TEMARIO
1. Introducción
2. Transformación de hongos
2.1 Antecedentes
2.2 Protocolos de Transformación
2.3 Vectores de Transformación
2.3.1 Marcadores de selección
1. INTRODUCCIÓN
Organismos eucariotas Hospederos para la
producción de proteínas
Se clasifican en: Levaduras (Unicelulares ) Hongos Filamentosos
Amplia diversidad de aplicaciones biotecnológicos
Características principales de los hongos
Mayor tamaño y genoma Organización celular compleja Núcleo definido Ciclos de vida complejos
Crecimiento vegetativo (micelios) Morfogénesis (cambio de forma)
Forma esporas sexuales y esporas asexuales
Los cromosomas que pueden ser separados por electroforesis.
1. INTRODUCCIÓN
2. TRANSFORMACIÓN DE LOS HONGOS
2.1 Antecedentes Los primeros experimentos en los años 70s.
Transfiriere fragmentos de
ADN cromosomal
Cepas mutantes
(requerimientos específicos)
Cambia un aminoácido o nucleótido.
Basado en convertir:células del hongo en protoplastos
2.2 Protocolos de transformación
Hongos filamentosos se basa en el método de convertir el micelio del hongo en protoplastos.
Existen varias modificaciones al método básico, con las cuales se pretende mejorar la frecuencia de transformación
2.2 Protocolos de transformación
2.3. Vectores de transformación
Los vectores de transformación son diseñados para:
Transformación
integrativa
Ser mantenidos
como plásmidos
• Recombinación homóloga
• Integración Ectópica
Insertar el ADN en un sitio con similitud
Se integra al azar
Vectores multifuncionales: Genes que permiten su selección
Orígenes de replicación (ori)
2.3. Vectores de transformación
Esquema del vector multifuncional
2.3.1 Marcadores de selección
Identificadores de células transformadas
• Transformación heteróloga
• Transformación Homóloga
Complementan auxotróficos
• Ejemplos: Higromicina B,fleomicina, kanamicina o el benomil
• Desventaja: pueden presentar resistencias
Resistencia antibiótica • crecer fuentes de
carbono y nitrógeno que la sepa hospedante no utiliza
• Ejemplo: gen de acetamidasa
Confieren la capacidad de
crecer
Los vectores son usados para:
Aumentar el número de copias de un gen en los cromosomas.
Interrumpir o reemplazar un gen deseado o no deseado.
Levadura ha permitido separa cerca de 6000 genes para determinar las funciones de cada uno de ellos
2.3. Vectores de transformación
Casete consiste en un
gen de selección (encuentra en cada extremo junto con cadenas cortas del gen a modificar)
el vector (liberado por acción de una enzima de restricción).
2.3. Vectores de transformación
2.3. Vectores de transformación
Compara su fenotipo hasta asociar un gen particular con una función particular, no siempre se origina un fenotipo detectable.
Levaduras obtención mayor eficiencia de recombinación homóloga que en hongos filamentosos, pues la recombinación es más fácil al trabajar con fragmentos cortos de ADN y cada deleción se marca con una secuencia única.
(a) Integración al azar
Por sobrecruzamiento de secuencias de ADN
(b) Integración modificada por enzima de restricción
Solamente en el sitio que actúa la enzima de restricción
2.3. Vectores de transformación
Para asegurar una buena expresión del gen
Se puede dirigir el gen hasta el sitio específico del cromosoma.
• .
2.3. Vectores de transformación
Una cepa que contiene un gen determinado mutado con un plásmido que contiene el mismo gen. El gen se volverá funcional si existe un sobrecruzamiento simple y el vector se integra en el mismo sitio que el gen
Hongo filamentoso por doble sobrecruzamiento
La enzima de restricción corta una sola vez el plásmido y los vuelve lineal.
2.3. Vectores de transformación
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