Autor práce: Eva Klemensová Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc. OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚFAKULTA 2009 PŘÍRODOVĚDECKÁ KATEDRA BIOLOGIE A EKOLOGIE
- 1. OSTRAVSK UNIVERZITA V OSTRAV FAKULTA PRODOVDECK KATEDRA
BIOLOGIE A EKOLOGIE Detekce pokozen DNA pomoc PCR BAKALSK PRCE 2009
Autor prce: Eva KlemensovVedouc prce: RNDr. Petr Peinka, CSc.
2. Obsah
3. Cle
- izolace plasmidov DNA svhodnmi sekvencemi pro metylaci
jednoetzcovch nebo dvouetzcovch sek DNA
- oven monosti pouit polymerzov etzov reakce pro detekci DNA
pokozen metylanmi inidly
- pokusit se optimalizovat podmnky pro detekci pokozen DNA
4. vod
- pPGM1 a pPGM2 vytvoeny vloenmpalindromatick nukleotidov
sekvencedo pBluescript II SK (-) do msta vzniklho tpenmHindIII
- pBluescript II SK (-) slou jako kontrola pro srovnn
- palindromatick sekvence m schopnost tvoit kovou strukturu u
pPGM2, u pPGM1 mn ochotn
- jednoetzcov sek vlsenku(hairpin loop), kde se nave metylov
skupina MMS
- pi polymerzov etzov reakci dochz v mst metylace kblokaci syntzy
DNA
- Polymerzov etzov reakce (PCR)
- zmnoen DNA nebo jen jej sti
- cyklick denaturace pvodnch a syntza novch etzc vybranch sek
dvouetzcov DNA prostednictvm termostabiln DNA-polymerzy
ztermostabilnch mikroorganism nap.TaqDNA-polymerza
- vymezen danho seku dvmaprimery(stejn Tm)
- exponenciln roste (2 n , n = poet cykl) poet kopi vybranho
seku
AG A CATG C CTAGGCATGTCT Amp r pPGM2 AG G CATG T CTAGGCATGTCT
Amp r pPGM1 - Amp r pBluescript II SK- vloen s ekvence rezistence
plasmid 5. Alkylan inidla
- metylmetansulfont, etylmetansulfont,
- inidlo pokozujc DNA, mutagen, karcinogen
- vznikN7-metylguaninu a N3-metyladeninu
- blokace syntzy DNA pi PCR
- vt reaktivita s jednoetzcovou DNA
Pirozen metylace DNA
-
- bakterie- oznaen vlastn DNA a krozpoznn cizorod DNA (C5-
metylcytosin), regulace replikace a postreplikan
opravy(N6-metyladenin)
-
- obratlovci- regulace genov exprese (C5-metylcytosin v
CGdubletech)
6. Oxidan inidla
- manganistan draseln, hydroxylov radikly
- dvouetzcov DNA oxidovan velmi pomalu, jednoetzcov DNA
snadnji
- pedevm reakce s thyminem, vsledn produkt m naC5 a C6 navzny
hydroxylov skupiny
- fagocytujc buky obsahuj OH , m mikrobicidn inek
7.
- Pprava bunk pro izolaci plasmidov DNA
- odstrann chromozomln DNA a protein vysrenm, centrifugace, slit
pes gzu
- Nanesen roztoku plasmidov DNA na kolonu QIAGEN
- zachycen zporn nabitch nukleovch kyselin na kladn nabitch
koncch DEAE (pH 7) vkolon
- Modifikace s plasmidov DNA s MMS
- vechny koncentrace byly zastoupeny paraleln a inkubovny pi
teplot37 C :
-
-
- jedna koncentran ada po dobu5 minut
Metody 8. PCR modifikovan plasmidov DNA
- Nastaven teplot vtermocykleru:
-
- poten denaturan fze5 minpi94 C
-
- dal denaturan fze30 s pi94 C
-
- hybridizan fze30 s pi60 C
- Agarzov gelov elektroforza
Obsah PCR zkumavky: 1 lplasmidov DNA (0,3 g/ml pPGM1; 0,4 g/ml
pPGM2; 0,8 g/ml pBSK-) 6,5 ldestilovan voda 1 l10x koncentrovanho
pufru proTaqDNA-polymerzu 0,5 lTaqDNA-polymerza (5000 U/ml) 0,25
lbu primer T7 nebo B500for +0,25 lbu primer SK nebo B900rev (100M)
0,125 l dATP;0,125 l dGTP;0,125 ldCTP;0,125 ldTTP (10 mM) 9.
Vsledky 10. Drha:123456789101112131415 Konc. MMS
(mM):01,211,8119,20,65,959,3621,3 0,65,959,3621,31,211,8119,2
Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 10 cyklech
PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drha 1 :
plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-8 : stoupajc koncentrace
(0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut,drhy 9-15 :
stejn stoupajc koncentrace MMS po inkubaci 30 minut. 11.
Drha:123456789101112131415 Konc. MMS
(mM):01,211,8119,20,65,959,3621,3 0,65,959,3621,31,211,8119,2
Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 15 cyklech
PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drha 1 :
plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-8 : stoupajc koncentrace
(0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut,drhy 9-15 :
stejn stoupajc koncentrace MMS (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM)po
inkubaci 30 minut. 12. Drha:1234567891011121314Konc. MMS
(M):00,121,312,950,121,312,95 0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5
minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 10 cyklech PCR
Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drhy 1,14 : plasmid
bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 : stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 %
neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, drhy8-13 : stejn stoupajc
koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut.
13. Drha:1234567891011121314Konc. MMS (M):00,121,312,950,121,312,95
0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace
pPGM2 sMMS po 15 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod,
na 1% gelu.Drhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 :
stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci
5 minut,drhy 8-13 : stejn stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli
0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 14.
Drha:123456789101112131415Konc. MMS (M):00,121,312,950,121,312,95
0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 minModifikace
pPGM1 sMMS po 10 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod a
40 min, na 1% gelu.Drhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy
2-7 : stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po
inkubaci 5 minut,drha 8 : standard (100 bp),drhy 9-14 : stejn
stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci
30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp
200 bp 100 bp 15. Drha:123456789101112131415Konc. MMS
(M):00,121,312,950,121,312,95 0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5
minInkubace 30 minModifikace pBluescript II SK (-) sMMS po 10
cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Drhy
1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 : stoupajc
koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5
minut,drha 8 : standard (100 bp+1 kb),drhy 9-14 : stejn stoupajc
koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut.
10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3500 bp 3000 bp 2500 bp
2000 bp 1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 750 bp 700 bp 600 bp 500 bp
400 bp 300 bp 250 bp 200 bp 100 bp 16. Drha:12345678910111213Konc.
MMS (mM):0,121,312,950,121,312,95 00,622,080,622,080 Inkubace 5
minInkubace 30 minModifikace pBluescript II SK (-) sMMS po 10
cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod a 40 min, na 1%
gelu.Drhy 1,13 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-6 : stoupajc
koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 5
minut,drha 7 : standard (100 bp),drhy 9-12 : stejn stoupajc
koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 30 minut.
1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100
bp 17. Drha:123456789 Zkouka zneitn na pBluescript II SK(-) a pPGM1
po 30 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod a 40 min, na
1% gelu.Drhy 1-4 : pBluescript II SK(-),drha 5 : standard (100
bp),drhy 6-9 : pPGM1.Drhy 1 a 6obsahuj ve
(plasmid,TaqDNA-polymerza, pufr, dest.voda, primery, dNTP),drhy 2 a
7 : ve bez primer,3 a 8 : ve bez plasmidu,4 a 9 : ve
bezTaqDNA-polymerzy. Neustle byla zjiovna pina krtkch sek, nakonec
je vysvtleno, e dvodem je zneitn primer. Ve drhch 2 a 7, kde nejsou
obsaeny primery se neobjevuje zneitn. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp
600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp pBluesript II SK(-)pPGM1
18. Diskuse
- pPGM2 - sekvence schopn vytvoit kovou strukturu->mon detekce
pokozen DNA s MMS
-
-
- metylace vlsenky-> blokace syntzy DNA pi PCR->snen
intenzity DNA se zvyovnm koncentrace MMS ve vzorcch
- pPGM1 - men schopnost tvorby kov struktury->nezaznamenno
pokozen DNA pomoc PCR
-
-
- mal rozestupy mezi koncentracemi a nzk koncentrace MMS nebo nen
identifikace pomoc PCR mon
-
-
- inkubace 5 minut sMMS pi 37 C - intenzita nasyntetizovanch sek
DNAklesala mrnji
-
-
- 30ti minutov inkubace pi 37 C - vt pokles intenzity DNA
- u primer vymezujcch krat seky pi stejnch koncentracch MMS
nasyntetizovno vce sek DNA - del seky obsahuj vce mst pro
metylaci
-
-
- detekce pokozen DNA s MMS pomoc vce rznch primer vymezujcch rzn
dlouh seky DNA a srovnat mezi sebou
-
-
- vt rozestupy mezi koncentracemi MMS a vy koncentrace MMS sclem
pokusu o detekci pokozen DNA u pPGM1
-
-
- optimalizace hybridizan teploty
-
-
- proeten metylace udvouetzcovch sek
19. Zvr
- izolovny plasmidy pPGM1 a pPGM2, pBluescript II SK(-) pro
srovnn
- pomoc PCR bylo detekovno pokozen metylmetansulfontem u pPGM2,
ne u pPGM1
-
-
- primery vymezujc krat seky 140 bz - koncentrace 0,005-5% MMS a
tmto koncentracm odpovdajc molrn koncentrace 0,6-621,3 mM MMS
-
-
- pro primery vymezujc del seky 474 bz u pPGM2 - koncentrace MMS
0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M
-
-
- inkubace s MMS 5 a 30 minut pi 37 C
-
-
- elektroforetick separace pi 80 Vpo dobu 1 hodiny nebo 1 hodiny
a 40 minut na 1 % agarzovm gelu
20. Literatura
- Molekulrn biologie 1-7. Metylace, reparace, rekombinace DNA,
http://www. google . cz / search
?q=7.%09POSTREPLIKA%C4%8CN%C3%8D+MODIFIKACE+DNA& ie = utf
-8& oe = utf -8& aq =t& rls = org . mozilla : cs :
official & client = firefox -a , 11. ervna 2009.
- WIKIPEDIA The Free Encyclopedia,
- http://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_methanesulfonate, 12. ervna
2009.
- Lundin, C., North, M., Erixon, K., Walters, K., Jenssen, D.,
Goldman, A.S.H. and Helleday, T., Methyl methanesulfonate (MMS)
produces heat-labile DNA damage but no detectable in vivo DNA
double-strand breaks,Nucleic Acids Research, 33, 2005
3799-3811.
- WIKIPEDIA The Free Encyclopedia,
- http://en.wikipedia.org/wiki/Ethyl_methanesulfonate, 26. dubna
2009.
- Rhaese, H.J., Boetker, N.K., The Molecular Basis of Mutagenesis
by Methyl and Ethylsulfonates,Eur. J. Biochem., 1973, 32,
166-172.
- Wurdeman, R.L., Douskey, M.C. and Gold, B., DNA methylation by
N-methyl-N-nitrosourea: methylation pattern changes in single- and
double-stranded DNA, and in RNA with mismatched or bulged
guanines,Nucleic Acids Research, 1993, 21 4975-4980.
- Bui, C.T., Rees, K., Cotton R.G.,Permanganate oxidation
reactions of DNA: perspective in biological studies,Nucleosides
Nucleotides Nucleic Acids, 22 (9), 2003, 1835-1855.
- Peinka, P.,Pouit chemickch sond pi studiu loklnch struktur DNA
in vitro a in
- situ, kandidtsk disertan prce,Brno, 1993.
- Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W., DNA Repair and
Mutagenesis . ASM Press, 1995. ISBN 1-55581-088-8.
- Peinka, P., Laboratorn cvien zmolekulrn biologie,Ostrava, 2007.
ISBN 978-80-7368-414-3.
- Paleek, E., Local Supercoil-Stabilized DNA Structures,Critical
Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, 1991,
151-226.
- Kogo, H., Inagaki, H., Ohye, T., Kato, T., Emanuel, B.S., and
Kurahashi, H., Cruciform extrusion propensity of human
translocation-mediating palindromic AT-rich repeats.Nucleic Acids
Research. 35, 2007, 1198-1208.
- Structure of nucleic acids, http:// images . google . cz /
imgres ? imgurl =http://web. virginia . edu / Heidi /chapter12/
Images /8883n12_27. jpg & imgrefurl =http://web. virginia . edu
/ Heidi /chapter12/chp12. htm & usg
=__hvefvvfO03eb7LwyYMgRkIUrIcY=&h=189&w=343& sz
=10& hl = cs &start=9&um=1& tbnid
=x4qpPQQPYqUJHM:& tbnh =66& tbnw =120& prev =/ images
%3Fq%3DDNA%2Bcruciform%2Bstructure%26hl%3Dcs%26lr%3D%26client%3Dfirefox-a%26channel%3Ds%26rls%3Dorg.
mozilla : cs : official %26sa%3DN%26um%3D1 , 20. dubna 2009.
- Vierstraete A. Department of Biology, Faculty of Science,
University of Ghett .1999.
- Citovno z:Linhartov, P., Molekulrn genetick metody pro studium
pbuznosti kmen Acidothiobacillus ferrooxidans, Bakalsk prce,Brno,
2006.
- marda, J., Doka, J., Pantek, R., Rikov V., Koptkov, J., Metody
molekulrn biologie,Brno, Vydavatelstv MU, 2005. ISBN
80-210-3841-1.
- Fermentas LIFE SCIENCES, http://www. fermentas . com / techinfo
/ nucleicacids / mappbluescriptiiskks . htm , 8. dubna 2009.
- WIKIPEDIA The Free Encyclopedia,
- http://en.wikipedia.org/wiki/PCR, 19. ervna 2009.
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/58062?report=genbank, 20.
dubna 2009.