1

Kreatin kinaza - analitika

Predavanja iz Kliničke enzimologije

Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska biohemija

Školska 2013/2014. godina

2

Analitika CK

• Određivanje aktivnosti ukupne CK

• Određivanje izoenzima CK-MB

• Separacija izoenzima CK

– hromatografske metode

– elektroforetsko razdvajanje

– imunohemijske metode

• Rutinske metode određivanja CK-MB

– imunoinhibicija – određivanje aktivnosti CK MB

– Imunohemijske metode određivanje masene koncentracije CK-MB

• Separacija izoformi CK

3

Metode određivanja aktivnosti CK

• Metode: fotometrijske, fluorimetrijske i kuplovane

• Komercijalni testovi koriste kreatin-fosfat kao supstrat

• Oliver, Rozalki:

– cAMP za inhibiciju AK; cistein

• Szasz-ova metoda

• Referentna metoda po IFCC na 37o C

339 nm

4

Određivanje aktivnosti ukupne CK

• Optimizirana metoda određivanja aktivnosti ukupne

CK po IFCC

• Szazsova metoda CK-NAC

– Supstrat: kreatin fosfat

– Povratna reakcija

– pH 6,7

• Uloga Mg jona

• Zaštita SH grupa

• Dodatak NAC N-acetilcisteina

5

Preanalitičke varijacije CK

• Uzorak

– Serum ili heparinizirana plazma

– Drugi antikoagulansi se ne mogu koristiti jer inhibiraju CK

• Stabilnost

– CK u serumu je nestabilna

– 8 sati na ts, 48 sati na 40o C i 1 mesec na -20o C

– Za duže čuvanje na -80o C

– Dodatak NAC i EDTA u reagens-rastvoru reaktivira enzim

• Interferencije

• Uticaj hemolize

– Jak uticaj i slabe hemolize

– Umerena i jaka hemoliza interferira zbog prisustva ATP, G-6-P i

AK u eritrocitima

– Utiču na produženje lag faze i na neželjene reakcije

6

Interferencije u metodi određivanja aktivnosti

ukupne CK

1.Uticaj hemolize

• interferencija adenilat kinaze iz eritrocita

• 2ADP AMP + ATP

• Uklanjanje interferencije

– dodatak inhibitora AK adenozin pentafosfat A5P

2. Interferencija makro formi

• Uklanjanje interferencije

– zagrevanjem jer su one termolabilne

– elektroforetsko razdvajanje

7

Preanalitičke varijacije i referentne

vrednosti za CK

• Uticaj pola, godina, rase, telesna težina, genetika i

fizičke aktivnosti

• Crnci više vrednosti

• Muškarci više vrednosti

– raspodela vrednosti ka višim

RV za IFCC metodu (37o C)

m: 46-171 U/L

Ž: 34-145 U/L

• Bebe imaju više vrednosti pri rođenju zbog traume

skeletnih mišića

• Smanjenje u roku od 6-10 nedelja

8

Referentne vrednosti za CK

• CK aktivnost u serumu normalno odražava

– Uglavnom CK-MM

– Vrlo malo CK-MB

• Uticaj vežbanja i traume mišića

– Povećana aktivnost CK kod fizičke aktivnosti

– Maratonci i CK

– Dobro utrenirani dugoprugaši imaju viši CK-MB

9

Metode separacije i kvantifikacije izoenzima kreatin kinaze

Metode separacije izoenzima

• Hromatografske

• Elektroforetske

• Imunohemijske

Elektroforetske tehnike

• Potporni medijumi: agar, agaroza, celuloza acetat

• Detekcija izoenzima:

• NADPH fluorescentna metoda 360 nm

• NADPH bojena reakcija sa tetrazolijum solima pri čemu nastaje obojeni

formazan

• Denzitometrija fluorimetrije traka izenzima na elferogramu

• Detekcioni limit 2 do 5 U/L

• Detecija abnormalnih traka

10

Elektroforetsko razdvajanje izoenzima i izoformi CK

11

Elektroforetsko razdvajanje izoenzima CK

Denzitometriranje

normalni uzorak 24 sati posle AIM

Dinamika promena izoformi CK-MM kod akutnog

infarkta miokarda

12

Broj sati posle AIM

Odnos izoformi MM3, MM2 i MM1

Porast MM2 posle 6 sati, a MM3 posle 9 sati

Vraćanje na normalu posle 15 sati

13

Određivanje CK-MB imunoinhibicijom

2 faze

I faza

• imunoinhibicija sa antitelima na M subjedinicu

II faza

• Određivanje aktivnosti B subjedinice sa optimiziranom metodom za određivanje aktivnosti ukupne CK po IFCC

Izračunavanje :

• Aktivnost CK-MB = aktivnost B subjedinice x 2

Referentne vrednosti CK-MB:

• < 5 % od ukupne aktivnosti CK

• Interferencija makroformi CK, CK Mt

14

Određivanje masene koncentracije CK-MB

• Nasuprot imunoinhibiciji gde se meri katalitička aktivnost CK-MB,

imunoesej ovde meri masenu koncentraciju CK-MB.

• Metoda koristi sendvič tehniku

– dva antitela

– jedno antitelo je za B subjedinicu

– drugo za M-subjedinicu

• Prvo antitelo je imobilizirano za matriks, a sekundarno je

konjugovano sa enzimom kao markerom

• Metoda je takva da se meri samo CK-MB, a ne ni MM ni BB

• Metode koje mere masu su osetljivije od onih koje mere aktivnost

• Detekcioni limit je 1 μg/L

• Gornja granica RV je 5 μg/L

15

Određivanje masene koncentracije CK-MB

Elisa tehnika

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

anti-CK-B coated tube

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Tagged anti-CK-M

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

POSITIVE

Y Y Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Substrate