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papel de los ZnO en el desarrollo del cancer
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Kee Woei Ng, Stella P.K. Khoo, et al.
THE ROLE OF THE TUMOR SUPPRESSOR P53 PATHWAY IN THE CELLULAR DNA DAMAGE
RESPONSE TO ZINC OXIDE NANOPARTICLES
María José ÁlverezNatalia Zuleta Rendón
Estudiantes3° Semestre
MedicinaUniversidad Pontificia
Bolivariana 2011
http://www.aprea.com/home/content/view/21/75/
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INTRODUCTION
Protein p53
• Is a DNA binding protein that responds to cellular damage.
• Is found at low levels in the cell, but when there is damage level increases
http://www.bioinf.org.uk/p53/
• It works producing proteins that stop the cell cycle for DNA repair mechanisms repair.
• When damage is very big and irreparable, p53: by regulating transcription of genes that produce proteins to induce apoptosis and cell suicide.
http://www.web-books.com/eLibrary/ON/B0/B9/47MB9.html
Tumors• It is an abnormal mass of tissue. Tumors can be
cancerous (malignant) or noncancerous (benign).
• Tumors appear to occur when there is a problem with the division of cells in the body. Altering the balance of division and death of cells, can form a tumor.
Dna Damage
• Changes in the DNA molecule leading to alterations in transcription and replication. These changes may be point mutations, insertions or deletions.
• May be caused by: Spontaneous mutations (replication) Induced mutations(mutagens): physical or
chemical agents that cause mutations; as reactive oxygen species, UV radiation and heat.
http://www.disinfo.com/2010/12/los-alamos-scientist-tsa-scanners-shred-human-dna/
Zinc oxide nanoparticles • Is an inorganic salt, often used in consumer products
such as sunscreens and cosmetics.
• It is believed to have genotoxic effects.
SUPPRESSION OF p53 INDUCED BY ZnO
Exposure to particles
of ZnO entering the
cell
They produce reactive
oxygen species
Nuclear membrane cross c
ausing damage to DNA
p53 protein is activated
If the damage is minor apoptosis
occurs
If the damage is severe there
may be a tumor
GENERAL AIM
• The deep understanding of whether the cellular DNA damage pathway, through tumor suppressor p53, is activated by ZnO nanoparticles.
Materiales y métodos
Caracterización de las nanopartículas de ZnO
Nanopartículas preparadas en metanol y sometidas a ultrasonido.
Observadas bajo microscopio de transmisión de electrones, medidas y
dispersadas a un pH de 6 en soluciones coloidales.
Para determinar el tamaño hidrodinámico, el índice de poli-
dispersidad y el potencial zeta de las partículas
Cultivo celular
Células epiteliales bronquiales humanas, fibroblastos de prepucio
neonatal y macrófagos de roedores, fueron cultivadas en DMEM*,
suplementadas con FBS** 10%, L-glutamina 1% y
antibiótico/antimicóticos
FBS: usado en la producción de proteínas, anticuerpos
monoclonales, enzimas.DMEM para estabilizar el medio de
cultivo con aminoácidos y vitaminas.
Método Material & fundamentoFunción
DMEM*:high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s MediaFBS**: fetal bovine serum
Empaquetamiento del retrovirus shp53 y transducción de las
células BJ
Células 2-239, por medio del fosfato de calcio, infectadas con plásmidos retrovirales codificados con shp53, o un vector de control vacío y lavadas con PBS.
Células con virus almacenadas a -80 C. Células BJ de receptor ecotrópico guardadas en contenedores después de transducción. igual volumen de medio viral mezclado con medio de crecimiento de polibreno y añadido a las células.
El calcio queda en el fondo y los fostatos quedan en la parte más alta del precipitado junto con el
DNA.
Exposición de las células a las
nanopartículas
Soluciones de nanopartículas de ZnO preparadas en PBS estériles, adicionadas al DMEM y 'sonicadas' para obtener las concentraciones deseadas de 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml.
Cultivo de BEAS-2B y RAW264.7 por 24H expuestas a nanopartículas.
Células BJ cultivadas por 24 H en contacto con nanopartículas.
BEAS-2B y RAW264.7: análisis de citotoxicidad
Células BJ: estudios de genotoxicidad
Células sonicadas y cultivadas en DMEM: control negativo.
Método Material & fundamento Función
BEAS-2B:Human bronchial epithelial cellsBJ: human neonatal foreskin broblastsRAW264.7: murine macrophages DMEM: high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
Proliferación celular y perfil metabólico
las células tratadas con nanopartículas fueron lavadas en
PBS, lisadas con tritón X-100 0.1% v/v en agua desionizada.
Todo se mezcla por 30 min a 80 RPM.
solución pico-green mezclada con las células lisadas, y todo
incubado por 5 min a temperatura ambiente en la
oscuridad.
Cuantificación de las cantidades de DNA.
Picogreen: prepara los ejemplares lisados para la fluorescencia
Lavado con PBS: para el análisis de los perfiles metabólicos de las células que interactuaron con las
nanopartículas.
los perfiles metabólicos relativos se obtienen comparando los
niveles de absorbancia con los valores de DNA cuantificado por
fluorescencia.
Ensayo cometa
células BEAS-2B sembradas e incubadas 16 H.
Nanopartículas adicionadas e incubadas 4 h.
Células lavadas con PBS, tripsina y mezcladas con agarosa en
relación 1: 3. Suspensión célula-agarosa
distribuida sobre una lámina de vidrio con agarosa pre-cubierta.
Todo colocado en 1.2M NaCl, 100mM EDTA, 1% Tritón, 0.26M
NaOH por 16h en oscuridad.Láminas lavadas y teñidas con
verde SYBR.
Almacenamiento por 16 H con las soluciones lisantes: para preparar
la mezcla para electroforesis.
verde SYBR: para observación bajo microscopio de fluorescencia
y respectivo score.
Método Material & Fundamento Función
Western blotting
células lavadas con PBS, se les agrega 50µl de Buffer: (31.25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 12.5% glicerol,
0.05% ß-mercaptoetanol, 1% SDS, 0.005% azul bromofenol)
Adición de inhibidores de proteasas y fosfatasas .
almacenamiento en hielo, sonicación y centrifugación.
sobrenadante analizado con kit de ensayos de proteínas y agente de compatibilidad con detergentes
iónicos.
muestras de 7µg de proteínas fueron calentadas antes del SDS-
PAGE* usando geles de gradiente a 120 V, 90 min, electrotransferidas a
membranas de nitrocelulosa. INMUNOBLOTTING: bloqueo de
sitios inespecíficos con leche seca sin grasa filtrada en TBS-T. Las membranas fueron puestas en
contacto con anticuerpos primarios diluidos en un buffer e incubados
con agitación constante.después de lavados, fueron incubadas con anticuerpos
secundarios conjugados con HRP.
sonicación, buffer y detergentes iónicos: lisis
celular
centrifugación: Precipitación de restos celulares.
Kit de ensayos: análisis de proteínas del sobrenadante.
Método Material y fundamento Función
SDS-PAGE*: electroforesis en gel de poliacrilamida
RESULTADOS
• Caracterización de ZnO El diámetro de las nanopartículas: 22.5 - 4.9 nm, obtenidos
de las mediciones de 50 nanopartículas.
Las nanopartículas de diferentes propiedades físico-químicas, tales como tamaño, forma y carga superficial puede ejercer diferentes efectos citotóxicos en las células.
• Citotoxicidad y la genotoxicidad de las nanopartículas de ZnO
•El ensayo cometa muestra migración del DNA en la cavidad de agarosa lo cual comprueba el daño de éste.
• Efectos en la p53
Se demostró una disminución de la función metabólica de las células BJ con respecto al grupo de control (sin ZnO).
Se cuantificó el DNA (ensayo PicoGreen) y se observó que el número de células disminuía a medida que se incrementaba la concentración de ZnO.
Microscopía electrónica que muestra la poca proliferación de células tras la exposición de 24h a ZnO.
•Papel de la p53
A P53 responde al aumento de ZnO por lo cual lleva a la célula a un estado pre-apoptótico.
B P53 no responde a aumento de Zno, debido a su fosforilación lo que disminuye su acción sobre el ciclo celular.
• El daño del DNA también pudo haber sido causado por incrementos de ROS inducidos por el ZnO, estos también son citotóxicos.
http://circres.ahajournals.org/content/101/7.cover-expansion
Xia et. al [16]* salts and proteins could help in nanoparticle dispersion in an aqueous environment
Yes
Singh et. al [2] removal of structural defects from MWCNT was sufficient to substantially reduce their inflammatory response and overall toxicity.
Yes
Heng et.al [33]* 13.9% of BEAS-2B cells were found to have internalized the same spherical ZnO nanoparticles used here, introduced at 15 mg/ml, after 4 h incubation’’
Yes
Brayner et. al * [34]decreased progressively due to stress
induced by the presence of the
nanoparticles in the culture medium. After
contact with ZnO-TOPO nanoparticles, this
decrease was followed by cell death.
yes
DISCUSSION
Heng et. al [14] *the high cell density monolayer was
consistently more resistant to the cytotoxic
effects of ZnO nanoparticles compared to
the sparse monolayer for all four different
cell types
Yes
Heng et. al [15] Hence, it is obvious that initial transient exposure of BEAS-2B cells to oxidative stress sensitized their sub- sequent response to cytotoxic challenge with ZnO nanoparticles
Yes
Xia et. al [16]*results demonstrate that metal oxide
nanoparticles induce a range of biological
responses that vary from cytotoxic to
cytoprotective
No mention of cytoprotection.
Yuan et. al [17] The results indicated the obvious dose-effect cyto- toxicity relationship between all the ZnO NPs and HELF cells. In
Yes
Puzin et. al [35] *the number and variety of engineered
nanoparticles will increase rapidly over the
next few years, and there is a need for new
methods to quickly test the potential toxicity of
these materials.
Yes
Ng et. al [36]* Metabolic assays by themselves are not directly correlated with cell numbers since the same number of cells of the same cell type may have very different metabolic activities in different environments
Yes
Muller et. al [37]*Our study demonstrates that ZnO toxicity in
HMMs is due to pH-triggered, intracellular
release of ionic Zn2+
rather than the high-
aspect nature of the Cell death had features
of necrosis, apoptosis, with mitochondria
displaying severe structural changes
Yes
Xia et. al [38]*the dissolution of ZnO nanoparticles and Zn
2+
shedding leads to a series of sublethal and
lethal toxicological responses at the cellular
level that can be alleviated by iron doping.
Yes
Wätjen et. al [38] the mechanism of induction of apoptosis by zinc may involve calcium mobilization
Yes
Saji et. al [40]*Among the materials, dissolution of ZnO
nanoparticles and Zn2+
release were capable
of ROS generation and activation of an
integrated cytotoxic pathway that includes
intracellular calcium flux, mitochondrial
depolarization, and plasma membrane
leakage.
Yes
Huan et. al [41]*The predictive toxicological approach is
defined as establishing and using
mechanisms and pathways of injury at a
cellular and molecular level to prioritize
screening for adverse biological effects and
health outcomes in vivo
Yes
Schiestl et. al [42] * Although TiO2 is chemically inert, TiO2
nanoparticles can cause negative health
effects, such as respiratory tract cancer in
rats.
Yes
Osmond et. al [6] post-production processing and packaging, is the possibility that ZnO nanoparti- cles may be released incidentally as ‘dust’ or as aerosol droplets into the ambient air.
Yes
Borm et. al [43] The formation of large complex particles incorporating nano- scale components will need to be considered in the risk assessment for nanotechnology because they create a potential route for uptake of Nanoparticles and fibre
Yes
Nohynek et. al [44]* Vesicle materials do not penetrate into living human skin. Vesicle formulations may enhance or reduce skin absorption of ingredients, albeit at a limited scale
Yes
Mortensen et. al [45]Our findings raise concern that NP of similar
size and surface chemistry, such as metal
oxide NP found in sunscreens, may also
penetrate UV damaged skin.
Yes
Korting et. al [46]Since inhibition of mitotic activity is linked to
the atrophogenicity of topical corticosteroids,
the results suggest that liposome
encapsulation may improve the benefit-risk
ratio in eczema
Yes
kocbek et. al [47]*Transmission electron microscopy images
show NPs in vesicles within the cell cytoplasm.
Keratinocyte alterations.
Yes
Geiser et. al [48] Uptake of ZnO nanoparticles may also occur via passive diffusion through the cell membrane into the cytoplasm
Yes
CONCLUSIONS
• This study is very important to the medical practice because through this we can determine that generate particles damage the genetic material that can cause cancer.
• This investigation proves once again the importance of p53 in cell cycle control.
• Some components of your commonly used products could induce cellular damage, so it’s important to know the composition of them.
• Specifically ZnO nanoparticles can cause skin cancer because it induces DNA damage.
MAPAS CONCEPTUALES
Natalia Zuleta Rendón
BIBLIOGRAFÍA
• MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología molecular. 6. ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina, 2011. p 127-133
• http://www.adcis.net/es/Applications/SuccessStories/CometAssay.html