoviridae

Siphoviridae Myoviridae

1 / S î?

T "1 : ■

LL- . . . - :___•_ L _ — -: 45 -1

187 09 M K ■tfïmtirK rr 42e 3A 47 V EW 06 ROSA 71 M 29 52A » 92 X2

1 S3

-PTW28 O .

'« V$ -aUARIDl 5j*

-TO J S;

T*wt

I'm

S" ca <

I re

Figure 8. Analyse comparative des séquences nucléotidiques des génomes de phages de S. aureus. Matrice comparant la parenté des séquences nucléotidiques de chaque génome de phage générées par le logiciel DOTTER (64).

19

Une étude subséquente a ajouté à cette classification un nouveau grand groupe (D) de la

classe II combinant les différents phages appartenant à la famille des Siphoviridae (38).

Celui-ci a réunit les phages phi 13, PV83, PVL, N315 et 77; ce dernier était difficile à

classifier dans les études précédentes à cause de sa haute similarité avec les membres de

tous les groupes de la classe II. Les phages tempérés de S. epidermidis, CNPH82 et PHI5

ont été classés dans le groupe C de la classe II partageant une haute identité génomique

avec le phage phiETA. De plus, un arbre phylogénétique basé sur les distances

protéomiques a été conçu. Celui-ci compare tous les phages connus de Siphoviridae

appartenant à plusieurs genres bactériens (Figure 9). Il confirme les regroupements réalisés

après l'analyse génomique de phages staphylococciques (40).

Gram negative bacteria

>-* 1

i \ \ \

^ \ \ \ \

\\\ V .

. <m±. . - c \ ^

* N \ \ i ■

, LK - 4 ,

Lax-tocaccj and Streptococci

Figure 9. Arbre protéomique des phages appartenant à la famille des Siphoviridae. Figure tirée de Daniel et al, 2007 (40).

20

Une autre étude a permis de classer les prophages de S. aureus appartenant à la famille des

Siphoviridae (55). Cependant, cette classification est basée sur le polymorphisme du gène

de l'intégrase et non sur le génome complet des phages (55). De leur coté, Canchaya et al

ont pu assembler les 12 prophages de S. aureus, disponibles à ce moment, appartenant à la

famille des Siphoviridae et les diviser en 5 groupes distincts de modules structuraux grâce

à des matrices de type dot-plot. Trois groupes du genre Sfi21-like ayant des extrémités

génomique de type cos ont été identifiés: [1] PVL, PV83, phi 13, phi Sa3, [2] SLT, phiSa2,

phi 12 et [3] phiMu50A, phiN315 ainsi que deux groupes du genre Sfill-like ayant des

sites de types pac : [1] phiMu50B, phil 1 et [2] phiETA (30). D'autre part, Pantucek et al.

(90) ont réalisé le premier test moléculaire basé sur la méthode de la réaction en chaîne de

la polymerase (ou PCR) pour identifier et classifier les phages staphylococciques et

détecter les prophages dans le génome des souches lysogéniques de S. aureus. Après

l'alignement des séquences d'ADN de ces derniers, quatre régions conservées d'ADN ont

été identifiées dans tous les phages et prophages staphylococciques par les phages de types

de 3 A (représentant du sérogroupe A), 11 (sérogroupe B) et 77 (sérogroupe F) (90).

Cependant, un débat sur la taxonomie des phages est présentement en cours. Plusieurs

pensent que le type de classification établi par l'ICTV il y a plus de 30 ans, doit être révisé

avec la venue de l'âge post-génomique (81). Une classification alternative basée sur la

comparaison génomique et protéomique est envisagée (37, 98). La classification basée

surtout sur la morphologie a plusieurs inconvénients. En effet, les prophages ne sont pas

reconnus par l'ICTV bien que les phages lysogéniques existent. De plus, cette taxonomie

n'est pas en mesure de classifier tous les phages puisqu'ils n'ont pas tous été observés en

microscopie électronique, alors que le génome complet de beaucoup de ces phages non

classifies est déjà séquence. Contrairement à la bactérie et à l'ARN ribosomal, un phage ne

possède pas de gènes ou de séquences protéiques conservés et communs à tous les phages.

Une approche proposée par Rohwer et al. a permis de regrouper les phages et de construire

un arbre protéomique (98). Les solutions proposées sont loin d'être sans faille. La première

proposition se base sur la division du génome des phages en plusieurs modules, la

classification des modules par similarité des séquences, et la description des phages à l'aide

d'un code de chiffres qui représente chaque allele spécifique (67). Cependant, cette

méthode deviendrait complexe lorsque le nombre des différents alleles pour un module

21

spécifique est grand et que la taille du génome de ce phage est grande. Une autre méthode

ne prend pas en considération la structure des modules, et intègre le génome complet dans

un logiciel qui produit un .arbre protéomique de phages (98). La troisième méthode

proposée par Proux et al. compare les gènes structuraux entre eux (94).

1.2.4. Cycle de multiplication des phages

Comme il a déjà été mentionné plus haut, l'utilisation de phages pour la lutte contre les

souches de S. aureus est présentement à l'étude. Les phages les plus prometteurs sont

virulents. Ils suivent donc un cycle lytique menant à la lyse de l'hôte suite à leur

replication. Ce cycle comporte plusieurs grandes étapes dont l'infection de l'hôte, la

transcription des gènes de phages, la traduction de l'ARNm en protéines phagiques, la

replication de l'ADN de phage, l'encapsidation de ce dernier, l'assemblage des particules

de phage et enfin la libération des nouveaux virions (lyse) (Figure 10).

I yje cellulaire el ^ - ^ libération des *• irions J A

Adsorption rl éjection «Je l'ADN du phage

Sous conditions de stress, excision du prophage

l)u|>U aiiam bactérienne et transmission du prophage aux cellules filles

Synttiese drs protéines de structure cl encapsulation de l'ADN du phage

Lysogénie Replication de ^ ^ .— l'ADN du phage f f ^ | Intégration du génome du phage

dam le chromosome hocténen

Figure 10. Étapes des cycles des bacteriophages : cycles lytique et lysogénie. Figure

tirée et adaptée de Labrie (2004) (66).

22

Contrairement aux virus de cellules eucaryotes ayant un cycle lytique d'une durée d'une

heure, celui des bacteriophages peut s'achever en moins de 20 minutes (4).

L'infection débute par la reconnaissance et l'adsorption du phage à un récepteur spécifique

de la surface bactérienne. Dans le cas de S. aureus, les récepteurs de phages à la surface

des bactéries sont peu connus et le mécanisme de fixation du phage à son hôte est peu

caractérisé. De plus, il y a peu d'information sur les protéines phagiques jouant un rôle

dans la reconnaissance et la fixation du phage à S. aureus (61). Des récepteurs

hypothétiques ont été identifiées dont notamment la présence d'acides téichoïques (Figure

11) liés de façon covalente à la couche de peptidoglycane et traversant la paroi bactérienne

(118). La présence des résidus D-glucose et NAG (N-AcétylGlucosamine) ou même de 4-

0-p-(N-acétyl-D-glucosaminyl) dans la structure de l'acide téichoïque semble avoir un rôle

très important dans la reconnaissance du phage à son hôte (35, 39, 70, 115).

Peptidoglyea n- anc hored CWGs (P-CWGs)

Wall teichoic acid [Staphylococcus oireus]

-Peptidog!yc.3n

Membraneanchored CWGs (MCWGs)

Lipoteichotc *ad (S aurtui)

!8 SO

Figure 11. Structure des acides téichoïques. Les trioses, peptoses et hexoses sont représentés par des triangles, pentagones et hexagones respectivement. Les sucres, les alcools dérivés de sucres et les acides dérivés de sucres sont représentés en jaune, orange et violet respectivement. Les acides gras sont indiqués par des lignes en zigzag. N-acétylglucosamine (GlcNAc); M-CWG: glycopolymères de la surface bactérienne ancrés dans la membrane cytoplasmique; P-CWG: glycopolymères de la surface bactérienne ancrés dans la couche de peptidoglycanes. Résidus non-glycosylés: P, phosphate ; Rto, ribitol ; A, D-alanine ; Gro, glycerol ; ManNAc, jV-acétylmannosamine et Glc, glucose (118).

23

Le phage s'adsorbe de son côté à la surface bactérienne grâce à une protéine de liaison

(PLR) située à l'extrémité de sa queue (115). Cependant, celle-ci n'est pas encore

caractérisée chez les phages de S. aureus (61). Puis, la paroi cellulaire bactérienne est

digérée par une enzyme spécialisée du phage, présente au bout de sa queue (4). Moak et al.

ont noté dans leur étude la présence d'hydrolases à peptidoglycane chez quelques phages

de S. aureus appartenant à la famille des Siphoviridae : phil 1 et 85 (78). Plus récemment,

une étude a été réalisée par Rashel et al. (95) qui ont montré pour la première fois qu'un

phage de S. aureus, nommé OMR11, possède un gène (gp 61) codant pour ce type

d'hydrolase à peptidoglycane situé à l'extrémité de sa queue. En effet, cette dernière

possède deux domaines catalytiques dont le domaine amidase et le domaine lysozyme

situés dans les régions N-terminale et C-terminale respectivement. Ceux-ci ont une activité

lytique contre S. aureus et donc agissent en formant des trous dans la couche de

peptidoglycane de la bactérie permettant ainsi la pénétration de l'ADN phagique dans le

cytoplasme de S. aureus (95). L'ADN viral se circularise grâce à ses extrémités cohésives

ou soit par la recombinaison des bouts redondants (4, 115). Arrivé à cette étape, le phage

peut, s'il possède les gènes appropriés, poursuivre le mode lytique ou prendre le mode

lysogénique(115).

Dans ce dernier cas, l'ADN de phage s'intègre à l'ADN chromosomique bactérien et se

réplique passivement avec la cellule. Ce sont les phages virulents et les phages tempérés

devenus lyriques (suite à une induction) qui poursuivent le mode lytique. Ceux-ci débutent

p.ar la transcription de leurs gènes assurée par l'ARN polymerase de phage ou soit une de

l'hôte et se divisant en trois phases : précoce, intermédiaire et tardive (115). Les modules

des gènes précoces sont les premiers à être transcrits. Les produits de ces gènes ont une

fonction dans l'arrêt ou le contrôle du métabolisme de la bactérie, la dégradation de l'ADN

de l'hôte, la protection contre les enzymes de restriction, l'initiation de la replication de

l'ADN du phage et la synthèse des protéines de régulation essentielles pour la suite du

cycle lytique (4, 74). Pour plusieurs phages, la phase de transcription des gènes

intermédiaires et tardifs se déroule pendant plus de 15 minutes après l'infection (4). Le

produit des gènes intermédiaires joue un rôle dans la synthèse de l'ADN du phage et code

pour l'ADN polymerase nécessaire à l'étape de replication du phage. Cette dernière résulte

en l'obtention de concatémères soit de longues molécules d'ADN composées de multiples

24

copies d'un même génome (93). L'étape suivante est celle de la morphogénèse au cours de

laquelle les protéines structurales sont produites et assemblées pour former la capside et la

queue du phage et l'ADN est encapsidé (Figure 12). Ces protéines sont encodées par les

gènes compris dans le module des gènes tardifs (4).

» 1

î @ O dp

Ll

Q 4- Tail protwnt

i

0 -Q

Figure 12. Voie d'assemblage des protéines structurales des phages caudés (4).

L'encapsidation représente la dernière étape dans la maturation de l'ADN de phages

caudés et elle est reliée à l'expansion de la procapside formée d'une tête protéique vide.

C'est un processus complexe au cours duquel l'ADN est introduit à haute vitesse dans la

procapside. Cette étape est réalisée grâce à une enzyme appelée terminase qui, dotée d'une

activité endonucléase, ATP dépendante, se lie au concatémère par sa petite sous-unité,

coupe l'ADN et le transporte dans la capside préformée grâce à sa grande sous-unité au

prix de l'hydrolyse d'ATP (115). Le site de clivage de l'ADN diffère d'un phage à l'autre

(4). En effet, chez les phages de type pac, l'ADN encapsidé commence à un site pac et

continue jusqu'à ce que la procapside soit remplie d'ADN suivant le mécanisme de la tête

pleine. Pour le phage T4, environ 2 % du génome est additionné au génome entier dans la

procapside (93). En effet, la terminase coupe successivement le concatémère à des

distances toujours un peu plus loin que le site pac entraînant ainsi l'obtention d'extrémités

redondantes. Cependant, pour les phages de type cos (extrémités cohésives), l'ADN

commence et se termine par un site cos reconnu par la terminase (63, 101). Ainsi, une seule

25

copie linéaire et complète du génome est retrouvée à l'intérieur de la capside de ces

phages.

Enfin, le cycle lytique s'achève par la lyse cellulaire de l'hôte suite à l'action de la holine

et de l'endolysine ou aussi appelée hydrolase à peptidoglycane. Leurs gènes sont aussi

retrouvés sur le module tardif des gènes viraux (4). La holine cause des lésions non

spécifiques dans la membrane cytoplasmique de l'hôte, facilitant ainsi le passage de

l'endolysine vers la couche de peptidoglycane ce qui entraîne sa dégradation. La

dégradation se fait grâce à quatre classes d'endolysines : les muramidases, les amidases, les

peptidases et les transglycosylases. Habituellement, on retrouve un seul gène codant pour

une holine ou endolysine par génome de phage. À la suite de ce stade, la lyse de la cellule

hôte permet le relargage de nouveaux virions (4, 101, 122).

La plupart des phages tempérés passent par un cycle lytique suite à une induction (UV ou

autre). Ceci est manifesté par l'excision et la libération de l'ADN de phage grâce à une

excisionase (4, 93, 115). Cependant, d'autres phages suivent le mode lysogénique (Figure

10). Cette étape consiste en l'intégration de leur génome dans le chromosome bactérien

grâce à l'intégrase, une enzyme de type recombinase (115). Le maintien du génome viral

dans le chromosome bactérien est assuré par un répresseur. Le répresseur se lie à des

opérateurs phagiques et bloque l'activité de l'ARN polymerase, inhibe la synthèse

d'ARNm de d'autres phages qui tentent d'infecter l'hôte et assure une immunité de la

cellule infectée contre ceux-ci (93). Le phage entre donc en un stade de latence (prophage),

se protège de l'environnement et se réplique comme étant une partie du génome bactérien.

1.3. Applications des phages de S. aureus

Les phages commencent à être utilisés pour le contrôle des bactéries pathogènes dans

l'aliment ainsi que dans des sujets animaux. Les phages virulents ont plusieurs avantages

comparés aux phages tempérés (77). Une souche lysogène (contenant un prophage) est

également immune à une infection par un phage tempéré similaire au prophage. De plus, la

fréquence d'apparition de BIM (Bacteriophage Insensitive Mutant) est moindre avec les

phages virulents (51). Les BIM sont des bactéries qui acquièrent naturellement une

26

résistance à un phage. L'émergence de BIM est présumément associée à des mutations

ponctuelles dans les gènes codant pour les récepteurs de phage à la surface bactérienne.

D'un autre côté, les phages tempérés, devenus prophages, peuvent aussi transférer, entre

autres, des gènes codant pour la production de toxines dans les populations bactériennes

par conversion lysogénique (53). De plus, les phages virulents ayant un large spectre

d'action ou dits polyvalents sont ceux utilisés lors des applications de biocontrôle et de la

thérapie. Ils ont la possibilité de cibler plusieurs souches bactériennes de la même espèce

ce qui représente un net avantage (12, 77, 87, 91). Par conséquent, ce sont les phages

virulents qui sont utilisés comme additifs alimentaires et pour la prévention ou le

traitement (1,91).

1.3.1. Thérapie par les phages

Les phages ont été testés chez des animaux pour montrer leur capacité à lyser des cellules

pathogènes et donc à protéger l'organisme contre les infections. Pour ce qui est de

l'application des phages de S. aureus, au début du 20ieme siècle, le laboratoire parisien

commercial de d'Hérelle a commencé à produire au moins cinq préparations de phages

contre des infections bactériennes multiples dont celles causées par S. aureus. Ces

dernières ont pris le nom de Bacté-staphy-phage et ont été commercialisées par la

compagnie qui a pris le nom récent de L'Oréal. De même, dans les années 1940, la

compagnie américaine Eli Lilly d'Indianapolis a produit sept préparations différentes de

phages pour usage humain contre les staphylocoques sous le nom de Staphylo-lysate ou

Staphylo-jel. Celles-ci ont été utilisées pour remédier aux infections comme les abcès, les

plais suppuratives et autres maladies associées à cet organisme (109). Plus récemment,

l'efficacité de trois phages virulents a été testée contre les infections à S. aureus chez les

animaux. Le phage 9812 est un membre de la famille des Myoviridae et possède un large

spectre lytique. Pantucek et al. ont montré que ce phage peut lyser 95 % des 782 souches

de 5. aureus testées; ces souches provenant de divers environnements dont des hôpitaux

(91). D'autre part, 39 sur 53 souches de S. aureus résistantes à la méthicilline sont

sensibles au phage K, un autre phage appartenant à la famille des Myoviridae. Celui-ci est

également efficace contre les souches de S. aureus résistantes à la vancomycine et à la

téicoplanine (86, 96). Enfin, le phage 44AHJD est également efficace contre les infections

de S. aureus. C'est un phage virulent appartenant à la famille des Podoviridae (116).

27

1.3.2. Applications alimentaires des phages de 5. aureus

L'utilisation des phages comme additifs alimentaires a été approuvé par la FDA pour

contrer Listeria monocytogenes (114, 117). Ces phages n'affectent que les bactéries non

désirées dans les aliments. De plus, ils ne changent pas les propriétés organoleptiques des

produits alimentaires (goût, structure, couleur, odeur) (57). Les phages sont omniprésents

autant dans l'environnement, les aliments ainsi que dans le système digestif. Jusqu'à

présent, aucun mélange de phages n'a été produit et reconnu comme sécuritaire pour lutter

contre S. aureus au niveau d'une industrie alimentaire et donc comme agent de biocontrôle.

Néanmoins, différentes méthodes d'utilisation de phages dans du lait et d'autres aliments

contaminés par des S. aureus ont fait l'objet de recherches spécifiques. La suite de la

présente section sera focalisée sur les applications faites d.ans le lait.

1.3.2.1. Test de l'activité des phages d.ans le lait pour remédier à S. aureus

Des études ont révélé le potentiel lytique des phages contre S. aureus dans du lait traité à la

chaleur, du lait cru ainsi que du lactosérum (41, 54, 84). Dans la plupart de ces applications

laitières contre S. aureus, le phage K a été utilisé. Celui-ci est un phage polyvalent

appartenant à la famille des Myoviridae et, comme mentionné auparavant, ayant un large

spectre lytique (57). Il utiliserait les NAG (N-AcétylGlucosamine) à la surface des acides

téichoïques pour l'adsorption (87). Selon Chatterjee et a l (35), les cellules bactériennes

testées, résistantes au phage K et dépourvues de NAG n'ont pas été capables d'inactiver ce

phage. Dans ces études, les auteurs ont constaté que le phage K est fortement inhibé dans le

lait cru entier. Gill et al. ont tenté d'identifier la cause de cette inhibition en étudiant l'effet

du lactosérum obtenu à partir de lait cru (54). Le lactosérum est la fraction protéique

soluble résiduelle du lait après avoir retiré le gras et la caséine. Elle contient plusieurs

protéines dont la P-lactoglobuline, l'a-lactalbumine, la sérumalbumine, les

immunoglobulines et les protéose-peptones. Des photos de cellules de S. aureus incubées

dans le lactosérum de lait cru et dans du t.ampon ont été obtenues par microscopie à

épifluorescence et par microscopie électronique à balayage (Figure 13).

28

Figure 13. Micrographies prises par microscopie électronique à balayage, (a) Cellules incubées dans du lait cru entier pendant 10 minutes et lavées à deux reprises, (b) Cellules incubées dans du tampon contenant 10 mg/ml d'albumine de sérum bovin et lavées à deux reprises (54).

Ces dernières suggèrent qu'une composante du lait pourrait masquer le récepteur et être à

la base de cette inhibition. Lorsque le lactosérum a été traité par la chaleur, par la

proteinase K ou par ultrafiltration, l'adsorption des phages a augmenté et est devenue

comparable à celle obtenue dans du milieu nutritif TSB. Ceci montre donc que le composé

inhibiteur serait une protéine ou un groupe de protéines qui s'attachent à la surface de S.

aureus ou modifie cette dernière de façon à empêcher les phages de venir s'y adsorber. Des

cellules bactériennes ont ensuite été exposées au lactosérum puis remises dans du milieu

nutritif et testée contre le phage K. Le nombre de colonies formées a diminué de presque

10 % en comparaison avec le nombre obtenu dans du lactosérum cru. Ceci montre que le

phage n'a pas été dégradé, mais que son activité a été inhibée en présence d'un composant

du lactosérum cru. D'autre part, une chromatographie des fractions de lactosérum a révélée

que la taille des protéines inhibitrices est de 1 500 KDa, ce qui suggère que

l'immunoglobuline majeure IgGl (180 kDa) de lait bovin n'est pas responsable de cette

inhibition (54).

Dans une deuxième étude menée par O'Flaherty et al, l'activité lytique du phage K a été

testée contre une souche de S. aureus résistante à la méthicilline poussée pendant une durée

de quatre heures dans du lait chauffé à haute température et dans du lait cru (84). Les

résultats ont également indiqué que l'adsorption du phage K est inhibée dans le lait cru

29

compté au lait chauffé où l'adsorption phagique est restaurée. Pour mieux visualiser la

cause de cette inhibition, des photos de cellules d'une souche de S. aureus isolée de

mammite bovine prises une heure après l'addition du phage K par microscopie confocale

ont été obtenues (Figure 14). Le système de coloration Live/Dead Bac a été utilisé où les

cellules bactériennes vivantes sont vertes et les cellules bactériennes mortes ou lysées par

le phage K sont rouges. Les photos obtenues ont dévoilé l'apparition d'une agglutination

des cellules bactériennes dans le lait cru, ces dernières étant toujours vivantes une heure

après l'ajout du phage K (Figure 14). Cette même constatation a été faite auparavant par

Mamo et al. (75).

Cet agglomérat de cellules a masqué la surface des cellules la rendant inaccessible aux

phages. À l'inverse, les cellules bactériennes de S. aureus ne sont pas agglomérées dans du

lait chauffé à haute température. Après une heure d'infection avec le phage K à une MOI

(multiplicité d'infection) de 10, presque aucune cellule n'est restée vivante (84). Donc, le

composé causant cette agrégation est thermosensible et favorise l'agrégation des cellules.

Les auteurs ont suggéré qu'il pourrait probablement être une agglutinine ou appartiendrait

à la famille des immunoglobulines (62, 71).

30

I I I J H

* » i. * H

Figure 14. Micrographies de lait cru et de lait traité à haute température (HT) contenant la souche de Staphylococcus aureus DPC5246 colorée avec Live/Dead Bac. Cette photo a été obtenue p.ar microscopie confocale à balayage laser. Les cellules vivantes sont colorées en vert et les cellules mortes en rouge, (a) S. aureus DPC5246 dans du lait cru; (b) S. aureus DPC5246 avec le phage K dans du lait cru; (c) S. aureus DPC5246 dans du lait chauffé à haute température; (d) S. aureus DPC5246 avec le phage K à une MOI de 10 dans du lait chauffé à haute température. Les micrographies (c) et (d) ont été prises 60 minutes après l'infection avec le phage (84).

D'un autre coté, Das et al. ont démontré que la caséine (41), protéine majoritaire du lait

caillé peut se complexer aux bacteriophages et les inactiver. Ceci a été déterminé après

avoir observé l'effet du lactosérum, du lait écrémé et du milieu TSB sur l'activité des

phages par enumeration des virions en condition de bas pH. La caséine possède un point

isoélectrique (pi) de 4,7. À un pH de 4,0 et en maintenant la température à 4 °C afin

d'éviter la précipitation de la caséine, 55 % des phages ont été récupérés d.ans du lait

écrémé comparé au pourcentage de récupération obtenu avec du milieu TSB à un pH de

31

6,5. Il est donc possible qu'à un pH plus bas que le pi, ces derniers soient libérés de leur

complexe avec la caséine (41).

Une autre explication serait la formation d'une microcapsule à la surface des souches de S.

aureus (isolées de mammite bovine) après une incubation de 2 heures dans du lactosérum.

Incubées dans ces conditions, ces bactéries induisent la production d'une structure anti-

phagocytaire à leur surface. Celle-ci est hydrophile et résiste au traitement à la chaleur et à

la protease. Cependant, elle est altérée par un traitement au Périodate IO4" (composé

modifiant les cycles saccharidiques) et est donc probablement de nature saccharidique (76).

Ce matériel capsulaire hydrophile serait à l'origine du camouflage de l'organisme et donc

de sa persistance dans le milieu. Il serait attaché à la surface membranaire via une structure

sensible au Périodate comme les acides téichoïques (75, 76, 102). Cette structure pourrait

donc se comporter comme une barrière et empêcher l'interaction entre les phages et les

récepteurs à la surface de S. aureus (119).

1.3.2.2. Utilisation de phages isolés du lait cru et production de cocktails de phages

Certains ont émis l'hypothèse que les phages isolés du lait cru seraient plus efficaces que

d'autres dans le contrôle des bactéries pathogènes isolées du même milieu (27).

Récemment, deux phages tempérés ont été isolés à partir d'échantillons de lait cru : OH5 et

OA72 (51). Ils appartiennent à la famille des Siphoviridae et leur génome d'ADN double

brin consiste en une molécule linéaire. Les dérivés lyriques de ces derniers, nommés

phiIPLA35 et phiIPLA88, ont été testés contre les souches de S. aureus Sa9 dans différents

types de lait. L'expérience a été produite en testant l'efficacité de chaque phage séparément

puis en testant le mélange des deux, et ce, dans les laits cru, pasteurisé et UHT (Ultra Haute

Température), entiers et écrémés et ainsi qu'à différentes températures et MOI (52). Ces

phages ont infecté les souches de S. aureus d'origine laitière et bovine alors que les isolats

cliniques semblent y être résistants. Les auteurs ont ensuite démontré que le mélange de

phages a une plus grande efficacité sur l'inhibition des souches bactériennes de S. aureus

que l'action d'un seul phage. Le cocktail de phages est capable de couvrir un spectre

d'hôtes plus large et pourrait éviter l'apparition de résistance bactérienne. Les deux phages

se sont bien adaptés à l'environnement laitier et ont efficacement inhibé la croissance de S.

32

aureus dans le lait ainsi que dans le lait caillé en cours de fabrication. Cela a été efficace à

des températures de 4 °C, 22 °C et 37 °C (51, 52) confirmant l'utilisation potentielle des

phages comme des agents de biocontrôle dans cette matrice alimentaire. Cependant, leur

biosécurité n'a pas été caractérisée puisque ces phages contiennent des gènes

potentiellement toxiques pour l'humain (53). En effet, un motif du nom de VirE trouvé

dans la protéine bactérienne de virulence E a été détecté dans le produit de gène gp32 du

phage phiIPLA35. Ce motif a été décrit dans plusieurs protéines de replication d'ADN de

phage et pourrait avoir un rôle particulier dans le métabolisme de l'ADN. Cependant, ceci

n'exclu pas le fait qu'il pourrait aussi avoir un rôle putatif dans la pathogénicité de S.

aureus (53).

La question de pH a aussi été traitée par Garcia et al. (51). L'activité lytique du cocktail de

phages a été testée contre des souches de S. aureus à différents pH dans du lait caillé à

25 °C pendant une incubation de 12 heures. À bas pH, le mélange de phages a été

partiellement inactivé entre 4 heures et 6 heures d'incubation à 25 °C. De plus, une

différence de concentration de phages a été observée entre le lait caillé obtenu après l'ajout

d'acide et celui obtenu après l'ajout enzymatique de présure (chymotrypsine). La

concentration phagique, utilisée dans le lait caillé obtenu après l'ajout d'acide, a diminué

de presque 2 unités de log pend.ant une période de 12 heures tandis que celle trouvée par le

lait caillé obtenu après l'ajout de chymotrypsine est restée stable tout au long de cette

même période d'incubation. Le pH semblerait être donc un paramètre clé dans le processus

d'inactivation des phages dans le lait (51). Aucune référence traitant de l'effet du pH dans

le lactosérum n'a été trouvée dans la littérature.

1.4. Problématique à l'étude et objectifs de recherche

L'utilisation des phages de S. aureus et les conséquences reliées à leur utilisation ne sont

pas encore claires. Cependant puisque les phages ont déjà été utilisés comme agents de

biocontrôle, et que le phage K, d'origine inconnue, n'a pas pu lyser les souches de S.

aureus dans le lait cru, il serait intéressant de tester l'activité de phages isolés du lait cru

dans l'élimination des souches de S. aureus. Dans cette étude, un nouveau phage a été isolé

33

du lait cru. Il a ensuite été caractérisé et comparé aux autres phages de S. aureus et ce, aux

niveaux microbiologique et génomique. Et enfin, deux phages ont été choisis pour

l'application alimentaire et leur activité contre une souche de S. aureus isolée de fromage

de lait cru a été testée dans des laits UHT et cru.

34

2. Matériel et méthodes

2.1. Objectif 1. Isolement de nouveaux phages de S. aureus à partir

d'échantillons de lait cru

La présence de phages de S. aureus a été testée dans six échantillons de lait cru provenant

d'autant de fermes différentes :

B-l: Lait cru d'un troupeau de suisse brune de la région de Chaudière-Appalaches

B-2: Lait cru d'un troupeau de Holstein de la région de Chaudière-Appalaches

B-3: Lait cru d'un troupeau de Holstein de la région de Chaudière-Appalaches

B-4: Lait cru d'un troupeau de Holstein de la région de Chaudière-Appalaches

B-5: Lait cru d'un troupeau de Holstein de la région de Chaudière-Appalaches

CRDA: Lait cru de consommation, industriel, de la région de la Montérégie

Ceux-ci ont été obtenus via le laboratoire du Professeur Steve Labrie (Université Laval).

Les éch.antillons ont été centrifugés pour éliminer une quantité plus ou moins importante de

gras. Par la suite, deux amplifications des phages potentiellement présents ont été réalisées

en utilisant 5 ml d'échantillons dans 5 ml de milieu TSB deux fois concentré et en utilis.ant

un isolât bactérien mutant d'une souche isolée de fromage de lait cru procurée par le

MAPAQ (numéro de référence # 44635101). Cette souche mutante est résistante au phage

QW de S. aureus. Pour la suite de cet objectif, le nom BIM 01-QW sera adopté. Ce BIM a

été choisi afin d'élargir le spectre lytique de notre collection de phages. Le contrôle

d'amplification de phages utilisé dans cette expérience a été d'ajouter intentionnellement le

phage staphylococcique cp812 lors des amplifications afin de s'assurer du bon

fonctionnement des étapes du protocole. Après une filtration de la deuxième amplification,

la présence de phages a été testée à l'aide d'une titration : 100 pi de la solution bactérienne

du mutant BIM 01-QW ainsi que 100 pi du filtrat ont été ajoutés à 3 ml de gélose molle

contenant 0,75 % d'agar. Le mélange a été versé sur une boîte de Pétri et incubé pour la

nuit à 37 °C. Ensuite, des plages de lyse ont été isolées et amplifiées avec la souche hôte

BIM 01-QW. L'amplification de la plage de lyse isolée a été par la suite titrée afin

d'obtenir le compte du nombre de phages. Un titre supérieur à IO8 UFP/ml permet de

35

visualiser les phages en microscopie électronique et d'obtenir une concentration d'ADN

suffisamment élevée pour poursuivre la caractérisation génomique du phage.

2.2. Objectif 2. Caractérisation du nouveau phage isolé

Une observation microscopique du phage a permis de connaître son morphotype et de le

classer dans une des familles connues de phages. De plus, le spectre lytique de ce phage

ainsi que l'analyse de son génome ont permis de caractériser le phage aux niveaux

microbiologique et génomique.

2.2.1. Observation des phages en microscopie électronique

Le lysat du phage à observer a été centrifugé à température ambiante et à vitesse maximale

pendant 10 minutes puis filtré à l'aide d'un filtre de 0,45 pm. Pour l'observation du phage

en microscopie électronique, une étape de lavage du filtrat de phages a été réalisée. Elle

consiste à centrifuger 1,5 ml du filtrat de phages à une concentration d'au moins IO8

UFP/ml à 4 °C, à 17 000 rpm pendant 1 heure. Ensuite, le surnageant a été retiré

délicatement en gardant 100 pi du filtrat au fond du tube. Le lavage des 100 pi restants a

été effectué avec de l'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 7,0) à deux reprises à la température

de la pièce. Un volume de 100 pi a été conservé afin de préparer les grilles pour

l'observation des phages en microscopie électronique (44). Par la suite, une aliquote de 7,5

pi de celui-ci a été déposé sur une grille en cuivre et recouverte d'une couche de

Formvar/Carbone (Compagnie Ted Pella). Une coloration au PTA (2 %) ou au UA (2 %) a

été faite et, après élimination du liquide à l'aide d'un papier buvard, la grille a été

introduite dans le microscope électronique à transmission JEOL JEM-1230 pour

l'observation (44). Ce dernier est situé à l'Institut de Biologie Integrative et des Systèmes

(IBIS) de l'Université Laval. Les observations ont été effectuées à 80 kV et la prise de

photo a été faite avec une caméra numérique.

36

2.2.2. Spectre lytique du nouveau phage

Pour caractériser ce nouveau phage au niveau microbiologique, son spectre lytique a été

réalisé contre les différentes souches et isolats de S. aureus disponibles dans notre

laboratoire (Tableau 2).

Tableau 2. Les différentes souches de S. aureus disponibles au laboratoire et leur provenance

PROVENANCE NOM DE LA SOUCHE Collection Félix d'Hérelle HER 1101, HER 1049, HER 1225, SA812, A170,

HER 1226, HER 1238 MAPAQ 01,09 Hôpitaux canadiens Dix souches de S. aureus résistantes à la méthicilline

(SARM) (38) Laboratoire 13 souches résistantes aux trois familles de phages

Les différentes souches mutantes obtenues et isolées au laboratoire à la suite d'un test de

dépôt de la goutte, sont résistantes à plusieurs phages de S. aureus disponibles dans la

collection Félix d'Hérelle. Celles-ci ont pris le nom de 01-QW, 09-QW, 01-P68, 09-P68,

01-44AHJD, 09-44AHJD, 09-Msa, 01-K, 01-LH1, 1049-Pyophage, 1049-Team 2, 1049-

(p812etA170-Team2.

Le filtrat du phage a été dilué (1/100) pour éliminer une possible activité de l'endolysine.

La souche cible a été inoculée dans du milieu TSB et incubée à 37 °C pour la nuit. Ensuite,

10 UFC/ml de bactéries ont été ajoutées à 1 ml de TSB et pipetées sur une boîte de Pétri

contenant 1,5 % d'agar. Une aliquote de 5 pi de cette dilution a été déposée sur le tapis

bactérien de la souche cible. Cette expérience a été répétée au moins trois fois pour

confirmer les résultats obtenus. Après environ 6 heures d'incubation à 37 °C, la présence

d'une plage de lyse à l'endroit où l'aliquote a été déposée indique que le phage est capable

de lyser la souche cible. L'absence de celle-ci signifie que la souche testée est résistante au

phage ou bien que le phage n'est pas capable de terminer son cycle lytique dans cette

souche.

37

2.2.3. Séquençage d'ADN

L'ADN du nouveau phage (nommé LH1) a été isolé en utilisant la trousse «Qiagen

Lambda Maxi Kit » (Qiagen). À l'aide d'un spectrophotomètre de type NanoDrop 2000

(Thermo Scientific), la concentration de cet ADN a été estimée. Une digestion avec

l'endonucléase EcoRV a été effectuée afin de confirmer l'identité de l'ADN isolé. Pour ce

faire, environ 500 ng d'ADN ont été mélangés à 10 U d'enzyme de restriction (Roche) et

du tampon B [10 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoéthanol, pH

8,0]. Huit microgrammes de l'ADN du phage LH1 ont été envoyés sous forme suspendue

dans 50 pi de tampon EB [10 mM TrisHCl (pH 8,0)] (Qiagen) au service de séquençage du

centre d'innovation de Génome Québec et de l'Université de McGill situé à Montréal. Ce

dernier utilise l'appareil Genome Sequencer FLX Titanium (Roche) pour le séquençage.

Par la suite, une marche sur le génome a été effectuée avec des amorces synthétiques

(Invitrogen) afin de rassembler les différents contigs obtenus du service de séquençage et

obtenir une séquence génomique complète (Tableau 3).

Tableau 3. Liste d'amorces utilisées pour l'assemblage des contigs de l'ADN du nouveau phage isolé

amorce 1 (5'- 3') amorce 2 (5'- 3') contig 1 AAGTTCATCTCTTAACCGAC ACAACTGCAACTGTAATGGC contig 2 TTTTAGAACAGGAGAGAGTG TGCAGAAGTGTCCTCTATTG

■ contig 3 CCATTGCTTTCGCACGATCC GCTGGTCAAGTCATGAATCG contig 4 GTCAGTTTGTTATAGCTGTC CACTAAACGCAGTCTTGGAC

Les séquences ont été assemblées à l'aide des logiciels Staden

(http://staden.sourceforge.net/) et BioEdit 7.0.9.0

(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) (58). Les cadres de lecture ouverts ont

été détectés avec l'outil « ORF Finder » disponible sur le site Internet de NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ainsi qu'avec le logiciel GeneMark™ 2.5

(http://exon.biology.gatech.edu/) (23). La fonction potentielle de chacune des protéines a

été déduite par homologie à l'aide du programme BLAST 2.2.23 disponible sur le site de

NCBI (10). Et enfin, le point isoélectrique (pi) et la masse moléculaire (MM) de chacune

des protéines de phage déduites ont été obtenus en utilisant Compute pI/Mw

(http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html).

38

2.3. Objectif 3. Comparaison du nouveau phage isolé aux autres phages

de S. aureus

Le génome du nouveau phage LH1 a été comparé aux génomes de phages de S. aureus

déjà disponibles dans la base de données publiques GenBank. La caractérisation et

l'analyse bioinformatique ont permis le regroupement des phages selon la similarité des

profils de restriction et leur identité génomique. Ceci permettra de faire un choix éclairé

des phages à utiliser dans le lait. De plus, le phage ayant le spectre lytique le plus large sera

considéré comme un agent de biocontrôle potentiel et sera utilisé ultérieurement dans

l'application alimentaire.

2.3.1. Profils de restriction du génome des phages de S. aureus

Dix autres phages de S. aureus, disponibles au Centre de référence Félix d'Hérelle pour

virus bactériens, ont été comparés au nouveau phage isolé (Tableau 4).

Tableau 4. Onze phages caractérisés dans cette étude, leur provenance et leur souche hôte de S. aureus

PHAGES PROVENANCE SOUCHES HÔTES

mj

■S 1 t

Pyophage Géorgie

SA812 mj

■S 1 t

Team 1 Géorgie SA812 mj

■S 1 t

Team 2 Géorgie

SA812

mj

■S 1 t phi812 République Tchèque

(91) SA812

mj

■S 1 t

K Belgique (56) SA812

|

1 P68 France (99) 68 (HER 1049)

|

1 QW Eaux Usées du Québec 68 (HER 1049)

|

1 44AHJD États-Unis (99) 44A (HER 1101)

1 :s s a-03

3A Canada HER 1225 1 :s s a-03

Msa Italie (31) Al 70

39

Dans le tableau 4, les dix phages disponibles dans notre laboratoire sont énumérés ainsi

que leur provenance et leurs souches hôtes respectives. Tout d'abord, chaque phage a été

amplifié et titré sur sa souche hôte dans du milieu TSB. Le titre doit être supérieur à IO8

UFP/ml pour obtenir une préparation assez concentrée afin d'isoler l'ADN phagique. Puis,

l'ADN a été extrait suivant le guide accompagnant la trousse lambda de Qiagen. Le dosage

de l'ADN obtenu a été effectué à l'aide du NanoDrop 2000. Par la suite et afin d'établir le

profil de restriction de l'ADN de chaque phage, celui-ci a été digéré avec l'enzyme

EcoRV. Une migration sur gel d'agarose 0,8 % (P/V) a été effectuée pendant environ une

heure à 100 V. Enfin, les bandes d'ADN obtenues ont été colorées au bromure d'éthidium

0,5 pg/ml et visualisées aux UV avec l'appareil Gel Doc (BioRad). Les profils de

restriction de chaque phage ont été comparés entre eux afin de pouvoir regrouper les

phages ayant un profil similaire.

2.3.2. Spectre lytique des phages

Le spectre lytique de chaque phage a été réalisé contre toutes les souches de S. aureus

disponibles, la méthodologie étant décrite plus haut. Les spectres ont été comparés entre

eux et avec celui du nouveau phage LH1 pour identifier le phage capable de lyser le plus

de souches de S. aureus tout en étant compatible avec LH1.

2.3.3. Test d'adsorption des phages à des cellules de S. aureus

Certaines souches testées dans le spectre lytique sont des souches mutantes résistantes aux

phages qui sont des dérivés naturels de souches sauvages sensibles aux phages. La

résistance peut être due à plusieurs facteurs liés au cycle de multiplication du phage. S'il

s'agit de BIMs d'adsorption, c'est l'interaction du phage avec le récepteur bactérien qui

serait bloquée et le phage n'arriverait plus à s'adsorber à la surface de la bactérie. Afin de

déterminer si les BIMs obtenus étaient des BIMs d'adsorption, un test d'adsorption des

phages a été réalisé. Un lysat de phages à une concentration de 103 UFP/ml a été ajouté à

différentes cultures bactériennes inoculées dans du milieu TSB ayant une D.O.600 située

entre 0,6 et 0,8 (correspondant à une concentration bactérienne de plus de IO8 UFC/ml). Le

surnageant a été recueilli après 15 minutes d'incubation à 37 °C et centrifugé pour une

40

minute à vitesse maximale à la température de la pièce. Le pourcentage d'adsorption s'est

fait par ce calcul :

titre du surnageant contrôle tampon - titre du surnageant cellules titre du surnageant contrôle tampon xlOO

Plus le pourcentage d'adsorption est élevé, plus le phage s'adsorbe efficacement à la

cellule et donc dans ce cas, la souche mutante ne serait pas un mutant d'adsorption.

2.3.4. Analyse bioinformatique des génomes de phages

Il existe jusqu'à présent 54 génomes complets de phages de staphylocoques disponibles

dans les bases de données publiques (GenBank). Plusieurs de ces phages, dont le génome

est à ADN double brin, ne sont pas classés dans les familles connues (Tableau 5). Les

phages soulignés dans le tableau 5 ne sont pas des phages de S. aureus. Cependant, ceux-ci

partagent une identité génomique élevée avec les phages de S. aureus, d'où leur inclusion

dans cette étude (40, 64).

Tableau 5. Les génomes de phages de staphylocoques disponibles dans GenBank

Myoviridae Podoviridae Siphoviridae Non classés

K,G1, 44AHJD, phil 1, phil2, phil3,187,2638A, 37, 3A, P954,PT1028,

Twort 66, P68, 42E, 55,77, 80alpha, phiPV83, CNPH82, ROSA,

SAP-2 EW. PHI 5. PVL. phiETA. DhiETAZ phi2958PVL,

phiETA3, phiMRl 1, phiMR25, phiN315, phiPVL-CN125,

phiNM, phiNM3, phiPVL108, phiSLT, tp310-1, tp310-2,

phiSauS-IPLA35, phiSauS-IPLA88, 53,29, tp310-3

47, 52A, 69, 71, 85, 88,92, 96, X2

Des analyses bioinformatiques de ces génomes ont été réalisées afin de comparer et de

regrouper les différents phages ayant un pourcentage élevé d'identité nucléotidique. Ceci a

41

été effectué à l'aide des logiciels MEGA 4.1 (contenant ClustalW et Tree Explorer) en

utilisant la méthode du Neighbor-Joining (112) et à l'aide du logiciel DOTTER (107).

Le génome du nouveau phage LH1 a été comparé aux autres afin de le classer dans un

groupe de phages. De même, un autre phage de S. aureus a été isolé des eaux usées du

Québec par le médecin résident Dr Jeannot Dumaresq (données non publiées). Ce phage

nommé QW appartient à la famille des Podoviridae. Son génome a aussi été séquence et

comparé aux autres phages de S. aureus afin de le classer.

2.4. Objectif 4. Utilisation des phages pour éliminer la présence des S.

aureus dans différents types de laits

Suite à leur caractérisation et leur regroupement, les phages K et LH1 ont été choisis pour

une application alimentaire. Il a déjà été montré que l'activité du phage polyvalent K est

inhibée dans le lait cru (54, 84). Il sera donc intéressant de le tester dans le lait et confirmer

les résultats des articles précédents. Dans cet objectif, l'activité du phage K a été comparée

à celle du nouveau phage isolé à partir du lait cru. L'interaction phage-bactérie dans le lait

chauffé à ultra haute température (UHT) et le lait cru ainsi que l'inhibition de la croissance

bactérienne par les phages en fonction du temps ont été vérifiées.

2.4.1. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait UHT

L'élimination de S. aureus par l'ajout de phages a été réalisée dans du lait UHT et du lait

cru. La souche bactérienne utilisée dans cet objectif est la souche 01 obtenue du MAPAQ

et isolée d'un fromage au lait cru québécois. La croissance bactérienne a été testée sur une

période de dix heures à une température d'incubation de 37 °C. Les trois premiers tubes

sont les contrôles : contrôle lait contenant seulement du lait, contrôle lait contenant une

quantité précise du phage K et un contrôle lait contenant le nouveau phage LH1. Ensuite,

un quatrième tube contenait du lait et la culture bactérienne de S. aureus, et dans les

cinquième et sixième tubes, les deux phages ont été rajoutés à la solution bactérienne. Le

dénombrement des plages de lyse s'est fait sur du milieu TSB alors que le milieu Baird-

Parker a été employé pour l'énumération des colonies bactériennes.

42

La moyenne de la concentration de S. aureus dans le lait cru québécois contaminé est de

104 UFC/ml (valeur obtenue par les études de Karine Lavoie du laboratoire du Professeur

Steve Labrie, Université Laval, résultats non publiés). Cette concentration a été adoptée

dans cette expérience avec un MOI de 5, un MOI étant le rapport du nombre de particules

virales sur le nombre de cellules bactériennes.

Un premier essai a été réalisé à différentes dilutions afin de distinguer les bonnes

conditions d'expérience pour énumérer les microorganismes. Celle-ci a été répétée ensuite

trois fois pour confirmer les résultats.

Afin de calculer le volume de culture bactérienne à ajouter dans les tubes de lait, une

mesure de la concentration bactérienne en fonction de la densité optique a d'abord été

effectuée (Figure 15). La densité optique de la culture correspond à une valeur plus ou

moins précise de la concentration bactérienne d'où la nécessité de faire des comptes

bactériens. Pour une concentration de IO4 UFC/ml de S. aureus dans le lait, le volume de

solution bactérienne à rajouter dans un tube de 5 ml de lait est de :

1 x IO4 x 5 V = concentration de la culture bactérienne

l,4E+09

1.2E+09

l,0E+09

Ê 8,0E+08

5 6,0E+08

4.0E+08

2,0E+08

0,0E+00

0,2 0,4 0,6 0,8

Densité optique (600 nm)

1,2 1,4

Figure 15. Représentation graphique de la concentration bactérienne de S. aureus en fonction de la densité optique.

43

2.4.2. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait cru

L'action des phages seuls (sans l'ajout de la culture bactérienne dans le lait) a été testée

dans différents types de lait. Le lait cru a été chauffé selon les conditions standards de

pasteurisation (63 °C pendant 30 minutes puis refroidi à 13 °C) (69). Un autre échantillon

de lait cru a été maintenu dans de l'eau bouillante (100 °C) pendant environ une minute

pour se rapprocher des conditions de production du lait UHT. Du lait UHT commercial

ainsi que du lait cru ont été utilisés comme contrôles. Le dénombrement des plages de lyse

des deux phages a été réalisé dans un milieu TSB. La présence de S. aureus dans les

différents types de laits a été suivie sur milieu Baird-Parker en tant que contrôle tout au

long de l'application alimentaire en fonction du temps.

44

3. Résultats

3.1. Objectif 1. Isolement de nouveaux phages de S. aureus à partir

d'échantillons de lait cru

Deux amplifications utilisant la souche BIM 01-QW ont été nécessaires afin d'obtenir des

plages de lyse dans les six différents échantillons de lait cru. L'isolement d'une plage de

lyse de chaque échantillon testé a été effectué. Ensuite, trois amplifications de celles-ci ont

été réalisées afin d'obtenir un titre de phage élevé permettant une extraction de l'ADN de

phages des six échantillons. Un nouveau phage a été isolé et a été nommé LH1. La

connaissance de sa morphologie et de sa séquence permettra de le classer dans un groupe

de phages et de le comparer aux autres phages de S. aureus pour lesquels le génome est

disponible.

3.2. Objectif 2. Caractérisation du nouveau phage isolé

3.2.1. Observation des phages en microscopie électronique

Observé sous microscope électronique, LH1 a une capside allongée d'une longueur de 83,6

nm ± 0,5 et d'une largeur de 44,3 nm ± 0,2. Le phage LH1 a une queue non contractile

d'une longueur de 286,1 nm ± 10, 7 et d'une épaisseur moyenne de 5,3 nm ± 0,6. Donc,

celui-ci appartient à la famille des Siphoviridae et est de morphotype B2 (Figure 16).

45

te

-f

■0 100 nm I I

Figure 16. Image en microscopie électronique du phage LH1. Échelle : 100 nm. Cette photographie a été prise par la caméra numérique fixée au microscope électronique de marque JEOL JEM-1230.

Peu de phages de S. aureus caractérisés possèdent ce morphotype B2. Il existe seulement

les phages 3A, 47 et 42e (64). L'analyse bioinformatique du génome du phage LH1 nous

permettra de déterminer s'il est vraiment similaire à ces phages.

3.2.2. Spectre lytique du phage LH1

Le phage LH1 a été testé contre 32 souches différentes de S. aureus disponibles au

laboratoire. Ceci a permis l'obtention du spectre lytique de LH1. Il s'est avéré que 7 des 32

souches testées sont sensibles à LH1 soient les souches 01, 09, SARM-2 (canadien),

SARM-7, BIMs 01-QW, 01-44AHJD et 01-P68. Ces mêmes souches sont également

lysées par le phage Msa qui appartient aussi à la famille des Siphoviridae. Cependant, en

plus de ceux-ci, le phage Msa est capable de lyser les souches A170, SARM-1, S ARM-10

et les BIMs 01-LH1 et A170-Pyophage. D'autre part, les phages apprenant à la famille

des Myoviridae sont capables de lyser 26 souches de S. aureus testées et de lyser

partiellement les six autres souches restantes. Ceci suggère donc que le spectre lytique du

nouveau phage LH1 est restreint par rapport à certains autres phages de S. aureus.

46

3.2.3. Génome du phage LH1

Le génome du phage LH1 a été séquence afin de le classer dans un groupe connu de

phages de S. aureus. De plus, il est important de s'assurer de l'absence de gènes de

virulence dans le génome de LH1 avant de l'utiliser dans une application alimentaire

comme agent de biocontrôle. Le génome a une taille de 46 050 paires de bases. La totalité

du génome du phage LH1 a été couverte 36 fois par séquençage. Il contient 58 cadres de

lecture ouverts ayant plus de 40 codons. Après l'assemblage du génome de LH1 avec le

logiciel Staden, et l'analyse des chromatogrammes obtenus, une chute de signal a été

observée aux deux extrémités du génome du phage LH1. Ceci indique que ce phage

possède des extrémités cohésives ou sites cos. L'alignement du génome du phage LH1

ainsi que celui de trois autres génomes de phages appartenant à la famille des Siphoviridae

et partageant un niveau d'identité génomique élevé avec le phage LH1 ont été obtenus, et

ce, à l'aide du logiciel BioEdit. L'édition graphique a été réalisée à l'aide du logiciel

Adobe Illustrator (Figure 17). La fonction putative de chacune des séquences en acides

aminés de ces derniers a été déterminée grâce au programme pBLAST disponible sur le

site de NCBI. Les codons de départ (ATG, TTG, CTG, ATA et GTG) ainsi que les codons

d'arrêt (TAG, TAA et TGA) ont été utilisés (64). Le RBS ou site de fixation du ribosome

constitue la séquence nucléotidique conservée Shine-Dalgarno (SD) (105). Il est situé entre

8 à 12 nucleotides en amont du codon de départ. Celle de S. aureus (5'-AGGAGG-3') a été

utilisée pour identifier les séquences de RBS dans les génomes de bacteriophages infectant

cette bactérie (64). Toutes ces données sont affichées dans le tableau 6 à la page suivante.

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I 2 3 4 S 6 9 12 14 15 16 17 18 19 22 25 26 27 2» 29 30 33 35 37 40 41 42 45 48 SI 54 56

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36 17 41 130 S3 » 31 67 38 JO 47 SS 59 9 40 IS I I 4 6 l p J f * 1 22 13 '4 6 44 4 7 - j *35 8 21 7aJ

,6-$%3

7Sp4

333

U 19 3 T i - F s i ' j V 2 7 ? 137*

43 3 8 IS 172-0 2V41 I J I 14 4 52 2 S 36 87 HI '«1 12 11 2» I» 13 7 1 » 32 40 7 3 ^ 3 9 24, „23» 15S

7»%

9 » * • & * ] . ? 1 IS 6 43 4 45^7 J 4 71 .1 i t ^ n ' O W w 22 3 J t f M t f 7 l e 8 2S»

!#♦ HH» -I R Figure 17. Alignement du génome des phages LH1, 3A, 42e et 47. Chaque flèche

représente un cadre de lecture ouvert. Ceux partageant plus de 80 % d'identité en acides

aminés sont indiqués par la même couleur et sont reliés par des ombrages gris. Les

pourcentages d'identité inférieurs à 80% sont affichés sur la figure.

L'analyse bioinformatique du génome du nouveau phage LH1 montre qu'il se rapproche le

plus des phages 3A, 47, phiSLT, et phi2958PVL. Cependant, il n'est pas clairement montré

quel phage parmi ceux-ci représente le plus haut pourcentage d'identité génomique avec le

phage LH1. La comparaison des résultats avec d'autres logiciels bioinformatiques

confirmera cette identité.

50

3.3. Objectif 3. Comparaison du nouveau phage isolé aux autres phages

de S. aureus

3.3.1. Profils de restriction du génome des phages de S. aureus

Le profil de restriction de l'ADN des dix phages de 5. aureus disponibles au laboratoire a

été réalisé. Ces différents profils ont été comparés entre eux et à celui du phage LH1

(Figure 18).

2216 Il 198 10 180 9 162 8 144

7 128 6 108 5 090 4 072

Figure 18. Profils de restriction obtenus avec EcoRV du génome de onze phages

caractérisés (avec EcoRV). Marqueur 1 kb de la compagnie Invitrogen. Les phages

appartenant à la même famille sont regroupés sous un crochet commun.

3.3.2. Spectre lytique des phages

Afin de caractériser et de comparer les phages entre eux, un spectre lytique de chacun de

ceux-ci a été réalisé en utilisant 32 souches de S. aureus (Tableau 7). Les phages

51

appartenant à la famille des Myoviridae ont le plus large spectre lytique. Seules deux

souches de S. aureus résistantes à la méthicilline, CMRSA-2 et CMRSA-6, sont

p.artiellement sensibles aux phages Pyophage, Team 1, Te.am 2 et phi812 et K

respectivement. Les isolats 01-K, A170-Team 2, 1049-Pyophage, 1049-Team 2 et 1049-

phi812 sont partiellement résistants à ces cinq phages. Jusqu'à présent, aucun isolât de S.

aureus n'est complètement résistant aux phages appartenant à la famille des Myoviridae.

Les phages P68, QW et 44AHJD appartenant à la famille des Podoviridae ont un

spectre lytique plus restreint que celui des phages appartenant à la famille des Myoviridae.

Ces trois phages ont un niveau d'identité génomique dépassant les 99%. Cela s'illustre

aussi p.ar leur capacité à lyser les différentes souches de S. aureus. Enfin, les phages

appartenant à la famille des Siphoviridae possèdent un spectre lytique restreint par rapport

aux deux autres familles. Les phages Msa, LH1 et 3A sont capables de lyser 13, 7 et 1 sur

32 souches de S. aureus testées respectivement. Il serait donc intéressant de choisir un

phage appartenant à la famille des Myoviridae dont le phage K pour comparer son activité

à celle du phage LH1 dans le lait.

Tableau 7. Spectre lytique des onze phages étudiés sur 32 souches de S. aureus

Collection Félix d'Hérelle MAPAC Hôpitaux canadiens Laboratoire

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O

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S *o 'C ■s o

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£ 1

P68 c, 8

'fa t l

£ 1 QW

c, 8 'fa t l

£ 1 44AHJD

, h, o o -c *o S* s

<j"i S

M " , h, o o -c *o S* s

<j"i S

LH1 -1 II , h, o o -c *o S* s

<j"i S 3A

] Q partiellement sensible ] Πsensible

52

3.3.3. Tests d'adsorption des phages à des cellules de S. aureus

Plusieurs souches mutantes de S. aureus résistantes aux phages ont été isolées au

laboratoire. Pour savoir si la mutation acquise par ces BIMs est au niveau du récepteur de

phage à la surface bactérienne, un test d'adsorption des phages a été réalisé. Ce dernier a

été effectué sur les deux souches BIM 01-P68 et BIM 01-QW représentant les souches

mutantes de la souche sauvage 01 isolée du fromage de lait cru et qui sont maintenant

résistantes aux phages P68 et QW respectivement (Tableau 8).

Tableau 8. Pourcentage d'adsorption des phages aux souches mutantes de S. aureus 01-P68 et 01-QW

POURCENTAGE D'ADSORPTION

SOUCHES T Cellules Cellules résistantes sensibles

01-QW 0 18,3 ±2,0 82,1 ±3,7

01-P68 0 14,2 ±7,7 100 ± 0

Les résultats de ce tableau montrent que les phages QW et P68 ont pu s'adsorber aux

cellules sensibles à plus de 80 % comparés à un pourcentage d'adsorption de moins de

20 % aux souches mutantes 01-QW et 01-P68. Ces dernières sont donc bien des BIM

d'adsorption. Elles ont alors subi une mutation au niveau des composants de la paroi

bactérienne jouant un rôle dans l'interaction phage-hôte.

3.3.4. Analyse bioinformatique des génomes de phages

Le génome de la majorité des dix phages de S. aureus disponibles au laboratoire ne sont

pas encore séquences. Le phage QW, isolé au laboratoire, a été observé en microscopie

électronique et son ADN a été séquence afin de pouvoir le comparer aux autres phages en

fonction de son identité génomique et de sa morphologie. L'analyse de son génome et de sa

morphologie a montré qu'il appartient probablement à la famille des Podoviridae avec 16

766 paires de bases. La totalité du génome du phage QW a été couverte 33 fois. Il possède

53

20 cadres de lectures ouverts (40 codons et plus) représentés avec leur fonction respective dans le tableau ci-dessous (Tableau 9).

Tableau 9. Caractéristiques des cadres de lecture ouverts du génome du phage QW

Sens ORF Début Fin

19

20

Taille (a.a.)

Séquence SD 5'- AGGAGG -3'

Fonction putative de la protéine déduite

Meilleure homolgie avec BLAST

513 842 1041

824

1078 1469

103

78 142

ATTAGGaaGTG AGGAGTgatataataATG

TTCAAfitttattacaATG

1824 2108 94

2295 2756 153

2737 4050 437

AGTAAAaataaatATG

:ATACfitctgaaATG

GTGAGGtataactttttatattATG

Protéine putative de liaison à l'ADN simple brin

Protéine d'encapsidation putative

4084

4287

4203

6350

ADN polymerase

687 ATGACGcattttatacgtatGTG ADN polymerase

7142

7878

261

140

AAGAGTcattaaaaATG

GAQAGiïgggtataatATG Holine

9897 8302 531

10426 10169 85

10944 10234 236 12899 10956 647

ACGTGAtagaATG Protéine de la queue

ATQAAAatggtacatttacATG Amidase

AGGAGTgatataaATG Amidase

AGGTGGttaaataATG Protéine mineure structural

13668 12913 251 AGCAGTeatataaATG Protéine du collet inférieur

14644 13661 327

15885 14659 408

16074 15892

16489 16088

60

133

AGGAGCgtaaaatATG Protéine

AGGAGGaataataaattATG Protéine majeure de la capside

AGGAGGaatttaaacATG

TGGAGGtgtataaATG

44AHJD, ORF002 44AHJD. ORF003

44AHJD.ORF004 44AHJD. P68. OR F006 44AHJD, Pi ORF008 •14AHJD, P68, ORF009 et 66, ORF 005 44AHJD, P68, ORF010 et66,ORF001 •MAHJD,P68, ORF010 et 66, ORF001 et SAP-2, ORF009 44AHJD, P68, ORF011

66, ORF004 44AHJD, P68, ORF012 et66,ORF013

E-value

6e-52 3e-37

2e -

7e-45

le-74

0

44AHJD, P68, ORF013 et 66, ORF 003 et SAP-2, ORF012 44AHJD,ORF015et P68.ORF016 44AHJDORF015et P68. ORF016 44AJUD,ORF016et P68,ORF017,et66, ORF002 et SAP-2, ORF015 44AHJD, ORF017et P68,ORF018,et66, 3e-143 ORF008

5e-;

9e-101

66, ORF007 44AHJD. ORF019et P68, ORF021et66, ORF006 et SAP-2, ORF018 44AHJD, ORF020 et P68,ORF021et66, ORF029 44AHJD,ORF021 et P68, ORF22

2e-26

4e-63

54

Deux de ces cadres de lecture ouverts, or/76 et orfl7, encodent des protéines du collet

supérieur et inférieur. Ceci paraît évident vu la morphologie du phage QW observée en

microscopie électronique (Figure 19).

Figure 19. Image en microscopie électronique du phage QW. Échelle : 50 nm. Cette photographie a été prise par la caméra numérique fixée au microscope électronique de marque JEOL JEM-1230.

Les génomes de tous les phages de S. aureus disponibles dans les bases de données

publiques ont été comparés entre eux. Les logiciels MEGA 4.1 et DOTTER ont permis de

regrouper les phages ayant un niveau d'identité génomique élevé en méga-groupes sous

deux différentes formes. La figure ci-dessous montre l'organisation des génomes de phages

de S. aureus par le logiciel MEGA 4.1 selon leur identité génomique, et ce, sous forme

d'un arbre phylogénétique. Donc, plus les génomes de phages sont identiques, plus ceux-ci

sont situés dans des branches ayant un ancêtre commun ou une racine plus proche (Figure

20).

Myoviridae 55 Podoviridae

Siphoviridae

Figure 20. Arbre phylogénétique comparant les séquences nucléotidiques des génomes de phages de S. aureus. Cet arbre est généré par le logiciel MEGA 4.1 en utilisant la méthode Neighbor-Joining. Échelle: 200 paires de nucleotides.

Une autre analyse de type « dot plot » a également permis de regrouper les phages selon

leur niveau d'identité génomique et a confirmé les résultats obtenus avec le premier

logiciel utilisé. La matrice obtenue rassemble tous les génomes de phages et permet

d'identifier les différences nucléotidiques entre deux phages. La comparaison des génomes

se fait en examinant la continuité de la droite de comparaison entre deux génomes qui

constitue l'élément primordial; plus la droite est continue et passe par la diagonale du

56

carré, plus le degré d'identité génomique entre ces deux phages est élevée. Une absence de

gène ou une faible identité peuvent se schématiser par un bris de cette ligne (Figures 21 et

22).

aOOOMM 1 . . . a . i ■ t 1 . . a

\ 2 0 0 0 0 0 -

.... : — a-. — — ,

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Myoviridae L

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Siphoviridae

Podoviridae

53

PMETA2 - p 4 - . 1 1

plaaUR25 p * > * TA ptaaURU phlETAJ tt

- «a X2 71 S2A »

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Figure 21. Analyse comparative des séquences nucléotidiques des génomes de phages de S. aureus générée par le logiciel DOTTER.

57

' 20000 1 1

e:::: l

80000 10001

\ : \ \ \ \

10000 **: \ x \

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30000-i

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QW I 44AHJD P68 SAP-2 66

_ QW

_ 44AHJD

_ P 6 8

_ SAP-2

_ 66

_ PT1028

I PT1028

Figure 22. Analyse comparative des séquences nucléotidiques des génomes de phages de S. aureus appartenant à la famille des Podoviridae générée par le logiciel DOTTER.

Ces trois dernières figures confirment la présence d'au moins 9 groupes génétiquement

différents de phages de S. aureus. Le premier groupe rassemble les phages appartenant à la

famille des Myoviridae : K, GI et Twort. Ensuite, la famille des Podoviridae se divise en

deux groupes : les phages 44AHJD, QW, P68, 66 et SAP-2 ainsi que le groupe formé du

phage PT1028. Et enfin, la famille des Siphoviridae se divise en six groupes distincts : [1]

phi2958PVL, 3A, LH1, 42e, 47, tp310-2, phi 12, phiSLT et phiIPLA35, [2] P954, phiNM3,

phiN315, 77, phiPV83, phil3, tp310-3, phiPVL108, phiPVL-CN125, PVL et tp310-l, [3]

CNPH82, PH15, 37 et EW, [4] 187, phiIPLA88, 53, 69, 85, 80alpha, phiNMl, phiETA2,

58

phill, phiMR25, phiETA, phiMRll et phiETA3, [5] 88, 92, X2, 71, 52A, 29, 55, 96,

ROSA et le groupe 6 représenté par le phage 2638A.

3.4. Objectif 4. Utilisation des phages pour éliminer la présence des S.

aureus dans différents types de laits

Après la comparaison de tous les phages entre eux aux niveaux microbiologique et

génomique, les phages K et LH1 ont été choisis pour être utilisés comme potentiels des

agents de biocontrôle dans une application alimentaire.

3.4.1. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait UHT

L'inhibition de la croissance bactérienne de la souche 01 par les phages K et LH1 (MOI=5)

ainsi que l'évolution de la concentration phagique ont été suivies sur une période

d'incubation de 10 heures. Tout d'abord, la concentration bactérienne avec et sans l'ajout

des phages a été testée (Figure 23).

u =J

o

i ■lait+01

■lait+01+K

■lait+01+LHl

4 6

Temps (h)

10

Figure 23. Représentation graphique du logarithme de la concentration bactérienne de S. aureus en fonction du temps dans du lait à Ultra Haute Température. La courbe bleue sur la figure représente la concentration bactérienne en fonction du temps, sans l'ajout de phage dans le lait UHT. Les courbes vertes et mauves montrent la concentration bactérienne dans le lait UHT avec l'ajout des phages LH1 et K respectivement.

59

Cette expérience a été répétée trois fois pour confirmer les résultats et les valeurs d'écart-

types sont montrées sur la figure. Après neuf heures d'incubation, une chute de la

concentration bactérienne a été remarquée avec l'ajout des deux phages de presque 1,5

unités de log comparé à la concentration bactérienne sans l'ajout de phage. Ensuite, la

concentration phagique de K et de LH1 (MOI=5) a été vérifiée dans le lait UHT (Figure

24).

E LL. D

S? ■lait+01+K

•lait+01+LHl

Figure 24. Représentation graphique du logarithme de la concentration des phages K et LH1 en fonction du temps dans du lait à Ultra Haute Température. La courbe rose sur la figure représente la concentration du phage K en fonction du temps. La courbe grise montre la concentration du phage LH1 dans le lait UHT en fonction du temps.

Celles-ci ont été comparées à la concentration bactérienne avec l'ajout du phage K (Figure

25) et du phage LH1 (Figure 26).

60

4 6

Temps (h)

10

LL.

ao O

•lait+01+K (UFC/ml)

■lait+01+K (UFP/ml)

Figure 25. Représentation graphique du logarithme de la concentration du phage K et de S. aureus 01 en fonction du temps dans du lait à Ultra Haute Température. La courbe mauve sur la figure représente la concentration bactérienne du phage K en fonction du temps comparée à la courbe rose montrant la concentration phagique de celui-ci.

7,5

7

6,5

6

5,5

I o" LL. Z)

o m,

M q

—♦—lait+01+LHl (UFC/ml)

•^^ la i t+01+LHl

5 (UFP/ml)

4,5

4

Temps (h)

Figure 26. Représentation graphique du logarithme de la concentration du phage LH1 et S. aureus 01 en fonction du temps dans du lait à Ultra Haute Température. La courbe verte sur la figure représente la concentration bactérienne du phage LHlen fonction du temps comparée à la courbe grise montrant la concentration phagique de celui-ci.

61

3.4.2. Test de l'inhibition de S. aureus par des phages dans le lait cru

La même expérience d'inhibition bactérienne a été réalisée dans le lait cru. Cependant,

après 2 heures d'incubation, aucun phage n'était détecté dans les tubes contrôles contenant

les phages ajoutés (Figure 27).

1,8 E+05 1,6 E+05 1,4 E+05 1,2 E+05

E 1,0 E+05 _ > LL. a. 8,0 E+04

6,0 E+04 4,0 E+04 2,0 E+04 0,0 E+00

•lait cru+K

■laitcru+LHl

■laitUHT+K

•laitUHT+LHl

Figure 27. Représentation graphique de la concentration phagique de K et de LH1 (MOI=5) en fonction du temps dans les laits UHT et cru

Après traitement du lait à la chaleur (pasteurisation à 63 °C et ebullition à 100 °C), la chute

du nombre de plages de lyse a été atténuée de nouveau. Ceci a donc diminué l'inhibition de

l'activité des phages. Les phages n'étaient donc pas inactivés. Ils étaient toujours infectieux

mais non disponibles.

62

4. Discussion

Il est reconnu que les phages évoluent rapidement avec leur souche hôte et leur

environnement (27). Ainsi, l'activité des phages isolés d'un produit laitier par exemple

devrait être plus efficace que celle de phages isolés d'un environnement différent contre

des souches pathogènes isolées de produits laitiers. Une fois qu'un phage de S. aureus a été

isolé du lait cru, il a été caractérisé et comparé à d'autres phages de staphylocoques et

enfin, son activité a été testée dans du lait UHT ainsi que du lait cru contre une souche de

S. aureus isolée d'un fromage québécois de lait cru. Les différents résultats obtenus pour

chaque objectif ont été analysés et rassemblés afin de bien répondre à l'hypothèse de

travail exposée.

4.1. Caractérisation du phage LH1

Le phage LH1 a été isolé d'un échantillon de lait cru. Le protocole utilisé est donc efficace

pour l'isolement de nouveaux phages de staphylocoques. Grâce à la caractérisation de ce

phage, il s'est avéré que LH1 est un membre de la famille des Siphoviridae de morphotype

B2 puisqu'il possède un génome d'ADN double brin, une capside allongée et une longue

queue non contractile. Ce phage a un spectre lytique relativement restreint pouvant lyser 7

sur 32 souches de S. aureus testées. Étonnement, le phage LH1 peut lyser partiellement

quelques souches de SARM (SARM-2 et SARM-7). Il pourrait être ajouté ultérieurement,

dans un autre projet, à un mélange de phages destinés à la thérapie phagique. L'analyse de

son génome a permis de mettre en évidence plusieurs points. Tout d'abord, le génome de

LH1 a des extrémités cohésives vu qu'une chute de signal a été observée après

l'assemblage du génome. Ensuite, il possède les deux modules lysogénique et lytique. La

présence de cadres de lecture codant pour une holine et un anti-répresseur de même que

pour une intégrase, un répresseur et le régulateur transcriptionnel rinA montre que le phage

LH1 était probablement un prophage et est devenu virulent suite à une induction et une ou

des mutations. Le régulateur transcriptionnel rinA a été révélé comme nécessaire dans

l'activation de l'expression du gène de l'intégrase du phage (pli de S. aureus (121).

63

Ensuite, TORF053 encode la protéine E associée à la virulence. Cette dernière a déjà été

décrite dans le processus de replication de l'ADN du phage phiIPLA35 appartenant à la

famille des Siphoviridae et semble jouer un rôle particulier dans le métabolisme de l'ADN

(110). Cependant, ceci n'efface pas le fait qu'il pourrait être impliqué dans la pathogénicité

de l'hôte bactérien (53). Et enfin, deux gènes du phage LH1 encodent pour une toxine, la

leucocidine de Panton-Valentine. Celle-ci est une cytotoxine produite et sécrétée par des

souches de S. aureus résistantes à la méthicilline associées à la communauté. Elle est

capable de détruire les cellules du système immunitaire, tels que les neutrophiles

polymorphonucléaires, en formant des pores dans celles-ci ainsi que de causer une

pneumonie nécrosante létale. Cette leucocidine est codée par deux gènes co-transcrits lukS-

PV et lukF-PV habituellement localisés sur des prophages. La forme active de la

leucocidine de Panton-Valentine requiert l'assemblage de deux polypeptides, LukS-PV et

LukF-PV (65). Ces derniers sont codés par les deux ORF 26 et ORF 27 respectivement

chez le phage LH1. Ce phage ne pourra donc pas être utilisé comme un agent de

biocontrôle en dehors de ce projet de maîtrise. Par contre, il serait probablement possible

d'enlever ces deux gènes par génie génétique, mais il n'est p.as clair comment les autorités

réglementaires seraient réceptives à l'utilisation de phages génétiquement modifiés.

4.2. Comparaison des phages de S. aureus au phage LH1

Différents phages de S. aureus disponibles ont été comparés entre eux afin de bien choisir

les phages à utiliser dans une application alimentaire. Le profil de restriction de dix phages

de S. aureus disponibles au laboratoire ainsi que celui du phage LH1 ont été réalisés.

L'analyse des résultats a montré qu'il existe une grande similarité de profils entre les

phages Pyophage, Team 1 et Te.am 2, cp812 et K ainsi qu'entre les phages P68 et QW. En

effet, Pyophage, Team 1, Te.am 2, cp812 et K infectent la même souche bactérienne de S.

aureus SA 812, alors que les phages P68 et QW lysent la souche S. aureus 68. Cependant,

les profils des phages QW et 44AHJD semblent être identiques. De plus, l'analyse du

génome du phage QW montre une grande similarité entre les cadres de lecture ouverts de

QW et 44AHJD. D'autre part, le profil de restriction de LH1 est similaire à celui du phage

64

3A. Effectivement, ce dernier est aussi un Siphoviridae de morphotype B2, ce qui justifie

ce rapprochement.

Ensuite, le spectre lytique de chacun de ces onze phages a été obtenu en utilisant 32

souches de S. aureus. En comparant ceux-ci, il est clair que les phages appartenant à la

famille des Myoviridae ont un spectre lytique plus large que les autres phages. Cette

observation a également été notée par d'autres chercheurs (87, 100). Aucune souche n'a

résisté complètement à ces phages. Même des souches mutantes résistantes aux autres

phages ont été testées dont 01-P68 et 01-QW. Ces deux souches mutantes ont été

confirmées comme étant des BIMs d'adsorption puisque le phage s'adsorbait à des taux de

18,35% et 14,21% respectivement. L'isolement d'un phage pouvant infecter ces BIMs

d'adsorption serait souhaitable dans les applications alimentaires et la thérapie par phages.

Une comparaison de tous les génomes des phages de S. aureus disponibles dans les bases

de données publiques a été réalisée avec les logiciels MEGA 4.1 et DOTTER. En

regroupant les résultats de ces deux logiciels, les différents phages peuvent être divisés en

au moins neuf groupes génétiquement distincts dont un groupe pour la famille des

Myoviridae et deux pour la famille des Podoviridae et six groupes de phages appartenant à

la famille des Siphoviridae (Figure 28).

65

•

Myoviridae

rPodoviridae

I I I l l l l l l l II l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l II

i , l j ,H il?y a!4 j Hpfiiî 8

Siphoviridae

Figure 28. Identification d'au moins neufs groupes génétiquement différents de

phages de S. aureus

De plus, d'après cette analyse bioinformatique, le phage LH1 semble se rapprocher le plus

des phages de type 3A. Ceci a aussi été démontré par la similarité du profil de restriction de

l'ADN de ces deux phages. L'analyse du génome du phage LH1 a bien montré un haut

niveau d'identité génomique entre le phage LH1 et 3A ainsi que les phages 47, phiSLT,

phi2958PVLetphil2.

D'autre part, le phage QW dont le génome a aussi été séquence au cours de ce projet, s'est

rapproché le plus du phage 44AHJD. Cependant, en comparant le spectre lytique de ces

66

deux phages et en analysant le génome de QW, une faible distinction est observée entre ces

deux phages permettant ainsi de les différencier.

Cette analyse bioinformatique a permis de trouver une éventuelle corrélation entre les

groupes de phages, leur identité morphologique et génomique. Ainsi, les phages différents

au niveau de leur génome et de leur spectre lytique pourraient être choisis pour la

production de cocktails de phages afin de cibler le plus grand nombre de souches de S.

aureus possibles.

4.3. Activité du phage LH1 dans différents types de lait contaminés par S.

aureus

L'activité du phage LH1 a d'abord été comparée à celle du phage K dans le lait UHT. Le

suivi des concentrations bactérienne et phagique dans le temps a montré qu'avec l'ajout de

LH1 et K (MOI=5), la concentration bactérienne a diminué de plus de 1,5 unités de log

après neuf heures d'incubation à 37 °C. Cette diminution a été compensée par une

augmentation d'environ 1,7 unités de log de la concentration des phages LH1 et K après le

même intervalle de temps. Ceci montre donc que les phages sont bien à l'origine de cette

inhibition puisqu'ils se sont multipliés.

D'un autre coté, en comparant l'activité et l'efficacité des phages LH1 et K sur la

croissance bactérienne, celles-ci sont quasiment similaires. Cependant, le phage K semble

inhiber légèrement davantage la croissance bactérienne. En effet, les résultats montrent une

inhibition d'environ 1,8 unités de log avec l'ajout du phage K avec une MOI de 5 comparé

à une diminution d'à peu près 1,3 unités de log avec l'ajout du phage LH1. On peut donc

déduire que le phage LH1 isolé du lait cru n'est pas plus efficace que le phage K dans

l'élimination de S. aureus d.ans le lait UHT.

D'autre part, il a été démontré que les deux phages ne peuvent infecter la souche 01 dans le

lait cru. En effet, l'activité des phages a disparu après une heure d'incubation à 37 °C.

Cependant, après un traitement du lait cru à la chaleur, le nombre de phages a augmenté de

67

nouveau. Ceci indique qu'un composé inconnu thermosensible du lait cru bloque l'action

des phages. De plus, la présence naturelle de S. aureus dans le lait cru a été suivie. Sa

concentration approximative de 150 UFC/ml est trop faible pour être la cause de

l'inactivation des phages K et LH1 (5 x 104 UFP/ml). Donc, le composé qui est à l'origine

de cette inactivation provient du lait lui-même et est thermosensible. Il pourrait s'agir

d'une protéine du lactosérum (54) ou bien d'une protéine du caillé qui vient se complexer

au phage (41). Les particules de gras pourraient de même jouer un rôle dans cette

inactivation. Cette même expérience devrait être réalisée dans le lactosérum obtenu après

l'ajout d'un volume précis d'acide pour précipiter les caséines du lait caillé et d'un volume

de base afin de rétablir le pH de la solution à sa valeur d'origine. Ceci va permettre de

savoir si ce composé provient précisément du lactosérum ou du lait caillé (milieu acide) et

donc d'avoir une idée de l'effet du pH sur l'activité des phages.

68

5. Conclusions et perspectives Ce projet a fait appel à des recherches fondamentales ainsi qu'appliquées. Des phages de S.

aureus ont été isolés, caractérisés et testés comme d'éventuels agents de biocontrôle dans

le lait. Les différents phages de S. aureus ont été regroupés selon leur niveau d'identité

génomique. Ceci a aidé dans le choix des phages à utiliser dans l'application alimentaire. Il

est important de choisir des phages ayant un spectre lytique et un génome différent pour la

préparation des cocktails de phages afin de cibler le plus grand nombre de souches de S.

aureus différentes pouvant se retrouver dans le lait et le contaminer. De plus, cela peut

prévenir le développement de souches résistantes aux phages.

Le génome du nouveau phage LH1 a été séquence afin de s'assurer de son innocuité avant

son utilisation dans l'application alimentaire. Malheureusement, dans le cadre de ce projet,

le séquençage du génome du phage LH1 a été effectué vers la fin des travaux. Ainsi, nous

avons réalisé tard que ce phage portait des gènes codant pour des toxines. Donc, il serait

préférable de rapidement déterminer la séquence génomique des nouveaux phages isolés

ou aussi de vérifier la présence de gènes de toxines par PCR avant de passer aux travaux

appliqués. Ceci étant dit, nous avons quand même poursuivi les travaux puisque le phage

LH1 nous permettait de vérifier l'hypothèse à savoir si les phages de S. aureus isolés du

lait cru sont plus efficaces que ceux isolés de d'autres environnements.

Le phage LH1 ainsi que le phage K déjà disponible, ont été testés dans le lait UHT et le lait

cru pour vérifier leur efficacité à éliminer la présence de cellules de S. aureus. Cette

dernière expérience a montré que le lait cru contiendrait un composé thermosensible qui

inhiberait l'action des phages sur S. aureus. Ceci a aussi été rapporté dans la littérature (54,

84). Il est quand même intéressant de constater que le lait cru contient des phages de S.

aureus mais que ceux-ci ne sont pas efficaces. Il serait souhaitable d'identifier avec

certitude le composé inhibiteur pour connaître s'il serait possible de l'inactiver facilement

dans le lait cru et ainsi relâcher ce potentiel anti-staph. De plus, il est amplement connu que

les phages des bactéries lactiques se multiplient rapidement dans le lait (79). Une autre

question à résoudre serait de comprendre pourquoi les phages de staphylocoques sont

inactivés dans le lait cru alors que les phages des bactéries lactiques ne le sont pas. Ceci

nous pousse également à nous demander si le mélange K-LH1 serait plus efficace. Un autre

69

point serait de se questionner si tous les phages isolés du lait ne sont pas plus efficaces

contre les souches de S. aureus laitières que ceux isolés d'ailleurs ou bien si ceci est un fait

particulier pour LH1 seulement. Ces réflexions nous mènent aussi à nous demander si ces

phages peuvent éliminer la présence de S. aureus dans le fromage, un milieu dans lequel

les phages pourront facilement être dégradés ou inactivés et où le lait peut avoir été

chauffé.

De plus amples recherches se poursuivront afin d'isoler du lait cru d'autres phages

virulents de S. aureus résistants au bas pH et insensibles aux composés du lait. Ceci devrait

être suivi par des recherches sur la combinaison bactériophage-pathogène-aliment afin

d'empêcher une recontamination de la matrice alimentaire par des bactéries mutantes. De

plus, il est intéressant de comprendre la nature et le mode d'action du composé laitier ou de

la constante physico-chimique jouant un rôle dans l'inhibition de l'interaction de S. aureus

et de ses phages et de déterminer s'il provient du lactosérum ou du lait caillé. Finalement,

l'application alimentaire devrait se faire à la température utilisée dans les industries

laitières et non à la température optimale de croissance de S. aureus. Elle devrait aussi se

réaliser avec d'autres phages et d'autres souches de S. aureus.

Toutes ces réflexions et perspectives sont suggérées afin d'optimiser les conditions pour

l'industrie alimentaire et minimiser les risques de contamination et d'intoxication par S.

aureus.

70

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