• MICOBACTERIAS

• Es un grupo de varias especies que conforman la familia Mycobacteriaceae.

• Se caracterizan por contener ácidos micólicos en su pared. (ácidos grasos largos y ramificados)

• La familia Mycobacteriaceae tiene al géneroMycobacterium , con mas de 50 especies.

• De estas son patógenos Mycobacteriumtuberculosis, Mycobacteriumleprae, Mycobacterium bovis.

• Desde el punto de vista clínico, las micobacteriaspueden agruparse en tres grupos:

– Especies que nunca son patógenas.

– Especies saprófitas que pueden convertirse enpatógenas (micobacterias atípicas).

– Especies que siempre son patógenas y producentuberculosis humana y lepra.

• En base a 2 parámetros:

• 1·-Velocidad de crecimiento:– distinguimos mycobacterium de crecimiento rápido(aparecen en el

cultivo antes de 1 semana)

– y crecedores lentos (tardan más de 1 semana).

• 2·- Formación de pigmentos:– Escotocromógenos: forman pigmentos en ausencia de luz.

– Fotocromógenos: forman pigmentos en presencia de luz. Pigmentoamarillo

– No cromógenos: no forman pigmentos .

CLASIFICACIÓN• Lentos

o No cromógenos M. tuberculosis M. bovis M. africanum M. ulcerans M. avium M. intracelulare

o Escotocromógenos M. scrofulaceum

o Fotocromógenos M. kansasii M. marinum

• Rápidoso No cromógenos

M. fortuitum M. chelonae

• Bacilos aerobios que no forman esporas

• De 1 a 10μm de longitud

• Acido-alcohol resistentes

• Con la tinción de Ziehl-Neelsen y la de Kinyoun.– Una vez teñidos, no se decoloran con una solución de alcohol etílico al

95% con ácido clorhídrico al 3%.

COMPONENTES DE LA PARED CELULAR

Esta pared consta de cuatro capas: la más interna es elpeptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina yácido N-glucolilmurámico con cadenas cortas de alanina oglicina en el caso de M. leprae. Esta capa da rigidez y forma ala bacteria.

La segunda posee arabinogalactanos que se encuentranunidos a los ácidos micólicos de la tercera capa. Se trata deácidos grasos de cadena larga (60-90 átomos de carbono) degran importancia taxonómica.

• La capa más externa se encuentra constituida por lípidos como el cordon factor (trehalosa 6,6’-dimicolato) y por mucósidos.

• En conjunto, esta composición de la pared le confiere a la micobacteria una escasa permeabilidad celular, que es responsable, entre otras cosas, de la ineficacia de múltiples agentes antimicrobianos, así como de la característica ácido-alcohol resistencia con determinadas tinciones para su visualización microscópica.

• Además, determinados componentes de la pared, como el lipoarabinomanano, intervienen en la patogenia y favorecen la supervivencia del microorganismo en el interior de los macrófagos.

• Las micobacterias son bacilos rectos o ligeramentecurvados. Son inmóviles y no esporulados.

• Con la tinción de Gram no se tiñen o se comportan como Gram positivos débiles. (Las bacterias gram positivas son de color violeta y las gram negativas de coloración rosa.)

• La presencia de ácido micólico en su pared les confiere unaresistencia a la solución de alcohol ácido que losdiferencia del resto de las bacterias.

• Aprovechando esta propiedad se desarrolló una tinciónespecífica para bacterias ácido alcohol resistentes.

• Con la tinción de Ziehl-Neelsen las micobacterias seobservan como bacilos de color rojo. Aparecenindividualmente o formando pequeños grupos.

• Otras tinciones utilizadas para poner de manifiesto estosmicroorganismos son la tinción de Kinyoun, la de Tan-Thiam-Hok o la tinción fluorescente de auramina-rodamina.

• Es la realización de una tinción AAR a partir de un frotis deuna muestra biológica, generalmente esputos. Utilidades:1·- Diagnóstico de presunción de tuberculosis

2·- Seguimiento de un paciente tratado con antituberculosos, de estemodo podemos observar en que momento se negativiza latuberculosis.

3·- Confirmar que los aislamientos obtenidos de un cultivo son AAR

Un buen diagnóstico depende de un buen frotis.

Condiciones que debe reunir un frotis(esputo):

• Seleccionar aquellas partes purulentas

• Utilizar un porta limpio y perfectamente desengrasado.

• La extensión ni demasiado gruesas ni demasiado fina.

• Dejar secar durante 30 minutos en ambiente cálido.

• Tinción AAR: son 3 principalmente:

Tinción AAR: son 3 principalmente:– Zielh-Neelsen:Colorante: fucsina fenicadaContra-colorante: azul de

metileno (objetivo de inmersión)

– KinyounColorante: fucsina fenicadaContra-colorante: verdemalaquita (rosa fondo verde) (100X)

– Auramina-rodamina: Colorante: fluorocromo Contra-colorante:permanganato potásico. Hace falta un microscopio de fluorescenciapar ver el resultado

• Método directo y rápido (24 hrs), es útil para detectar la presencia debacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en una muestra clínica.

• Fundamento: se utiliza para diferenciar BAAR es decir, algunasbacterias poseen en su pared celular (acido micólico) ciertos lípidosque le confieren la propiedad de resistir la decoloración con ácido –alcohol.

• Esta tinción requiere un calentamiento para que el coloranteatraviese la pared bacteriana. Los microorganismos que resisten lacoloración son:

– micobacterias, actinomicetos y nocardia.

• La acción del calor, introducido en este método, hace quela misma se permeabilice y haga accesible la penetraciónde la fucsina, tiñéndose la pared celular.

• Al normalizarse la temperatura de la preparación, elcompuesto lipidico impermeabiliza la pared a la accióndel decolorante ácido, con lo cual el microorganismo semantiene teñido.

• El resto de las especies, así como las células epiteliales yotros artefactos, que no disponen de ácido micólico en supared o membrana, son decolorados, después de teñidospor la fucsina

TÉCNICA

Hacer un frotis a partir de la cepa

Fijar al calor (emplea el calor como mordiente )(* La función del mordiente es favorecer la fijación del colorante)

1. Recubrir el frotis con el colorante de Ziehl (Fucsina básica), colocarlo sobre la tela de asbesto

2. Calentar cuidadosamente en el mechero hasta que la solución emita vapores (procurando que hierva pero no se evapore, si esto sucede adicionar mas colorante) durante 8 minutos.

3. Lavar el frotis en el chorro de agua

4. Decolorar con alcohol-ácido y lavar nuevamente

5. Cubrir con solución acuosa de azul de metileno (colorante de contraste) al 0.3%. Durante 30 segundos; lavar al chorro de agua y dejar secar

6. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

7. Los bacilos ácido- alcohol resistentes deben observarse de una coloración roja.

• Fundamento: Las paredes celulares lipídicas, de las micobacterias poseen una característica única, es la gran afinidad y fijación del colorante carbofuccina. Esta fijación es tan fuerte que resiste el desteñido con intensos agentes decolorantes como alcoholes y ácidos fuertes.

• La tinción de Kinyoun permite teñir las bacterias ácido-alcohol resistentes sin tener que calentar a la llama la preparación (tinción fría).

• Se utiliza un reactivo especial que además de fuscina agrega un ↑ [Fenol]. El fenol disuelve los lípidos de las paredes celulares permitiendo que el colorante frio entre en contacto con los ácidos carboxílicos y forme el complejo ácido-alcohol resistente.

• Esta técnica permite obtener resultados diferenciales ya que no es posible la decoloración en caliente.

• TÉCNICA:

• 1º Extensión.

• 2º Fijación en llama(preferiblemente).

• 3º Cubrir la muestra con solución de Kinyoun durante 3 minutos.

• 4º Lavar con agua corriente durante 30 segundos.

• 5º Cubrir con solución de Gabett (solución contra el colorante de Kinyoun) durante 1 minuto.

• 6º Lavar con agua corriente y secar.

• 7º Observar al m/o con objetivo de inmersión.

• INTERPRETACIÓN:

Observar la preparación al microscopio, empleando objetivo de 100x de inmersión. Las bacterias ácido alcohol resistentes se observan de color rojo sobre fondo de color azul oscuro

• Fundamento: Tanto la Auramina como la Rodamina son dos fluorocromos (es un componente de una molécula que hace que ésta sea fluorescente) que tiñen microorganismos.

• En las micobacterias se fijan sobre los ácidos micolicos de la pared diferenciándolas, por lo que en la investigación de estas bacterias es una técnica principal. Además se aplica un colorante de contraste no fluorescente con el fin de ejercer un papel de campo oscuro.

• Técnica:

1. Extender, secar y fijar.

2. Teñir con Auramina-Rodamina a temperatura ambiente (37ºC) durante 15 minutos.

3. Lavar con agua destilada.

4. Decolorar con alcohol clorhídrico durante 2-3 minutos y después lavar con agua destilada.

5. Contrastar durante 2-4 minutos con colorante de contraste, ya que tiempos mayores originan perdidas de brillo. El contraste reduce la posibilidad de artefactos.

6. Lavar, secar y observar al microscópio con objetivo de 40x.

• Resultado e interpretación: En los microorganismos se verán puntos amarillos-verdosos brillantes.

• Observaciones al método: Es una tinción equivalente a la de los B.A.A.R.

• No obstante debe utilizarse una tinción B.A.A.R de Ziehl-Nielsen para confirmar su prueba.

• Este método tiene la ventaja sobre el anterior de que no es necesario el calentamiento de la preparación.

• Las mycobacterium son muy exigentes para el cultivo, lo queimplica que prefieren medios no selectivos y mediosenriquecidos. La clasificación de los medios es:

• Medios selectivos:o Medio selectivo 7H11 (Mitchinson). Contiene mycobactosel

• Medios no selectivos:o Base de huevo: Lowestein-Jensen Este medio se utiliza para el cultivo

de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita para inhibirparcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza comosustancia de enriquecimiento.

o Base de agar: Middlebrook 7H10, 7H11 (permite detectarrápidamente) contiene varias sales inorgánicas que proporcionansustancias esenciales para el crecimiento de micobacterias.

o Líquidos: caldo 7H9, Dubos

• Medios diferenciales:o Medio PNB

o Medio sólido de Sauton (mycobacterium atípicos)

o Medio sólido TB

• Medios de cultivo radiométricos = bactec TB: tienenuna fuente de carbono marcada radiactivamente (emitenradiación). Hay carbono radiactivo si la bacteria lo utilizaluego va a emitir radiación y esta se mide con radiómetro.

• PRUEBAS BIOQUÍMICAS MÁS UTILIZADAS:• Test de la niacina ó ácido nicotínico: sirve para comprobar la

producción de niacina por parte de las mycobacterium en menor ómayor cantidad el mycobacterium tuberculoso es el que más produce.

• Reducción de nitratos: sirve para comprobar la presencia de nitrato reductasa.

• Prueba de la catalasa : hidroliza el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2). A excepción de algunas mycobacterium tuberculosas todas las mycobacterium son positivas a la catalasa.Hay 2 formas de realizar esta prueba:

– Catalasa semi-cuantitativa: medir la altura que alcanzan las burbujas cuando están en un tubo.

– Catalasa a 68ºC: los mycobacterium tiene 2 tipos de catalasas: termoestables(mantiene) y termolábil (destruye).A 68°C se destruye, entonces aquellas especies de mycobacterium que sólo tengan catalasa termolábil van a perder la positividad de la prueba. Los que tengan los 2 tipos son catalasa positivas.

• La cátalas termolábil la tienen: M. Tuberculosis, M. Bovis, M. Africanum.

• Hidrólisis del Tween80 (detergente): lo que se ve es si elmycobacterium tiene capacidad de hidrolizar con estedetergente. Dan positivas las escotocromógenas y lasnocromógenas de crecimiento lento no patógenas.

• Test de la arilsulfatasa

• Reducción de telurito: se comprueba si producen una sal de telurito potásica, que es incolora, se ve si la reducen a telurito metálico que es de color negro. Tarda en verse 3-4 días

• Inhibición del crecimiento por la hidracida del ácido tiofeno-2-carboxílico (TCH).

• La prueba tuberculínica es una reacción cutánea de hipersensibilidadque indica la existencia de infección tuberculosa previa. La prueba selleva a cabo con un extracto proteico purificado (PPD) deMycobacterium tuberculosis.

• Se usa el lote RT-23 del PPD, que debe administrarse por víaintradérmica (intradermorreacción de Mantoux) aplicando en la caraanterior del brazo 0,1 ml que contienen 2 unidades de PPD RT-23, queson equivalentes a 5 unidades del antígeno de referencia (denominadoPPD-S).

• Las reacciones deben leerse midiendo el diámetro transverso de lazona de induración a las 48-72 horas. Se ha recomendado que laprueba se considere positiva a partir de 5 mm.

• Conviene recordar que la prueba tuberculínica puede ser positiva si elpaciente ha tenido contacto con otras micobacterias no tuberculosas.Por ello, en los países con una alta incidencia de otras micobacteriosis,para considerar que un paciente ha tenido contacto con M.Tuberculosis se exigirá un mayor tamaño de la prueba tuberculínica.

• Los métodos más modernos utilizan la genética. De este tipo tenemos:

• Sondas genéticas: ponen en contacto la bacteria con una sonda de ADN marcada radiactivamente o marcada con compuestos quimioluminiscentes.

• PCR (reacción en cadena de la polimerasa): permite amplificar una secuencia de ADN para después detectarle.

• Análisis cromatográfico de los lípidos de la pared: permite conocer la composición lipídica de la pared y sabiendo éste sabemos de que bacteria se trata. Es un método rápido (2horas), específico y muy reproducible.

• Con la presencia de las coinfecciones de TB/SIDA y TB/Diabetes han aumentado las micobacterias no tuberculosas como causantes de enfermedad y éstas son resistentes a los medicamentos contra la tuberculosis.

A) PRUEBA DE NIACINA• Fundamento: Aunque todas las micobacterias producen algo de niacina

(ac. nicotínico), sólo el M. tuberculosis la produce y acumula en gran cantidad. Es una prueba básica para hacer la diferenciación de M. tuberculosis y M. bovis de otras micobacterias.

B) PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS• Fundamento: Algunas micobacterias (entre ellas M. tuberculosis)

utilizan nitratos como fuentes de nitrógeno, reemplazando a las sales de amonio y reduciéndolos a nitritos. Se detecta la presencia de nitritos cuando se forma un colorante rojo de diazonio.

C) PRUEBA DE LA CATALASA A TEMPERATURA AMBIENTE Y A 68°C.

• Todas las micobacterias, excepto las mutantes isoniacida-resistentesde M.tuberculosis y M. gastri, sintetizan catalasa en mayor o menor cantidad.Esta prueba permite diferenciar el Complejo M. tuberculosis de las otrasmicobacterias.

• Fundamento: Los organismos que producen la enzima catalasa, tienen lacapacidad de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre.

Se inhalan los bacilos, que llegan a los bronquios y alvéolos.

En la primoinfección, los bacilos de la tuberculosis se multiplican, y losmacrófagos son atraídos por respuesta del huésped con factoresquimiotácticos y la proteína quimiotáctica de monocitos; también seatraen linfocitos T mediante la interleucina 8.

Los bacilos entran a los macrófagos,donde se multiplican y sobrevivengracias al factor cordón (trealosa 6,6dimicolato), que permite el desarrollo delorganismo en agregados laterales de lafusión de los lisosomas con losfagosomas.

Los bacilos destruyen al macrófagoinfectado y se liberan al espacioextracelular, donde nuevamente sonfagocitados, y durante estos ciclos sediseminan de forma directa a los ganglioslinfaticos, en particular mediastinales ehiliares

(está situado en el hilio, lugar donde los bronquios se separanpara introducirse en los pulmones. Es la parte de la cara internapulmonar por donde penetran los bronquios, los nervios yvasos pulmonares constituyendo el PEDÍCULO PULMONAR. )

Las lesiones tisulares caracteristicas sonlos tuberculos, que son granulomas, quese forman ante el estímulo del factorcordón.

Los bacilos, al instalarse en los tejidos, seponen en contacto con los linfocitos,previamente “preparados” por losmacrofagos, y de esta manera se activa alas clonas que tienen los receptores demembrana para los inmunogenos delbacilo.

Las colonias de bacilos son rodeadas porcélulas epiteloides que se fusionan yoriginan las células gigantespolinucleadas, éstas son envueltas poracúmulos de linfocitos y así vanconstituyendo el túberculo.

Cuando aparece la respuesta inmune celular,entre las tres y diez semanas después delinicio de la infección, esta respuesta, juntocon los fosfolípidos de la pared, ocasionanque el centro del tubercúlo se desmorone yadquiera la apariencia de “queso” , procesollamado caseificación , donde songeneralmente esterilizados los focos deinfección.Si la lesion caseosa se drena en los bronquios,es aspirada y se distribuye a otras partes delpulmón o al estomago.El complejo de la pared suprime la actividadde las celulas T, induce la secreción del factorde necrosis tisular alfa e inhibe la activaciónde macrofagos.Los linfocitos CD4+ intervienen en laresistencia a la infección, por secreción deinterferón gamma e interleucinas.

Los linfocitos T citotoxicos y las células asesinasnaturales matan a los macrofagós y a losmonocitos infectados.

La recuperación clínica es evidente, pero losbácilos que se localizan en los vérticespulmonares permanecen latentes en el 95% delos casos durante toda la vida.En el 5% restante, pueden ocasionar unareactivación, que se caracteriza por lesionescrónicas tisulares, la formación de tubérculos encada foco ectópico, caseificación y fibrosis.• La reactivación generalmente ocurre en el

vértice pulmonar, donde la tensión de oxígeno (la cantidad de oxigeno que esta presente y que

ejerce una presión en el lugar en donde esté.) es mayor, ya que Mycobacterium tuberculosis es anaerobio estricto.

El ser humano constituye el único reservorio natural.

La desnutrición es el factor de mayor importancia en el desarrollo del padecimiento.

La enfermedad se transmite por contacto estrecho de una persona con otra mediante la inhalación de aerosoles infecciosos.

Las partículas grandes quedan atrapadas en las superficies mucosas y son eliminadas por la acción de los cilios del árbol respiratorio. Sin embargo, las partículas pequeñas que contienen uno a tres bacilos tuberculosos pueden llegar hasta los alvéolos y comenzar una infección.

Un tercio de la población mundial está infectada por este microorganismo

Hay 8,8 millones de casos cada año y 2 millones de muertes esta enfermedad es más frecuente en el sudeste asiático, África subsahariana y el este de Europa

Los grupos de población con riesgo elevado de enfermedad por M. tuberculosis son las personas «sin techo», los alcohólicos, los drogadictos, los reclusos y los individuos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Los pacientes que reciben un tratamiento

inadecuado pueden constituir un foco de infección durante periodos de tiempo prolongados

Son las lesiones que se producen por la colonización del bacilo en los pulmones, lo que da lugar a una neumonitis y a la diseminación del agente a los ganglios linfáticos al hilio pulmonar, junto con el desarrollo de un nódulo llamado Ghön.

El paciente generalmente presenta:

Fiebre, generalmente por las tardes o por las noches.

Anorexia

Astenia y diaforesis vespertina

Debilidad

Disnea

Perdida de peso progresiva

Tos productiva con esputo purulento, mucosanguinolento o sanguinolento.

Es "diseminada" si se ha extendido desde los pulmones a otros órganos del cuerpo por medio de la sangre o el sistema linfático.

Generalmente se presenta: Sudoración Fatiga Inquietud o indisposición Pérdida de peso Tos Dificultad respiratoria Fiebre

Palidez

Dolor articular

Escalofríos

Glándulas inflamadas

Inflamación abdominal

Prueba cutánea de tuberculina y prueba QuantiFERON-TB son indicadores sensibles de la exposición al microorganismo.

La microscopía y el cultivo son sensibles y específicos

la detección directa mediante sondas moleculares es relativamente insensible

la identificación se basa con mayor frecuencia en la utilización de sondas moleculares específicas de especie.

• Se necesitan pautas con múltiples fármacos y cursos de tratamiento prolongados para prevenir la aparición de cepas resistentes a fármacos

• Isoniacida (INH), etambutol, piracinamida y rifampicina durante 2 meses seguidos de 4 a 6 meses de INH y rifampicina u otras combinaciones alternativas de antimicrobianos.

• La profilaxis de la exposición a la tuberculosis puede incluir INH durante 9 meses, rifampicinadurante 4 meses, o rifampicina y piracinamidadurante 2 meses, la piracinamida y el etambutol o el levofloxacino se utilizan durante 12 meses después de estar expuesto a M. tuberculosis multirresistente.

• Se hace profilaxis con BCG en los países endémicos

• El control de la enfermedad se hace con vigilancia activa, medidas profilácticas y terapéuticas y un control exhaustivo de cada caso

• Murray R. Patrick, Microbiología Clínica. EspañaMadrid 5ed : Elsevier , 2006

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• Romero Cabello Raúl, Microbiología y parasitologíahumana: bases etiológicas de las enfermedadesinfecciosas y parasitarias. 3ed, México: EditorialMédica Panamericana, 2007.

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