Tecnología de ADN recombinante

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Tecnología de ADN recombinante

Garrido, A., Villaverde, C., Blanco, M., Teijón, J., Mendoza, C., Ramírez, J. (2006). Tema 25: Tecnología de ADN recombinante. En Fundamentos de Bioquímica Metabólica (3a Ed., Pág. 337-352). Madrid: Editorial Tébar.

La tecnología del ADN recombinante comprende una seriede métodos para identificar un gen (o segmentos concretos deADN) en un organismo, aislarlo, analizarlo, si es preciso, modi-ficarlo y reinsertarlo dentro de otro organismo consiguiendoque se exprese con normalidad.

Los objetivos de este conjunto de técnicas son, principal-mente:

1. Obtener grandes cantidades del producto del gen.2. Conocer las consecuencias de una determinada modifi-

cación del gen en el funcionamiento celular.3. Sustituir un gen defectuoso por otro normal.

Estas técnicas han permitido un avance considerable de labiología y genética molecular, la medicina, la agricultura y laecología. En medicina están proporcionando nuevos métodosde diagnóstico, de agentes terapéuticos y revelando el mecanis-mo molecular de diversas enfermedades.

FUNDAMENTOS DE LA CLONACIÓN

El conjunto de bacterias que surgen de una bacteria aisladaen una placa de cultivo, y que se conoce como colonia, es, sen-cillamente, un clon. Clonar es hacer copias idénticas de unosorganismos, células, virus o moléculas de ADN derivadas de lareplicación de un único progenitor genético. Mediante la clona-ción se puede disponer de cantidades suficientes de un únicotipo de células.

TEMA 25 Tecnología deADN recombinante

Fundamentos de la clonación. Vectores de clona-ción. Estrategia de la clonación. Aplicaciones a lasciencias médicas.

© Editorial Tébar. Prohibida la reproducción sin la autorización expresa de la editorial

La clonación de un gen o un fragmento de ADN implica laseparación del resto del genoma, la unión a una molécula por-tadora y la inserción en un organismo para poder amplificarlomuchas veces. Con este procedimiento se pueden obtener mi-les e incluso millones de copias del gen o fragmento de ADNinicial.

La clonación requiere básicamente las siguientes etapas:

1. Corte del ADN genómico por sitios específicos y obten-ción de los fragmentos de ADN.

2. Elección de moléculas de ADN (vectores) capaces deautorreplicarse y corte específico de las mismas.

3. Unión de los fragmentos de ADN a las moléculas auto-rreplicativas (recombinación).

4. Introducción de ambas en una célula huésped.5. Selección e identificación de células huésped que contie-

nen el ADN recombinante.

El corte del genoma para obtener fragmentos de ADN serealiza mediante enzimas de restricción o endonucleasas de res-tricción. Estas sustancias reconocen secuencias específicas deADN de doble cadena y cortan ambas en lugares específicos.Las secuencias reconocidas son palindrómicas, esto es, poseensimetría rotacional respecto a un eje. Los cortes son de dos ti-pos: uno en que se cortan las cadenas simétricamente respectoa un eje y otro en que se cortan en el mismo punto. El primerodeja extremos cohesivos o adhesivos y el segundo extremos ro-mos (Fig. 25.1).

338 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Figura 25.1.– Especificidad de las enzimas de restricción. La Ban H1 yla Eco RI dejan extremos cohesivos y la HhaI romos.

Etapas de la clona-ción:1. Cor te de l ADN

genómico por si-tios específicos.

2. Elección de molé-culas de ADN (vec-tores) capaces deautorreplicarse.

3. Unión de los frag-mentos de ADN alos vectores.

4. Introducción delos fragmentos deADN-vector en cé-lulas huésped.

5. Selección e identi-ficación de célulashuésped con el vec-tor e inserto ade-cuado.

Las enzimas de res-tricción reconocen ycortan ADN de doblecadena por sitios es-pecíficos.

Las palabras o frasespalindrómicas sonaquel las que soniguales se comiencepor la primera o porla última letra:– Radar.– Dábale arroz a la

zorra el abad.


Se han caracterizado y purificado cientos de enzimas a laque se denomina por una abreviatura correspondiente a la es-pecie bacteriana de la que derivan. Así, Bam de Bacillus am-gloliquefaciens, Eco de Escherichia coli, Hal del Haemophilusaegyptius, etc.

Los fragmentos de ADN resultantes dependiendo del ta-maño, se pueden separar por electroforesis en geles de poliacri-lamida o agarosa; los geles de poliacrilamida separan fragmen-tos de unos mil pares de bases y los de agarosa de 15.000 a20.000 pares de bases. Los fragmentos se separan en bandasque se pueden visualizar añadiendo a la disolución de los gelescolorantes como bromuro de etidio, que a la luz ultravioletapresenta una intensa fluorescencia de color naranja. La longi-tud o tamaño de los fragmentos de ADN se puede conocer me-diante la comparación de las bandas con fragmentos patronesde longitud conocida (marcadores). Cada fragmento de ADNse puede purificar cortando la banda correspondiente del gel,eliminando la matriz del gel y el colorante.

TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 339

Figura 25.2.– Fragmentos de ADN obtenidos de un genoma con diferentes en-zimas de restricción. Los fragmentos de mayor tamaño son los de parte su-perior. El tamaño de los fragmentos se conoce comparando con fragmentos

patrones de longitud conocida.


Para identificar en cuál de las bandas se encuentra el gen ola secuencia de ADN de nuestro interés se suele realizar una hi-bridación. Esta técnica consiste en desnaturalizar los fragmen-tos de ADN que aparecen en el gel después de la eletroforesis ytransferirlos a membranas de nitrocelulosa o nylon. Las posi-ciones de los fragmentos en el gel se mantienen en la membra-na. Después la membrana se introduce en una disolución quecontiene una sonda radiactiva marcada con 32P (Fig. 25.3).Posteriormente se observa por autorradiografía el fragmento ofragmentos de restricción que posean una secuencia comple-mentaria a la sonda y que, por consiguiente, haya hibridadocon ella. Esta técnica se denomina trasferencia Southern (Sout-


Figura 25.3.– Transferencia e hibridación de ADN (o Southern blotting). Cadabanda radiactiva en la película corresponde al fragmento de ADN de interés.

Una sonda es un frag-mento de ADN (oARN) monocatenariocon el fosfato finalmarcado con 32P.


hern blotting) en honor a su diseñador E. M. Southern. De for-ma similar se pueden separar moléculas de ARN por electrofo-resis en gel e identificar secuencias concretas por hibridación.En este caso se denomina transferencia Northern. También sepuede aplicar esta técnica para detectar una proteína determi-nada uniéndola a un anticuerpo específico y entonces se deno-mina transferencia Western. Resumiendo, las técnicas Sout-hern, Northern y Western se corresponden respectivamentecon las transferencias de ADN, ARN y proteína.

VECTORES DE CLONACIÓN

En E. coli, el microorganismo que más se emplea en clona-ción y el mejor conocido molecular y funcionalmente, se utili-zan tres vectores o vehículos de clonación: los plásmidos, losbacteriófagos y los cósmidos. Los plásmicos son moléculas deADN circular de doble cadena extrageniomales y que se repli-can independientemente del cromosoma bacteriano. Su ta-maño oscila entre 2 y 400 kilopares de bases (Kpb), transpor-tan genes para la inactivación de antibióticos, producción detoxinas y degradación de productos naturales. Los plásmidosno son imprescindibles para la vida de las bacterias, algunas nocontienen ninguno y otras pueden contener hasta veinte. Sepueden clasificar en conjugativos y no conjugativos dependien-do de si llevan o no un conjunto de genes de transferencia, de-nominados trans, que favorece la conjugación bacteriana esdecir, la transferencia de material genético de una bacteria aotra. Los plásmidos también se pueden introducir sin el concur-so de ningún elemento por transformación.

Tanto en el proceso de conjugación como en el de transfor-mación para detectar el ADN plásmidico, se necesita un méto-do de selección. La estrategia más común es introducir en elplásmido un gen que la célula huésped necesita para crecerbajo determinadas condiciones o un gen que confiera resisten-cia frente a un antibiótico, en este caso sólo aquellas célulasbacterianas que porten el plásmido serán resistentes al antibió-tico y podrán crecer en medios que lo contengan.

Uno de los plásmidos más utilizados es el pBR322, que con-tiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina. Elplásmido contiene una serie de sitios específicos que puedenser cortados por enzimas de restricción para introducir frag-mentos de ADN. La inserción de ADN en el punto de corte deEcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a losantibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de corte alos Hind III, Pal 1I o Ban HI inactiva el gen de resistencia a la


Vectores de clona-ción:– Plásmidos: pBR322

pBR328– Bacteriófagos: Fagol, T2, Fago m.

– Cósmidos.

Conjugación bacte-riana. Una bacteriatransfiere a través deun pili un cordón desu genoma a otrabacteria.



Figura 25.4.– Plásmido pBR322. Se indican los puntos de corte de algunasenzimas de restricción y las zonas que codifican resistencia a tetraciclina y am-

picilina.

Figura 25.5.– Transducción o infección por fagos de una bacteria. El ADN delfago controla el sistema metabólico y replicativo bacteriano y termina por des-

truirla. En algunos casos el ADN del fago se inserta en el de la bacteria.


tetraciclina, y el PstI resistencia a amplicilina. Las células bacte-rianas que contengan pBR322 con un fragmento de ADN in-sertado en el punto de corte de, por ejemplo, Hind III, son re-sistentes a la ampicilina y sensibles a la tetraciclina, y se pue-den seleccionar fácilmente observando las colonias que crecenen amplicilina y no aparecen en la placa que contiene tetracicli-na. Las células que no portan el plásmido son sensibles a los


Figura 25.6.– Identificación de la colonia bacteriana que portael vector con el fragmento de ADN de interés.


dos antibióticos, mientras los que lo portan, pero no llevan in-sertado el ADN, son resistentes a ambos.

El bacteriógrafo más utilizado como vector es el fago �. Estebacteriógrafo tiene un mecanismo muy eficaz para introducirmás de 48 Kpb de ADN en la bacteria. El procedimiento gene-ral para clonar ADN en el fago � se basa en dos característicasde su genoma:

1) Cerca de un tercio de su genoma puede ser reemplaza-do por ADN foráneo.


Figura 25.7.– Esquema de clonación de un fragmento de ADN procariótico enE. coli con pBR322 (ampR � ampicilina resistente, tetR � tetraciclina resistente).


2) El ADN se empaqueta en partículas de fago de alrede-dor de 40-50 Kpb.

Cuando los fragmentos de ADN de un tamaño adecuado seligan al ADN del fago, los ADN resultantes se pueden empa-quetar dentro de partículas de fago, por adicción de extractocrudo de células bacterianas que contienen todas las proteí-nas necesarias para ensamblar un fago completo. Ese proce-so se denomina empaquetamiento in vitro. Los fagos pue-den infectar bacterias de E. coli bien destruyéndolas o inser-tando su ADN en el genoma de la bacteria. En este últimocaso el ADN del fago se replica junto al ADN de la céluladurante muchas generaciones. Ciertos cambios ambientalespueden poner en marcha la expresión del ADN del fago ydesencadenan los procesos que conducen a la lisis de labacteria.

Los cósmidos están construidos a partir de plásmidos y ge-nes �. Los cósmidos son moléculas de ADN pequeñas(5-7 Kpb), circulares y con las siguientes características:

1) Un origen de replicación plasmídico.2) Uno o más marcadores seleccionables.3) Varios sitios de restricción donde se puede insertar el

ADN exógeno y4) Un sitio cos, que es una secuencia de ADN del bacterió-

fago que se necesita en el equipamiento.

Genotecas. Una genoteca es una colección de fragmentosderivados del genoma de un organismo insertados en un vec-tor de clonación. El vector se introduce en microorganismos(generalmente bacterias o levaduras) de tal forma que cada cé-lula contenga un fragmento del ADN recombinante. El procedi-miento se basa en romper el ADN en muchos fragmentos y,posteriormente, clonarlos todos. Esto es, la información conte-nida en un organismo está representada en el conjunto de frag-mentos de la genoteca. Los fragmentos se insertan en el ADNde un vector previamente tratado en la misma enzima de res-tricción que se ha utilizado para la rotura del ADN. La mezcla(fragmento ADN-vector) se usa para transformar las célulasbacterianas o se empaqueta en partículas de fago. El resultadofinal es una serie de bacterias o fagos en que cada portador deuna molécula de ADN recombinante es diferente. Al conjuntode todos ellos se le denomina genoteca, librería genómica o bi-blioteca genómica.

Para identificar el gen de interés en una genoteca se hacencrecer las bacterias en medio sólido de forma que en las placasse puedan apreciar colonias bacterianas individuales.


Los cósmidos estánconstruidos a partir deplásmidos y genes l.

Las genotecas soncolecciones de frag-mentos obtenidos delgenoma de un orga-nismo e insertados envectores de clonación.


Posteriormente, se procede como anteriormente, esto es, setratan las bacterias con álcali para desnaturalizar su ADN y setransfieren las células a una membrana de nitrocelulosa o ny-lon. Posteriormente, las placas se sumergen en una disoluciónque contiene una sonda de ADN marcada radiactivamente quehibrida con el ADN del gen complementario. Se lava la placa yse expone a una película de rayos X, las manchas que apare-cen en la película indican la posición de las colonias portadorasdel inserto de ADN de interés.

ESTRATEGIA DE LA CLONACIÓN

La clonación de un gen es un procedimiento en teoría relati-vamente sencillo. Si el ADN procede de una célula bacteriana,una vez extraído y purificado se trata con una enzima de restric-ción que deje extremos cohesivos. Si se elige como vector de clo-nación, un plásmido (pBR322) se corta con la misma enzima derestricción para que queden extremos que se complementen conlos de los fragmentos de ADN. Ambos elementos se unen me-diante la ADN ligasa. Los plásmidos con el inserto sufren unaprimera selección en placas con antibióticos a los que son resis-tentes. Posteriormente, bien con una sonda, de forma semejantea como se identifican los fragmentos de ADN, o bien extrayendoel plásmido, cortándolo en la misma enzima de restricción y rea-lizando electroforesis se pueden seleccionar aquellas células bac-terianas que llevan el plásmido con el inserto de ADN de interés.

La clonación de genes eucarióticos (vegetales o animales)planteó, al principio, serios problemas, puesto que la mayoríade sus genes son un conjunto de intrones y exones. Por ello, es-tos genes no pueden ser expresados en bacterias que carecende la maquinaria necesaria para cortar los intrones y eliminar-los del transcrito. Esta dificultad se supera introduciendo en labacteria plásmidos con fragmentos de ADN complementario(ADNc) del ARNm. Esto es, existe una enzima denominadatranscriptasa inversa que sintetiza ADN a partir de un ARNm.Para su acción la enzima requiere:

a) Los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP);b) ARNm purificado.

Posteriormente, se forma un doble cordón ADN-ARN quese somete a degradación alcalina para hidrolizar el ARN. ElADN monocatenario o de simple cordón se trata con ADN po-limerasa que requiere los 4 dNTP, un cebador o “primer” y lacadena de ADN que le sirve de molde. El resultado es un frag-mento de ADN bicatenario que se denomina ADNc.


La clonación de ge-nes eucariotas no sepuede realizar direc-tamente del ADN, yaque éste está consti-tuido por exones e in-trones.

Los intrones no se tra-ducen y las bacteriasno tienen mecanismospara eliminarlos.

La transcriptasa in-versa sintetiza ADNpartir de ARNm. ElADN obtenido se de-nomina ADNc (ADNcomplementario).


A partir de este ADNc el procedimiento sigue el mismo ca-mino que la clonación de fragmentos de ADN de células proca-rióticas.

Técnicas en ingeniería genética: PCR y secuenciaciónde ADN.

Existen dos técnicas que han supuesto un avance especta-cular en la investigación sobre el ADN genómico:

a) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR).b) La secuenciación de fragmentos de ADN.

Anteriormente hemos estudiado que la clonación del ADNgenómico permite lograr dos objetivos importantes: Primerosepara cada fragmento de ADN de los demás del genoma, ysegundo, amplifica segmentos de ADN seleccionados. Despuésde que el ADN o región particular del ADN ha sido clonado,debe conocerse su secuencia.

La técnica de PCR permite obtener millones e incluso milesde millones de copias de cualquier secuencia seleccionada delADN genómico en unas pocas horas. Una propiedad importan-te de esta técnica es que no hace falta que el segmento deADN elegido sea separado del ADN genómico antes de co-menzar el procedimiento de amplificación. Sin embargo, unavez que se ha amplificado, el segmento puede separarse fácil-mente del resto de ADN (que no se ha amplificado) mediantela electroforesis en gel.


Figura 25.8.– Síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir deARNm de un órgano de mamífero.

La técnica de PCRpermite obtener mi-llones de copias deun fragmento de ADNsin necesidad de se-pararlos previamentedel genoma.


La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza enun tubo de plástico de pequeña capacidad (0,2 ml) al que seañaden los siguientes componentes: El fragmento de ADN dedoble cadena que se desea amplificar, las cuatro dNTP, el “pri-mer” o cebador y un ADN, polimerasa estable al calor. EstaADN polimerasa (taq) procede de la bacteria termófila Ther-mus acuaticus y es estable y activa a 72 ºC.

Un ciclo de PCR consta de 5 etapas, dos de ellas, la inicial yfinal, se realizan solamente una vez y las tres intermedias unnúmero prefijado de veces que se denominan ciclos (entre 25 y40) (Fig. 25.9).


Figura 25.9.– Esquema de la etapa cíclica de la reacción en cadena de la ADNpolimerasa. Después de un ciclo se amplifica el ADN dos veces; después de 25

el fragmento de ADN se puede amplificar unas 106 veces.

Una mezcla de reac-ción de PCR contie-ne:1. Genoma o fragmen-

to de ADN.2. Los cuatro desoxi-

rribonucleósido tri-fosfato.

3. Un “primer” o ce-bador.

4. La enzima taq.


Las tres etapas intermedias son:

a) Separación de las cadenas de ADN por calentamiento(94-95 ºC) durante unos segundos.

b) Hibridación de los cebadores. La disolución se enfría(52-54 ºC) para que se unan las cadenas de ADN se-paradas.

c) Síntesis de ADN. Se calienta la disolución (72 ºC) paraque la ADN polimerasa sintetice nuevas cadenas deADN a partir de los cebadores.

Estas tres etapas (separación de las hebras, hibridación delos cebadores y síntesis de ADN) se llevan a cabo repetitiva-mente cambiando únicamente la temperatura de la mezcla dereacción. No es necesario añadir ningún reactivo después delprimer ciclo. El fragmento de ADN se puede ampliar según 2n,siendo n el número de ciclos; esto es, después de 25 ciclos sepuede amplificar unas de 106 veces (Fig. 25.10).


Figura 25.10.– Diagrama de una reacción de PCR típica. Los números por en-cima de la línea indican la temperatura y por debajo el tiempo en minutos:

segundos.

El análisis de la estructura del ADN se puede realizar porvarios métodos, pero el que se utiliza casi con exclusividad enlos últimos años es el desarrollado por F. Sanger y colaborado-res y que se denomina “método por interrupción controlada dela replicación enzimática”.

El método para secuenciar un fragmento de ADN se basaen copiar uno de los cordones de ADN mediante la ADN poli-merasa. El cebador para la síntesis es un fragmento comple-mentario que se puede obtener por digestión con una enzimade restricción o por síntesis química. La reacción contieneademás los cuatro desoxirribonucleósido trifosfato, un análogo,2 , 3 -didesoxirribonucleósido trifostato, de una base, el cualimpide, cuando se introduce en la cadena, un crecimiento pos-terior de esta. Como el compuesto entra en la cadena al azar,se producen fragmentos de distinta longitud. El proceso se repi-te con otra muestra del fragmento original y el análogo cargadocon otra base diferente. Los cebadores se marcan con una sus-

2', 3'- didesoxirribo-nucleósido trifosfato.El compuesto impideel crecimiento de lacadena porque carecede grupos hidroxiloen los carbonos 2' y3'.

3'AGTAGACATGACGA5' 5'TC3'

3'AGTAGACATGACGA5' 5'TCATC3'

3 'AGTAGACTGACGA5'3'TCATCT6AC3'3'AGTAGATGAC6GA5'5'TCATCTGAC3'

Fragmentos de ADNde distintos tamañosobtenidos en la sínte-sis de una cadenacuando en la mezclade reacción se incor-pora 2,3-didesoxiciti-din trifosfato.


tancia con diferente color según sea la base terminal, así, azulpara adenina, rojo para citosina, verde para timina y amarillopara guanina.

Las mezclas de reacción se juntan y se someten a electrofo-resis. Las bandas separadas de ADN se detectan por fluores-cencia al salir del gel, y la secuencia de colores se correspondecon la de las bases. El método se realiza en un aparato auto-mático de secuenciación que puede determinar de una vez cer-ca de un millar de bases.

APLICACIONES A LAS CIENCIAS MÉDICAS

Los descubrimientos producidos en los últimos años utili-zando las técnicas de ADN recombiante o Ingeniería genética ylos relacionados con ellas han permitido obtener un mejor co-nocimiento de la estructura, organización y expresión de los ge-nes, y han posibilitado su aplicación en diferentes campos delas ciencias. En medicina la aplicación de estas técnicas haabierto nuevas esperanzas en el diagnóstico, prevención, detec-ción y terapia de varias enfermedades.

Las técnicas de ADN recombinante han permitido la inser-ción y expresión de genes, que codifican productos de interésbiomédico en bacterias, levaduras, y el crecimiento a escala in-dustrial ha facilitado la obtención de cantidades apreciables deproteínas y péptidos humanos de gran utilidad para el trata-miento de determinadas enfermedades que hasta entonces seobtenían sólo en pequeñas cantidades de tejidos animales o decadáveres.

La mayor parte de las enfermedades genéticas no tienen untratamiento eficaz, y las que lo tienen se basan tanto en elaporte periódico de sustancias que el organismo no puede fa-bricar, como en evitar la acumulación de un producto nocivoprovocado por la carencia de la enzima necesaria para su me-tabolismo. Una solución terapéutica sería la inserción del gennormal en las células defectuosas del individuo enfermo y suexpresión correcta; este proceso se denomina terapia génica.Para aplicar esta clase de terapia es necesario, principalmente,conocer el gen defectivo y clonar el gen homólogo normal.Posteriormente, hay que saber en qué células suele estar activo,éste es punto clave del proceso porque un gen sólo puede serinsertado en células accesibles, por ejemplo, células de la san-gre o de la piel. Actualmente se están ensayando varios proto-colos clínicos para el tratamiento de enfermedades genéticascomo la carencia de adenosina desaminasa (ADA), la fibrosisquística, las anemias hemolíticas, la hemofilia, etc.


Aplicaciones de la In-geniería genética alas ciencias médicas:– Conocer la función

y expresión de losgenes.

– Obtener substan-cias con fines te-rapéuticos en canti-dades adecuadas.

– Diagnóstico precozde enfermedades.

– Obtención de ani-males transgénicos.

– Terapia génica.– Aplicaciones de la

técnica del PCR.– Detectar virus y

bacterias en los te-jidos.

– Detectar cánceresen estadios preco-ces.

– Determinar el pa-rentesco entre indi-viduos.

– Identificar indivi-duos mediante la“huella dactilar delADN”.


La obtención de animales transgénicos mediante la mi-croinyección de embriones con el gen o por transducción conretrovirus ha permitido obtener fundamentalmente ratonestransgénicos que tienen gran interés como modelos de enfer-medades génicas como la enfermedad de Tay-Sachs y la Dia-betes mellitus.

Por otra parte, la técnica de PCR también está proporcio-nando una ayuda valiosa a las ciencias médicas. Mediante estatécnica se pueden detectar la presencia de bacterias y virus enla sangre y tejidos de un individuo antes de que éste desarrolleuna respuesta inmune. También se pueden detectar cánceresen un estadio temprano. En medicina forense esta técnica per-mite conocer el parentesco de personas. Un simple cabello, unapequeña mancha de sangre o de semen suelen ser suficientespara obtener cantidades adecuadas de ADN para un análisisposterior. Otra aplicación interesante es en el transplante de ór-ganos. En este proceso el aceptor rechaza el órgano cuando losantígenos HLA del donante no son suficientemente parecidos alos del aceptor. La amplificación de los genes por PCR permitedeterminar los tipos de HLA y comprobar sus diferencias oanalogías.


RESUMEN

La tecnología del ADN recombinante o Ingenieríagenética ha supuesto un desarrollo extraordinario en el co-nocimiento de las bases moleculares de la vida. El diseñoy construcción de moléculas recombinantes se basa en elconocimiento de los mecanismos de replicación del ADN,de la estructura, de la organización y de la regulación de laexpresión génica.

La clonación de un gen o fragmento de ADN de célu-las procariotas requiere un corte específico del ADN genó-mico por enzimas de restricción, y la elección de un vectoradecuado para unir el gen. Los vectores más utilizados sonlos plásmidos, los baceteriofagos y los cósmidos. El vectorcon el gen se introduce en células hospedadoras para sumultiplicación. La identificación de las células con el inser-to de interés se suele realizar mediante sondas radiactivassegún la técnica de transferencia de Southern. La clona-ción de genes de células eucarióticas requiere la obtenciónprevia del ADN a partir de ARNm mediante la transcripta-sa inversa.


APLICACIONES CLÍNICAS

La terapia génica en las enfermedades hereditarias se aplicópor primera vez en 1990 a una niña de cuatro años que pa-decía carencia de adenina desaminasa (ADA). Esta enzima delsistema inmunológico y su deficiencia expone a los pacientes acontraer fácilmente enfermedades infecciosas. El gen que codi-fica la ADA suele estar activo en los linfocitos, por lo que fuerelativamente fácil extraer esas células de la sangre del pacientee identificarlo.

Posteriormente, se introdujo el gen correcto en células pre-cursoras de los linfocitos utilizando vectores basados en retrovi-rus. Este proceso permitió la corrección de la enfermedad debi-do a la deficiencia de ADA.

Otros casos susceptibles de aplicar una terapia génica sonaquellos en los que el gen alterado es el responsable de la pro-ducción de una sustancia presente en la sangre, donde su fun-ción es necesaria, por ejemplo, en las enfermedades hemofíli-cas debidas a la carencia de un factor de coagulación. En estoscaso se puede insertar el gen correcto en cualquier tipo de cé-lula del mismo organismo con tal de que éste pueda sintetizarel producto e introducirlo en la sangre. Hay bastantes tipos decélulas capaces de realizar esta función, como las células del te-jido conjuntivo subcutáneo, de la epidermis o de los músculos.


La información contenida en el ADN de un organismose puede fragmentar, unirse a vectores de clonación y al-macenarse. Al conjunto de todos ellos se denomina geno-teca o librería de genes.

Dos técnicas han permitido un avance espectacular dela Ingeniería genética: La de la reacción en cadenada de lapolimerasa (PCR) y la secuenciación automática de nu-cleótidos.

La aplicación de las técnicas de ADN recombinanteestá mostrando su valiosa utilidad en el diagnóstico y pre-vención de varias enfermedades y en las nuevas terapias aaplicar.


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