Mirka Šafaříková
Tel. 38777 [email protected]
Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140
Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:
zopakovaní základních principů a postupů
Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin
Aminokyseliny - amfionty
R CH COOH
NH2
R CH COO-
NH3+
H3O+
OH-
R
+H3N
H
C COO-
R
+H3N
H
C COOH
R
H2N
H
C COO-
Komerční - většinou hydrochloridy (NH3+Cl-)
Amfolyty - sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady
pH 4 - 8 → aminokyselin jako amfionty
Proteiny – amfolyty- na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězcůAK schopných disociace
Isoelektrický bod (pI)Isoelektrický bod - Hodnota pH, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule
R CH COO-
NH3+pI =
12 (pK1 + pK2)
amfolyty odštěpují H+amfolyty přijímají H+ pI
NH3+RCOOH NH2RCOO-
pI proteinů: neutrální cca 5-6kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11
Purifikace proteinůCíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množstvíenzymu)Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátupočet purifikačních kroků – omezení ztrát, časová a finančnínáročnostŽádná metoda není dokonalá – je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužitTyp purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky. - záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)
Metody obecně používané v biochemických laboratořích
Metody
základní• rozpuštění• hrubé oddělení
speciální• izolace• stanovení
homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace
chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové, ...
převedení biomolekul do kapalné fáze
Volba separační metodyDělení látek podle rozdílných vlastností:
molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita
Metoda pokusu a omylu obvykle nedáváoptimální výsledky
Metody používané v programu: purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace)kontrola stupně purifikace – celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení
Srážení (NH4)2SO4 - vysolováníprotein
(NH4)2SO4
sníženírozpustnosti
zvýšenírozpustnosti
(NH4)2SO4
vsolování – snižování hydrofobních int.
vysolování – ztráta hydratačního obalu
různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích
Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)
Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.
Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace → nižší koncentracePoužití:odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru)
Dialýza
koncentrační gradient
Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da → 1 000 kDa
Membrány, dutá vlákna
elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli
odsolování – MWCO 10 (25) kDa
voda, pufr s nízkou iontovou silou
Ionexová chromatografieChromatografie na měničích iontů
Ion Exchange Chromapography - IEC Princip: separace podle nábojeIontoměniče (ionexy - “ion exchangers”) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázanéionizovatelné skupiny.
porézní materiályelektrostatické interakce – eluce změnou pH, iont. síly
katex - výměna kationtů anex - výměna aniontů
Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly
Pevnost vazby - pH, iontová síla roztoku
Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj
Cl-, OH-Na+, H+
Vliv pH na velikost náboje:
Vliv iontové síly:vyšší iontová síla → slabší vazba na ionex
P-
P+
pH:většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5 - 6 a je stabilníobvykle v rozmezí pH 6 - 9katex: pH 3 – 8 (bazické proteiny) anex: pH 5 – 10
většinou vazba na anex
Funkční skupinyCM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katexS sulfomethyl- silný katexSHP sulfohydroxypropyl- silný katexDEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anexQAE kvarterní aminoethyl- silný anexQ kvarterní amin – silný anexTMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex
Silné ionexy – jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH (sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny) Slabé ionexy – jejich ionizovatelnost je silně závislána pH. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při pH 6 - 9, jinak ztrácejí náboj
Průtoková rychlost:závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částicrychlost 3 - 10 ml.cm-2.min-1 (cca 5 cm/h)
Eluce:vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směrgradient pH – směrem k pI příkrost gradientu (příkrý - menší naředění, nižší rozlišení)celkový objem eluentu – 10ti – 20ti násobek objemu náplně kolony
Chromatografie s hydrofobní interakcíHydrofobní interakce
Makromolekuly - hydrofobnískupiny (na povrchu nebo zanořenév kapsách)
Zcela hydrofobní materiály (polystyren) – vazba molekuly ireversibilní (denaturace)hydrofobní sorbenty – hydrofobní zónyligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-
Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu
Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.
Síla vazby roste s:rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH4)2SO4, teplotou,nejsilnější interakce: pH – pISíla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul
Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace
na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu relat. nezávislá na složení mobilní fáze
Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys.
malé molekuly – difuse do struktury gelu → pomalejší postup kolonouvelké molekuly – volně protékajínesferické molekuly - chovají se jako by byly větší
Stupeň rozlišení:
Rs =vzdálenost mezi separovanými zónami
šířka zón Rs > 1.2
Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce
Aplikace vzorku:objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30% neúčinné dělení zředěných vzorků!!!
Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). → opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon
Frakcionační rozsah gelu:
Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu.
Sephadex G-25 1 – 5 kDa
Sephadex G-100 4 – 150 kDa
molekuly penetrují do gelu bez zábranVe → Vt
molekuly nepronikají do geluVe → V0
mez vyloučení -velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórůgelu
Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovacímezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.
Použití:orientační stanovení Mr, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kDa)purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25)
Výhody:šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky – ale nesmí být moc viskozní), teplotělevná, jednoduchá
Omezení:nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) – omezenívlivu difuse
techniky s vysokou kapacitou
techniky s nízkou kapacitou
Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.
precipitace
hydrofobní interakce
ionexová chromatogr. (afinitní chromatogr.)
obsah solí, pH – není důležitéobjem a koncentrace vzorku
zakoncentrování vzorku (elektroforesa)
gelová filtrace odstranění částečnězdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů
dialýza, gelová f. G-25
Obsah protokolu:1. Číslo a charakteristika enzymu2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité
metody a nastavení jejích parametrů3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek – případné
ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace
4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky
Izolace enzymu Protein (mg) Enzym (U) Výtěžek
enzymu (%) NabohaceníČasová
náročnost(čl./hod)
Na začátku izolace 511 14700 100 1 0
Amonium sulfát 181 14831 100 2,8 0,01
Hydrofobní interakce 172 14075 95,7 2,8 0,06
Ionex 26,4 13879 94,4 18,3 0,12
Gelová filtrace 20,2 13544 92,1 23,3 0,18
5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu