Mirka Šafaříková

Tel. 38777 5627mirkasaf@usbe.cas.cz

Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:

zopakovaní základních principů a postupů

Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin

Aminokyseliny - amfionty

R CH COOH

NH2

R CH COO-

NH3+

H3O+

OH-

R

+H3N

H

C COO-

R

+H3N

H

C COOH

R

H2N

H

C COO-

Komerční - většinou hydrochloridy (NH3+Cl-)

Amfolyty - sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady

pH 4 - 8 → aminokyselin jako amfionty

Proteiny – amfolyty- na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězcůAK schopných disociace

Isoelektrický bod (pI)Isoelektrický bod - Hodnota pH, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule

R CH COO-

NH3+pI =

12 (pK1 + pK2)

amfolyty odštěpují H+amfolyty přijímají H+ pI

NH3+RCOOH NH2RCOO-

pI proteinů: neutrální cca 5-6kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11

Purifikace proteinůCíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množstvíenzymu)Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátupočet purifikačních kroků – omezení ztrát, časová a finančnínáročnostŽádná metoda není dokonalá – je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužitTyp purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky. - záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)

Metody obecně používané v biochemických laboratořích

Metody

základní• rozpuštění• hrubé oddělení

speciální• izolace• stanovení

homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace

chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové, ...

převedení biomolekul do kapalné fáze

Volba separační metodyDělení látek podle rozdílných vlastností:

molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita

Metoda pokusu a omylu obvykle nedáváoptimální výsledky

Metody používané v programu: purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace)kontrola stupně purifikace – celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení

Srážení (NH4)2SO4 - vysolováníprotein

(NH4)2SO4

sníženírozpustnosti

zvýšenírozpustnosti

(NH4)2SO4

vsolování – snižování hydrofobních int.

vysolování – ztráta hydratačního obalu

různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích

Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)

Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.

Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace → nižší koncentracePoužití:odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru)

Dialýza

koncentrační gradient

Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da → 1 000 kDa

Membrány, dutá vlákna

elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli

odsolování – MWCO 10 (25) kDa

voda, pufr s nízkou iontovou silou

Ionexová chromatografieChromatografie na měničích iontů

Ion Exchange Chromapography - IEC Princip: separace podle nábojeIontoměniče (ionexy - “ion exchangers”) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázanéionizovatelné skupiny.

porézní materiályelektrostatické interakce – eluce změnou pH, iont. síly

katex - výměna kationtů anex - výměna aniontů

Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly

Pevnost vazby - pH, iontová síla roztoku

Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj

Cl-, OH-Na+, H+

Vliv pH na velikost náboje:

Vliv iontové síly:vyšší iontová síla → slabší vazba na ionex

P-

P+

pH:většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5 - 6 a je stabilníobvykle v rozmezí pH 6 - 9katex: pH 3 – 8 (bazické proteiny) anex: pH 5 – 10

většinou vazba na anex

Funkční skupinyCM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katexS sulfomethyl- silný katexSHP sulfohydroxypropyl- silný katexDEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anexQAE kvarterní aminoethyl- silný anexQ kvarterní amin – silný anexTMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex

Silné ionexy – jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH (sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny) Slabé ionexy – jejich ionizovatelnost je silně závislána pH. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při pH 6 - 9, jinak ztrácejí náboj

Průtoková rychlost:závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částicrychlost 3 - 10 ml.cm-2.min-1 (cca 5 cm/h)

Eluce:vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směrgradient pH – směrem k pI příkrost gradientu (příkrý - menší naředění, nižší rozlišení)celkový objem eluentu – 10ti – 20ti násobek objemu náplně kolony

Chromatografie s hydrofobní interakcíHydrofobní interakce

Makromolekuly - hydrofobnískupiny (na povrchu nebo zanořenév kapsách)

Zcela hydrofobní materiály (polystyren) – vazba molekuly ireversibilní (denaturace)hydrofobní sorbenty – hydrofobní zónyligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-

Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu

Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.

Síla vazby roste s:rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH4)2SO4, teplotou,nejsilnější interakce: pH – pISíla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul

Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace

na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu relat. nezávislá na složení mobilní fáze

Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys.

malé molekuly – difuse do struktury gelu → pomalejší postup kolonouvelké molekuly – volně protékajínesferické molekuly - chovají se jako by byly větší

Stupeň rozlišení:

Rs =vzdálenost mezi separovanými zónami

šířka zón Rs > 1.2

Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce

Aplikace vzorku:objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30% neúčinné dělení zředěných vzorků!!!

Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). → opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon

Frakcionační rozsah gelu:

Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu.

Sephadex G-25 1 – 5 kDa

Sephadex G-100 4 – 150 kDa

molekuly penetrují do gelu bez zábranVe → Vt

molekuly nepronikají do geluVe → V0

mez vyloučení -velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórůgelu

Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovacímezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.

Použití:orientační stanovení Mr, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kDa)purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25)

Výhody:šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky – ale nesmí být moc viskozní), teplotělevná, jednoduchá

Omezení:nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) – omezenívlivu difuse

techniky s vysokou kapacitou

techniky s nízkou kapacitou

Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.

precipitace

hydrofobní interakce

ionexová chromatogr. (afinitní chromatogr.)

obsah solí, pH – není důležitéobjem a koncentrace vzorku

zakoncentrování vzorku (elektroforesa)

gelová filtrace odstranění částečnězdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů

dialýza, gelová f. G-25

Obsah protokolu:1. Číslo a charakteristika enzymu2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité

metody a nastavení jejích parametrů3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek – případné

ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace

4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky

Izolace enzymu Protein (mg) Enzym (U) Výtěžek

enzymu (%) NabohaceníČasová

náročnost(čl./hod)

Na začátku izolace 511 14700 100 1 0

Amonium sulfát 181 14831 100 2,8 0,01

Hydrofobní interakce 172 14075 95,7 2,8 0,06

Ionex 26,4 13879 94,4 18,3 0,12

Gelová filtrace 20,2 13544 92,1 23,3 0,18

5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu