Osnovne višepulsnejednodimenzijske tehnike - pmf.unizg.hr · Jednodimenzijske tehnike 90 ......

Jednodimenzijske tehnike

90x

nakvizicija

Osnovne višepulsne jednodimenzijske tehnike

Tehnika primjena

J modulirana spinska jeka ili APT (Attached proton Editiranje spektara heterojezgri (13C) premaJ-modulirana spinska jeka ili APT (Attached proton test)

Editiranje spektara heterojezgri (13C) prema multiplicitetu

INEPT (Insensitive nuclei enhanced by polarisation transfer)

pojačavanje signala jezgri s malim (13C) pomoću prijenosa polarizacije sa jezgri s velikim (1H, 19F). Editiranje spektara heterojezgri prema multiplicitetu.

DEPT (Distortionless enhancement by polarisation transfer)

pojačavanje signala jezgri s malim (13C) pomoću prijenosa polarizacije sa jezgri s velikim . Editiranje spektara heterojezgri prema multiplicitetu. Robusniji od p j g p p jINEPT-a. Nema informacija o kvarternim 13C

DEPT-Q Isto kao DEPT ali sadrži kvarterne 13C

pojačavanje signala jezgri s malim (13C) pomoću PENDANT

j j g j g ( )prijenosa polarizacije sa jezgri s velikim (1H, 19F). Editiranje spektara heterojezgri prema multiplicitetu. Sadrži informacije o kvarternim 13C

CH3

OOH

O

OH

CH3

O

O

OH

OOH

Tehnike dvostruke rezonancije

a) Spregnuti spektar s NOE rasprezanje

b) Raspregnuti spektar bez NOE rasprezanje

c) Raspregnuti spektar s NOE (rf) lj i j j d ij ličit

RasprezanjeRasprezanjepolje primjenjeno s dvije različite snage-power gated

-pinen

d) R ti kt

CDCl3

d) Raspregnuti spektar s NOE-power gated

c) Raspregnuti spektar bez NOENOE

b) Spregnuti spektar s NOE

a) Spregnuti spektar bez NOE

CH3

OOH

O

OH

OH

APT spektar

(Aceton)(Aceton)

INEPTINEPT

x x ±y

x x y1H

x x13C

x x = 1/4J

Refokusirani INEPT

x x ±y1H

x

Rasprezanje

13Cx x x

p j

AX

Povećanje osjetljivosti!

X 13C 15N 29Si 31P

IINEPT = I0(H/X)

I I (1 + /2 )

IINEPT 3.98 9.87 5.03 2.47

INOE 2.99 -3.94 -1.52 2.24INOE = I0 (1 + H/2X) INOE

DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

x

x ±y1H

13Cx x

= 1/2J

C

= 180J Faza i intenzitet signala ugljikovih atoma ovisi o kutu Slično kao i kod INEPT-a, no s tom razlikom što se kod DEPT-a editiranje postiže različitim

kutem , a ne vrijednostima

= 180J

Stoga je i učinkovitost editiranja veća za DEPT

DEPT-45 DEPT-90 DEPT-135

XH + + +XH2 + 0 -XH + 0 +XH3 + 0 +

DEPT eksperiment

CH i CH3 gore, CH2 dolje

DEPT eksperiment

3 g , 2 j

Pojavljuju se samo CH skupine

Svi protonirani ugljici se pojavljuju nema kavarternihpojavljuju, nema kavarternih

Normalni 13C spektarspektar

Opća shema za sakupljanje 2D podataka

Broj eksperimentap

1eć

enje

t 1Po

ve

Homonuklearna korelacijaCOSY (COrrelation SectroscopY)COSY (COrrelation SectroscopY)

t1 tt1 t2

Spinski sustav AX AX AX

IA=IX=1/2

CH3

O

O

OH

OOH

TOCSY (TOt l C l ti S t Y)TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY)t

t1

tm

Spin-locky

Postoje korelacije među spinovima unutar spinskog sustava, bez obzira da li su j j p p g ,međusobno spregnuti

Ako postoje neprekinuti lanac spinova A-B-C-D, TOCSY slijed će prenositi magnetizaciju od spina A na spinove B, C, Dmagnetizaciju od spina A na spinove B, C, D

Homonuklearna križna polarizacija (HOHAHA) tm - vrijeme mješanja ili spin-lock ili izotropno mješanje, potrebno za prijenos

magnetizacije unutar spinskog sustava tj svi spinovi dijele koherencijumagnetizacije unutar spinskog sustava, tj svi spinovi dijele koherenciju Vrijeme tm je u ms što omogućava višestupanjski prijenos koherenacije za vrijeme tm primjenjuje se rf polje ili pulsevi uzduž osi y koji zaključavaju spinove

uzduž te osi i kreiraju homonuklearnu spinsku jeku Homonuklearnom spinskom jekom sprege nastavljaju evoluirati, što znači da su na

kraju vremena tm kemijski pomaci odstranjeni dok sprege ostaju aktivnej m j p j p g j Zahtjev da jezgre osjećaju ista lokalna polja za vrijeme mješanja da bi se omogućio

prijenos zove se i Hartman-Hahn uvjet, odnosno vrijedi AB1A =XB1X

TOCSY

COSY

TOCSY

CH3

O

O

OH

OH

HETCORHETCOR

CH3

O

O

OH

OH

W0 = prijelaz od nula kvanta

W1 = prijelaz od jednog kvanta

W2 = prijelaz od dva kvanta

W0 i W2 imaju istodobnu promjenu 0 2 j p joba spina

kvantno su zabranjeni jer ∆M≠1kvantno su zabranjeni jer ∆M≠1

W0 i W2 predstavljaju puteve križnerelaksacije

Interakcije kroz prostor- križna relaksacija (NOESY, ROESY)

COSY

1. Skalarne interakcije

1. Skalarne interakcije, dipolarne interakcije, NOESYkemijska izmjena

2 Vrijeme miješanja2. Vrijeme miješanja,

3. Prijenos magnetizacije kroz prostor

NOESY spektar azitromicina

NOESY vs. ROESY

NOESY

ROESY

Protokol za određivanje ili potvrdu strukture molekula

postupak tehnika informacija

1H kt 1D k ij ki i k t t i t li1H spektar 1D kemijski pomaci, konstante sprega, integrali

1H-1H korelacija COSY povezanost protona preko sprega (asignacija)j p p p p g ( g j )

13C spektar s DEPT, APT, broj atoma C i multipletnost (C, CH, CH2, CH3)često nepotrebno ako se koriste inverzne 2Deditiranjem PENDANT često nepotrebno ako se koriste inverzne 2D tehnike s editiranjem

spektri hetero-jezgri 1D kemijski pomaci i homo-/hetero-nuklearne p j g(31P, 19F..) 1D j p

konstante sprega

1H-13C korelacija kroz HMQC HSQC asignacija atoma C i H, multipletnost iz HSQC jednu kemijsku vezu HMQC, HSQC spektra s editiranjem

1H-13C korelacija kroz HMBC povezanost atoma C i H kroz više veza, jviše kemijskih veza HMBC p ,

povezanost preko hetero-atoma, identifikacijastrukturnih fragmenata

korelacija kroz prostorkorelacija kroz prostor preko NOE efekta 1D ili 2D

NOESY, ROESYstereokemija: konfiguracija i konformacija

NMR kt k ij č t t jNMR spektroskopija u čvrstom stanju

13C NMR spektar u otopini

13C NMR spektar u čvrstom stanjuj

Interakcije ovisne o položaju u prostoru Interakcije ovisne o položaju u prostoru

2 21 2 21 3cos 1 sin cos 22iso CSA θ η θ φ

Dipolarne interakcije

1H 1H ≈ 40 kHz – 120 kHzH, H 40 kHz 120 kHz13C, 1H ≈ 3 kHz – 30 kHz

Utjecaj anizotropije kemijskog pomaka (CSA) na NMR spektre u čvrstom stanjuspektre u čvrstom stanju

Anizotropija kemijskog pomaka

Sferna simetrija

Zrcalna simetrija

Osovinska i t ijsimetrija

Čarobni trik...

(3cos2θ - 1) = 0 kada je θ = 54.74°

b k č d č k ili d beskonačno dugačak cilindar

E. R. Andrew i I. J. Lowe

MASagic ngle pinningM A SCP-MAS

• dipolarne interakcije1H, 1H ≈ 40 kHz – 120 kHz

MAS

13C, 1H ≈ 3 kHz – 30 kHz

Efekt MAS-a na 13C spektar

Analiza svojstava krutine – solvati (lizinopril)

A. Amorfni oblikB. Kristal anhidratC. Kristal dihidratD D2O otopinaD. D2O otopinaE. D20 otopina

Analiza svojstava krutine – polimorfi

sulfatiazolflufenamska kiselina

Strukturna analiza – L-tirozin hidroklorid

a) MAS-J-HMQCa) MAS-J-HMQC

b) dipolarni HETCOR

O

O CH3

Sprega tekućinske kromatografije i NMR-aSprega tekućinske kromatografije i NMR aLC-NMR

Sprega tekućinske kromatografije i NMR-a

NMR s SGI ili PC (windows)

HPLC s PC

Načini izvedbe LC-NMR-a

Kontinuirani protok (on-flow) Izvedivo za 1H i 19F (osjetljivost) Izvedivo za H i F (osjetljivost) Za uzorke nepoznatih kromatografskih svojstava Labilni spojevi (razgradnja, izomerizacija)

Zaustavljeni protok u vremenskim intervalima (time-slice) Loše odvojive komponente u smjesi Slaba ili nikakva UV kromofora Slaba ili nikakva UV kromofora Slabo definirana retencijska vremena

Zaustavljeni protok (stopped-flow) Poznata retencijska vremena komponenata u smjesi Poznate UV kromofore

Skladištenje u kapilarnim petljama (loop transfer) Skladištenje u kapilarnim petljama (loop transfer) LC pikovi se skladište u kapilarne petlje

LC-SPE-NMR LC pikovi se skladište u SPE (solid phase extraction) patronama (cartridge)

T h ik ij i l t lTehnike supresije signala otapala

P ić j (NOESY ti “ h d” l i)Prezasićenje (NOESY tip, “shaped” pulsevi)Jedno-, dvo-, i višestruka supresija signala

WET (water suppression enhanced trough T1effects)effects)

WATERGATE (water suppression by gradient-t il d it ti )tailored excitation)

Excitation sculpting (dvostruka pfg spinska-jeka)p g ( p g p j )

Protonski spektri mesalazina u 71% CH3CN i 29% D2OProtonski spektri mesalazina u 71% CH3CN i 29% D2O

a) običan spektar CH3CNHOD

mesalazin

b) prezasićenje CH3CN) p j 3

c) dvostruko prezasićenje CH3CN ) p j 3i HDO

d) Dvostruko prezasićenje CH CN i HDO 13CCH3CN i HDO uz 13C rasprezanje

P t ki kt i l i 71% CH CN i 29% D OProtonski spektri mesalazina u 71% CH3CN i 29% D2O

a) Običan spektar

b) WET višestruka supresijab) WET višestruka supresija otapala

c) 3-9-19 WATERGATE (W3)

d) 3-9-19 WATERGATE (W3)

Tipični LC-NMR spektri kontinuiranoga protoka

1H LC-NMR spektri kontinuiranog protokap

Odvajanje izomera vitamina AOdvajanje izomera vitamina A

Ograničenja LC-NMR-ag j

Količina izorka za NMR limitirana je kromatografijom Količina izorka za NMR limitirana je kromatografijom

S di LC i l l i t t č NMR Samo dio LC signala nalaz ise unutar protočne NMR probe

Količina od samo jednog injektiranja je dostupna za NMR

Nedeuterirana otapala daju jake pozadinske signale

Deuterirana otapala (obično D2O) preskupa su za kromatografiju i onemegućuju opažanje izmjenjivihkromatografiju i onemegućuju opažanje izmjenjivih protona

Rješenje: sprega ekstrakcije na čvrstoj fazi (SPE) Nakon kromatografskog odvajanja za skladištenja pikova u

SPE patronama (cartridge)p ( g ) Patrone se suše u struji dušika za otklanjanje otapala

N d t i t l k i titi d j j k ti Nedeuterirana otapala se mogu koristiti za odvajanje komponenti smjese u LC-u

Oblik LC pika nije bitan za NMR

Deuterirana otapala se mogu koristiti za ispiranje uzoraka s patrona i Deuterirana otapala se mogu koristiti za ispiranje uzoraka s patrona i uvođenje u NMR protočnu probu

Nije potrebna supresija signala otapala

Mogu se opažati izmjenjivi ptoronig p j j p

Manji volumen eluiranja, povećanje S/N

Mogućnost višestrukog skladištenja LC pikova za povećanje koncentracije za NMR

Oblik kromatografskog pika u 1) tehnici LC-NMR i 2) tehnici LC-SPE-NMR

Primjena LC SPE NMR tehnikePrimjena LC-SPE-NMR tehnike

analiza biljnih ekstrakataanaliza maslinovog ulja analiza maslinovog ulja

analiza tropskog voćali t b lit i it analiza metabolita in vitro

analiza organskog sastava tla i sedimenata

analiza onečišćenja i razgradnih produkata u aktivnim farmaceutskim pripravcimaaktivnim farmaceutskim pripravcima

LC2-SPE-NMR za analizu složenih smjesa i onečišćenja s udjelom oko 0 1 %onečišćenja s udjelom oko 0,1 %

Primjer: LC-SPE krio-NMR analiza 7-etiltriptofolaPrimjer: LC SPE krio NMR analiza 7 etiltriptofola

-Prekursor u sintezi etodolaka-Lječenje reumatoidnog artritisa

7-ethyltryptophol Methyl 3-oxopentanoate Methyl ester of Etodolac

7-ethyltryptophol

LC-kromatogram uzorka 7-etiltriptofolaOptimal uvjetikolona: Waters XBridge Phenyl (150 mm 4 6 mm; 3 5 μm)kolona: Waters XBridge Phenyl (150 mm 4.6 mm; 3.5 μm)mobilna faza: metanol-fosfatni pufer (pH 7), gradientna metodaprotok: 1 ml/min temperatura: 25 °C injektirani volumen: 20 µlUV detekcija: 225 nm, 273 nmpočetna masa: 10 mg

onečišćenje 2D8

1H COSY

HSQC

2D8

LC-SPE-krio-NMR sustav