Apoptóza Apoptóza DetekceDetekce

Význam Význam

ObsahObsah

Definice, historie apoptózyDefinice, historie apoptózy Morfologie apoptózyMorfologie apoptózy Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy Apoptóza ve fyziologických procesechApoptóza ve fyziologických procesech Apoptóza v patologických procesechApoptóza v patologických procesech Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumuApoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumu

Definice, historie apoptózyDefinice, historie apoptózy

Programovaná buněčná smrt, aktivní proces, liší se od Programovaná buněčná smrt, aktivní proces, liší se od nekrózynekrózy

• Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenom with wide ranging implications biological phenomenom with wide ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972), 26, in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972), 26, 239 239

Evolučně konzervovaný (Evolučně konzervovaný (Caenorrhabditis elegansCaenorrhabditis elegans)) – – podzimní padání listů ze stromůpodzimní padání listů ze stromů

Morfologie apoptózyMorfologie apoptózy

Kondenzace chromatinu Kondenzace chromatinu

BuddingBudding

Apoptotická tělískaApoptotická tělíska

Morfologie apoptózyMorfologie apoptózy(ELMI)(ELMI)

Fáze a mechanizmy vzniku procesu Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózyapoptózy

Indukce apoptózyIndukce apoptózy Aktivace efektorů apoptózyAktivace efektorů apoptózy Fáze degradaceFáze degradace

Indukce apoptózyIndukce apoptózy

RadiaceRadiace HypertermieHypertermie CytostatikaCytostatika CytokinyCytokiny Interakce T lymfocytů s cílovými buňkamiInterakce T lymfocytů s cílovými buňkami Hypoxie, kyslíkové radikály, atd.Hypoxie, kyslíkové radikály, atd.

Aktivace efektorů apoptózyAktivace efektorů apoptózy

Receptorová signální dráhaReceptorová signální dráha Nereceptorová signální dráha-poškození DNA, hypoxie, Nereceptorová signální dráha-poškození DNA, hypoxie,

atd.atd. Mitochondriální signální dráhaMitochondriální signální dráha

Pozn. Pozn.

Na všech drahách se podílí členové rofiny BCL-2 !!Na všech drahách se podílí členové rofiny BCL-2 !!

Apoptóza - receptorová signální dráhaApoptóza - receptorová signální dráha(převzato z Science, Vol 281, p 1306, 1998)(převzato z Science, Vol 281, p 1306, 1998)

Apoptóza - receptorová signální dráha Apoptóza - receptorová signální dráha (FAS-L)(FAS-L)

Apoptóza - nereceptorová signální dráhaApoptóza - nereceptorová signální dráha(převzato z Science, Vol 281, p 1320, 1998)(převzato z Science, Vol 281, p 1320, 1998)

Mitochondriální signální dráhaMitochondriální signální dráha

APAFAPAF Cytochrom cCytochrom c Ionty CaIonty Ca

Rodina proteinů BCL-2 (antiapoptotické)Rodina proteinů BCL-2 (antiapoptotické)(převzato z Science, Vol 281, p 1322, 1998)(převzato z Science, Vol 281, p 1322, 1998)

Rodina proteinů BCL-2 (proapoptotické)Rodina proteinů BCL-2 (proapoptotické)(převzato z Science, Vol 281, p 1322, 1998)(převzato z Science, Vol 281, p 1322, 1998)

Kaspázy (Caspases)Kaspázy (Caspases)

Cysteinyl Aspartate Cysteinyl Aspartate Specific ProteinasesSpecific Proteinases

Neaktivní prekurzoryNeaktivní prekurzory Specifické substrátySpecifické substráty

Fáze degradaceFáze degradace

Substráty kaspázSubstráty kaspáz• lamin Blamin B• keratin 18 keratin 18 • PARPPARP Fragmentace DNA - DNA ladderingFragmentace DNA - DNA laddering Změny na cytoplasmatické membráněZměny na cytoplasmatické membráně

Fáze a mechanizmy vzniku procesu Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf I.apoptózy – souhrný graf I.

(převzato z xxx)(převzato z xxx)

Fáze a mechanizmy vzniku procesu Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf II.apoptózy – souhrný graf II.

(převzato z xxx)(převzato z xxx)

Fáze a mechanizmy vzniku procesu Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf III.apoptózy – souhrný graf III.

(převzato z xxx)(převzato z xxx)

Fáze a mechanizmy vzniku procesu Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf IV.apoptózy – souhrný graf IV.

(převzato z xxx)(převzato z xxx)

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Světelná mikroskopie Světelná mikroskopie • apoptotická tělískaapoptotická tělíska Elektronová mikroskopie – ultrastruktura Elektronová mikroskopie – ultrastruktura • kondenzace chromatinukondenzace chromatinu• buddingbudding Změny DNA Změny DNA • DNA laddering, DNA laddering, • značení štěpených konců DNA (TUNEL, ISNTA)značení štěpených konců DNA (TUNEL, ISNTA) Změny na cytoplasmatické membráně – Změny na cytoplasmatické membráně – • exposice PS (fosfatidylserin) a vazba Annexinu V exposice PS (fosfatidylserin) a vazba Annexinu V • permeabilita membrány a vazba barviv na DNA (Hoechst, permeabilita membrány a vazba barviv na DNA (Hoechst,

DAPI) DAPI)

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Substráty kaspáz Substráty kaspáz • detekce štěpení PARP, laminu B, transglutaminázydetekce štěpení PARP, laminu B, transglutaminázy Mitochondriální funkce Mitochondriální funkce • uvolňování cytochromu c, uvolňování cytochromu c, • změny membránového potenciálu mitochondriální změny membránového potenciálu mitochondriální

membrány (rhodamin 123, Mitotracker)membrány (rhodamin 123, Mitotracker)

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy(TUNEL)(TUNEL)

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy(Lamin B)(Lamin B)

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy(xxx)(xxx)

Metody detekce apoptózyMetody detekce apoptózy

Použití pouze jedné z metod nedokazuje jednoznačně Použití pouze jedné z metod nedokazuje jednoznačně přítomnost apoptózy – je třeba použít nejméně dvě přítomnost apoptózy – je třeba použít nejméně dvě metody (např. morfologie a TUNEL)!!metody (např. morfologie a TUNEL)!!

Apoptóza ve fyziologických procesechApoptóza ve fyziologických procesech

EmbryogenezeEmbryogeneze Klimakterium, seniumKlimakterium, senium Ochrana „imunoprivilegovaných“ místOchrana „imunoprivilegovaných“ míst

Apoptóza v patologických procesechApoptóza v patologických procesech

Patologická inhibice apoptózyPatologická inhibice apoptózy Patologická indukce apoptózyPatologická indukce apoptózy

Patologická inhibice apoptózyPatologická inhibice apoptózy

NádoryNádory• folikulární lymfomyfolikulární lymfomy• karcinomy s mutací genu p53karcinomy s mutací genu p53• hormonálně dependentní nádory (karcinomy mléčné hormonálně dependentní nádory (karcinomy mléčné

žlázy, prostaty, vaječníku)žlázy, prostaty, vaječníku) Autoimunní chorobyAutoimunní choroby• systémový lupus erythematodessystémový lupus erythematodes• glomerulonefritidyglomerulonefritidy

Patologická inhibice apoptózyPatologická inhibice apoptózy

Virové infekce Virové infekce • HerpesviryHerpesviry• PoxviryPoxviry Bakteriální infekce Bakteriální infekce • TBCTBC Alergická onemocněníAlergická onemocnění

Patologická indukce apoptózyPatologická indukce apoptózy

AIDSAIDS

Neurodegenerativní onemocněníNeurodegenerativní onemocnění • Alzheimerova chorobaAlzheimerova choroba• Parkinsonova chorobaParkinsonova choroba• amyotrofická laterální sklerózaamyotrofická laterální skleróza

Patologická indukce apoptózyPatologická indukce apoptózy

Myelodysplastické syndromyMyelodysplastické syndromy• aplastická anemieaplastická anemie Ischemické poškozeníIschemické poškození• infarkt myokarduinfarkt myokardu• mozková apoplexiemozková apoplexie Toxické poškození jaterToxické poškození jater• alkoholalkohol

Apoptóza v diagnóze a terapii a Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumuperspektivy výzkumu

Intenzivní studium mitochondriální dráhyIntenzivní studium mitochondriální dráhy Zaměření na roli iontu Ca v procesu apoptózyZaměření na roli iontu Ca v procesu apoptózy Zlepšení metod detekce apoptózy Zlepšení metod detekce apoptózy • fluorescenční dynamická detekce změn na membránách fluorescenční dynamická detekce změn na membránách • „„timing“ jednotlivých změn – nutnost kvalitní timing“ jednotlivých změn – nutnost kvalitní

zobrazovaní a záznamové technikyzobrazovaní a záznamové techniky

Apoptóza v diagnóze a terapii a Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumuperspektivy výzkumu

Imunohistochemické stanovení exprese BCL-2 v dif. Imunohistochemické stanovení exprese BCL-2 v dif. dg. dg. folikulární lymfomfolikulární lymfom x x folikulární hyperplasiefolikulární hyperplasie

Imunohistochemické stanovení proteinů regulujících Imunohistochemické stanovení proteinů regulujících apoptózu jako apoptózu jako indikátorů prognózyindikátorů prognózy (BCL-2 u (BCL-2 u karcinomu mléčné žlázy, stanovení laminu B u karcinomu mléčné žlázy, stanovení laminu B u astrocytomů...)astrocytomů...)

Apoptóza v diagnóze a terapii a Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumuperspektivy výzkumu

Možné ovlivnění regulačních apoptotických drah Možné ovlivnění regulačních apoptotických drah pomocí pomocí genové terapiegenové terapie (v současnosti klinické studie s (v současnosti klinické studie s p53 např. u ca. plic…)p53 např. u ca. plic…)

Komplexní analýza apoptotických regulačních drah u Komplexní analýza apoptotických regulačních drah u různých nádorů pomocí různých nádorů pomocí „apoptotických“ DNA chips „apoptotických“ DNA chips (microarrays)(microarrays) a a laserové mikrodisekcelaserové mikrodisekce – nové klinické – nové klinické subjednotky = kvalitnější, cílenější léčbasubjednotky = kvalitnější, cílenější léčba