Autor: Jana Široká

Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc

Ostravská Univerzita

Přírodovědecká fakulta

Úvod Elektrochemické metody lze použít při detekci

poškození DNA (řetězcových zlomů a poškození bazí) a k detekci elektroaktivních látek interagujících s DNA.

Elektrochemická aktivita DNA je odvozena od elektrochemických vlastností jejích stavebních prvků.

Měřením na rtuťových elektrodách lze sledovat i malé změny ve struktuře dsDNA. Tyto změny se na elektrochemické odezvě projevují kvantitativně (změnou intenzity jednotlivých píků) i kvalitativně (různé formy DNA poskytují píky při různých potenciálech).

Adsorpčně-desorpční děje

Adsorpčně-desorpční děje dávají vzniknout tzv. tensametrickým (kapacitním) signálům, které mohou poskytnout informace o vlastnostech DNA na povrchu elektrody.

Molekuly DNA jsou záporně nabité a při vložení negativního potenciálu na elektrodu dochází k jejich elektrostatickému odpuzování, které může mít za následek jejich desorpci nebo reorientaci. Přitom se mění diferenciální kapacita elektrodové dvojvrstvy a objevují se tensametrické píky.

Obr. 1: tenzametrické píky

a) nadšroubovicové kovalentně uzavřené kružnicové DNA neobsahující volné konce (pík 1 odpovídá adsorpci/desorpci částí molekul DNA adsorbovaných prostřednictvím cukrfosfátové páteře) a

b) poškozené DNA (pík 3 odpovídá odvinutým úsekům DNA adsorbovaným prostřednictvím bází).

(Čs. čas. fyz. 56, 2006)

Charakter odezvy závisí na tom, které složky molekul DNA se adsorpčně-desorpčních dějů účastní. Úseky DNA, které jsou na povrchu elektrody adsorbovány prostřednictvím negativně nabité cukr-fosfátové páteře, podléhají segmentální desorpci okolo potenciálu 1,1 V (pík 1), distortované oblasti dvoušroubovice okolo -1,2 V (pík 2). Účastní-li se adsorpce molekul DNA na elektrodovém povrchu zbytky bází, dochází k desorpci při potenciálech kolem 1,3 V (pík 3).

Cíle:

Izolace plasmidové DNA s vhodnými sekvencemi pro přímé poškození cukr-fosfátové páteře a pro poškození bází DNA

Modifikace izolované DNA genotoxickými látkami. K detekci poškození DNA použít elektrochemické postupy.

Srovnání citlivosti elektrochemických a elektroforetických metod při detekci poškození DNA.

Izolace DNA Plasmid BlueSkript byl získán z bakterií izolací

pomocí kolonek Quiagen. Podstatou izolace je alkalická lýze a oddělení

nerozpustné buněčné frakce s chromozomální DNA od vodné frakce, ve které je rozpuštěna plasmidová DNA. Vodná frakce je nanesena na kolonu. Kladné náboje v koloně interagují se záporně nabitými NK a zadrží je. Z kolony jsou nežádoucí biomakromolekuly jsou vymyty pufrem. Eluce DNA je provedena pufrem o vyšší iontové síle než je promývací pufr.

Pro odstranění zbytků proteinů byla použita fenol-chloroformová extrakce, kde fenol slouží jako denaturační činidlo a chloroform slouží k odstranění zbytků fenolu.

Poškození DNA Byl zjišťován vliv manganistanu draselného a

hydroxylových radikálů (vzniklých Fentonovou reakcí (CuCl2+ H2O2) na DNA. Vzorky byly připravovány v objemu 20l ve fosfátovém nebo Tris-HCl pufru (0,02M). Manganistan draselný je silné oxidační činidlo, které

reaguje s thyminem a také způsobuje řetězcové zlomy. Hydroxylové radikály reagují s bázemi i se zbytky

deoxyribóz a jejich působením vznikají řetězcové zlomy. Vzorky byly inkubovány 30 minut při 37°C, poté byly

přesráženy octanem sodným a etanolem a rozpuštěny ve 20l 0,2 M NaCl.

Detekce poškození byla prováděna gelovou elektroforézou a AC voltametrií na HMDE.

Výsledky

Koncentrace KMnO4 (mM)

K 24 12 6 4 2 1 0,5 K 1 0,5 0,25 0,1 0,05 0,02 0,01

Obr. 3: Modifikace DNA v závislosti na koncentraci KMnO4

Obr. 2: Izolace DNA; dráhy: 1. bakteriální lyzát před nanesením na kolonu, 2. vzorek prošlý ekvilibrovanou kolonou, 3. a 4. promývací frakce, 5. eluovaná DNA, 6. 1kb žebřík

1 2 3 4 5 6

ocDNA

scDNA

Obr. 4: Modifikace DNA KMnO4; plasmid pBS (75mg/ml) ve fosfátovém pufru

Obr. 5: Modifikace DNA KMnO4; plasmid pBS (34.5mg/ml) ve fosfátovém pufru

Obr. 6: Modifikace DNA KMnO4; plasmid pBS (57.5mg/ml) ve fosfátovém pufru

Obr. 7: Modifikace DNA hydroxylovými radikály , plasmid pBS ve fosfátovém pufru

Obr. 8: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; závislost výšky píků na koncentraci CuCl2; plasmid pBS ve fosfátovém pufru

Obr. 9: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; plasmid pPGM1 (60mg/ml) v pufru Tris-HCl

Obr. 10: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; závislost výšky píků na koncentraci CuCl2; plasmid pPGM1 (60mg/ml) v pufru Tris-HCl

Byl potvrzen vliv KMnO4 na strukturu plasmidové DNA - tvorba řetězcových zlomů. Elektrochemická detekce poškození při vyšších koncentracích KMnO4 nebyla možná.

U vzorků modifikovaných hydroxylovými radikály docházelo k nárůstu obou píků se zvyšující se koncentrací CuCl2.

U vzorků, které byly připravovány ve fosfátovém pufru, se objevilo jen velmi malé zvýšení píku 3 oproti píku 1. Použití fosfátového pufru pravděpodobně zpomaluje reakci.

U vzorků připravovaných v pufru Tris-HCl v nejvyšších koncentracích došlo k viditelnému zvýšení píku 3, který odpovídá ocDNA.

Srovnání metod: elektrochemická metoda je rychlejší než elektroforetická. Zdá se, že je také mnohem citlivější ke změnám ve struktuře DNA.

Signál může být ovlivněn vedlejšími interakcemi látek s elektrodou.