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Universidad de La SalleCiencia Unisalle
Zootecnia Facultad de Ciencias Agropecuarias
1-1-2017
Criopreservacion de semen caprino utilizandodiferentes concentraciones de glicerol en eldiluyenteDaniel Alejandro Trujillo GarcíaUniversidad de La Salle
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Citación recomendadaTrujillo García, D. A. (2017). Criopreservacion de semen caprino utilizando diferentes concentraciones de glicerol en el diluyente.Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/zootecnia/358
1
CRIOPRESERVACION DE SEMEN CAPRINO UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES
DE GLICEROL EN EL DILUYENTE
Daniel Alejandro Trujillo García
Universidad de La Salle Facultad de Ciencias Agropecuarias
Programa de Zootecnia Bogota, D.C., Colombia
2017
2
CRIO PRESERVACIÓN DE SEMEN CAPRINO UTILIZANDO DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE GLICEROL EN EL DILUYENTE
Daniel Alejandro Trujillo García
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de Zootecnista
Director:
MSc., PhD (e) Nestor Isaías Tovío Luna
Línea de Investigación: Producción Animal
Universidad de La Salle Facultad de Ciencias Agropecuarias
Programa de Zootecnia Bogotá, D.C., Colombia
2017
3
DIRECTIVOS
Rector: Hno. Alberto Prada San Miguel
Vicerrectora Académica: Dra. Carmen Amalia Camacho
Vicerrector de Promoción y Desarrollo Humano: Hno. Diego Andrés Mora
Vicerrector de Investigación y Transferencia: Dr. Luis Fernando Ramírez
Vicerrector Administrativo: Dr. Eduardo Ángel Reyes
Secretaría General de la Universidad de La Salle: Dra. Saray Yaneht Moreno
Decano Facultad de Ciencias Agropecuarias: Hno. Dr. Ariosto Ardila
Secretario Académico: Dr. Alejandro Tobón
Director programa de Zootecnia: Dr. Abelardo Conde Pulgarin
Asistente académico programa de Zootecnia: Dra. María Camila Corredor
4
APROBACIÓN
DIRECTOR DE PROGRAMA
__________________________________________
Dr. Abelardo Conde Pulgarín
ASISTENTE ACADEMICO
_________________________________________
Dra. María Camila Corredor
DIRECTOR TRABAJO
__________________________________________
Dr. Nestor Isaías Tovío Luna
JURADO ____________________________________________
Dr. Cesar Gómez
5
DEDICATORIA
PRINCIPALMENTE A DIOS POR PERMITIRNOS LLEGAR A ESTE MOMENTO TAN
ESPECIAL.
A NUESTROS PADRES PORQUE SON LA RAZÓN DE NUESTRA VIDA, POR TODO
SU AMOR, APOYO Y ENTREGA, POR CADA CONSEJO QUE NOS HICIERON
MEJORES PERSONAS, FORMÁNDONOS CON BUENOS SENTIMIENTOS, HÁBITOS Y
VALORES.
6
AGRADECIMIENTOS
A LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE POR HACERNOS PARTE DE ESTA COMUNIDAD,
POR TODOS LOS CONOCIMIENTOS BRINDADO QUE NOS HICIERON EXCELENTES
PROFESIONALES. A CADA UNO DE NUESTROS PROFESORES POR TODO EL
APORTE DEL CONOCIMIENTO QUE NOS BRINDARON COMO PERSONAS Y
PROFESIONALES.
A NUESTRO DIRECTOR DE TRABAJO DE GRADO NESTOR ISAÍAS TOVÍO LUNA POR
SU CONTRIBUCIÓN EN NUESTRA FORMACIÓN PROFESIONAL Y COMO HUMANOS,
POR SU DEDICACIÓN Y SU ETERNA PACIENCIA POR ESTE PROYECTO.
A LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y DE ZOOTECNIA DE LA
UNIVERSIDAD NACIONAL POR PERMITIR LA VINCULACIÓN EN UN PROYECTO
INVESTIGATIVO.
7
RESUMEN
Se evalúa el efecto de la aplicación de glicerol al 6, 7 y 8% en diluyente para
cripreservcion de semen caprino sobre los porcentajes de recuperación de la
motilidad progresiva individual, vivos y anormalidades espermáticas pos
descongelación. Para esto se utilizo semen de 3 machos adultos de la raza
Saanen en el trópico alto colombiano. En total se congelaron 27 pajillas para
cada uno de los tratamientos (Glicerol al 6, 7, y 8%); es decir, en total se
congelaron 81 muestras. Se presento efecto (P<0.05) del glicerol al 7% sobre
el porcentaje de la recuperación de la motilidad progresiva individual siendo
esta mayor frente al glicerol al 6 y 8%. Se presento efecto (P<0.05) del glicerol
al 7% sobre el porcentaje de vivos siendo esta mayor esta variables frente al
glicerol al 6 y 8%. No se presento efecto (P>0.05) del glicerol sobre el
porcentaje de anormalidades primarias, pero este efecto si se evidencio
(P<0.05) en las anormalidades secundarias y totales observándose menores
porcentajes de estas variables cuando el glicerol se utilizo al 7% frente al
glicerol al 6 y 8%. De acuerdo a lo evidenciado el glicerol afecta el porcentaje
la recuperación de la motilidad progresiva individual, el porcentaje de
espermatozoides vivos, la presencia de anormalidades secundarias y totales.
Palabras clave: Glicerol, espermatozoide, caprino, criopresvacion
8
CONTENIDO
Pág.
Resumen…………………………………………………………………………………...7
Lista de tabla………………………………………………………………………………10
Lista de figuras……………………………………………………………………………11
Lista de Graficas………………………………………………………………………….12
1. IINTRODUCCION (Planteamiento del problema y justificacion) ……….………13
2. Objetivo general………………………………………………………………………………………………………18
2.1. Objetivos especificos………………………………………………………………………………..…………18
3. MARCO TEORICO………………………………………………………………………………………………..…18
3.1. Características del semen caprino……………………………………………18
3.1.1. Plasma Seminal………………………………………………………………………………………………..18
3.1.2. Volumen de Semen………………………………………………………………………………………….20
3.1.3. Espermatozoides caprinos………………………………………………………………………………10
3.1.3.1. Dimensión y morfología espermática………………………………………………………20
3.1.3.2. Motilidad de los Espermatozoides………………………………………………………………22
3.1.3.3. Concentración
Espermática…………………………………………………………………23
3.2. Efectos del proceso de criopreservacion y descongelacion de la célula
espermática………………………………………………………………………………………………………………….23
3.3.
Diluyentes………………………………………………………………………………28
3.3.1. COMPONENTES DE LOS DILUYENTES……………………………….……… 28
3.3.1.1.Crioprotectores………………………………………………………………..29
9
3.3.1.1.1. Glicerol……………………………………………………………………………………………………….30
3.3.1.2. Medios Buffer y Azúcares……………………………………………………………………………32
3.3.1.3. Antibióticos……………………………………………………………………………………………………33
3.3.1.4. Protectores contra el Choque Térmico…………………………………………………….33
4. MATERIALES Y METODOS………………………………………………………………………………33
4.1. Localización…………………………………………………………………………………………………..33
4.2. Grupo experimental………………………………………………………………………………………….34
4.3. preparación de diluyente………………………………………………………………………………….34
4.4. Colectas y procesamiento seminal…………………………………………………………………35
4.4.1. Aplicación de los tratamientos a muestras seminales………………………………36
4.5. Analisis estadistico……………………………………………………………………………………………38
4.5.1. Variables respuesta………………………………………………………………………………………39
5. RESULTADOS Y DISCUSION…………………………………………………………………………39
5.1. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre el
porcentaje motilidad progresiva individual…………………………………………………40
5.2. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre e
porcentaje de espermatozoides vivos…………………………………………………………42
5.3. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre el
porcentaje de anormalidades primarias……………………………………………………43
5.4. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre el
porcentaje de anormalidades secundarias…………………………………………………45
5.5. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre el
porcentaje de anormalidades totales…………………………………………………………..47
6. CONCLUSIONES…………………………………………………………………48
7. RECOMENDACIONES…………………………………………………………..48
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ………………………………………………50
10
Lista de tablas
Tabla 1. Dinámica comparativa poblacional de ovinos y caprinos (millones de
cabezas) ………………………………………………………………………………………………………………………….13
Tabla 2. Producción Anual productos caprinos y ovinos (Toneladas)
………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
Tabla 3. Principales alteraciones observadas en el
eyaculado………………………………………………………………………………………………………………………..20
Tabla 4. Características seminales en fresco por macho y
general…………………………………………………………………………………………………………………………….38
Tabla 5. Variables espermáticas según tratamiento (6, 7 y 8 % de glicerol)
………………………………………………………………………………………………………………………………………….39
11
Lista de Figuras
Figura 1, Anormalidades Espermáticas……………………………………………………………………21
Figura 2. Microarquitectura del medio durante la congelación de semen……………………………………………………………………………………………………………………………….25
Figura 3. Cambios probables en el espermatozoide y el medio durante la
congelación y descongelación de
semen………………………………………………………………………………………28
12
Lista de Graficas
Grafica 1. Comportamiento de la motilidad progresiva individual de las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %)………………………………………………………………………………………….41
Grafica 2. Comportamiento de células espermáticas vivas (%) de acuerdo al
porcentaje de glicerol en el diluyente (tratamientos al 6, 7 y 8
%)……………………………………………………………………………………………………………………………………43
Grafica 3. Comportamiento de las anormalidades primarias en las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %)…………………………………………………………………………………………44
Grafica 4. Comportamiento de las anormalidades secundarias en las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %)…………………………………………………………………………………………46
Grafica 5. Comportamiento de las anormalidades totales en las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %)…………………………………………………………………………………………47
13
1. INTRODUCCION (PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN)
Los caprinos y ovinos son considerados los pequeños rumiantes más comunes
que proveen impacto económico en el mundo, y su dinámica poblacional en los
últimos años muestra incremento de la población de la especie caprina;
comportamiento contrario presento la población ovina “Ver tabla 1” (Moreno et al,
2014).
Tabla 1. Dinámica comparativa poblacional de ovinos y caprinos (millones de
cabezas)
Grupo
geográfico Especie Año 2005 Año 2010
Mundo Caprina 838.623.162 909.691.096
Ovina 1.099.671.843 1.077.762.456
Total Pequeños rumiantes 1.938.295.005 1.987.453.552
Colombia Caprina 1.160.000 1.200.000
Ovina 3.332.990 3.400.000
Total Pequeños rumiantes 4.492.990 4.600.000
Modificado de Moreno (2013)
En América latina y del caribe se ha calculado una población cercana a los 120
millones de pequeños rumiantes, los cuales hacen parte de los sistemas de
producción pecuaria. De acuerdo a lo anterior se ha sugerido que estas especies
son un importante recurso para las economías regionales, y se estima que existen
aproximadamente 19,7 cabezas de pequeños rumiantes por cada 100 habitantes
(Moreno, 2013).
En la tabla 2 se puede evidenciar la producción anual de leche, carne y piel de los
sistemas productivos de ovinos y caprinos a nivel mundial y nacional.
14
Tabla 2. Producción Anual productos caprinos y ovinos (Toneladas)
Especie Producto Mundo Colombia
Caprina
Leche 16.690.395
Carne 5.168.151 7.4
Piel 1.132.622 1.178
Ovina
Leche 10.046.506
Carne 8.532.257 7.5
Piel 1.890.030 1.293
Modificado de Moreno (2013)
En Colombia la población de pequeños rumiantes está constituida
aproximadamente por 4.6 millones de animales representados en 3.4 millones de
ovinos (74%) y 1.2 millones de caprinos (26%), presentando un incremento de
2,04% y 3,45% respectivamente en los últimos años (Moreno et al, 2014).
Datos estadísticos referencian que en Colombia la producción de carne y piel
proveniente de ovinos y caprinos se ha venido en incremento, pero para la
determinación de la producción de leche caprina no se calculado ni referenciado
datos estadísticos productivos. Esto podría deberse principalmente al
desconocimiento de la industria caprina nacional, percepción que ha limitado su
reconocimiento económico, su relevancia y su capacidad productiva (Grajales et
al, 2007); sin embargo se sugiere que la producción de leche es uno de los
objetivos principales de los programas de mejora genética en caprinos, lo que ha
llevado a la necesidad de obtener animales precoces que suministren buena
cantidad de leche y rica en sólidos totales, que sirva perfectamente para la
fabricación de productos lácteos (Tovío et al., 2007).
Con el objetivo final de aumentar la productividad se han comenzado a utilizar
15
herramientas biotecnológicas que permitan un desarrollo hacia el avance genético,
lo que exige cada día que se requiera fortalecer y mejorar los protocolos
relacionados con el manejo y control reproductivo en caprinos, especialmente
hacia el macho teniendo en cuenta que este es determinante en el aporte de
características de productividad lo cual podría ser mas eficiente si se lograra una
intensificación en la implementación de los programas de inseminación artificial
(Jian-Hua et al., 2016).
La inseminacion artificial es una de las biotecnologias de mayor relevancia en los
ultimos años, pues permite un avance genético especialmente en los animales
productores de leche, mediante la realizacion de las pruebas de progenie y el
mejor aprovechamiento de los sementales con caracteristicas productivas
superiores (Mahieu et al., 2008). Sin embargo, en caprinos su uso ha sido limitado
en comparación con otras especies, debido entre otros factores a la dificultad para
congelar y descongelar el semen, ya que algunos diluyentes puedes resultar
tóxicos para los espermatozoides y tanto al congelar como al descongelar, se
disminuye la motilidad progresiva y se incrementa la cantidad de acrosomas
dañados (Jian-Hua et al., 2016).
Los avances en investigacion sobre este tema tambien han sido lentos, sin
embargo se consiguen en el mercado hoy dia diluyebtes especiales para semen
caprinos, pero los resultados posdescongelacion son controversiales (Tovio et al.,
2007), lo que amerita seguir investigando sobre la coservacion de semen de
caprinos dede el punto de vista de diluyentes (Martinez et al., 2006).
La dilución del semen se realiza por razones técnicas y biológicas, dentro de las
razones técnicas se tiene que el macho por medio de la inseminación artificial
utilizando semen congelado permite una mayor cubrición de hembras comparado
con las realizadas por monta natural (Evans et al., 1990) En la monta natural el
macho cabrío deposita miles de millones de espermatozoides en la vagina de la
hembra y de este gran número de espermatozoides solamente unos 100 o 140
millones atraviesan el cérvix (Grajales et al, 2011). Cuando se utiliza la
inseminación artificial en cabras, tanto el volumen de inseminación como el
16
número de espermatozoides que contiene la dosis inseminante se reduce
sustancialmente al compararlo con la monta natural (Holt, 2000).
El límite inferior generalmente aceptado como resultante de un buen índice de
fertilización, tras la inseminación artificial cervical, es de 100 millones de
espermatozoides por dosis preparada; de esta forma se puede inseminar un gran
número de hembras con un solo eyaculado (Watson, 2000). Si se utilizara semen
sin diluir, este volumen contendría un número de espermatozoides superior al
límite mínimo de seguridad, lo que resultaría en un método poco económico; este
inconveniente, se soluciona mediante la dilución del semen (Evans et al., 1990).
Adicionalmente se sugiere que un volumen adecuado para utilizar tanto en
inseminación cervical como intrauterina debe ser de 0.05 – 0.20 ml; para
inseminación vaginal se debe usar un volumen mayor; el disminuir este volumen
por debajo de 0.05 ml, no es práctico dada la dificultad de manejar y depositar,
cantidades tan pequeñas en una inseminación tradicional “no vía laparoscopica”
(Grajales et al, 2011).
Entre la razones bilógicas por lo cual se diluye el semen sometido a congelación
se resalta la formación de hielo intracelular, tanto en la congelación como en la
descongelación, los cuales destruyen la célula al actuar físicamente sobre ella
(Karp, 2008). Igualmente los espermatozoides pueden sufrir la pérdida de la
integridad de las membranas celulares, así como una inactivación de 20% de
enzimas acrosomales y la pérdida de fosfolípidos y de proteínas si la célula no se
encuentra en un medio propicio para mantenimiento (Zhao et al., 2009).
Adicionalmente los espermatozoides tienen mejor recuperación si un crioprotector
está presente en el medio diluyente. Entre estas sustancias utilizadas como
crioprotectores penetrantes y de baja toxicidad en concentraciones de 1 molar o
más se encuentran el metanol, etilenglicol, 1-2 propanidiol, butanediol,
acetamida, propilenglicol, dimetilacetamida y el DMSO “dimetil sulfoxido”
(Grajales, et al., 2011). Sin embargo, el glicerol ha sido la sustancia crioprotectora
con mejores resultados en los diluyentes para congelación de semen de varias
especies, entre las cuales se encuentran los caprinos (Tovío et al., 2007).
17
El efecto crioprotector del glicerol contra el congelamiento de los espermatozoides
se debe a que este tiene un punto de congelación más bajo que el del agua,
minimizando la concentración extracelular de solutos y aumentando las
posibilidades de supervivencia de estas células dentro de la célula y ayuda al
mantenimiento de la presión osmótica del diluyente y la célula (Hereng et al.,
2011).
Sin embargo las características físico-químicas de los crioprotectores no son
suficientes para definir las condiciones de una buena protección celular; en efecto,
se ha demostrado que el principal factor limitante de la utilización de
crioprotectores, es su toxicidad, ya que su uso puede conducir a lesiones
osmóticas y/o lesiones bioquímicas de acuerdo a la concentración utilizada como
en el caso del glicerol, del cual se ha demostrado su efectividad como
crioprotector en células espermáticas de toro, ovejo y cabro entre otros, por lo cual
es el crioprotector mas utilizado en los medios diluyentes comerciales (Mahieu et
al., 2008).
La inclusión de glicerol en diluyentes para semen caprino según algunos autores
debería estar entre un 3 al 9% (Grajales et al, 2011); aunque algunos otros
investigadores, reportan inclusiones de glicerol de hasta un 15 a 20%, obteniendo
buenos resultados en la evaluación del semen pos descongelación (Holt 2.000).
No obstante según los porcentajes descritos se nota el amplio rango de las
concentraciones de glicerol recomendados para semen caprino, inclusive en los
diluyentes comerciales, por lo cual aun persiste mucha incertidumbre sobre la
concentración optima (Tovío et al., 2007) en las condiciones en de trópico alto
colombiano.
De acuerdo a lo anterior se requiere del diluyente, con sus respectivos
componentes que permita la máxima viabilidad pos descongelación del semen
caprino, esto de acuerdo a que la investigación generada en cuanto a la temática
en referencia es poca y limitada a nivel mundial y nacional; por tal motivo la
importancia de generar bases fisiológicas, que faciliten el estudio del
comportamiento reproductivo de la especie y que estas a su vez sirvan para
18
futuras investigaciones que conduzcan a una más adecuada explotación y
aprovechamiento de la especie.
2. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) como crioprotector en un medio
diluyente para congelación de semen caprino en el trópico alto colombiano.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Evaluar el efecto de la concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del
diluyente, sobre el porcentaje de motilidad progresiva individual en semen
caprino pos descongelado en el trópico alto colombiano.
b) Evaluar el efecto de la concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del
diluyente, sobre el porcentaje de anormalidades espermáticas en semen
caprino pos descongelado en el trópico alto colombiano.
c) Evaluar el efecto de la concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del
diluyente, sobre el porcentaje de células espermáticas vivas pos
descongelación en semen caprino en el trópico alto colombiano.
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Características del semen caprino
3.1.1. Plasma Seminal
El plasma seminal es una mezcla de líquidos secretados por las glándulas
vesiculares, el epidídimo, conductos deferentes y otras glándulas sexuales
accesorias (Evans 1.990; Salamon 1.995).
Los principales constituyentes estudiados en el plasma seminal del macho
cabrío son: Fructosa, Inositol, Ácido Cítrico, Riboflavina, Iones Inorgánicos,
Enzimas, Glicerofosforilcolina y Prostaglandinas. De acuerdo a estas últimas
podemos decir; que en el plasma de cabro hay muy altas concentraciones de
prostaglandinas ( 40 ug./ml.), lo cual colabora con la producción de las
19
contracciones de la musculatura uterina y esto beneficia el transporte de los
espermatozoides a través del tracto genital de la hembra (Maxwell, 1.995).
El efecto benéfico del plasma seminal se debe a que activan la motilidad de los
espermatozoides que, durante su permanencia en el epidídimo, han estado en un
estado de quietud, a bajas tasas metabólicas, debidas a las características del
medio respecto a pH, temperatura, tensión de oxígeno y a la alta relación entre
alta presión osmótica/alta concentración de potasio, También proporciona un
medio rico en nutrientes y actúa como vehículo para los espermatozoides (Evans,
1990; Volkmann et al, 2.001).
El semen del macho cabrío al igual que en otras especies como: hámster, ovejo,
cerdo y humano entre otros, presenta la fosfolipasa A, que se origina en la
glándula bulbo-uretral. Esta contribuye entre otras actividades a la modulación en
eventos de la fusión de la membrana en el proceso de la fertilización (Upreti et al.,
1999). También hay evidencias en el importante papel que cumple esta en el
proceso de exocitosis acrosamal (Garde y Roldan, 1996). Generalmente los
niveles de fosfolipasa A, son solamente detectables con métodos radioactivos
(Upreti et al, 1.999).
Cuando se utiliza yema de huevo en el diluyente como medio protector contra el
choque térmico, esta fosfolipasa degrada la lecitina de la yema de huevo,
formándose productos tóxicos para los espermatozoides a la vez que se produce
la coagulación del medio. (Evans y Maxwell, 1.990).
El semen normal del macho cabrío presenta un color blanco grisáceo o
amarillento. La presencia de otras coloraciones o sangre la cual da al semen una
coloración rosada, puede ser debido a lesiones del pene causadas durante la
colecta y/o eyaculado. Las coloraciones pardas son indicadores de contaminación
o alguna clase de infección en el sistema reproductor. (Freitas et al, 1.997; Evans,
1.990; Evans y Maxwell, 1.987) “Véase tabla 3”.
20
3.1.2. Volumen de Semen
Cuando el semen es colectado por medio de vagina artificial el volumen promedio
es de 1 ml y cuando se colecta utilizando electroyaculador el promedio esta en 2.5
ml (Salamon, 1.995). El volumen de eyaculado se puede ver afectado por varias
causas y esto se relaciona diferentes causas (Véase Cuadro 1). Karagiannidis et
al, (2.000), reporta volúmenes de eyaculados colectados con vagina artificial de
0.7 a 2 ml. para las razas alpina, saanen y damasco.
Tabla 3. Principales alteraciones observadas en el eyaculado
Parámetro Característica Denominación
Volumen
Ausente Asospermia
Reducido Hipospermia
Aumentado Hiperpesmia
Concentración
Cero Azoospermia
Reducida Oligospermia
Normal Normospermia
Aumentada Polizoospermia
Motilidad Disminuida Astenozoospermia
Morfología Anormales Teratozoospermia
Células extrañas Sangre Hemospermia
Pus Piospermia
Fuente: Modificado de Tovío. 2002
3.1.3. Espermatozoides caprinos
3.1.3.1. Dimensión y morfología espermática
Los espermatozoides del macho cabrío tienen una longitud de 60 m. Su cabeza
mide unos 8 – 10 m de longitud y 4 m de ancho con 1m de grueso (Evans y
Maxwell, 1.990). Este es relativamente pequeño comparado con el oocito cuyo
diámetro es de 160 – 180 m. Se puede decir que el oocito tiene un volumen
16.000 veces mayor que el del espermatozoide (Maxwell, 1.995).
Las anormalidades morfológicas pueden ser primarias o secundarias; las primarias
se deben a fallas en la espermatogénesis, mientras que las secundarias ocurren
21
durante el paso de los espermatozoides a través del epidídimo (Hafez, 1999). La
lesión espermática que se produce durante el eyaculado o después o por manejo
inadecuado del semen extraído, se considera una anormalidad espermática.
Igualmente se debe dar especial atención al acrosoma, ya que este es de gran
importancia en el momento de la fecundación (Karagiannidis et al, 2.000) “Véase
Figura 1”.
Las razas saanen, alpina y damasco presentan un rango de anormalidades entre 5
a 15% (Karagiannidis et al, 2.000). Anormalidades superiores al 20% están
relacionadas con una baja fecundidad (Hafez, 1.999).
Figura 1, Anormalidades Espermáticas
MENORES A, Gota citoplasmática proximal. B, Cabezas deformes. C., Cola completamente doblada., Cola enrollada, cola enrollada alrededor de la cabeza. D, Defectos en la pieza media. E, Mal desarrollados. F. Cráteres.
Mayores A, Gota citoplasmática distal. B, Cabeza normal sin cola. C, Curva simple o terminación de la cola enrollada. D, Cabezas estrechas, pequeñas o gigantes. E, Implantación abaxial. F. Acrosomas anormales (arrugado, distal).
FUENTE: CURSO DE CONGELACION DE SEMEN BOVINO. BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA. (2002)
22
3.1.3.2. Motilidad de los Espermatozoides
En el semen normal los espermatozoides tienen una carga eléctrica negativa con
lo que se repelen entre sí. Si estos pierden esta carga tienden a agruparse; este
fenómeno recibe el nombre de aglutinación y puede ser debido a un aumento de
la acidez del medio, presencia de iones metálicos, bacteria u otras impurezas o a
la presencia de aglutininas originadas en el animal (salamon, 1.995) (véase tabla
3).
LA ENERGÍA NECESARIA PARA MANTENER LA MOTILIDAD Y VIABILIDAD PROCEDE DE LOS
AZÚCARES, ESPECIALMENTE DE LA FRUCTOSA PRESENTE EN EL PLASMA SEMINAL
(WATSON, 2.000). CUANDO LOS AZÚCARES SON METABOLIZADOS POR LOS
ESPERMATOZOIDES SE PRODUCE DIÓXIDO DE CARBONO, AGUA Y ALGO DE ÁCIDO
LÁCTICO. ESTE DIÓXIDO DE CARBONO EN ALTA CONCENTRACIÓN INHIBE LA MOTILIDAD
DE LOS ESPERMATOZOIDES AFECTANDO DE ESTA FORMA LA FECUNDACIÓN (SALAMON,
1.995).
los espermatozoides presentan 3 principales tipos de movimientos los cuales son:
Movimiento progresivo hacia delante, Movimiento circular o rotatorio y Movimiento
oscilatorio o convulsivo sin progreso ni cambio de posición (Maxwell, 1.995). Para
la inseminación solo se debe usar el semen que presente altas proporciones de
espermatozoides con motilidad progresiva. Se deben discriminar los
espermatozoides con movimiento rectilíneo de aquellos inmóviles, con movimiento
circular o con cualquier otro tipo de movimiento (Deka, 1.984). Motilidades
progresivas por debajo del 60% se han considerado bajas para una posible
fecundación (Valencia et al, 1.994; Kelly et al, 1,997), pero normalmente se
reportan motilidades altas de 70a 90 % en las razas alpina y saanen
(Karagiannidis et al, 2.000). La velocidad de movimiento hacia delante de un
espermatozoide de macho cabrío suspendido en plasma seminal es de 5-15
mm/min. (Promedio 7 mm./min.) ( Valencia et al, 1.994).
23
3.1.3.3. Concentración Espermática
El semen caprino normalmente contiene concentraciones de 2.000 a 5.000
millones de espermatozoides/ml. En animales con buena condición, de las razas
alpina saanen y damasco (Karagiannidis et al, 2.000).
Un factor muy ligado a la concentración espermática es la consistencia del semen
( sus valores van desde 5 a 0), la cual depende de la relación entre
espermatozoides y plasma seminal. Una alta consistencia indica una alta cantidad
de espermatozoides, permitiendo así una mayor dilución (Evans, 1.990; Maxwell,
1.995; Karagiannidis et al, 2.000). Mientras que alteraciones en esta, se relacionan
con problemas de diferente tipo. (Véase tabla 3). Aparte de la consistencia, la
concentración espermática es determinada fácilmente por medio del
hemocitómetro, el cual se utiliza con una dilución de semen solución 1:200
(Valencia et al, 1.994). Esto nos da la base para una determinación confiable del
número de espermatozoides/ml. de semen la cual es necesaria para precisar la
formula matemática para hacer la dilución (Karagiannidis et al, 2.000).
3.2. Efectos del proceso de criopreservacion y descongelacion de la célula
espermática
La congelación se presenta un abatimiento de la calidad de la célula, que se
manifiesta con una disminución de la motilidad y mortalidad espermática (Jian-
Hua et al., 2016). Este proceso es atribuido a una alteración de los componentes
celulares, unido a un trastorno en el intercambio iónico involucrando al potasio y a
fosfatos contenidos en el diluyente (Zhao et al., 2009).
Los efectos de la crtiopreservacion se pueden dividir en dos:
I. Efectos de las soluciones que provocan cambios de presión osmótica del
medio, provocado por la adicion de los diluyentes, con el subsecuente flujo
de agua del interiorde la célula y veceversa, cuando las células son
descongeladas (Karp, 2008).
24
II. Si la velocidad de enfriamiento es muy rapida, se forman cristales de hielo
al interior de la céliula espermática, pues el agua no ha podido salir de la
célula, lo cual causa daños irreparables en las menbranas espermáticas
(Zhao et al., 2009). También hay formación de cristales extracelulares y si
estos son muy grandes pueden causar daños mecánicos en los
espermatozoides, especialmente al momento de ser descongelados (Holt,
2.000).
Estos efectos se pueden retomar cuando la temperatura de la suspensión alcanza
los –6 C, momento en el que se inicia la formación de cristales extracelulares del
agua en el diluyente; este proceso puede tomar uno o dos minútos, luego se
reinicia el enfriamiento de la suspensión, se forman más cristales fuera del
espermatozoide, se aumenta la concentración extracelular de solutos, el agua se
mueve desde dentro de la célula al medio extracelular y el espermatozoide inicia
una deshidratación progresiva (Amann, 1.995).
El movimiento del agua ocurrido fuera de la célula se debe a fuerzas osmóticas
generadas por la gran concentración de solutos en el diluyente, lo que reduce el
volúmen de cada célula cuando la temperatura es menor a los –50 C y ,
finalmente, a – 196 C (Giraud et al. 2.000). Es decir, se inicia la formación de
cristales de hielo extracelular de agua pura, por lo cual los solutos quedan
separados del cristal, aumentando así su concentración en la porción de agua
precongelada la cual también exíste en el interior del espermatozoide y que se
difunde a través de la menbrana plasmática hacia el exterior, con el propósito de
que la concentración de sales del interior y exterior de la celula se equilibre (Karp,
2008). La perdida de agua intracelular y la subsiguiente deshidratación del
espermatozoide son deseables por que así se reduce de grandes cristales de hielo
dentro de la célula que pueden causar daños a las estructuras internas o a la
membrana plasmática (Zhao et al., 2009).
25
Figura 2. Microarquitectura del medio durante la congelación de semen.
Fuente: Modificado de Forero . Congelación de semen equino. (2003).
Canales de agua no congelada y el movimiento del agua del interior al exterior de la célula, con la disminución resultante de volumen del espermatozoide y aumento de la concentración intracelular de solutos.
Otra teoría para explicar el daño en la membrana plasmática, plantea que al
disminuir la temperatura por debajo de 0 C°, la formación de ATP también
disminuye provocando que la bomba sodio-potásio de la membrana plasmática
también reduzca su actividad (Karp, 2008).
A estos procesos debe sumársele el daño causado por los crioprotectores como
el glicerol, que en algunos estudios ha demostrado ser tóxico para los
HIELO
HIELO
H2O
HIELO
H2O
HIELO HIELO
26
espermatozoides, debido a los daños bioquímicos que causa en los componentes
celulares, pues altera la presión osmótica de las células, modifica las membranas
plasmáticas y acrosomal y provoca reacciones de la membrana plasmática con
otras moléculas del diluyente; incluso, se ha llegado a pensar que al interactuar
con la membrana plasmática, reduce la longevidad del espermatozoide pues
podría inducir su capacitación; sin embargo, el glicerol disminuye el punto de
congelamiento de las estructuras celulares por debajo del agua, lo cual minimiza la
concentración extracelular de solutos (efectos de la solución) y aumenta los
espacios de diluyente no congelado en los que el espermatozoide puede
sobrevivir mientras esté criopreservado (Holt, 2.000).
Todos los eventos ocurren dependiendo del ritmo de enfriamiento (Crister, 1.999).
La salida del agua de la célula espermática es mayor cuando el espermatozoide
es enfriado lentamente, que cuando el enfriamiento se hace con rapidez (Hereng
et al., 2011).. Si se hace un congelamiento rápido se reduce al mínimo el daño
debido a las alteraciones en el metabolismo celular a los cambios en la presión
osmótica y en las membranas, pero se producen grandes cristales de hielo que
causan graves daños mecánicos. En cambio, si el congelamiento se hace
lentamente, no se forman grandes cristales, pero se producen cambios en las
membranas y el metabolismo celular. En otras palabras, si el agua no sale con la
velocidad suficiente para mantener el equilibrio, las células empiezan a supe
enfriarse, logrando el equilibrio osmótico por congelamiento intracelular que
induce la muerte celular (Jian-Hua et al., 2016).
27
Figura 3. Cambios probables en el espermatozoide y el medio durante la
congelación y descongelación de semen.
ENFRIAMIENTO DESCONGELACIÓN
- 196°C 37°C
Alrededor de - 12 ° C
Figu 4. Cambios probables en el espermatozoide y el medio durante la congelación y descongelación de semen. A. Enfriamiento muy rápido B. Enfriamiento rápido C. Enfriamiento lento 1. Descongelación subóptima (muy rápida). 2. Descongelación óptima 3. Descongelación subóptima (muy lenta)
A una tasa óptima de enfriamiento (B), el agua sale y el espermatozoide se encoge por deshidratación. Durante la descongelación a una tasa adecuada (2), el movimiento de agua provoca la rehidratación del espermatozoide, con el balance de la presión del soluto y la formación de microcristales de hielo.
Fuente: Modificado de Forero. Congelación de semen equino. (2003).
- 5 °C
A
L
M
A
C
E
N
A
M
I
E
N
T
O
1
2
3
C
B
A
20 ° c
28
3.3. Diluyentes
Las dos principales funciones del diluyente son conservar la fertilidad de los
espermatozoides y aumentar el volumen total, de forma tal que la dosis
determinada de espermatozoides pueda ser envasadas y utilizada
convenientemente para la inseminación artificial, de tal manera que de un
eyaculado normal pueden inseminarse un gran numero de animales (Tribulo H. et
al, 2.000).
Para poder cubrir estos requerimientos, el diluyente para semen debe tener
características como suministro de nutrientes como fuente de energía
(Hammersted, 1.999, proteger contra el daño que produce el enfriamiento rápido
(Hafez, 1.999), amortiguar los cambios de pH, cuando se forma ácido láctico,
previniendo el daño por éste (Hereng et al., 2011). mantener una adecuada
presión osmótica, al igual que un equilibrio electrostático correcto (Hammersted,
1.999), aumentar el volumen de semen para usarlo en varias inseminaciones
(Hafez, 1.999), contener un apropiado balance mineral (Hammersted, 1,999), tener
capacidad de neutralización de los productos tóxicos que metabolizan los
espermatozoides (Jian-Hua et al., 2016), poseer capacidad de estabilización de
los sistemas enzimáticos y de la integridad de las membranas espermáticas
(Hammersted, 1.999), estar libres de organismos infecciosos (Grajales et al.,
2011), inhibir o minimizar el crecimiento bacteriano (Hammersted, 1.999).
El diluyente puede ser dividido en fracción A y fracción B, la cual lleva el
porcentaje del crioprotector. Esta fracción B es agregada a 5 °C. ya que a
temperaturas mayores crioprotectores como el glicerol se hace tóxico a los
espermatozoides. A temperaturas menores de 0 °C. el crioprotector no penetra a
la célula, y de esta forma no ejerce su efecto adecuado (Keskintep et al, 1.998).
3.3.1. COMPONENTES DE LOS DILUYENTES
Los diluyentes basados en sustancias amortiguadoras como citrato o
hidroximetilaminometano (TRIS.), con agregado de yema de huevo o leche
descremada (medio contra el choque térmico), azúcares, electrolitos, glicerol
29
(crioprotector), son los más convenientes y apropiados para la congelación de
semen caprino. (Zhao et al., 2009; Salamon, 2.000; Corteel, 1.981; Deka, 1.984;
Evans, 1.990).
Sin embargo con el semen de macho cabrío se debe tener mucho cuidado con la
inclusión de la yema de huevo en el diluyente, ya que el plasma seminal de este
contiene la fosfolipasa A, que se origina en la glándula bulbo uretral. Esta
fosfolipasa degrada la lecitina de la yema del huevo, generando productos tóxicos
para los espermatozoides y provocando la coagulación del medio, por este motivo
se sugiere que la inclusión máxima de yema de huevo en el diluyente no supere el
2.5% (Valencia et al, 1.994).
3.3.1.1. Crioprotectores
Son sustancias que gracias a sus características de ser moderadoras en los
cambios de concentraciones de solutos, de mantener equilibrio de potencial
químico entre el agua extra e intracelular, de ser deshidratantes y disminuir la
formación de cristales de hielo y de ser estabilizadoras de la membrana celular;
evitan los daños a las células durante la congelación (Songsasen et al, 1.995).
Los crioprotectores pueden ser clasificados de acuerdo a su modo de acción lo
cual va ligado a sus características físico-químicas:
a) Crioprotectores que penetran libremente a la célula, de peso molecular
bajo. Figuran sustancias de baja toxicidad en concentraciones de 1 molar o
más como: el glicerol, 1 - 2 propanidiol, butanodiol, acetamida,
dimetilacetamida, DMSO (dimetil – sulfoxido), etilenglicol, etanol y glicerol.
Estos son alcoholes que ejercen su propiedad crioprotectora penetrando a
la célula y por sus radicales hidróxido o sulfoxido, fijan parte del agua
intracelular durante los procesos de congelación y descongelación,
limitando la formación de cristales de hielo intracelular (Holt, 2.000).
En este grupo de crioprotectores también encontramos compuestos
anfipáticos como la betaína, la glutamina y la prolina. Estos compuestos, se
piensa que interactúan directamente con los lípidos y proteínas de la
30
membrana, alterando el comportamiento de su fase de transición y su
estado de hidratación (Holt, 2.000).
b) Crioprotectores que no penetran la célula y de peso molecular bajo. Se
incluyen proteínas como las contenidas en la leche o la yema de huevo,
azúcares como la lactosa, fructosa, manosa y tetralosa; polímeros
sintéticos como la metil celulosa, y las amidas. (Amann, 1.995).
En su orden, el efecto crioprotector de los azúcares, aparentemente es
aumentar el porcentaje de agua no congelada a ciertas temperaturas o
reducción de la concentración de sales en la solución acuosa no congelada
(Holt, 2.000).
c) Crioprotectores que no penetran a la célula y de peso molecular elevado,
como son el polyvinylpilorridon (PVP), el dextran, la albúmina de suero
bovino, etc. (Holt, 2000).
La elección del crioprotector prácticamente se hace por ensayo y error, debido a
que no se conoce completamente la acción de cada uno de sus componentes ni el
efecto conjunto de la sustancia sobre los espermatozoides (Holt, 2.000).
El espermatozoide requiere soportar los rigores de cada uno de los pasos de la
crio preservación, manteniendo su capacidad de fertilización, sustentado por un
diluyente que asegure la recuperación de todos los compartimentos espermáticos,
esto implica que se optimice el proceso de congelación, junto con la composición
de los diluyentes, para minimizar los daños que no pueden ser corregidos
(Hammerstedt, 1.999).
3.3.1.1.1. Glicerol
El glicerol es el crioprotector más usado frecuentemente. Actúa como crioprotector
penetrante y sirve como solvente y soluto en el diluyente. (Vidament et al, 2.001;
Holt, 2.000; Critser, 1.999; Amann, 1.995).
Las características de descripción química del glicerol son: 1, 2, 3 propanetiol o
glicerina, C3 H8 O3, peso molecular 92.09; C39.12% H8.75% O52.12%.
31
CH20HCHOHCH20H. Es un liquido viscoso y su sabor es suave tibio. Se
solidifica a 0 C formando cristales ortorrómbicos. Su punto de fusión es 17.8 C. y
su punto de ebullición es a 760 mm. de Hg. 290C. (Yoshida, 2000).
El efecto crioprotector del glicerol contra el congelamiento de los espermatozoides
se debe a que este tiene un punto de congelación más bajo que el del agua,
minimizando la concentración extracelular de solutos y aumentando las
posibilidades de supervivencia de los espermatozoides dentro de los cristales de
hielo del solvente; es decir, incrementa la fracción no congelada en el exterior de
la célula y ayuda al mantenimiento de la presión osmótica del diluyente y la célula
(Holt, 2.000; Amann, 1.995; Hafez, 1.999; Gongora et al.,1.983). Sin embargo, el
glicerol es tóxico pues altera la morfología de las células espermáticas cuando se
adiciona a temperatura ambiente, además de limitar la acción protectora de otros
compuestos presentes en el diluyente, e interferir parcialmente con la acción
inhibitoria de los antibióticos (Holt, 2.000; Vargas, 1.997; Amann, 1.995).
Algunas investigaciones han evidenciado que la presencia de un nivel alto de
glicerol en el diluyente, causa daños a la membrana celular, altera la
permeabilidad, inducen la fusión entre membranas e inhibe la actividad enzimática
(Yoshida, 2000).
Se postula que el daño que el glicerol ejerce sobre las células se debe a que
afecta la viscosidad del citoplasma alterando las tasas de difusión mediada de la
célula. De otro lado, debido a su carácter penetrante, el glicerol se instala en la
bicapa lipídica de la membrana celular, provocando cambios en su estructura
lipídica y, por tanto, afectando su estabilidad y permeabilidad al agua. Este efecto
también provoca alteraciones en las vías de transmisión de señales celulares, lo
que, al parecer, puede inducir una reducción de la longevidad espermática pues
se aceleran sus procesos de capacitación. Así mismo, es probable que interfiera
con el balance entre la utilización y la síntesis de ATP, lo que conduce a daño
irreversible durante el enfriamiento de las células, aunque, aparentemente, esto
no ocurre en todas las especies. Igualmente, la cantidad de glicerol durante la
descongelación afecta la integridad del acrosoma (Hereng et al., 2011).
32
Para reducir el daño que pueda causar el glicerol al espermatozoide, algunos
autores proponen adicionarlo de manera lenta para evitar los cambios de volumen
en la célula cuando el agua y el glicerol difunden a través de la membrana
plasmática y, ojalá, se hiciera a bajas temperaturas (4 – 5 –°C), más que a la
temperatura ambiente (22 o 37 °C) (Amann, 1.995).
Sin embargo, teniendo en cuenta lo descrito, se ha encontrado, que el daño
celular de los espermatozoides congelados con glicerol es menor que el producido
al utilizar otros crioprotectores como el DMSO, el cual induce a la célula a un
estrés osmótico (Gao et al, 1.995; Bustamante et al., 1.981; Fiser et al., 1.996;
Robbins et al, 1.976; Colas et al., 1.977; Locksley, 1.978; Holt, 2.000).
La inclusión de glicerol en semen de cabro según Leboeuf (2.000), está en un
rango de 3-9%; aunque Salamon (2.000), reporta inclusiones de glicerol de hasta
un 15 a 20%, lo cual favorece la retención de la transaminasa oxaloacética
glutamica. Holt (2.000), reporta datos de inclusión de 3 a 20% en semen de
marsupial y de ratones, obteniendo buenos resultados en la evaluación del semen.
No obstante según los porcentajes descritos, aún persiste mucha incertidumbre
sobre la concentración ideal u optima del diluyente, con sus respectivos
componentes que permita la máxima viabilidad del semen de caprinos.
3.3.1.2. Medios Buffer y Azúcares
Desde los años 70 se ha venido experimentando con el uso y concentración de los
medios buffer. Básicamente se ha estudiado y observado la buena capacidad
tamponante que tiene el citrato para mantener el pH adecuado para la célula
espermática (Simon, 1.981; Salamon, 2.000).
En 1.959 se reporto que la inclusión de arabinosa (5.85%) o urea (2.4%) en
cambio de la glucosa mejoraba la supervivencia de los espermatozoides post-
calentamiento (Salamon, 2.000). Debido a esta acción del glicerol, muchos
investigadores usaron hipertónicamente citrato – azúcar – yema de huevo como
diluyentes con una presión osmótica de 8-12 atmósferas (Maxwel, 1.995).
33
3.3.1.3. Antibióticos
Los antibióticos adicionados al diluyente se pueden seleccionar dependiendo de
su estabilidad con el pH del diluyente; por ejemplo, la penicilina es muy estable en
el diluyente basado en citrato y, junto con la estreptomicina, actúa bien sobre gran
negativos (Vargas, 1.997). Es importante saber que los antibióticos actúan sobre
bacterias y no sobre virus, para los cuales se deben tener otro tipo de controles
(Hafez, 1.999).
3.3.1.4. Protectores contra el Choque Térmico
Desde 1932 investigadores comenzaron a describir la adición de lípido (yema de
huevo) en el diluyente para proteger la célula espermática contra el choque
térmico (Salamon, 2.000). Posteriormente en 1939, se mostró el efecto benéfico
de la yema de huevo sobre el almacenamiento y la congelación del semen a
temperaturas cercanas a cero grados (Hatn, 1.989). La leche descremada y
calentada a 90 °C/10 minutos (para inactivar la acción fatal de las enzimas de la
leche sobre los espermatozoides), también ha sido utilizada como protector contra
el choque térmico, pero con esta no se consiguen tan buenos resultados como
cuando se utiliza el agregado de yema de huevo (Keskintep et al, 1.998).
4. MATERIALES Y METODOS
4.1. Localización
El trabajo de campo se desarrollo en un sistema de producción de leche caprina
ubicado en el municipio de Subachoque departamento Cundinamarca, localizado a
los 4o 55’ 41’’ latitud norte y 74o 210 25’’ de longitud oeste; altura sobre el nivel
del mar 2663 metros; temperatura media de 13.3 oC; humedad relativa 60% y
precipitación 824.2 mm/año.
El trabajo de laboratorio se realizo en colaboración con el Laboratorio de
Hormonas de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad
Nacional de Colombia – Sede Bogotá D.C., en el cual se midieron y calcularon las
34
concentraciones requeridas de los componentes del diluyente para crio
preservación a utilizar. Igualmente se utilizó el material y equipos necesarios,
reglamentarios para llevar a cabo los procedimientos adecuadamente.
4.2. Grupo experimental
Se trabajaron 3 reproductores, de la raza Sannen, los cuales correspondieron a
animales adultos entre 2.5 a 3.5 años de edad; con pesos entre 68 a 75
kilogramos y condición corporal entre 3 y 4, en escala calificatoria de 1 a 5
(Edmonson et al., 1989). Estos machos tenían fertilidad comprobada (preñeces
comprobadas). Igualmente se verifico su estado sanitario con el cual se descarto
la presencia de enfermedades con los exámenes pertinentes de laboratorio.
Adicionalmente se verifico su capacidad de eyaculado por medios artificiales
(Vagina artificial). Los animales se manejaron bajo pastoreo en praderas
sembradas con una mezcla de Lolium Peremne (Rye Grass) y Pennisetum
clandestinum (Kikuyo); igualmente se suministro sal mineralizada y agua a
voluntad.
4.3. preparación de diluyente
Se utilizo un diluyente bajo sistema de dos pasos (diluyente de dos fracciones: A y
B) el cual estaba compuesto básicamente de citrato-fructosa (80%).
La fracción 1 (A) del diluyente específicamente estaba conformada por citrato de
sodio al 2.9% deshidratado, 1.25% de fructosa, 100 UI de penicilina por cada 5ml.
y 1ml. de estreptomicina por cada ml. Estos componentes fueron filtrados en poro
de 0.22. El otro 20% del diluyente lo componía el protector contra el choque
térmico; en este caso se utilizo yema de huevo. La fracción 2 (B) del diluyente
tenia la misma composición de la fracción 1 (A) mas un porcentaje de glicerol.
Se realizaron tres diluyentes de la fracción 2 (B), cada una con tres
concentraciones diferentes de Glicerol; 6, 7 y 8%, los cuales fueron los
tratamientos a utilizar en la investigación.
35
4.4. Colectas y procesamiento seminal
El semen se colecto con vagina artificial la cual se mantuvo a temperatura interna
de 39° C. Esta vagina contaba con tubos colectores estériles (falcon®) graduados
por mililitros; los cuales también estaba atemperados a 39° C.
Luego de colectar el semen se mantubo a una temperatura de 37° C. para evitar
choque térmico que pudiera alterar a las células espermáticas. Se evaluaron sus
características macroscópicas directamente en el tubo colector Falcon® (Color,
consistencia y volumen) y microscópicas utilizando microscopio con contraste de
fases Nikon® (motilidad progresiva individual, vivos y anormalidades).
Para el calculo de la concentración se utilizo cámara de Neubauer®. Las
anormalidades se calcularon mediante metodología de tinción utilizando eosina
nigrosina (1:1) y se observaron utilizando lente de inmersión en microscopio con
contraste de fases Nikon®
De acuerdo a las características seminales (Volumen, concentración, motilidad y
morfología) se procedió a agregar la mitad del volumen total del diluyente
(fracción A. - 37° C) teniendo en cuenta que se realizo dilución de dos pasos
(fracción A y B), donde la primera fracción es sin glicerol y la segunda es la
fracción gicerolada (tratamiento planteado para la investigación), la cual se aplico
a 5° C.
Los formula utilizada para dilución fue la siguiente:
Volumen eyaculado X concentración X motilidad progresiva
individual X normalidad
Concentración a dejar cada dosis de 0.5 ml (50 millones por dosis)
= Volumen final – Volumen eyaculado = Cantidad total de diluyente a utilizar / 2 = cantidad de fracción A (aplicar a 37° C) y B de diluyente a aplicar (aplicar a 5° C)
36
Antes de la primera dilución (fracción A) se realizo un proceso de centrifugación
del semen a 1400 RPM/8 minutos, utilizando una solución de citrato fructosa. Esto
con la finalidad de poder separar el paquete espermático del plasma seminal.
Posterior a la primera dilución se comenzo la curva de descenso de temperatura
(en nevera calibrada a 5° C) con el fin de llevar a 5° C el semen en dos horas
(aproximadamente 1° C cada 4 minutos).
4.4.1. Aplicación de los tratamientos a muestras seminales
Al llegar a los 5° C se procedió a dividir en tres alícuotas iguales el semen ya
diluido con la fracción A; enseguida se le aplico a cada alicuota de semen cada
una de la fracción B de diluyente correspondiente a la parte glicerolada
(tratamiento 6, 7 y 8% de glicerol). Luego de esto el semen a 5° C se dejo en
equilibrio por dos horas tiempo suficiente para que el glicerol deshidratara e
ingresara a la celula espermática.
Después del equilibrio por dos horas el semen se empaco en pajillas de 0.5 ml. las
cuales se dejaron con una concentración de 50.000.000 millones de
espermatozoides. Las pajillas pajillas se marcaron previamente con los siguientes
datos:
• Nombre del macho
• Raza
• Fecha
• % de glicerol (Tratamiento)
Las pajillas se comenzaron a congelar sometiéndolas a vapores de nitrógeno
liquido a una altura de 8 centímetros (pajilla − nitrógeno) por 10 minutos. Pasado
este tiempo se sumergieron en nitrógeno liquido (T° de –196° C).
En total se realizaron 3 colectas seminales por macho (tres machos), para lo cual
se dejaron descansar ocho (8) días entre colecta y colecta para garantizar una
buena recuperación reproductiva.
37
Se obtuvieron en total 9 eyaculados; cada eyaculado se dividió en 3 alícuotas
iguales para que a cada una de estas le correspondiera aplicar un nivel diferente
de inclusión de la fracción 2 (B) de glicerol (cada uno de los tratamientos). En total
se obtuvieron 27 muestras (nueve eyaculados divididos en tres alicuotas). Cada
una de las 27 muestras fueron sometidas a congelación en pajillas de 0.5 ml., de
las cuales se descongelaron 3; es decir, 81 muestras en total (27 muestras por
tres pajillas por muestra) en total fueron analizadas estadísticamente (27 pajillas
con inclusión de glicerol al 6%, 27 pajillas con inclusión de glicerol al 7% y 27
pajillas con inclusión de glicerol al 8%).
Posteriormente se procedió a descongelar las pajillas a 37° C durante un minuto
para someter a evaluación espermática en donde se verifico el porcentaje de
recuperación de la motilidad progresiva individual y el porcentaje de
anormalidades espermáticas y el porcentaje de células vivas; estas variables se
verificaron de acuerdo a la misma metodología utilizada con el semen fresco.
CONGELACIÓN DE SEMEN CAPRINO
Separacion plasma seminal
Congelacion en N2L.
Vapores de N2. durante 12 min.
Evaluacion de semen
Equilibrar durante 1 horas a 5 °C.
Dilución con fraccion glicerolada
Evaluacion del semen (5 °C.)
Curva de descenso de temperatura.1°C cada 4 min.
Dilucion con fraccion A. (Sin glicerol)
Evaluacion paquete espermatico
Centrifugacion 1.400 rpm. / 10 min.
Evaluacion macro y microscopica
Colecta de semen
38
4.5. Analisis estadistico
Para determinar el comportamiento de variables previo a congelación seminal
(Volumen, concentración, motilidad progresiva individual, morfología y vivos) se
utilizo estadística descriptiva en donde se evidencian promedios, desviaciones
estándar y coeficiente de variación para cada una de las variables (Véase tabla 4).
Tabla 4. Características seminales en fresco por macho y general
*Todos los resultados se expresan como promedio, desviación estandar y coeficiente de variación.
Para la distribución de las muestras (alicuotas) en los tratamientos (6, 7 y 8% de
glicerol) se utilizó la metodología correspondiente a la generación de números
aleatorios, los cuales provenían de una distribución uniforme continua (0,1).
(Resultado de una variable al azar especificada por una distribución) (Rienzo et
al., 2001).
Para determinar el efecto de los tratamientos (6, 7 y 8% de glicerol) sobre las
variables respuesta “motilidad progresiva individual, vivos y anormalidades” se
39
empleo un modelo completamente aleatorizado con el peso, condición corporal y
edad como covariables.
Para todas las variables que se analizaron mediante el modelo de covarianza
(motilidad progresiva individual, vivos y anormalidades), la homegeneidad de
varianzas de los tratamientos se probó mediante una prueba F (Steel and Torrie,
1980).
Para el análisis estadístico de los datos se utilizo el paquete especializado
estadístico Analytics Pro SAS®.
4.5.1. Variables respuesta
I. Motilidad progresiva individual
II. Porcentaje de espermatozoides vivos pos descongelación
III. Porcentaje de anormalidades espermáticas posdecongelacion (Primarias,
secundarias y total)
5. RESULTADOS Y DISCUSION
En la tabla 5 se muestra la comparación entre los tratamientos utilizados (glicerol
al 6, 7 y 8 %), en cuanto a las variables de motilidad progresiva individual (%),
anormalidades primarias (%),, anormalidades secundarias (%), y total de
anormalidades (%),.
Tabla 5. Variables espermáticas según tratamiento (6, 7 y 8 % de glicerol)
*Todos los resultados se expresan como promedio
40
5.1. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre
el porcentaje motilidad progresiva individual
En el presente estudio de acuerdo a la variable de recuperación de la
motilidad progresiva individual se evidencio diferencias (P<0.05) entre los
tratamientos utilizados (diluyente para crio preservación con glicerol al 6, 7 y
8%), siendo mayor esta motilidad cuando al diluyente se aplicó glicerol al 7%,
seguido por glicerol al 6% y por ultimo glicerol al 8% (Véase grafica 1).
Este resultado difiere a lo encontrado en estudios similares, como el de Bernal
(2005), quien encontró que con la utilización de glicerol al 6% en diluyente
para crio preservación de células espermáticas caprinas se evidenciaban
motilidades pos descongelación mayores estadísticamente frente a
porcentajes de 7 y 8% de glicerol; en ese estudio se utilizo la raza Alpina
francesa, siendo el promedio poblacional de recuperación de la motilidad
48%, dato menor numéricamente hablando frente a los promedios
encontrados en el presente estudio si se observan los tres diferentes
promedios obtenidos con cada uno de los tratamientos de glicerol utilizados
(Véase tabla 5).
Grajales (1990), reporta como promedio poblacional de recuperación de la
motilidad progresiva individual 59%, estudio en el cual utilizo diluyente a base
de yema de huevo y glicerol al 6%. Ferrari (1999), reporta igualmente como
motilidad poblacional 49% utilizando diluyente a base de leche descremada y
dimetilsulfoxido (DMSO) como crioprotector.
Tovío en el 2004, trabajando con tres razas caprinas (Saanen, alpina y criolla
colombiana) encontró que utilizando glicerol al 7% en el diluyente se obtenían
estadísticamente mejores porcentajes de recuperación de la motilidad
progresiva individual. En ese mismo estudio se obtuvo un promedio general
de recuperación de la motilidad progresiva individual del 57%, dato similar
numéricamente al encontrado en el presente estudio cuando se utilizo glicerol
al 8%, y menor numéricamente cuando se utilizo al 6 y 7% (Véase tabla 5).
En el presente estudio los promedios de la recuperación motilidad progresiva
41
individual en cada uno de los tratamientos podrían considerarse entre los
valores normales encontrados pos descongelación seminal en caprino (Kelli,
1997). Según referencias estos valores deberían tener un rango entre 60 y
90% para que se considere en programas de inseminación artificial con mejor
promedio de fecundidad, por lo cual se podría plantear que la motilidad
progresiva individual obtenida con diluyente con glicerol al 6 y 7% cumplirían
los estándares de calidad, evidenciándose mejores resultados con glicerol al
7% (Véase tabla 5)
Se evidencia en los estudios revisado y similares que posiblemente el factor
racial, latitud, nutrición, manejo de las muestras, diluyentes utilizados e
individualidades son determinante en cuanto a las diferentes respuestas
numéricas obtenidas en los estudios referenciados frente a la presente
investigación.
Grafica 1. Comportamiento de la motilidad progresiva individual de las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %).
63,69
72,34
56,69
0
10
20
30
40
50
60
70
80
6 % (n=27) 7 % (n=27) 8 % (n=27)
Motilidad progresivaindividual (%)
b a c
42
5.2. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre
e porcentaje de espermatozoides vivos
En el presente estudio de acuerdo a la variable de espermatozoides vivos se
evidencio diferencias (P<0.05) entre los tratamientos utilizados (diluyente para
crio preservación con glicerol al 6, 7 y 8%), siendo mayor esta motilidad
cuando al diluyente se aplicó glicerol al 7%, seguido por glicerol al 6% y por
ultimo glicerol al 8% (Véase grafica 2).
Este resultado es igualmente concordante con los datos encontrados de
acuerdo a la variable de recuperación de la motilidad progresiva individual
encontrados (Véase grafica 1).
Ramírez (1993), trabajando con machos de la raza Saanen y diluyente a base
de leche descremada encontró un promedio poblacional de 92%; sin embargo
otros autores como Tovío (2004), trabajando con tres razas caprinas encontró
un promedio general de vitalidad de 40.2%, utilizando diluyente a base de
yema de huevo y glicerol como crio protector; y Bernal (2005), 53% en
machos alpinos utilizando diluyente al 7% de glicerol.
De acuerdo a lo anterior Salamon (2000), afirma que la viabilidad espermática
pos descongelación en células caprinas debe estar en un rango entre 40 y
50%, por lo cual los porcentajes obtenidos en el presente estudio serian
satisfactorios en cualquiera de los tres tratamientos utilizado (6, 7 y 8% de
glicerol); resaltando los mayores porcentajes de espermatozoides vivos al
utilizar el glicerol al 7%.
Al igual que la variable anteriormente analizada (recuperación de la motilidad
progresiva), en los estudios revisados las respuestas pueden estar
influenciadas posiblemente por el factor racial, latitud, nutrición, manejo de las
muestras, diluyentes utilizados e individualidades, variable que
indudablemente podrían determinar en cuanto a las diferentes respuestas
numéricas obtenidas en los estudios referenciados frente a la presente
investigación.
43
Grafica 2. Comportamiento de células espermáticas vivas (%) de acuerdo al
porcentaje de glicerol en el diluyente (tratamientos al 6, 7 y 8 %).
5.3. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre
el porcentaje de anormalidades primarias
En el presente estudio de acuerdo a la variable de espermatozoides vivos no
se evidencio diferencias (P>0.05) entre ninguno de los tratamientos utilizados
(diluyente para crio preservación con glicerol al 6, 7 y 8%), siendo solamente
diferencias numéricas (Véase grafica 3).
Este resultado es entendible desde el punto de vista que machos que poseen
fertilidad comprobada de acuerdo a sus porcentajes de preñez, son los
utilizados para las diferentes experimentaciones, esto con la finalidad de
descartar este factor de infertilidad por posibles alteraciones espermáticas
como lo son las anormalidades que puedan influir sobre los resultados.
De acuerdo a lo anterior se evidencio en el presente estudio que
numéricamente el rango de anormalidades encontrados están en los
reportados por otros autores como Salamon y Maxwell (2000) y Grajales
(1994), quienes plantean que rangos de anormalidades primarias entre 1.4 y
4.5%, son ideales para semen de animales en condiciones aceptables de
70,63
82,36
65,6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
6 % (n=27) 7 % (n=27) 8 % (n=27)
Vivos (%)
ab c
44
fertilidad.
El resultado encontrado en el presente estudio concuerda con lo reportado
por Bernal (2005), en donde no se reportaron diferencias estadísticas pos
descongelación para esta variable. En ese experimento se utilizo glicerol al
7% en semen de la raza caprina alpina, y su objetivo fue medir siete tiempos
de equilibrio del semen a una temperatura de 4 C°.
Igualmente Tovío (2004), para esta variable no encontró diferencias
estadísticas en semen de las razas Alpina, Saanen y Criolla colombiana. En el
citado estudio se utilizó diluyente al 7% de glicerol, y los datos promedio
poblacional para esta misma variable estuvo numéricamente muy similar
(2.16%) a los encontrados en el presente estudio tanto para el tratamiento 6,
7 y 8% de glicerol.
Grafica 3. Comportamiento de las anormalidades primarias en las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %).
2
2,1
2,4
1,8
1,9
2
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
6 % (n=27) 7 % (n=27) 8 % (n=27)
Anormalidades primarias (%)
aa a
45
5.4. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre
el porcentaje de anormalidades secundarias
En el presente estudio de acuerdo a la variable de porcentaje de
anormalidades secundarias se evidencio diferencias (P<0.05) entre los
tratamientos utilizados (diluyente para crio preservación con glicerol al 6, 7 y
8%), siendo menor el porcentaje de estas anormalidades cuando al diluyente
se aplicó glicerol al 7%, lo cual concuerda con el comportamiento que
presento la variable de motilidad progresiva individual, la cual igualmente
presento mejores características estadísticas en el semen congelado con el
7% de glicerol (Véase grafica 4).
Este resultado concuerda con lo encontrado por Tovío (2005), cuando utilizó
diluyente al 7% de glicerol encontrando estadísticamente menores
incrementos de anormalidades secundarias (5.4%) frente a diluyentes al 6 y 8
% de glicerol.
Grajales (1990), reporta encontrar un máximo de anormalidades secundarias
en muestra poblacional pos descongelación de 5.2%, y Bernal (2005), reporta
7% de anormalidades encontradas.
De los anteriores porcentajes encontrados en los diferentes estudios se podría
determinar que en el presente estudio esta variable de anormalidades
secundarias se comporto dentro del rango numérico encontrado en los
reportes citados y que según Grajales (1990), estarían dentro de los rangos
aceptables para semen pos descongelación sin afectar su fertilidad.
Posiblemente el mejor comportamiento en cuanto a menor porcentajes de
anormalidades secundarias pos descongelación cuando se utilizo glicerol al 7%
como agente crioprotector contra el congelamiento de los espermatozoides se
debió a que a esta concentración se minimizando la concentración extracelular de
solutos lo cual aumenta las posibilidades de supervivencia de los espermatozoides
dentro de los cristales de hielo del solvente; es decir, incrementa la fracción no
congelada en el exterior de la célula y ayuda al mantenimiento de la presión
osmótica del diluyente y la célula (Holt, 2.000).
46
Algunas investigaciones han evidenciado que la presencia de un nivel alto de
glicerol en el diluyente, causa daños a la membrana celular, altera la
permeabilidad, inducen la fusión entre membranas e inhibe la actividad
enzimática, por lo cual se podría de alguna manera decir que al 7% en
criopreservante para caulas espermáticas caprinas se evita este daño y también
mantendría la integridad del acrosoma.
(Hereng et al., 2011).
La inclusión de glicerol en semen de caprino según Leboeuf (2.000), podría
estar está en un rango de 3-9%; por lo cual se podría decir que en el presente
estudio se evidencio que se presenta mejores características en cuanto al no
incremento de anormalidades secundarias cuando se utiliza el glicerol al 7%.
Igualmente la mejor de características también se evidencia en la
recuperación de la motilidad progresiva individual (Véase grafica 1).
Grafica 4. Comportamiento de las anormalidades secundarias en las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %).
9,13
6,3
9,76
0
2
4
6
8
10
12
6 % (n=27) 7 % (n=27) 8 % (n=27)
Anormalidades secundarias(%)
a b a
47
5.5. Efecto de la concentración de glicerol (6, 7 y 8%) en el diluyente sobre
el porcentaje de anormalidades totales
En el presente estudio de acuerdo a la variable de porcentaje total de
anormalidades (Primarias y secundarias) se evidencio diferencias (P<0.05)
entre los tratamientos utilizados (diluyente para crio preservación con glicerol
al 6, 7 y 8%), siendo menor el porcentaje de estas anormalidades cuando al
diluyente se aplicó glicerol al 7%, lo cual era de esperarse ya que esta
variable es la sumatoria de anormalidades primarias y secundarias; por tal
motivo concuerda con el comportamiento que presento la variable de
anormalidades secundarias, la cual igualmente presento mejores
características estadísticas en el semen congelado con el 7% de glicerol
(Véase grafica 5).
Grafica 5. Comportamiento de las anormalidades totales en las células
espermáticas (%) de acuerdo al porcentaje de glicerol en el diluyente
(tratamientos al 6, 7 y 8 %).
11,13
8,4
12,16
0
2
4
6
8
10
12
14
6 % (n=27) 7 % (n=27) 8 % (n=27)
Anormalidades totales (%)
a ab
48
6. CONCLUSIONES
- Existió efecto de la concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del
diluyente, sobre el porcentaje de motilidad progresiva individual en semen
caprino en el trópico alto colombiano pos descongelado, siendo mejor la
motilidad cuando se utilizo glicerol al 7%.
- No se evidencio efecto de acuerdo a la concentración de glicerol al 6, 7 y 8
% en el total del diluyente, sobre el porcentaje de espermatozoides vivos en
semen caprino pos descongelado en el trópico alto colombiano.
- La concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del diluyente para semen
caprino en el trópico alto colombiano no influye sobre el porcentaje de
anormalidades primarias
- Existió efecto de la concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del
diluyente, sobre el porcentaje de anormalidades secundarias espermáticas
caprinas pos descongeladas presentándose menor porcentaje cuando se
utilizo glicerol al 7%.
- Existió efecto de la concentración de glicerol al 6, 7 y 8 % en el total del
diluyente, sobre el porcentaje total de anormalidades en semen caprino en el
trópico alto colombiano pos descongelado, presentándose menor porcentaje
cuando se utilizo glicerol al 7%.
7. RECOMENDACIONES
Es necesario diseñar estudios que permitan comparar diferentes porcentajes
de glicerol con diferentes, tipologías raciales en diferentes latitudes que
permitan evidenciar claramente el efecto de las covariables relacionadas.
Sería pertinente realizar investigaciones a nivel molecular, en las que se
profundice acerca de los factores determinantes celulares que involucran el
efecto de las diferentes concentraciones de glicerol sobre la célula espermática
caprina.
49
Es Importante realizar investigaciones que permitieran determinar la fertilidad
de la célula espermática caprina sometida a diferentes concentraciones de
glicerol y determinar bajo inseminación artificial el posible efecto del porcentaje
de glicerol sobre el porcentaje de preñez.
50
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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