Proteindynamik Very Important PaperDOI: 10.1002/ange.201311275

Bestimmung transienter Konformationszust!nde von Proteinen durchFestkçrper-R11-Relaxationsdispersions-NMR-Spektroskopie**Peixiang Ma, Jens D. Haller, J!r!my Zajakala, Pavel Macek, Astrid C. Sivertsen, Dieter Willbold,J!r"me Boisbouvier und Paul Schanda*

Abstract: Die Funktion von Proteinen basiert auf der F#hig-keit, eine Vielfalt an Zust#nden einzunehmen, die sich in ihrenStrukturen und freien Energien unterscheiden. Um eine Pro-teinfunktion zu verstehen, gilt es daher herauszufinden, wie dieverschiedenen, thermisch zug#nglichen Konformationen mit-einander verbunden sind und welche Strukturen und relativenEnergien sie aufweisen. Viele biomolekulare Reaktionenlaufen innerhalb von Mikro- bis Millisekunden ab, weshalbdiese Zeitskala von zentraler (und funktioneller) Bedeutungist. Wir zeigen hier, dass R11-Relaxationsdispersionsexperi-mente in Festkçrper-NMR mit Rotation am magischen WinkelEinblicke in die Thermodynamik und Kinetik solcher Aus-tauschprozesse gibt, und dass auch strukturelle Parameter $berkurzlebige Zust#nde erhalten werden kçnnen.

NMR-Spektroskopie in Lçsung ist ein erfolgreicher Ansatzzur Erforschung dynamischer Prozesse im Mikro- bis Milli-sekundenbereich und zur Charakterisierung kurzlebiger Kon-formationen.[1] Eine spezielle Technik ist die Relaxationsdi-spersions(RD)-NMR-Spektroskopie. RD-NMR-Technikennutzen den Effekt konformationeller Austauschprozesse aufdie spektrale Linienbreite, also auf die Relaxationsraten vonKernspinkoh!renzen (R2, R11). "ber die Bestimmung derSpin-Relaxationsraten in Anwesenheit eines ver!nderlichenRadiofrequenz(RF)-Feldes, bietet die RD-Technik einenZugang zu relativen Populationen und Austauschraten

sowie zu den chemischen Verschiebungen kurzlebiger Kon-formationen und somit zur lokalen Struktur.[1,2] Bei sehrgroßen molekularen Komplexen oder unlçslichen Aggrega-ten, bei denen Lçsungs-NMR-Spektroskopie an ihre Grenzenger!t, bietet sich die Festkçrper-MAS-NMR-Spektroskopie(MAS = magic angle spinning) zur Aufkl!rung von Strukturund Dynamik an. Jedoch bleibt auch im Festkçrper dieCharakterisierung der Dynamik konformationeller #nderun-gen mittels NMR-Spektroskopie eine Herausforderung. Wirbeschreiben hier eine Festkçrper-NMR-Technik, die Amid-15N-R11-RD-Relaxationsdaten, d.h. die Koh!renzzerfallsra-ten mit 15N-Spinlock-Feldern unterschiedlicher Feldst!rke,quantitativ bez$glich der konformationellen Dynamik analy-sieren und interpretieren kann. Die Daten gew!hren Einbli-cke in die chemischen Verschiebungen (CS; chemical shift)und Bindungsvektorrichtungen kurzlebiger Zust!nde. Durchdie Untersuchung eines konformationellen Flips in kristalli-nem Ubiquitin verifizierten wir die Robustheit des RD-Ansatzes.

Abbildung 1. Numerische Simulationen zeigen den Effekt von kon-formationellen Austauschprozessen auf die 15N-R11-Relaxation. a) Zwei-Spin-N-H-System, das zwischen gering und stark besetzten Zust!ndenaustauscht, die sich durch die 15N-chemische Verschiebung und dieOrientierung des NH-Bindungsvektors unterscheiden. Es wird ange-nommen, dass der 15N-CSA-Tensor kolinear zur NH-Bindung steht.b,c) Simulierte 15N-R11-RD-Profile des Zwei-Spin-Systems unter der An-nahme relativer Populationen von pB =10 % und pA = 90 %. Es wurdenunterschiedliche Szenarien in Bezug auf die isotrope 15N-Verschiebung(durchgezogene bzw. gepunktete Linie) sowie in Bezug auf die "nde-rung des Bindungswinkels q (rot bzw. schwarz) angenommen, wie inder Legende angegeben. Weitere Simulationen sind in Abbildung S1 inden Hintergrundinformationen zu sehen. Die Einsch#be in (b) und (c)zeigen vergrçßerte Darstellungen des Bereichs niedriger RF-Feldst!r-ken.

[*] Dr. P. Ma, J. D. Haller, J. Zajakala, Dr. P. Macek, Dr. A. C. Sivertsen,Prof. Dr. D. Willbold, Dr. J. Boisbouvier, Dr. P. SchandaUniv. Grenoble Alpes, Institut de Biologie Structurale (IBS)CEA, DSV, IBS, 38027 Grenoble (Frankreich)undCNRS, IBS, 38027 Grenoble (Frankreich)E-Mail : paul.schanda@ibs.fr

Prof. Dr. D. WillboldInstitut f#r Physikalische BiologieHeinrich-Heine-Universt!t D#sseldorf (Deutschland)undICS-6: Structural Biochemistry, Forschungszentrum J#lich(Deutschland)

[**] Diese Arbeit wurde durch die French Research Agency (ANR-10-PDOC-011-01 ProtDynByNMR) und das European Research Council(ERC-Stg-2012-311318-ProtDyn2Function) finanziert. Wir dankendem Grenoble Instruct Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL), unterst#tzt durch FRISBI (ANR-10-INSB-05-02) und GRAL(ANR-10-LABX-49-01) innerhalb des Programms Grenoble Part-nership for Structural Biology (PSB). A. Krushelnitsky, T. Zinkevichund R. Sounier danken wir f#r anregende Diskussionen und I. Ayalaf#r Probenvorbereitungen.

Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unterhttp://dx.doi.org/10.1002/ange.201311275 zu finden.

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1Angew. Chem. 2014, 126, 1 – 7 ! 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

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Konformationelle Fluktuationen zwischen verschiedenenZust!nden, d.h. verschiedenen Bindungsgeometrien, bewir-ken, dass die beteiligten Kernspins wechselnden lokalenUmgebungen im Protein ausgesetzt sind. Der einfachste Fall,der Austausch zwischen zwei Zust!nden, ist in Abbildung 1agezeigt. Aufgrund der Dynamik des konformationellen Aus-tauschs erf!hrt ein Spin eine Fluktuation der isotropenchemischen Verschiebung. Da auch Bindungsvektorrichtun-gen vom Austausch betroffen sind, resultiert daraus auch eineFluktuation der Anisotropie der chemischen Verschiebung(chemical shift anisotropy; CSA) und der dipolaren Kopplungzu benachbarten Spins. Beide Wechselwirkungen werden ineiner Lçsungs-NMR-Messung durch die Brownsche Teil-chenbewegungen (molecular tumbling) zu null gemittelt.Folglich sind in Lçsung nur Fluktuationen der isotropenchemischen Verschiebung f$r die Mikro- bis Millisekunden-dynamik relevant. Somit kçnnen R11-RD-Experimente inLçsung auch nur dann eine konformationelle Dynamikerfassen, wenn diese eine #nderung der isotropen chemi-schen Verschiebung bewirkt. Die relevante Theorie f$r dieseAustauscheffekte ist bereits erarbeitet worden und kanndurch die Gleichungen von Bloch-McConnell beschriebenwerden.[3]

Im Festkçrper findet eine molekulare Mittelungsbewe-gung (tumbling) nicht statt, und anisotrope Wechselwirkun-gen (dipolare Kopplungen und CSA) m$ssen durch sehrschnelle Rotation der Probe (MAS) periodisch moduliert und$ber eine Rotorperiode (auf einer Skala von ms) gemitteltwerden. Diese zeitliche Mittelung f$hrt zu einer Verringerungder Linienbreite, was ein essentieller Bestandteil f$r hoch-auflçsende Messungen ist. Wenn wir jedoch molekulareDynamik und RF-Einstrahlung (RF) in die "berlegungenmit einbeziehen, so kann es sein, dass mehrere zeitabh!ngigeProzesse (Probenrotation, RF-Einstrahlung und konforma-tioneller Austausch) interferieren und unterschiedliche Zer-fallsprozesse auftreten. Dies macht die Situation etwas kom-plizierter als in Lçsung.[4] Bevor wir die experimentelleUmsetzung betrachten, untersuchen wir zun!chst die Eigen-schaften des 15N-R11-Zerfalls durch numerische Simulationeneines Systems mit Austausch und MAS.

Abbildung 1b,c zeigt simulierte 15N-R11-RD-Profile eines1H-15N-Spinpaars, das zwischen zwei Zust!nden mit relativenPopulation von 90% und 10 % austauscht und einem 15N-Spinlock-RF-Feld mit ver!nderlicher Amplitude und MAS-Rotation ausgesetzt ist. Wir nahmen unterschiedliche Aus-tauschszenarien an, in denen entweder die isotrope chemi-sche Verschiebung des 15N-Spins fluktuiert oder eine Umori-entierung des NH-Bindungsvektors innerhalb des Molek$lsauftritt oder beides. Die Ergebnisse lassen sich wie folgtzusammenfassen: 1) Wenn ein Austausch zwischen zweiZust!nden stattfindet, die sich nur in der isotropen chemi-schen Verschiebung, aber nicht in der Bindungsorientierungunterscheiden, dann lassen sich R11-RD-Profile durch denBloch-McConnell-Formalismus beschreiben (schwarze Kurvein Abbildung 1 b,c).[1a] 2) Wenn der konformationelle Aus-tausch Fluktuationen des Bindungswinkels mit sich bringt(d.h. #nderungen dipolarer Kopplungen und der CSA), dannwird die Situation etwas komplexer. In diesem Fall zeigen

R11-Raten einen allgemein hçheren Wert, da fluktuierendeanisotrope Wechselwirkungen Relaxation induzieren.[5]

Von besonderer Bedeutung f$r diese Untersuchung ist derAspekt, dass R11-Raten einen ausgepr!gt hohen Wert anneh-men, wenn sich die Spinlock-Feldst!rke der Rotationsfre-quenz der Probe (nMAS) ann!hert, was auf das Auftreten einesals Rotationsresonanz (rotary resonance) bezeichneten Ef-fekts zur$ckzuf$hren ist.[6]

Wie k$rzlich berichtet wurde[4, 5] und in Abbildung 1 sowieS1 in den Hintergrundinformationen zu sehen ist, werdendurch konformationellen Austausch die Wiedereinkopp-lungsbedingungen der Rotationsresonanz verbreitert. Damith!ngen die R11-Relaxationsraten, die unter !hnlichen Bedin-gungen gemessen wurden, auch von der Kinetik des Aus-tauschs, den relativen Populationen und dem Austauschwin-kel zwischen den beiden Konformationen ab.

Zusammenfassend zeigen diese Simulationen, dass MAS-Festkçrper-NMR-R11-RD-Experimente wertvolle Einblickein den konformationellen Austausch liefern kçnnen. Es wirdauch gezeigt, dass nicht nur die Fluktuation der chemischenVerschiebung zwischen zwei Zust!nden zug!nglich ist (wie inder Lçsungs-NMR-Spektroskopie der Fall), sondern auch derBindungswinkel, in dem sich der kurzlebige angeregte Zu-stand vom $berwiegend vorliegenden Grundzustand unter-scheidet.

Die Tatsache, dass dieses Potenzial der MAS-Festkçrper-NMR-R11-RD-Experimente zur quantitativen Untersuchungdes konformationellen Austauschs in Proteinen bisher nochnicht umfangreich genutzt wurde, ist darauf zur$ckzuf$hren,dass nur ein gewisser Teil der R11-Zerfallsraten von dynami-schen Prozessen stammt und ein erheblicher Beitrag auchdurch koh!renten Zerfall, d.h. Dephasierung $ber dipolareKopplungen (“dipolare Dephasierung”), verursacht wird.

Vor allem in Mehrspinsystemen wie Proteinen mit ihrenzahlreichen 1H-Spins tr!gt die dipolare Dephasierung zumR11-Zerfall bei. Dieser Effekt muss unterdr$ckt werden, umden von dynamischen Prozessen stammenden Teil des R11-Zerfalls zu erhalten. K$rzlich wurde gezeigt, dass durch hoheMAS-Frequenzen von ca. 40 kHz oder hçher und einerSpinlock-Feldst!rke von> 15 kHz die dipolare Dephasierungso stark reduziert wird, dass selbst in der protonenreichenUmgebung eines Proteins dieser Effekt vernachl!ssigbarscheint.[7] Die Bedingung hoher Spinlock-Felder verhindertjedoch, dass R11-RD-Experimente auch im unteren Spinlock-Bereich von 5–10 kHz mçglich sind, also dort, wo RD-Profilebesonders empfindlich f$r isotrope Fluktuationen der chemi-schen Verschiebung sind.

Wir umgehen diese Einschr!nkung, indem wir die Probein hohem Grad deuterieren, was den Beitrag der dipolarenDephasierung zu den 15N-R11-Raten stark reduziert.[8] Inhochdeuterierten Proben, d.h. Proben, die vollst!ndig deute-riert und nur an austauschbaren Stellen (Amid-Protonen)teils reprotoniert sind, ist das Netzwerk aus starken dipolaren1H,1H-Wechselwirkungen so hoch verd$nnt, dass empfindli-che und hochaufgelçste protondetektierte Festkçrper-NMR-Spektren sowie lange 15N-Koh!renzzeiten gew!hrleistetsind.[8, 9] Abbildung 2a zeigt Beispiele von R11-RD-Profilenvon Aminos!uren einer hochdeuterierten Probe von mikro-kristallinem Ubiquitin, in der 50 % der Amid-15N reprotoniert

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wurden. Die 15N-R11-Raten wurden bei einer MAS-Frequenzvon 39.5 kHz und einer RF-Feldst!rke von 2–15 kHz gemes-sen, d.h. weit entfernt von der n = 1-Rotationsresonanzbe-dingung (diese w!re bei 39.5 kHz Spinlock-Feldst!rke).Damit die R11-Relaxationsraten unter Resonanzbedingungerhalten werden, muss der Beitrag von R1 im geneigtenrotierenden Koordinatensystem eliminiert werden (unterVerwendung von Standardformeln;[1a] siehe Hintergrundin-formationen).

Eine große Mehrheit der Aminos!uren in Abbildung 2a,z. B. Ile 3, Leu 15, Lys 33 und Gly 47, zeigen flache RD-Profile$ber den gesamten Bereich an RF-Feldst!rken. Dies best!-tigt, dass die koh!rente Dephasierung tats!chlich ausreichenddurch Deuterierung und schnelle MAS-Rotation unterdr$cktwird, und besagt folglich auch, dass nicht-flache R11-RD-Profile verl!sslich auf dynamische Prozesse zur$ckzuf$hrensind. Tats!chlich finden wir f$r einige Aminos!uren nicht-flache R11-RD-Kurven, d.h. erhçhte Relaxationsraten f$rniedrige Spinlock-Feldst!rken, wie es die Bloch-McConnell-Gleichungen unter Annahme von Austauschprozessen vor-aussagen. All die Aminos!uren, die nicht-flache R11-RD-Kurven erzeugen, befinden sich in einem definierten, abge-grenzten Bereich des Ubiquitins im N-terminalen Teil derHelix und in einem Loop, der an diese Helix $ber Wasser-stoffbr$cken gebunden ist (Ile 23, Lys 27, Glu 51, Asp 52, Arg54, Thr 55; siehe Abbildungen 3 und S5). Dass in diesemBereich des Proteins konformationeller Austausch stattfin-det, wurde bereits in zahlreichen NMR-Studien in Lçsungfestgestellt.[10] K$rzlich hatten wir auf der Grundlage vonCarr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-RD- und Multiple-Quantum-Relaxationsexperimenten auch f$r mikrokristalli-

Abbildung 2. Protonendetektierte 15N-RD-Daten von perdeuteriertem Ubiquitin bei 300 K. Gezeigt sind On-Resonance-R11-Raten, d.h. mit korrigiertem Offsetder chemischen Verschiebung (siehe Hintergrundinformationen). a) RD-Profile einer volldeuterierten Ubiquitinprobe (50% r#ckprotoniert), aufgenommenbei 39.5 kHz MAS und einer geringen Spinlock-Feldst!rke von 2–15 kHz. Die durchgezogenen schwarzen Linien zeigen das Ergebnis des Bloch-McConnell-Angleichs eines Austauschs zwischen zwei Zust!nden nur unter Verwendung der erhaltenen R11-Daten. Die orangen Linien stammen von einem Angleich,der zus!tzlich CPMG-Daten f#r die Aminos!uren 23, 27, 55 bei 600 MHz verwendet (siehe Abbildung S8). Die flachen gestrichelten Linien (konstante R11-Raten) in (a) und (b) zeigen Relaxationsraten, die bei 39.5 kHz MAS und einer Spinlock-Feldst!rke von 15 kHz gemessen wurden; man geht daher davonaus, dass sie nicht von Austauscheffekten betroffen sind. b) RD-Profile einer volldeuterierten Ubiquitinprobe (20% r#ckprotoniert), aufgenommen bei20 kHz MAS. Die durchgezogenen Linien zeigen simulierte R11-RD-Profile, die eine Austauschrate von kex =2900 s!1 und eine Population von pB =9.3%annehmen. Alle vorhandenen RD-Profile sowie experimentelle Details sind in den Hintergrundinformationen aufgef#hrt.

Abbildung 3. Aminos!uren, die am konformationellen Austausch inUbiquitin beteiligt sind. a) Die Unterschiede der chemischen Verschie-bung pro Aminos!urerest, Dd (erhalten aus den Daten von Abbil-dung 2a und b, und die Winkel!nderungen, q (erhalten aus Abbil-dung 2b), sind auf die Struktur des hier verwendeten Ubiquitin-Kris-talls (PDB 3ons) geplottet. Die Aminos!uren 24 und 25 (schwarzer Be-reich) sind in NH-Korrelationsspektren nicht sichtbar, da die hier auf-tretende Dynamik vermutlich eine erhçhte Linienbreite hervorruft.c) Unterschiede der NH-Bindungsrichtung zwischen der von uns ver-wendeten Kristallstruktur (Typ-II-b-Turn) und einer Kristallstruktur mitTyp-I-b-Turn (PDB 1ubi). Indem man beide Strukturen nach allen Se-kund!rstrukturelementen ausrichtet, erh!lt man die Winkeldifferenzder jeweiligen NH-Bindung.

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nes Ubiquitin $ber Austauschprozesse in diesem Bereich desProteins berichtet.[11]

Um den Austauschprozess quantitativ zu erfassen,wurden die R11-RD-Profile dieser Aminos!uren an ein Aus-tauschmodell gefittet, das auf dem Bloch-McConnell-Forma-lismus basiert. Streng genommen ist dieser Formalismus f$rMAS-Festkçrper-NMR nicht korrekt, wenn beim Austauscheine #nderung des Bindungsvektors auftritt (vgl. Abbil-dung 1). Jedoch scheint hier die Anwendung berechtigt, dadie RD-Kurven in Abbildung 2 in einem Bereich weit außer-halb der Bedingungen f$r Rotationsresonanz aufgenommenwurden; in diesem Bereich haben Winkel!nderungen nureinen sehr geringen Einfluss (vgl. Abbildung 1). Dass dieFluktuationen der Bindungswinkel tats!chlich eher kleinausfallen, wurde in unabh!ngigen Messungen best!tigt(siehe unten).

Wir haben die R11-RD-Profile der Aminos!uren 23, 27,51, 52, 54 und 55 an ein Modell angeglichen, das denAustausch zwischen zwei Zust!nden annimmt (Abbildung 2und S8). Aufgrund der r!umlichen N!he der Aminos!urennahmen wir an, dass sie alle am selben Austausch beteiligtsind und dass folglich die Austauschrate kex = kAB + kBA unddie Population (pB) des geringer besetzten Zustands f$r dieseAminos!uren identisch sind. Im Gegensatz dazu wurdeangenommen, dass der Unterschied der chemischen Ver-schiebung zwischen dem stark und gering besetzten Zustand,Dd, f$r diese Aminos!uren spezifisch ist, da die chemischeVerschiebung sehr empfindlich auf lokale #nderungen rea-giert. In Abbildung 2a zeigen die durchgezogenen Linien dieam besten passenden Kurvenangleiche. Der Angleich ergabeine Austauschrate kex von 8600" 1700 s!1 und eine Popula-tion des geringer besetzten Zustands pB von 3.1" 1.2%. DieDd-Werte liegen im Bereich 2–5 ppm (alle Werte sind inTabelle S1 aufgelistet). Um herauszufinden, wie zuverl!ssigdie Ergebnisse einer einzelnen R11-RD-Messung sind, unter-suchten wir den Fall, wenn zus!tzlich unabh!ngige Daten miteinbezogen werden. Eine Mçglichkeit w!ren R11-RD-Mes-sungen bei zus!tzlichen Magnetfeldst!rken, wie es h!ufig inder Lçsungs-NMR-Spektroskopie angewendet wird; diessetzt jedoch ein weiteres Spektrometer mit schnell rotieren-dem MAS-Probenkopf voraus. Alternativ verwenden wir hiereinen kombinierten Angleich mit CPMG-RD-Daten, die invorherigen Studien unter !hnlichen Bedingungen (Deuterie-rung, schnelles MAS und Magnetfeldst!rke 14.1 T) aufge-nommen wurden.[11] Da CPMG-RD-Experimente auf einerZeitskala von Mikro- bis Millisekunden empfindlich sind, istdie Kombination mit R11-Daten mçglich. Eine solche Analyseder R11-RD und CPMG-Daten ergibt !hnliche Dd-Werte wieder vorherige Angleich, der nur auf R11-RD-Daten basierte(Tabelle S1). Die erhaltene Austauschrate kex betr!gt 2900"140 s!1, und die Population pB 9.3" 0.6%. Auch wenn dieseWerte von den auf R11-RD-Daten allein basierenden Werten(kex = 8600" 1700 s!1, pB = 3.1" 1.2%) etwas abweichen, istdennoch bemerkenswert, dass die Kurven des kombiniertenR11/CPMG-Angleichs (orange in Abbildung 2a) von denKurven des R11-Angleichs kaum zu unterscheiden sind. Diesbeweist, dass die vorliegenden Daten in ausgezeichneter"bereinstimmung mit unabh!ngigen CPMG-Daten sind.Dass sich die ermittelten Parameter unterscheiden, weist

auf die bekannte Schwierigkeit hin, alle Parameter aus einereinzigen Messung (hier einem B0-Feld) zu extrahieren.

Das R11-RD-Experiment bietet Vorteile gegen$ber demzuvor vorgestellten CPMG-RD-Experiment:[11] Im Unter-schied zu den R11-Raten enthalten die gemessenen R2-Relaxationsraten im Festkçrper einen erheblichen Anteil andipolarer Dephasierung, selbst bei hoher Deuterierung undschnellem MAS (Abbildung S10).[7] Das hat zwei wichtigeKonsequenzen: 1) Da ein schnellerer Koh!renzzerfall auf-tritt, ist das Signal-Rausch-Verh!ltnis des CPMG-Experi-ments[11] deutlich geringer als im R11-Experiment. 2) Derverbleibende koh!rente Beitrag zu den effektiven R2-Ratenim CPMG-Experiment ist ann!hernd, aber nicht vollst!ndigunabh!ngig von der CPMG-Frequenz.[11] Daher kçnntenbeobachtete Schwankungen der R2-Raten in CPMG-Experi-menten zu einem gewissen Grad mit Artefakten behaftet sein.Zu beachten ist, dass die Zeitskalen von R11- und CPMG-RD-Experimenten teilweise $berlappen, aber nicht identisch sind,sodass man beide als komplement!re Ans!tze betrachtensollte.

In Lçsung zeigt die gleiche Molek$lregion des Ubiquitineinen konformationellen Austausch. Dieser ist jedoch sogarbei 20 K tieferer Temperatur noch deutlich schneller (kex =12500–25000 s!1) als in unserem Fall.[10] Bei einer !hnlichhohen Temperatur von 298 K sind die Profile in Lçsung flach(z. B. Ile 23), was in starkem Gegensatz zu den Festkçrper-R11-Dispersionen aus dieser Studie steht. Diese Beobachtungzeigt eindeutig, dass diese dynamischen Prozesse in Mikro-kristallen langsamer ablaufen als in Lçsung. Grund f$r dieVerlangsamung im Festkçrper sind intermolekukare Kontak-te, die im Kristall die Energiebarrieren f$r dynamischeProzesse zus!tzlich erhçhen.[11]

Nachdem wir gezeigt hatten, dass R11-RD-Experimentebei hohen MAS-Frequenzen nicht nur Informationen $berdie Thermodynamik und die Kinetik des Austauschs enthal-ten, sondern auch $ber die ortsspezifische chemische Ver-schiebung des niedrig besetzten Zustands (!hnlich wie durchLçsungs-NMR), wollten wir untersuchen, ob zus!tzlich struk-turelle Informationen $ber den niedrig besetzten Zustanderhalten werden kçnnen. Wie in Abbildung 1 zu sehen,h!ngen 15N-R11-RD-Profile in der Umgebung der Rotations-resonanz (wenn n1# nMAS) sehr empfindlich von der Winkel-!nderung ab, die mit dem konformationellen Austausch derNH-Bindung (d.h. der dipolaren Kopplung und 15N-CSA)einhergeht. Aus technischen Gr$nden wollten wir solcheMessungen bei hohen MAS-Frequenzen nicht durchf$hren,da sehr hohe Spinlock-Feldst!rken (n1# nMAS) die Hardwareund die Probe besch!digen kçnnen. Stattdessen reduziertenwir die MAS-Frequenz auf 20 kHz, da hier die Rotationsre-sonanz schon bei geringeren RF-Feldst!rken auftritt. Umsicherzugehen, dass der koh!rente Anteil des 15N-R11-Zerfallsauch bei langsamem MAS vernachl!ssigbar klein ist, erhçh-ten wir den Deuterierungsgrad (Reprotonierung von nur20% der Amide anstelle von 50 %). Die geringere Empfind-lichkeit (durch erhçhte Verd$nnung der Protonen) kanndurch das grçßere Volumen des Probenrotors kompensiertwerden, der bei geringeren MAS-Frequenzen einsetzbar ist.Abbildung 2b zeigt repr!sentative Beispiele f$r 15N-R11-RD-Profile, die bei Spinlockst!rken von 12–19 kHz aufgenommen

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wurden. Viele davon, wie z.B. Ile 3, Leu 15, Lys 33 und Gly 47,zeigen flache RD-Profile $ber den gesamten Bereich deruntersuchten Spinlock-Feldst!rken oder nur einen kleinenAnstieg bei Feldst!rken, die in der N!he (Abweichung von 2–3 kHz) der n = 1-Rotationsresonanzbedingung liegen. Inter-essanterweise erhielten wir !hnliche Werte des Plateaus wiebei Messungen mit hohen MAS-Frequenzen, was impliziert,dass die koh!renten Beitr!ge zu R11 auch bei geringerenMAS-Frequenzen tats!chlich ausreichend unterdr$ckt sind.Einen Anstieg von R11 nahe der Rotationsresonanzbedingung(n1 = nMAS) kann durch Wiedereinkopplung der dipolarenKopplungen und der CSA-Wechselwirkungen hervorgerufenwerden.[6] Ein Anstieg der R11-Raten kçnnte daher auchauftreten, selbst wenn kein konformationeller Austauschstattfindet. Auffallend ist jedoch, dass f$r die Aminos!uren,deren R11-Rate die grçßte Abh!ngigkeit von der Spinlock-Feldst!rke zeigt, auch ein konformationeller Austausch durchden isotropen CS-Mechanismus festgestellt werden konnte.Dies gilt f$r die Aminos!uren 23, 27, 51, 52, 54 und 55(Abbildung 2). Basierend auf den Simulationen in Abbil-dung 1 (die zeigen, dass RD-Profile von der #nderung desAustauschwinkels abh!ngen) schließen wir umgekehrt auf dieWinkel des mçglichen Austauschs der RD-Profile in Abbil-dung 2 b. Die Simulationen, die unterschiedliche Winkelannehmen, sind in Abbildung 2b als graue Kurven gezeigt.Die entnommenen Austauschwinkel variieren zwischen deneinzelnen Aminos!uren, und die grçßte Winkelfluktuationwird f$r Asp 52 und Arg 54 (20–308) festgestellt, w!hrend Ile23, Lys 27, Glu 51 und Thr 55 mit Winkelfluktuationen von108 oder weniger eine geringere Dynamik zeigen. F$r Gly 53sind wegen "berlappung im Spektrum keine Daten vorhan-den.

Interessant ist nun, diese Daten mit konkreten Struktur-modellen eines Austauschprozesses zu vergleichen. Wie auszahlreichen NMR-Daten, Mutationsexperimenten und Un-tersuchungen unterschiedlicher Kristallformen von Ubiquitinhergeleitet, beruht der vorgeschlagene Austauschmechanis-mus auf einem 1408-Flip der Peptidebene D52/G53 und einerUmlagerung der Wasserstoffbr$cke zwischen diesem Loopund der Helix der Aminos!uren 23–33. Abbildung 3 zeigt,dass in dem hier verwendeten Mikrokristall die NH-Bindungder Aminos!ure 53 in Richtung der Helix deutet (ein Typ-II-b-Turn), w!hrend in den meisten anderen Strukturen derProtein Data Bank sich die Bindung nach außen richtet (Typ-I-b-Turn, siehe Abbildung S9). Wir vermuten deshalb, dassder hier beobachtete konformationelle Austausch der "ber-gang zwischen diesen zwei Typen von b-Turns ist. Um dieseHypothese zu pr$fen, haben wir die NH-Bindungswinkel vonKristallstrukturen verglichen, die stellvertretend den Typ-I-b-Turn und den Typ-II-b-Turn enthalten. Der grçßte Unter-schied der NH-Bindungsorientierung wurde f$r Asp 52 undArg 54 gefunden, die beide an die drehende Peptidebene vonGly 53 angrenzen. Die Aminos!uren 23, 27, 51 und 55 zeigengeringere Winkelfluktuationen der jeweiligen Bindungsvek-

toren (Abbildung 3c). Dies ist qualitativ in guter "berein-stimmung mit unseren Daten aus Abbildung 2b, die ebenfallsdie grçßte Dynamik, d.h. den grçßten Winkelunterschied, f$rAsp 52 und Arg 54 zeigen – und deutlich kleinere Winkel f$rdie anderen am Prozess beteiligten Aminos!uren. DieseDaten zeigen, dass R11-RD-Experimente zus!tzlich zu CS-Daten strukturelle Einblicke auf angeregte Zust!nde gebenkçnnen. Diese Eigenschaft kçnnte von großem Wert f$r dieStrukturaufkl!rung von kurzlebigen Konformationen sein,auch in Anbetracht der zunehmenden Mçglichkeiten, diechemische Verschiebung f$r die Strukturbestimmung zuverwenden. Diese Mçglichkeit schließt auch Systeme ein,die bisher außer Reichweite f$r atomar aufgelçste Studienwaren, wie z. B. sehr große oder unlçsliche Proteine.

Received: December 30, 2013Published online: && &&, &&&&

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[6] a) Z.-H. Gan, D. M. Grant, Chem. Phys. Lett. 1990, 168, 304 –308; b) Z. Gan, D. M. Grant, R. R. Ernst, Chem. Phys. Lett.1996, 254, 349 – 357.

[7] J. R. Lewandowski, H. J. Sass, S. Grzesiek, M. Blackledge, L.Emsley, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16762 – 16765.

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[9] a) B. Reif, J. Magn. Reson. 2012, 216, 1 – 12; b) J. R. Lewandow-ski, J. N. Dumez, U. Akbey, S. Lange, L. Emsley, H. Oschkinat, J.Phys. Chem. Lett. 2011, 2, 2205 – 2211.

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[11] M. Tollinger, A. C. Sivertsen, B. H. Meier, M. Ernst, P. Schanda,J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 14800 – 14807.

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AngewandteChemie

5Angew. Chem. 2014, 126, 1 – 7 ! 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.de

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ZuschriftenProteindynamik

P. Ma, J. D. Haller, J. Zajakala, P. Macek,A. C. Sivertsen, D. Willbold,J. Boisbouvier,P. Schanda* &&&&—&&&&

Bestimmung transienterKonformationszust!nde von Proteinendurch Festkçrper-R11-Relaxationsdispersions-NMR-Spektroskopie

Funktionell relevante Proteinzust!ndesind oft kurzlebig und damit schwernachzuweisen. Es wird gezeigt, dass Re-laxationsdispersions-NMR-Spektroskopieim Festkçrper mit Rotation im magischenWinkel Zugang zu solchen Zust!ndenbietet. Informationen #ber die Aus-tauschkinetik, relativen Besetzungen undStrukturen dieser kurzlebigen Zust!ndekçnnen erhalten werden.

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6 www.angewandte.de ! 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2014, 126, 1 – 7! !

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