7/24/2019 Tecnologa Del DNA Recombinante
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Universidad Central de VenezuelaFacultad de MedicinaEscuela de Medicina Jos Mara VargasCtedra de Bioqumica
Br. Fabin odrguez
Caracas! "e#tiembre $%&%
'ecnologa del()* ecombinante
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Contenido
&. ecombinaci+n ,entica$. 'rans-erencia del ()*. Clonaci+n del ()*
.
Endonucleasas de estricci+n. Vectores de Clonaci+n. Bibliotecas de ()* ecombinante
/. eacci+n en Cadena de la 0olimerasa1. "out2ern blot
3. *#licaciones de la 'ecnologa del ()*ecombinante
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EC4MB5)*C56) ,7)E'5C*
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ecombinaci+n
eordenamiento de la 5n-ormaci+ngentica dentro 8 entre molculas
de ()*
ecombinaci+n ,entica
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ecombinaci+n
ecombinaci+n gentica 2om+loga9 entresegmentos homlogos de 2 molculas de DNA.Sitios inespecfcos.
ecombinaci+n es#ec:ca de sitio9recombinacin entre sitios precisos de DNA.
'rans#osici+n9 Segmentos cortos de DNA queson capaces de trasladarse de un segmento delDNA a otro.
Clases de ecombinaci+n
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'*)"FEE)C5* (E ()*
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'rans-erencia
*lgunas bacterias #ueden trans-erirsegmentos de ()* entre ellas #ara#osteriormente recombinarlos con
su #ro#io ()*.
'rans-erencia de ()*
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ecombinaci+n
0roceso en el cual una bacteria incor#ora un -ragmentode ()* que se encuentra en el medio e;terno
sedenominan Com#etentes?Com#onentes@
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ecombinaci+n
0roceso de trans-erencia de()* entre dos bacteriasdurante el cual un 0lasmido es
incor#orado a travs de un =#ilise;ual>
8 #osee un -actor de-ertilidad ?F@ 8 el #ili se;ualmientras que la clula rece#torase denomina =2embra> 8 no#osee -actor de -ertilidad ?FD@
0or este #roceso se trans:eren
'i#os de 'rans-erencia
Conugaci+n
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ecombinaci+n
El #roceso de trans-erencia esllevado a cabo #or un virusbacteriano! un Bacterio-ago! elcual in8ecta su ()* al
cito#lasma bacteriano
! sin destruir la clula.#uede #asar a -ase ltica.
'i#os de 'rans-erencia
'ransducci+n
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ecombinaci+n
0roceso en el que se trans:ere un segmento de ()* deun lugar a otro dentro de un mismo cromosoma o entreel cromosoma! #lasmidos o bacteri+-ago #resentes en la
clula.
E;isten clases de elementos trans#onibles9 secuenciasde inserci+n ?5"@! trans#osones 8 -agos Mu
'i#os de 'rans-erencia
'rans#osici+n
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C
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Clonaci+n
Consiste en #ro#agar un-ragmento de ()* en otra clula
Un clon es una #rogenie de
clulas que se derivan de unasola clula! cada una de lascuales contiene la mismain-ormaci+n gentica
El -ragmento a clonar #uedeinsertarse in vitro en un #lsmido#ara luego reinsertarlo en labacteria o introducirse en unbacteri+-ago que luego in-ectar
la clula bacteriana?'rans-ecci+n@
Clonaci+n del ()*
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Clonaci+n
"elecci+n del-ragmento a clonar.
Corte del -ragmentodel ()* original.
5nserci+n del-ragmento en unvctor ?ve2culo@.
ecombinaci+nentre el -ragmentoa clonar 8 el vector.
5ntroducci+n en la
clula del vectorrecombinante.
e#licaci+n delgenoma de laclula.
*islamiento del-ragmento de ()*
Clonaci+n del ()*
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E)(4)UC
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Clonaci+n
Enzimas bacterianas que cortan es#ec:camente el enlace
-os-odiester de secuencias en las dobles cadenas de ()*.
)o #ueden actuar sobre ()* metilado 8 sirven como de-ensa #ara laclula bacteriana.
,eneralmente reconocen sitios #alindr+micos ?sitios de restricci+n@
"e denominan de acuerdo al organismo que les dio origen9
Eco5 Escherichia coli
Endonucleasas de estricci+n
Cl i+
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Clonaci+n
E;isten dos clases deEndonucleasas de estricci+n9
'i#o 59 com#leos multienzimticos
con doble actividad metilasa 8endonucleasa! requieren *'0 8 "Dadenosilmetionina 8 cortan adistancia del sitio dereconocimiento.
'i#o 559 dmeros s+lo con actividadendonucleasa sobre un sitio dereconocimiento es#ec:co.
Endonucleasas de estricci+n
Eco5 reconoce la secuencia derestricci+n ,**''C 8 corta entre, 8 *
Cl i+
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Clonaci+n
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VEC'4E" (E C
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Clonaci+n
Molcula de ()* a la cual se une el -ragmentode ()* que se desea clonar.
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Clonaci+n
Molculas de ()*e;tracromosomales! #equeGas8 circulares
"u re#licaci+n #uede serinde#endiente de la delcromosoma bacteriano
0ueden e;istir varias co#ias#or clula.
Uno de los ms utilizados 2a
sido #B$$
Vectores de Clonaci+n
0lsmidos
Cl i+
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Clonaci+n
El vector a utilizar debe ser clivadocon la misma endonucleasa derestricci+n utilizada #ara usado#ara generar los -ragmentos a
recombinar.
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Clonaci+n
Molcula de ()* viral de 1%.%%% #b.
* este ()* se le quita un segmento de
$/.%%% #b con Eco 5! #ara que #ueda#ortar el ()* de inters ?se liga con()* ligasa@.
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Clonaci+n
Vectores 2bridos entre #lsmidos 8-agos! creados #or el 2ombre! #araclonar -ragmentos muc2o msgrandes! de 2asta /1.%%% #b
Vectores de Clonaci+n
C+smidos
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B5B
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Clonaci+n
,ru#o de clones! cada uno con un-ragmento distinto de ()*! entre loscuales se encuentra el de inters.
,enoteca gen+mica9 #roducida a #artirdel ()* gen+mico! inclu8e al genoma
com#leto! #ero no como se e;#resa.Utiliza C+smidos.
,enoteca de e;#resi+n o Biblioteca dec()*9 #roducida a #artir del m)*.5nclu8e s+lo los m)* que se e;#resan
en el ti#o celular del cual se e;trao. )oinclu8e #romotores! ni intrones! niotras regiones no codi:cantes.equieren realizar 'ranscri#ci+nreversa. Utiliza 0lsmidos
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Clonaci+n
0uede utilizarseuna sonda de
2ibridaci+nmarcadaradioactivamente.
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Clonaci+n
0uede utilizarse una sonda de2ibridaci+n marcadaradioactivamente.
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Clonaci+n
Una vez reconocidos!#ueden aislarse los clones!mediante el reconocimientode las #rotenassintetizadas a #artir deellos #ara esto #uede
usarse el Hestern blot
,enotecas
econocimiento de los clones.
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E*CC56) E) C*(E)* (E
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0C
'cnica de *M0
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0C
El #roceso requiere9 conocer lasecuencia del -ragmento a am#li:car!dos #rimers! d)'0 8 un ()* #olimerasatermoestable ?()* #olimerasa deThermophilus aquaticuso 'aq #oli@
(esnaturalizaci+n9 el *() es calentado aI/DI1C ; &K #ara se#arar la doblebanda.
*lineamiento9 desciende la tem#eratura
#ara que cebadores ?#rimers@ diseGadoses#ec:camente se unan al ()*monobanda. 1$C
Elongaci+n9 sube la tem#eratura 2astala +#tima de la ()* 0olimerasa usada.
L$C
eacci+n en Cadena de la0olimerasa
0C
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0C
eacci+n en Cadena de la0olimerasa
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"4U'E) B
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"out2ern blot
'cnica que #ermite localizar un gen en #articular.
"e digiere el ()* con endonucleasas de restricci+n se realizaelectro-oresis en agarosa! se desnaturalizan los -ragmentos! setrans:eren a un #a#el de nitrogelulosa se incuban con sondas de ()*marcado se realiza autoradiogra-a.
"out2ern blot
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*0
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*#licaciones del ()* ecombinante
*#licaciones del ()* ecombinante
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*#licaciones del ()* ecombinante
En la bD" 2a8 una sustituci+n del ,lu ?,*,@ en #osici+n 3 de la OD
globina #or una Valina ?,',@
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# cac o es de eco b a e
uella (actilar del ()*
En todos los individuos e;istensecuencias re#etidas en =tandem>?V)'@ que se re#iten de $ a ms de&%% veces #or locus. El #atr+n dere#eticiones es #ro#io de cadaindividuo.
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Siempre he defendido ferozmente la posicinde que debemos basar nuestra visin del
mundo en el estado de nuestroconocimiento, en los hechos, y no en lo que
nos gustara que ocurriera. or eso lagen!tica es tan importante. orque nosllevar" a respuestas para muchas de las
mayores y m"s complicadas cuestiones quehan preocupado a la gente durante cientos
#...$ de a%os. ero muchas de esasrespuestas no son f"ciles, puesto que #...$ la
gen!tica puede ser cruel.
James Hatson
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&unque circunstancialmente no obtengan
una cali'cacin alta, nuestra profesin esde largo aliento y se construye paso apaso.
(r. *le;is C2irinos
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,racias
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"E *C*B6 ,E)7'5C*8 8a casi se acaba el
cursoP