Criopreservación de células STEM de pulpa dental humana (DPSCs)

GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.

Munévar Niño JC, Jiménez T, Tamayo MC, Dorta D, Gómez

A, Rodríguez L, Velandia C, Forero J.

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

XVII Congreso Institucional de Investigaciones.

Bogotá, Octubre 27 2010

REGENERACIÓN TISULAR

Gutiérrez Collazos N,

REGENERACION TISULAR & ODONTOLOGIA

REGENERATIVA

Interés en las células Stem debido a

su enorme potencial terapéutico in vivo

Existe un interés científico generado por las aplicaciones terapéuticas

de células Stem mesenquimales adultas en el ser humano debido a:

Lesiones irreversibles de órganos y tejidos

Los productos de Ingeniería Tisular se basan en biomateriales novedosos que

integran células Stem capaces de auto-renovarse o bien de diferenciarse en tipos

celulares específicos. (neuronas, osteoblastos, condrocitos, queratinocitos)

Thirumala S, Goebel W. S, Woods E. Clinical grade adult stem cell banking. Organogenesis. 5: 3. 143 – 54. 2009

Síndromes

Enfermedades crónicas

Neoplasias

Trauma

INJERTOS DE HUESO HUMANO DISEÑADOS

ANATOMICAMENTE POR INGENIERIA

• Auto renovación in vitro / in vivo• Adherentes in vitro

• Potencial de diferenciación in vivo• Reserva celular in vivo

FRIEDENSTEIN A.J y col/1974

Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Ruadkow IA: Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol 1974, 2:83-92

Células Stem

Adultas

Mesenquimales

Medula ósea Tejido adiposo Sangre periférica Sangre de Cordón Umbilical Gelatina de Wharton Placenta Periostio

Ligamento periodontal DPSCs SHEDs SCAPs iPS

Propiedades

Gronthos S. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 y Iohara K J Dent Res. 2004; 83(8):590-5.

Caracterización del fenotipo

Expresión de marcadores

CD105+, CD73+, CD34-, CD45-

SHED

SCAPs

PDLSCs

iPS

Desarrollar óptimos métodos

de cultivo , expansión y

criopreservacion DPSCs

Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Booyde A, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5

Iohara K. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 2004; 83(8):590-5.

INTRODUCCIÓN

Optimizar la seguridad y el control de calidad de los métodos empleadosin vitro con las células Stem para aplicaciones terapéuticas in vivo.

Brandon Perry, Dan Zhou, Xiaohua Wu. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derivded

mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering: Part C. Volume 14, Number 2, 2008.

CRIOPRESERVACION

La criopreservación es el proceso de congelamiento de las células conel fin de reducir su actividad metabólica y mantenerlas a temperaturasreducidas durante tiempos prolongados, preservando al mismo tiempo

su VIABILIDAD, FENOTIPO Y POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN.

Evaluar la viabilidad y fenotipo de células

Stem de pulpa dental humana sometidas a 2

métodos de criopreservación en 3 tiempos

diferentes.

Pacientes

18- 31 años

48 dientes sanos

Premolares y

molares

erupcionados

Sistémicamente sanos

Cultivo

Células CD105+

Consentimiento informadoComité Institucional de Ética

en Investigación

Estudio Experimental in vitro

Sección del diente a nivel UAC

Procedimientos realizados en la Clínica el Bosque

Luego de la exodoncia se sumergió el diente en NaOCl 5% y solución

salina

DMEM suplementado SFB 10%

1. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2. DISGREGACION DE LA PULPA DENTAL

Mecánica Enzimática

Cámara de Neubauer

3. VIABILIDAD CELULAR

Células CD105+

MILTENYI MiniMACS

4. SEPARACIÓN MAGNETICA

NH Stem cell

media

MILTENYI

Biotec

5. Expansión in vitro CD105+

Incubación 37°C, Atmósfera húmeda

5% de CO2, 70% confluencia celular

Papaccio et al/2006

KamathFischer

Scientific

6. CRIOPRESERVACION

P≤0.05

Test T Student U Mann Whitney

7. ANALISIS ESTADISTICO

Control -fibroblastos

Control +C.U.H.

Protocolos de criopreservación

Método de Papaccio y col/2006Método de Kamath, A.

(SC Protocol Sheet: 00007 Thermo Fisher Scientific.Cellular engineering technologies, Inc.)

Desprenden las DPSCs de la monocapa con EDTA 0.02% en PBS

Retiro de monocapa se lava con PBS 10ml/75cm2

Conteo celular en hemocitometro Se agrega 5 ml de solución de Tripsina 0,5% (SH30042.01) Thermo Scientific HyClone

Se deposita la suspensión celular en solución de criopreservacion DMSO 10% en SFB

Incubación enzimática a 37ºC por 5 minutos

Se deposita la suspensión celular en un criovial 4ºC durante 2hrs, luego a -70ºC por 16 hrs,

Se agrega 5ml NH CFU-F y se centrifuga a 200rpm por 10 minutos

Finalmente -196ºC en nitrógeno líquido hasta el proceso de descongelación

Conteo celular en hemocitometro

Se deposita la suspensión celular en solución de criopreservación DMSO 10%, SFB 70% y 20% NH CFU-F

en nitrógeno líquido -196oC

PROTOCOLO DE DESCONGELACIÓN

Retiro de criovial DPSCs que se encontraba a

-196ºC en tanques de nitrógeno liquido

Se deposito el criovial al baño maría bajo

agitación moderada

Bajo la cabina de flujo laminar se abrió cada criovial para

transferir el contenido en tubos Falcon de 15 ml

Se agregó 10 ml de solución de descongelamiento

precalentada a la suspensión celular obtenida.

La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino y 20% de NH Expansion Medium. Se

centrifugó a 200 g durante 10 minutos la suspensión celular obtenida.

Se retiró el sobrenadante para resuspender el pellet en 5 ml de medio de cultivo NH Expansion Medium y así realizar

la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad y fenotipo de las DPSCs mediante citometría de flujo.

CITOMETRÍA DE FLUJO

EVALUACIÓN DE LA PRESERVACIÓN DEL FENOTIPO Y VIABILIDAD POST CRIOPRESERVACIÓN

(FACS CANTO II Becton & Dickinson)

Evaluación de la viabilidad mediante

exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D)

Fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la

suspensión de células DPSCs sometidas a 2

procesos distintos de criopreservación en 3

tiempos diferentes.

Marcaje fue leído en citómetro de flujo en U.I.B.O. reportando cada dato

como porcentaje para cada marcador en cada condición.

DATOS DESCRIPTIVOS DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

VARIABLES PROMEDIO*/ FRECUENCIA DS* / %**

Edad del paciente* n= 20 21 años +5.39 años*

Tiempo de obtención de la muestra* 78` + 47.02`*

Tiempo de procesamiento de la muestra* 197` + 41.91`*

Tipo de diente

Premolares 13 27%**

3ºs molares erupcionados 30 62,5%**

3ºs molares incluidos 5 10,4%**

Total de dientes 48 100%

*DS / **%

Microscopia De Contraste De Fase

Expansión in vitro

Morfología in vitro de células Stem de pulpa dental. 40x

Unidades Formadora de Colonias (DPSCs). 10x

Morfología in vitro de fibroblastos de la pulpa dental humana.

10 x

MSC de Cordón Umbilical in vitro. 10x

Citometría de flujo

Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservaciónEvaluación Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación

Inmunofenotipificación

0.0%

10.0%

20.0%

30.0%

40.0%

50.0%

60.0%

70.0%

80.0%

90.0%

100.0%

PO

RC

ENTA

JE E

XP

RES

IÓN

MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL

FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN PAPACCIO

24 HORAS

7 DIAS

1 MES

Porcentaje De Expresión De Marcadores de DPSCs Mediante Citometría De Flujo

0.0%

10.0%

20.0%

30.0%

40.0%

50.0%

60.0%

70.0%

80.0%

90.0%

100.0%

PO

RC

ENTA

JE E

XP

RES

IÓN

MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL

FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN KAMATH

24 HORAS

7 DIAS

1 MES

94.9%

97.3%

99.9%

98.1%

Fenotipo De Células Stem De Pulpa Dental Humana Por Citometría De Flujo

p≤0.05 p≤0.05

Zhang W, Walboomers XF, Shi S, Fan M, Jansen JA. Multilineage differentiation potential of stem cells derived from humandental pulp after cryopreservation. Tissue Eng. 2006 Oct; 12(10):2813-23.

Estudios recientes describen métodos de caracterización,aislamiento y cultivo celular de DPSCs, pero no analizan factoresrelevantes sobre la efectividad de la criopreservación, como lospresentados en este estudio

Gronthos et al/2000. PNAS Miura et al/2003. PNAS.

Papaccio et al/2006.

J Cell Physiol.

Iohara et al/ 2006.

Stem Cells.

Perry et al/2008.

Tissue Eng Methods.

Woods et al/ 2009.

Cryobiology

Woods EJ, Perry BC, Hockema J, Larson L, Zhou D, Goebe W, et al. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues. Elseiver. Cryobiology. 2009; 59(2): 150-157.

Woods y col/2009Cryobiology

Nuestro estudio

1 semana, 1 mes, 6 meses

1 día, 1 semana, 1 mes

TIEMPO DE CRIOPRESERVACIÓN

Estudio original e interesante para la biología de las DPSCs, es la primera vezque se comparan dos métodos de criopreservación reportados en laliteratura científica mundial:

El método de Papaccio y el método de Kamath.

DISCUSIÓN

DISCUSIÓN

METODOLOGÍA

Disgregación mecánica / enzimática, procedimiento previo a

la criopreservación semejante al empleado por Perry et al/2008.

Seo et al/2005, criopreservación realizada directamente sin antes

disgregar el tejido.

Seo BM., Miura M, Sonoyama W, Coppe C, Stanyon R, Shi S, et al. Recovery of Stem Cells from CryopreservedPeriodontal Ligament. J Dent Res. 2005; 84(10): 907-912.

DISCUSIÓN

La Disgregación enzimática posiblemente afecte los resultados, Woods etal/2009, quienes reportan en su estudio que es probable que el tejidopulpar digerido comprometa la integridad de la superficie de lasmembranas celulares.

La disociación enzimática produce stressen las membranas y potencialmentepueden predisponer a crio lesiones leves.

Papaccio G, Graziano A, d'Aquino R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, De Rosa A, Carinci F, Laino G. J Cell Physiol. Long-term cryopreserva-tion of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair. 2006 Aug; 208(2):319-25.

DISCUSIÓN

CULTIVO CELULAR

En nuestro estudio DPSCs presentaron morfología

estrellada, diámetro mayor al de los fibroblastos,

núcleo esférico definido y no se observaron

refringentes.

Polisetty et al/2008, las células cultivadas tienen lacapacidad para la formación de CFU que puedeaumentar o disminuir con los números de pasajes.

En algunos pozos se observó la formación deUnidades Formadoras de Colonias (CFU-F)

Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Mol Vis.2008; 14: 431-442.

Nu

est

ro e

stu

dio •CITOMETRIA DE FLUJO

• Viabilidad exclusión 7-AAD

• Fenotipo D105+/CD73+/CD34-/CD45-

• 2 métodos decriopreservación en 3 tiempos.

Tem

me

rma

ne

t a

l/2

01

0

• Evalúa la viabilidad defibroblastos de pulpa dentalhumana de acuerdo alporcentaje de confluenciaalcanzado en el primerpasaje.

• No evalúan el fenotipocelular con sus respectivosmarcadores.

Viabilidad y Fenotipo

La criopreservación podría modificar la configuración espacial de la proteínade membrana celular comprometiendo su detección por citometría de flujo o

bien quizás afecta su estadio de diferenciación celular.

Temmerman L, Beele H, Dermaut LR, Van Maele G, De Pauw GA. Influence of cryopreservation on the pulpal tissue of immature third molars in vitro. Cell Tissue Bank. 2010 Aug;11(3):281-9.

Las células Stem mesenquimales aisladas de pulpa dental, pueden sercriopreservadas manteniendo la viabilidad celular y sus propiedadesbiológicas, lo que genera posibilidades para la creación de un bancode células Stem de pulpa dental (DPSC).

Los resultados demuestran que según el método de congelación

empleado se modifica la expresión de los marcadores que

caracterizan el fenotipo de las DPSCs.

Emplear marcadores específicos (STRO-1, CD 146,, CD105,

CD73, CD90, CD34, CD45) que caractericen el fenotipo de las

DPSCs establecidos por las sociedades científicas de células

Stem para un próximo estudio.

Usar reactivos humanos libres de proteína animal para

cultivar, expandir y criopreservar células Stemmesenquimales de pulpa dental para futuras aplicaciones

terapéuticas en la práctica clínica odontológica.

Evaluar a largos tiempos de criopreservación ( ≥1año)con mayores criterios de evaluación.

Evaluar el potencial de regeneración in vivo(animales) después de la criopreservación de DPSCs

¡GRACIAS UIBO!

Agradecimientos

Dra. Andrea Villegas

Dr. Carlos Terán

Dr. Jorge Gruber

Residentes II año

Endodoncia