Clasificación taxonómica y filogenéticaTaxonomía numérica y agrupamiento jerárquico.

Taxonomía molecular.

MICROBIOLOGIA AGRICOLA y AMBIENTAL

2011

Clasificación taxonómica y filogenética

Análisis fenotípicos

y genotípicos

AnálisisGenotípicos(Evolución)

Taxonomía vs. Filogenia

Evolución de la Tierra y primeras formas de vida

Organismos primitivos

Los organismos primitivos debieron tener

Un metabolismo

Un mecanismo hereditario

“progenote”: estructuras complejas, pero que no se pueden considerar seres vivos

Primeros organismos vivos, unicelulares

Anaerobio

quimiolitotrofo

Organismos primitivos

Último ancestro común

Bacterias

Arquibacterias

Eucariotas

Aparecen dos mecanismos para transferir material genético

Transferencia lateral Transferencia vertical

Los organismos primitivos y el mecanismo hereditario

• Las formas replicativas de RNA se integraron establemente en vesículas lipoproteicas formando entidades celulares

• Las proteínas reemplazaron las funciones catalíticas del RNA

• El DNA reemplazó las funciones codificantes del RNA

Las RNA polimerasas cometen más errores que las DNA polimerasas

Si se hubiera mantenido el RNA como material genético codificante, no hubieran existido las formas celulares complejas actuales

Origen de los eucariotas modernos por eventos endosimbióticos

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. (2000), Brock Biología de los Microorganismos

• El primer evento en la formación de un eucariota fue la formación del núcleo

• Los cloroplastos se formaron a partir de bacterias fotosintéticas de vida libre que entraron en relación simbiótica con algún eucariota primitivo

• Las mitocondrias surgieron por un proceso similar.

• La hipótesis endosimbiótica ha recibido apoyo con el descubrimiento de una cianobacteria endosimbiótica que se encuentra adentro de un alga (Cyanophora paradoxa) y actúa como su cloroplasto

Filogenia

Análisis comparativo de genes o proteínas (reloj

o cronómetro molecular)

Secuenciación

Elección del mejor cronómetro evolutivo

• Debe estar universalmente distribuído en el grupo elegido para el estudio

• Debe tener funciones homólogas para cada organismo

• Se deben poder alinear para identificar secuencias homólogas y heterólogas

• La secuencia elegida debe cambiar a una velocidad conmensurable con la distancia evolutiva medida. Cuanto mayor sea la distancia filogenética medida, menor debe ser la velocidad a la cual la secuencia cambia

rRNA como cronómetro evolutivo

En procariotas: 5S; 16S; 23S

En eucariotas: 18S

Distribución generalizada

El producto de este gen realiza la misma función en todos los organismos

Baja frecuencia transferencia lateral

• Estructuras con baja tasa de mutación, y otras con tasas más altas.

Existen bases de datos que almacenan un número muy grande de secuencias diferentes para este gen

Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a partir de secuencias de rRNA 16S

Organismo Secuencia

A CGUAGACCUGAC

B CCUAGAGCUGGC

C CCAAGAGCUGGC

D GCUAGAUGUGCC

Organismos a comparar

Distancia evolutiva (ED)

ED corregida

A con B 0.25 0.30

A con C 0.33 0.44

A con D 0.42 0.61

B con C 0.25 0.30

B con D 0.33 0.44

C con D 0.33 0.44

Árbol filogenético, generado por computadora como el mejor ajuste de los ED corregidos

0.23

0.02

0.29

0.15

0.080.08

A

D

C

B

De esta forma si comparamos A con B resulta la suma 0.23 + 0.08 = 0.31.A con C = 0.23 + 0.08 + 0.15 = 0.46, que son valores muy semejantes a los valores de la tabla anterior.

Detección del DNA Contenido genómico G+C

Uno de los métodos más utilizados es por absorción en el UV (260nm)El DNA bicatenario absorbe menos que el monocatenario, ya que el apareamiento de las bases reduce la absorción en el UV

Desnaturalización de los ácidos nucleicos

Si se observa la absorbancia a 260nm a medida que se calienta un DNA bicatenario, se obtiene el Tm, que está en función del contenido G+C.

A mayor % G+C, mayor Tm

Porcentaje de G+C

% G+ C =

G + C

A + T + G + C

Organismos con fenotipos muy semejantes no siempre poseen % G+C similares

Si dos organismos que se creían cercanamente relacionados por sus propiedades, tienen % G+C muy diferentes, seguramente métodos más cuidadosos de análisis indicarán que no son tan cercanos como se creía

Dos organismos con idéntico % G+C no necesariamente son relacionados, pueden ser taxonómica y filogenéticamente no relacionados porque sus secuencias son diferentes

50 9070 8060

1.4

1.3

1.2

1.1

1.0

A260 relativa

50% del aumento total de la

A260

E. coli

Ps. aeruginosa

Tm (°C) 69 76 GC (%) 50 68

Curvas de desnaturalización de dos ADNs con distinto contenido de G+C

Contenido en G+C en el ADN de cepas pertenecientes a una especie

Pseudomonas spp Número de cepas

estudiadas

(G+C)%

P.aeruginosa 11 67,2 ± 1.1

P. acidovorans 15 66,8 ± 1.0

P. testosteroni 9 61,8 ± 1,0

P. cepacia 12 67,6 ± 0,8

P. pseudomallei 6 69,5 ± 0,7

Contenido en G+C en el ADN de cepas pertenecientes a una especie

Hibridización de ácidos nucleicos

Compara las secuencias de sus DNA’s

Si dos organismos tienen muchos genes similares o idénticos, tendrán muchas secuencias similares en sus DNA’s (gran homología). Esos DNA’s hibridizarán en una proporción acorde a las similitudes de sus secuencias.

Es un procedimiento útil para resolver relaciones a nivel de especie o menor

Hibridización de ácidos nucleicos

• El DNA se prepara a partir de organismos testigos. El DNA de uno de los organismos (organismo 1) está marcado con 32Pi.

• Experimento de hibridización. Se han probado todas las combinaciones, en cada experimento se añadió DNA no marcado para impedir el reapareamiento del DNA marcado. Luego de la hibridización se separa el DNA hibridizado del no hibridizado para medir solamente la radiactividad del DNA hibridizado.

• Resultado obtenido. La radiactividad en el control se toma como el 100% del valor de hibridización

Valores relativos de formación de duplexos

ADN-ADN ADN-ARNr

P. acidovorans / P. acidovorans 100 100

P. acidovorans / P. testosteroni 33 92

P. acidovorans / P .delafieldii 0 89

P. acidovorans / P. facilis 0 87

P. acidovorans / P. saccharophila 0 79

Valores relativos de formación de duplexos

Árbol filogenético universal

Este árbol filogenético fue obtenido a partir de la secuenciación del rRNA. Los datos apoyan una separación en tres dominios, dos de los cuales, Bacteria y Archaea, contienen solo representantes procarióticos. La localización marcada en rojo es la raíz del árbol y representa la posición del ancestro universal de todas las células.

Principales características diferenciales entre los dominios Bacteria, Archaea y Eukarya

Característica Bacteria Archaea Eukarya

Estructura celular procariota Si Si No

DNA circular Si Si No

Membrana nuclear Ausente Ausente Presente

Acido murámico de la pared celular Presente Ausente Ausente

Lípidos de membrana Uniones éster Uniones éter Uniones éter

Ribosomas 70S 70S 80S

tRNA iniciadorFormil-

metioninaMetionina Metionina

Sensibilidad a Chl, Sm, Kn Si No No

Metanogénesis No Si No

Reducción de Sº a H2S Si Si No

Nitrificación Si No No

Desnitrificación Si Si No

Fijación de nitrógeno Si Si No

Clorofila en la fotosíntesis Si No Si

Quimiolitotrofía (Fe, S, H2) Si Si No

Gránulos de PHB Si Si No

Clasificación taxonómica y filogenética

Análisis fenotípicos

y genotípicos

AnálisisGenotípicos(Evolución)

Taxonomía vs. Filogenia

Identificación Nomenclatura

TaxonomíaEs la ciencia de la clasificación

Determinar el grupo al que pertenece un aislamiento particular

Asignar un nombre a un grupo taxonómico

Subdisciplinas principales

Clasificación taxonómica

Clasificación y concepto de especie

En microbiología la unidad taxonómica básica es la especie

Especie Género Familia Orden

División Dominio Clase

Cepa: Poblacional clonal originada en un único individuo

Especie?

Nomenclatura

Sistema binomial Especie: Nombre del género + epiteto

Escherichia coli E. coli

Bacillus subtilis B. subtilis

Aspergillus niger A.niger

Un cultivo puro de una especie nueva debe depositarse en

ATCC: American Type Culture Collection

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

Los cultivos se mantienen liofilizados o congelados a –140º en 20% glicerol

Colecciones mundiales de cultivos puros

Clasif icación microbiana

Taxonomía clásica

Taxonomía numérica

Taxonomía genética o molecular

Taxonomía clásica o numérica

Algunas características fenotípicas de valor taxonómico

MorfologíaTinción de GramTipo de nutrición: fototrofía, quimiotrofíaEstructura química de la pared celularPresencia de inclusiones celulares y acumulación de productos de reservaEstructura química de la cápsulaCapacidad para usar diferentes fuentes de carbono, nitrógeno, azufreProductos de la fermentaciónRequerimientos y tolerancias a los gases, temperatura, pHSensibilidad a antibióticosPatogenicidadRelaciones simbióticasCaracterísticas inmunológicasHabitat

Reacción de GramObtención d e un

cultivo puro

Aislamiento de una bacteria del intestino de animales de sangre

caliente

Gram negativo Gram positivo

Forma de bastón

Otra forma

Aerobio estrictoAerobio facultativo

Fermenta lactosa con ácido y gas

No fermenta lactosa

Pruebas bioquímicas típicas de E.coli Escherichia coli

Metodología utilizada para identificar una nueva bacteria entérica

Taxonomía numérica y agrupamiento jerárquico

Coeficiente de similitud a

a + b +cS =

Se comparan muchas características de dos microorganismos, 1 y 2, con igual peso cada una

a: Nº de características positivas en los dos microorganismosb: Nº de características positivas en 1 y negativas en 2c: Nº de características positivas en 2 y negativas en 1

Agrupamiento de acuerdo al porcentaje de similitud

Resultados del agrupamiento

1 grupo2 grupos 2 grupos2 grupos2 grupos1 grupo

1,3 1,3 2,5 1,3,4 2,5 1,3,4 2,5 1,3,4 2,5 1,3,4,2,5

908070605040

5 grupos 1,1 2,2 3,3 4,4 5,5100

Número de grupos

Agrupamiento% similitud

Construcción de una matriz de similitud

Construcción de dendrogramas

Dendrograma100908070605040

1 3 4 2 5

Agrupamiento

% similitud

• Se examina un gran número de características fenotípicas de las bacterias 1, 2, 3, 4 y 5. Las similitudes entre las bacterias analizadas se expresan como porcentajes en una matriz de similitud

• Las bacterias que se parecen son agrupadas

El producto de los análisis de agrupamiento se expresan como dendrogramas.

Bibliografía

Brock Biología de los Microorganismos. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. (2000). Editorial Prentice Hall. New York, USA

Biology of the Prokaryotes. Lengerer JW, Drews G, Schlegel HG. (1999). Editorial Thieme NY.

Microbial diversity and ecosystem function. Allsopp D, Colwell RR, Hawksworth DL (1995). Editorial CAB International . Oxon UK.

Hanbook of new bacterial systematics. Goodfellow M, O’Donnell AG. (1993). Editorial Academic Press, Orlando FL.