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Vectores. Plásmidos . Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de clonado , son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en - PowerPoint PPT Presentation
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Vectores
PlásmidosPlásmidos. Son moléculas pequeñas de . Son moléculas pequeñas de ADN ADN doble cadena y circular. doble cadena y circular.
vectores de clonadovectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. general, producen un gran numero de copias.
vectores de expresión,vectores de expresión, poseen toda la poseen toda la información necesaria para llegar información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.expresar una secuencia aminoacídica.
Características: Características:
•Son pequeños (miles de pares de bases) Son pequeños (miles de pares de bases)
•son circulares son circulares
•tienen un único origen de replicacióntienen un único origen de replicación
•sitios únicos de clivaje para enzimas de restricciónsitios únicos de clivaje para enzimas de restricción
•gran numero de copiasgran numero de copias
•marcadores que permitan su reconocimientomarcadores que permitan su reconocimiento
VECTORES DE CLONADOVECTORES DE CLONADO
PLASMIDOSPLASMIDOS : : moléculas moléculas de DNA que se encuentran ende DNA que se encuentran en bacteriasbacterias y se replican en forma independiente del cromosomareplican en forma independiente del cromosoma
Características generales de un vectores de clonado:Características generales de un vectores de clonado:
pBR322pBR3224361 bp4361 bp
Orígen de replicación
Marcadores genéticos(permiten selección de transformantes)
Sitios de restricción únicos
Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)
mcs
• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción
• un promotorun promotor
Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:
• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción
• un promotorun promotor
Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:
• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción
• un promotorun promotor
Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:
Sec Enhancer Tata Box Sec. KosakSec Enhancer Tata Box Sec. Kosak
atgatg
MCSMCS
• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción
• un promotorun promotor
Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:
• un sitio de unión a un sitio de unión a ribosoma ribosoma
• un terminador y sitio de un terminador y sitio de poliadenilaciónpoliadenilación
• marcadores de marcadores de selección selección
• origen de replicaciónorigen de replicación
• tamaño pequeñotamaño pequeño
Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?
Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?
Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?
Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión
Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?
aataatacGacGttaagCTTAAttaagCTTAA GtacagGtacag
AATTCAATTCatgatgtcctcc
Ej: Vectores serie 1Ej: Vectores serie 1
GtacagGtacagAATTCAATTCatgatgtcctcc
cgatG AATTCcgatG AATTCatgatgtcctccgcatCTTAA GtacaggcatCTTAA Gtacag
InsertoInsertoaataatacG AATTCtacG AATTCtaaccccttaagCTTAA GatggttaagCTTAA Gatgg
aataatacGacGttaagCTTAAttaagCTTAA
VectorVector
Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?
Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión
Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?
aataatactGactGttaagaCTTAAttaagaCTTAA GtacagGtacag
AATTCAATTCatgatgtcctcc
Ej: Vectores serie 2Ej: Vectores serie 2
GtacagGtacagAATTCAATTCatgatgtcctcc
cgatG AATTCcgatG AATTCatgatgtcctccgcatCTTAA GtacaggcatCTTAA Gtacag
InsertoInsertoaataatactG AATTCtactG AATTCtaaccccttaagaCTTAA GatggttaagaCTTAA Gatgg
aataatactGactGttaagaCTTAAttaagaCTTAA
VectorVector
Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?
Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión
La resistencia del plasmidoLa resistencia del plasmido
Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?
Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?
Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión
La resistencia del plasmidoLa resistencia del plasmido
El nivel de expresión de la proteínaEl nivel de expresión de la proteína
Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?
ConstitutivosConstitutivos: siempre están transcribiéndose.Ej : siempre están transcribiéndose.Ej SV40, RSV,CMVSV40, RSV,CMV
PromotoresPromotores
El nivel de expresión depende del promotor
InduciblesInducibles: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún : se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T).Ej: cambio en el medio (inductor, cambio de T).Ej:
Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclinaTet o T-Rex inducilbe por tetraciclina
Olac inducible por IPTGOlac inducible por IPTG
Metalotioneína inducible por metales pesadosMetalotioneína inducible por metales pesados
GAL4-E1b inducible por mifepristonaGAL4-E1b inducible por mifepristona
Proceso de clonadoProceso de clonado::
-se corta el ADN de interés se corta el ADN de interés y el vector con la misma y el vector con la misma enzima de restricciónenzima de restricción
-se ligan los fragmentos se ligan los fragmentos generándose un vector generándose un vector recombinanterecombinante
-se transforman células se transforman células del organismo huéspeddel organismo huésped
- se seleccionan las que portan - se seleccionan las que portan el plásmidoel plásmido
- - Obtención de grandes Obtención de grandes cantidades de plásmidocantidades de plásmido
TransfecciónTransfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido : proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicosdentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos
Métodos químicos: DEAE-DextranoMétodos químicos: DEAE-Dextrano
Coprecipitados de CaPOCoprecipitados de CaPO44
Lípidos cationicosLípidos cationicos
Métodos físicos: BiobalisticaMétodos físicos: Biobalistica
MicroinyecciónMicroinyección
ElectroporaciónElectroporación
•Expresión de proteínas para su purificaciónExpresión de proteínas para su purificación
•Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celularExpresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular
•Estudio de promotores y elementos regulatoriosEstudio de promotores y elementos regulatorios
•Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA,
•postraduccionales, etc.postraduccionales, etc.
•Interacción de proteínasInteracción de proteínas
•ClonadoClonado
•Terapia génicaTerapia génica
Objetivo de la transfecciónObjetivo de la transfección
Métodos químicosMétodos químicos
Métodos físicos:Métodos físicos:
BiobalisticaBiobalistica
Microinyección
Electroporación
Consideraciones para transfección con lípidos cationicosConsideraciones para transfección con lípidos cationicos
Tansfección en presencia de suero Tansfección en presencia de suero
Antibióticos en el medio de cultivoAntibióticos en el medio de cultivo
Densidad celularDensidad celular
Elección del promotor Elección del promotor
Cantidad de DNACantidad de DNA
Transfección estable y transienteTransfección estable y transiente
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