UNIVERSITATEA „AL. I. CUZA” IAŞI
FACULTATEA DE FIZICĂ
Rezumatul tezei de doctorat
SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME
HIBRIDE DE POLIMERI HIDROSOLUBILI
ŞI MEDICAMENTE/NANOPARTICULE CU APLICAŢII
ÎN BIOMEDICINĂ
Conducător ştiinţific,
Prof. Dr. Dana Ortansa Dorohoi
Doctorand,
Daniela Angelica Bîndar (căs. Pricop)
Iași – 2012
Universitatea „Al. I. Cuza” Iaşi
În atenția
…………………………………………………..
Vă facem cunoscut că în data de 18 februarie 2012, ora 10, în
amfiteatrul L1, doamna Daniela Angelica Bîndar (căs. Pricop)
va susține, în ședință publică, teza de doctorat:
SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME HIBRIDE DE POLIMERI
HIDROSOLUBILI ŞI MEDICAMENTE/NANOPARTICULE CU APLICAŢII ÎN
BIOMEDICINĂ
în vederea obținerii titlului științific de doctor în domeniul fundamental
Științe Exacte, domeniul Fizică.
Comisia de examinare a tezei:
Prof. Univ. Dr. Dumitru LUCA,
Președinte
Facultatea de Fizică, Universitatea „Al. I. Cuza”, Iaşi
Prof. univ. dr. Dana – Ortansa DOROHOI
Conducător științific
Facultatea de Fizică, Universitatea „Al. I. Cuza”, Iași
CP. I Dr. Valeria Harabagiu Referent
Institutul de Chimie Macromoleculară „Petru Poni”, Iași
Prof. Univ. Dr. Viorica ȘIMON Referent
Facultatea de Fizică, Universitatea „Babeş-Bolyai”, Cluj-Napoca
Prof. univ. dr. Viorel MELNIG
Referent
Facultatea de Fizică, Universitatea „Al. I. Cuza”, Iași
Vă invităm pe această cale să participați la ședința publică de susținere
a tezei de doctorat.
Cuprins Introducere
Cap I. Stadiul actual al cunoaşterii în domeniul materialelor polimere inteligente şi a
obţinerii de nanoparticule
Bibliografie
Cap II Metode de caracterizare a materialelor nanofazice, suprafeţelor si filmelor
II.1 Voltametrie ciclică
II.2 Determonarea distribuțiilor de dimensiuni prin împrăștierea dinamică a
luminii
II.3 Determinarea potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale
II.4 Microscopie electronică de transmisie
II.5 Microscopia de forţă atomică AFM
II.6 Microscopie optică
II.7 Difracţia radiaţiei X
II.8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrale
Bibliografie
Cap III.Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de lipidă şi
chitosan
III.1 Încapsularea unor medicamente specifice în vezicule lipidice
III.1.1 Încapsularea clorurii de magneziu în vezicule lipidice
III.1.2 Încapsularea ketoprofenului in vezicule lipidice
II.1.3 Încapsularea dexketoprofenului în vezicule lipidice
II.1.4Încapsularea tramadolului în vezicule lipidice
II.1.5 Încapsularea hidrocloridului hidrat în vezicule lipidice
III.2 Caracterizarea in vivo a cineticii de eliberare a medicamentelor de către sistemele de
vezicule lipidice stabilizate în chitosan și compararea cu eliberarea in vivo
III.3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili trapaţi cu
medicament
IV.3.1 Cinetica de fixare si eliberare controlată a compuşilor sintetizaţi (in vivo)
IV.3.2 Testarea biocompatibilității medicamentelor încorporate în vezicule
IV.3.3 Cercetarea efectelor medicamentelor încorporate în vezicule, pe modele
nociceptive
Bibliografie
Cap IV.Obţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile , în
medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili
IV.1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile
IV.1 Sinteza nanoparticulelor de platina
IV.2 Sinteza nanoparticulelor de argint
IV.3 Sinteza nanoparticulelor de aur
IV.2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obținute
IV.3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au în chitosan în raport cu
diferiți factori
IV.3.1 Analiza stabilității în timp a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de au
IV.3.2 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur
încălzite
IV.3.3 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur
înghețate
IV.3.4 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur
sub acțiunea unor activatori
IV.3.4 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur
sub acțiunea radiației din spectrul vizibil
IV.4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile
IV.4.1 Evaluarea proprietăților antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe
diferite medii de cultură
IV.4.2 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile
Bibliografie
Concluzii generale
Lucrări publicate
1
Cap I. Stadiul actual al cunoaşterii în domeniul materialelor polimere
inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile
Medicina modernă a făcut pași considerabili în înțelegerea necesității
compatibilizării medicamentului cu țesutul. Practica a arătat că de multe ori corpul
percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă în consecință. Un domeniu
de interes pentru aplicațiile din biomedicină, se ocupă cu îmbunătățirea eficacității
medicamentelor în medii biologice, folosind nanotehnologia, în scopul
dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor. În
ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici în eliberarea controlată a
medicamentelor și în aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale
nobile. Interesul medical, în potențialul acestor nanomateriale, este motivat de
capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele. Și într-
un caz și în celălat nu există încă informaţii suficiente referitoare la impactul
acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului înconjurător.
Răspunsul transportatorilor de medicamente, la stimulii mediului biologic,
este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin.
Această stabilitate depinde de îmbunătățirea proprietăților de suprafață a
coloizilor, realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc între aceștia procese
repulsive. Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale, atât sub formă de
vezicule lipidice cât și sub formă de nanoparticule, este influențată de diferiți
factori cum ar fi pH-ul, temperatura, forța ionică, dimensiunea particulei, etc. ne
putem aștepta ca interacțiunile ce au loc între polimeri şi coloizi (vezicule sau
nanoparticule) să fie extrem de complexe. Stabilirea nivelului de stabilitate a
soluţiilor coloidale este definită în acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta.
Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze,
urmând să precipite, sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită
interacțiunea cu mediul biologic.
Obținerea veziculelor lipidice
Studiile au arătat că folosirea în medicații a transportatorilor de
medicamente sub formă de vezicule, având dimensiuni nanometrice, este mai puțin
toxică. Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor
amfifile de fosfatidilcolină în soluţie apoasă. Celula vie pare să-și fi autoansamblat
membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie. Pentru a obține vezicule,
filmul lipidic de fosfatidilcolină, este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care,
2
de altfel, vor deveni conținutul veziculelor. Trecerea sistemului, din starea de
bistrat lamelar în starea de vezicule, are loc ca urmare a creşterii entropiei
sistemului, care le determină autoansamblarea, împachetându-se unele în altele sub
formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni.
Fig. 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică.
Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice
(15 - 50 nm), se folosește o baie de ultrasunete (figura 5). Ultrasonarea
fragmentează aleatoriu veziculele multistrat, în ceea ce am putea numi vezicule
unilamelare [24], a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor.
Adăugarea chitosanului în soluțiile de vezicule cu medicament conduce la
modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare, provocând
creșterea stabilității acestora.
Obținerea nanoparticulelor de metale nobile
Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură,
utilizând faze suport polimerice. De exemplu, este bine cunoscut că în procesele de
biomineralizare, proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru
structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric. Aceste faze suport s-au
folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție îngustă.
3
Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza
electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și îşi găsesc aplicaţii
în domenii ce includ cataliza [35], sisteme de stocare a datelor, dispozitive
electronice noi, chemo şi biosenzori electrochimici [34], senzori refractometrici şi
de fluorescenţă. Folosirea efectului ultrasunetelor în electrochimie [37]
îmbunătățește mult transportul de masă, modificându-i viteza şi, de asemenea,
modificând mecanismul reacţiei electrochimice. Sinteza nanoparticulelor de aur în
soluții apoase de chitosan a pus în evidență faptul că acesta devine agent de
stabilizare și reducere datorită controlului nucleației. Dimensiunea nanoparticulelor
de aur formate variază în funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului.
Stabilitatea acestor soluții, este asigurată prin adsorbția moleculelor de
polimer la suprafața nanoparticulelor, producandu-se automat scăderea tensiunii
interfazice, datorită interacţiunii între faza dispersată şi mediul de dispersie.
Cap II. Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice,
suprafeţelor și filmelor
Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni
nanometrice, este raportul foarte mare suprafaţă-volum, care duce la apariția unor
proprietăţi fizice sau chimice noi. Problema care se pune este de a determina exact
aranjamentul în polimer și modificările ce apar la nivel local în cadrul
nanostructurilor. Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat în: analiză
structurală, mezofazică, nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate.
II.3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale
Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin
măsurarea potenţialului Zeta. Această tehnică constă în împrăştierea unui fascicul
de lumină laser, incident prin centrul unei celule ce conține proba, sub un unghi de
aproximativ 13° pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă.
Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului,
a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software. Stabilitatea soluţiilor
coloidale este definită în acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)
care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8]. Particulele
care au potențialul Zeta mai pozitiv decât +30 mV sau mai negativ decât -30 mV,
sunt în mod obișnuit, considerate stabile. Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și
a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer
Nano ZS, model Zen-3500.
4
II.4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă
atomică (AFM)
Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au, Ag
și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și în modul semicontact cu un dispozitiv Solver pe filme subţiri. Aceste analize au avut drept scop analiza
morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer.
În TEM, tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre
cele două lentile condensor, unde este focalizat [11]. Câmpul asociat unei lentile
electrostatice, sub formă de diafragmă metalică circulară, modifică viteza
electronilor, atât în mărime cât şi în direcţie. Pentru a putea concentra câmpul
magnetic în vecinătatea axei optice, se utilizează lentilele magnetice sub formă de
solenoizi, coaxiali cu fasciculul electronic. Câmpul magnetic al lentilei modifică
direcţia mişcării electronilor, înfăşurând" traiectoria lor în jurul axei optice, fapt ce
produce rotaţia imaginii electronice în raport cu obiectivul. Proba este plasată în
apropierea lentilei electromagnetice obiectiv. Imaginea formată de obiectiv se
numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila
electromagnetică intermediară. Apoi, această ultimă imagine, este mărită de lentila
electromagnetică proiector, care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran
fluorescent.
În ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei,
efectuată prin AFM, s-a folosit un aparat Solver Pro 7M. Imaginea este obţinută
prin măsurarea forţe de interacțiune, în care forţa repulsivă este influenţată de
densitatea totală a electronilor din jurul unui atom. În timpul deplasării vârfului de-
a lungul suprafeţei probei, forța de interacțiune pune ușor în mișcare un cantilever.
Componentele de bază ale unui AFM sunt vârful ascuţit montat pe
cantilever, sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului, traductorul
piezoelectric pentru mişcarea sondei în raport cu proba, sistemul de feedback
pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea înălţimii sondei și sistemul
imagistic pentru convertirea punctelor înregistrate într-o imagine. Devierea
cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele
cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă.
II.6 Microscopie optică. Microscopie în câmp întunecat (DF)
Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF
datorită efectului de plasmon, care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu
lumina, și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm.
Câmpul întunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic,
astfel încât razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv. Efectul
de câmp întunecat poate fi obţinut rapid, din câmpul luminos, prin rotirea
5
condensorului, astfel încât să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de
probă [13] și s-a realizat utilizând un microscop inversat Nikon Eclipse Ti.
II.7 Difracţia radiației X
Structura micro- şi nano- fazică, ca și dimensiunile medii ale cristalitelor
au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un
difractometru Shimadzu XRD 6000, utilizând radiaţia CuKα (1,54060 Å) care
operează la 40 kV şi 30 mA. Difracţia radiației X este o metodă folosită în
principiu pentru evaluarea constantei de reţea, d a unei probe cristaline [14, 15].
Datorită lungimii de undă mici, relativ la cea din lumina vizibilă, radiația
X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor.
Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a
fasciculului monocromatic împrăştiat [15]. Utilizând legea lui Bragg, putem
prezice unghiurile de difracție. Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer
[14].
II.8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice
Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR
Pentru a confirma existenţa legăturilor între polimer şi nanoparticule au
fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile în
cei doi polimeri. Spectroscopia în domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de
identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor
compușilor organici. Spectrometrul IR clasic este un aparat în care radiația
electromagnetică furnizată de o sursă este separată în două fascicule: un fascicul de
referință și unul care trece prin probă [17]. Măsurând absorbţia radiaţiei ca funcţie
de frecvenţă, se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o „amprentă”
moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor
funcţionale. Spectrele FTIR au fost înregistrate între 4000 şi 400 cm-1
cu un
spectrofotometru Tensor 10 Bruker.
Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)
Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării
electronice excitate a nanoparticulelor de Au, s-a folosit o tehnică de împrăştiere
Raman la rezonanţă. Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe
suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman
cunoscut, în literatura de specialitate, sub numele de SERS (spectroscopie Raman
amplificată de suprafaţă). Împrăștierea Raman la rezonanță, are loc atunci când
6
fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei
aflate în stare excitată. În urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu
intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală. Spectrele Raman au
fost obținute cu un microscop inVia Raman, Renishaw, având un laser cu o singură
lungime de undă (633 nm).
Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis
Analiza proceselor de îmbătrânire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule
de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizând
un spectrofotometru Hitachi U–2001.
Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice în
domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante, de
nanoparticule de aur în soluții de chitosan. Spectroscopia de absorbție moleculară
constă în aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă
diferite (UV -Vis) și se înregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației
funcție de lungimea de undă) [33].
CONTRIBUȚII PERSONALE
Scopul acestui studiu a vizat
1. Obținerea în condiții blânde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice
cu o bună dispersitate sub formă de:
- vezicule lipidice încărcate cu medicament și stabilizate în chitosan,
- nanoparticule din metale nobile sintetizate în polimeri biocompatibili.
2. Evaluarea proprietăților acestor materiale atât sub acțiunea unor stimuli reactivi
(temperatura-încălzire/răcire, pH-ul în procese de dializare, activatori chimici,
radiație luminoasă) cât și în studii in vivo în interacțiune cu țesutul biologic pe
medii de cultură, la eliberarea în medii gastrice sau în sânge ca și la trecerea de
bariera hemato-encefalică.
Cap III. Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de
lipidă şi chitosan
Obținerea în condiții blande a soluțiilor coloidale , se referă la abilitatea
de a controla morfologia diferitelor domenii, în copolomerii bloc, prin reglarea
echilibrului hidrofilic/hidrofobic. În acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule
lipidice, de dimensiuni nanometrice, încărcate cu diferite medicamente care să
poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să
7
asigure un control optim al eliberării medicamentului. Medicamentele încapsulate
în veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu, ketoprofenul,
dexketoprofenul, U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul.
Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat, după
evaporarea solventului, cu o soluţie de apă distilată şi medicament. După ce a fost
supusă ultrasonării timp de 20 min, pentru a obţine vezicule unilamelare, soluţia de
lipidă a fost combinată cu o soluţie de 0,5% chitosan [5]. Pentru a aduce soluţia de
vezicule lipidice, cu medicament stabilizat în chitosan, la un pH neutru, aceasta a
fost dializată timp de 10 de ore.
Fig. 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor îcărcate cu
ketoprofen și stabilizate în chitosan CKLV.
S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de
medicament în primele minute de după administrare, ceea ce indică faptul că prin
ultrasonare, întreaga cantitate de medicament a fost încapsulată în vezicule.
Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis încărcarea
lor cu sarcină pozitivă. Ca urmare, în toate sistemele analizate, chitosanul a făcut
posibilă creșterea stabilității veziculelor, corespunzând criteriilor soluţiilor
suspendate. Procesul de dializare, necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic, a
condus la diminuarea stabilității veziculelor, datorită proceselor de protonare/
deprotonare.
III.3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili
încărcați cu medicament
Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule
lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule
lipidice se face într-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei, la dizolvarea
unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen în același mediu de eliberare.
Și eliberarea, în sânge, a medicamentului din veziculele lipidicese, se face
cu întârziere față de medicamentul neâncorporat. În sânge, concentrația maximă de
medicament, eliberat din vezicule, se menține cu câteva ore în plus și efectul se
prelungește față de medicamentul neancorporat.
8
Fig. 32 Profilul de eliberare in vitro a
ketoprofenului din veziculele stabilizate,
comparativ cu un conţinut echivalent de
cristale solide pure de ketoprofen dizolvat
în același mediu de eliberare.
Fig. 33 Variaţia în timp a concentraţiei
de ketoprofen în sânge, la şoarecii
trataţi atât cu vezicule cu medicament
cât și cu o soluție simplă de ketoprofen.
În studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative
la nivelul testelor hemoleucogramei, pentru animalele care au primit veziculele
lipidice stabilizate cu chitosan și încărcate cu oricare din medicamentele utilizate.
Graficele obținerii efectului maxim posibil, pentru toate soluțiile
încorporate în vezicule lipidice stabilizate în chitosan, au arătat că:
- procesul de eliberare al medicamentelor se produce în același timp;
- intensitatea efectului scade față de substanțele neâncorporate;
- maximul de efect, se obține aproximativ în același timp (cam la 4
ore) după administrarea oricărei soluții;
-efectul medicamentelor încorporate se prelungește în acelașii interval de
timp.
Coroborând efectele medicamentelor încorporate, cu nivelul de
medicament eliberat în sânge la diferite momente de timp, din testele de
comportament și testele de nocicepție, s-a putut realiza o corelaţie relativă sub
aspect somatic.
Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice
Vezicule
cu medicament
Atingerea
nivelului maxim
Menținerea nivelului
maxim
Prelungirea
eliberării
Ket. eliberat în sânge 2 ore 4 ore 10 ore
Efect ket. în tail flick 2 ore 6 ore 12 ore
Efect ket. în writhes 3 ore 1 ora 8 ore
Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore
Se observă o bună corelare între obținerea concentrației maxime de
medicament în sânge și inducerea unui efect antinociceptiv, semnificativ statistic,
0 5 10 15 20 25 30 35 400
5
10
15
20
25C
on
cen
trat
ie m
ola
ra (m
ol/
L)
x 1
05
%
Timp (ore)
CKL
Ket cristale
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10
0
10
20
30
40
50
60
*
**
**
** KET
CKL
Co
nce
ntr
atie
Pla
smat
ica
(
g/m
L)
Timp (ore)
9
doar în testul tail-flick. La nivel gastric, în testul Writhes, efectul întârzie o oră iar
la nivelul sistemului nervos, din cadrul testului de comportament, întarzie cu 4 ore.
Fenomenul se datorează instabilității chitosanului, ce acoperă veziculele
cu medicament, la pH-urile specifice acestor medii de eliberare.
Efectul produs de analgezice în sânge, s-a menținut maxim cea mai lungă
perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide, la care efectul s-a menținut maxim (4
ore), deoarece chitosanul, la pH-ul ridicat al sângelui, devine mai puțin solubil,
permițând o mai lentă destrămare a veziculelor. La nivel abdominal, efectul
antinociceptiv al veziculelor cu medicament, în testul Writhes, s-a menținut maxim
(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit, deoarece chitosanul devine mai
solubil permițând eliberarea mai rapidă a medicamentului.
Cap IV.Obţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale
nobile în medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili
În acest capitol este prezentată sinteza, caracterizarea și evaluarea in vivo
a proprietăților nanoparticulelor din platină, argint și aur. Aceste nanoparticule fac
obiectul unor aplicații medicale, ce necesită obținerea lor printr-un proces de
nucleaţie, în condiții blânde, asiguranduli-se o bună dispersabilitate, prin reducerea
în agenți de stabilizare. Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut
urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese
neurotoxice la nivelul sistemului nervos.
IV.1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile
Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint , s-a utilizat o celulă
electrochimică alcătuită din doi electrozi. Prin reducere la catod se formează atomi
zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului. Prezența electrolitului,
alcătuit din soluția de precursor și polimer, permite formarea de microdomenii de
reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează.
Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU,
s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2, 4] care are avantajul
controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează în microdomeniile
polimerului.
Nanoparticulele de argint, acoperite cu poliamidhidroxiuretan, s-au
sintetizat prin electrosinteză în regim galvanostatic, pentru densităţi de curent de
6,25 mA/cm2 (AgI) şi 1,56 mA/cm
2 (AgII), la temperatura camerei, sub agitare
puternică şi în atmosferă de azot. Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min.
Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere în soluții de chitosan
10
cu diferite mase moleculare [7]. Prepararea soluțiilor precursor, pentru fiecare din
cele 4 tipuri de chitosan, s-a făcut amestecând 2, 4, 6, 8 și 10 ml HAuCl4 ·3H2O 10-
3 M cu 38, 36, 34, 32 și respectiv 30 ml de chitosan 0,1%; sub agitație cu
ultrasunete .
Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de
platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse în domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate
situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 0,6 mA/cm2 1,2 mA/cm
2.
Dimensiunile, mai mari, obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele
sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii între
polimer și nanoparticule, conform studiilor FTIR. Sistemele coloidale prezintă un
nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta.
Nanoparticulele de argint, împachetate în polimer par a avea o stabilitate
mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm). Nanoparticulele de aur prezintă o
anumită dinamică a dimensiunilor, de la câțiva zeci de nm până la cîteva sute de
nm, ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme, puse în
evitență atât prin DF cât și prin TEM. Prin AFM s-a observat că nanoparticulele
sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările
funcționale care permit interacțiunea cu polimerul.
Fig. 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale
chitosanului PG pentru toate
concentrațiile de precursor HAuCl4.
Fig. 70 Micrografia obținută prin
microscopie optică DF, evidențiază faptul că
nanoparticulele de Au au geometrii diferite,
deoarece plasmonii acestora sunt colorați
diferit.
Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie, urmând ca prin
îmbătrănire în timp să li se îmbunătățească nivelul de stabilitate.
530
535
540
545
550
555
2
4
6
8
0.05
0.10
0.15
0.20
PG
MMW
LMW
OSL
Abso
rban
ta (
u.a
.)
Lungim
ea d
e undã
(nm
)
Cantitatea de aur (mL)
11
IV.3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au în chitosan
în raport cu diferiți factorii externi
Supuse proceselor de îmbătrânire în timp, soluțiile de nanopatricule de Au
acoperite cu chitosan (menținute la 23ºC), au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la
intervale de 2, 3, 4, 7, 8 și respectiv 11 luni, și determinate distribuțiile de
dimensiuni și de potențial Zeta la 2, 3, 7 și 11 luni după sinteză.
Fig. 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur.
Soluțiile cu cea mai îndelungată stabilitate, de 11 luni, s-au dovedit a fi
cele care conțin concentrații mici de precursor de aur, indiferent de masa
moleculară a chitosanului. Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au
avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor, în
polimerul cu masă mică și mare moleculară. Stabilitatea acestor soluții scade odată
cu creșterea concentrației de precursor de aur.
Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C într-o etuvă
termostatată, au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de
dimensiune și potențial Zeta, fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie
Raman[10].
Fig. 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG, 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur.
400 600 8000,0
Ab
sorb
anta
(u
.a.)
Lungime de unda (nm)
2PG
1luna
2luni
3luni
4luni
7luni
8luni
532
532
535
530
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
Inte
nsi
tate
u.a
Deplasare Raman (cm-1)
6LMW m
6LMW inc
2918,5
1571,8
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
Inte
nsi
tate
u.a
.
Deplasare raman (cm-1)
6MMW m
6MMW inc
1571,8
1599,7
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
Inte
nsi
tate
u.a
.
Deplasare Raman (cm-1)
6PG m
6PG inc
659,5
603,6
1570
15152132,5
2118 2945
2917,6
400 600 800
0,0
Ab
sorb
anta
(u
.a.)
Lungimea de unda (nm)
2MMW
1luna
2luni
3luni
4luni
7luni
8luni
11luni
537
520
526
524531 629
530 638
638
400 600 8000,0
Ab
sorb
anta
(u
.a.)
Lungimea de unda (nm)
2LMW
1luna
2 luni
3 luni
4luni
7luni
8luni
11luni
530
521
524,5
12
S-a observat că cu cât masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)
cu atât soluțiile prezintă o mai bună stabilitate, odată cu creșterea timpului de
încălzire. Supuse procesului de încălzire, sistemele coloidale tind, în primele ore,
să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm, fapt ce indică o
îmbunătățire a mediului dielectric în imediata vecinătate a nanoparticulelor [12].
Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor, fenomen pus în
evidență și de intensificarea semnalului Raman [13], mai ales la soluțiile cu cea
mai mare concentrație de precursor de aur.
Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C, în cicluri
de câte 20 min în care au atins starea solidă prin înghețare și apoi au fost readuse în
stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot în 20 min, au fost analizate
spectral, li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta, distribuții de dimensiune și
micrografii TEM [10]. S-a observat că, cu excepția probelor ce conțin chitosan PG,
toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă. Pierderea stabilității a
fost motivată, în toate cazurile, de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de
nanoparticule, lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența
precipitatului depus pe fundul flaconului. Cu cât masa chitosanului scade cu atât
maximul de absorbție scade mai repede, ceea ce dovedește că succesiunea unui
număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care
au suferit o creștere a vâscozității și determină precipitarea nanoparticulelor
aglomerate [15].
Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG, 6MMW și 6LMW la înghețare.
O proprietate care se manifestă, de altfel și la încălzirea soluțiilor
coloidale, este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular. Aceasta pare să
13
fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează
intensitatea vibraței legăturii N-H, făcându-o mai flexibilă [16].
Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris),
supuse unui proces de oxidare electrochimică în regim galvanostatic la un curent
de 0,25 mA timp de 10 min, au fost analizate spectral în UV-Vis-NIR după 30
minute și în final prin DF și RAMA.
(a) (b)
Fig. 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol. 2LMW în ac. formic.
Procedura de oxidare electrochimică, a probelor, s-a repetat de încă 4 ori,
la intervale de 24 de ore. S-a observat o scădere a absorbanței, însoțită și de o
deplasare spre lungimi de undă mai mari. Soluțiile proaspăt preparate nu au
prezentat creșteri ale absorbanței, ci mai curând mici scăderi însoțite de deplasări
spre lungimi de undă mai mari.
În final dispariția semnalului Raman pune în evidență tocmai scăderea
activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative.
Fenomenul poate fi datorat adsorbției/absorbției de hidrogen la nivelul
nanoparticulelor de aur [18 - 20] în urma oxidării electrochimice. Se induc astfel
schimbări structurale în masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se
menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22]. Odată cu îmbătrânirea acestor
soluții, are loc o reorganizare structurală lentă, care conduce la stări mai puţin
active.
Au fost supuse iradierii, în spectrul vizibil, probe de nanoparticule de aur
epuizate prin îmbătrânire în timp, în scopul reactivării efectelor de Plasmon
Rezonant și SERS. S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min, distanța
optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de
25 0C. S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și
SERS.
400 600 800 1000
0.0
0.2
0.4
Ab
sorb
ance
(a.
u.)
Wavelength (nm)
2LMW MaetorB
10mL 2LMW+1mL Ac. Formic
10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (2)
10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (3)
10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (4)
10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (5)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
20000
40000
60000
80000
Inte
nsi
tate
(u
.a.)
Deplasare Raman (cm-1)
2LMW m
2LMW +Ac Formic
2134
2142
2907
2924
1584
1524
235,5
14
Creștea semnalului Raman sugerează o înbunătățire a relației (interacției
intime) mediu-polimer și nanoparticule. Soluțiile care conțin chitosani, cu mase
mici și medii moleculare, prezintă cel mai puternic semnal Raman. La toate
soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară, acest fenomen este mai slab.
(a) (b)
Fig. 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată
sub acțiunea luminii.
IV. 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale
nobile
Pentru început au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint
introduse în medii de cultură bacteriană. S-a urmărit modul în care efectul
antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag
II), de concentrația (10, 30, 60 μg/ml în mediu) și modul în care prezența
polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor în mediile biologice [25].
Fig. 129 Dinamica de creştere a curbei
bacteriene în mediu LB cu E. coli pentru
diferite mărimi şi concentraţii ale
nanoparticulelor de argint
Fig. 130 Dinamica de creştere a curbei
bacteriene în mediu LB cu S. aureus. pentru
diferite mărimi şi concentraţii ale
nanoparticulelor de argint.
400 600 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Inte
nsi
tate
(u
.a.)
Lungime de unda (nm)
2LMW
1exp
2exp
3exp
5exp
6exp
7exp
8exp
9exp
10exp
11exp
12exp
13exp
14exp
16exp
test 2
17exp
18exp
19exp
20exp
21exp
22exp
523
525
525
614
614
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
50000
100000
150000
200000
250000
Inte
nsi
tate
u.a
.
Deplasare Raman (cm-1)
2LMW m
2LMW Viz
1578
1546,5
2134
2123,4
2921
2910
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Control
AgI (1g/ml)
AgI (5g/ml)
AgI (5g/ml)
AgII (1g/ml)
AgII (5g/ml)
AgII (5g/ml)
Den
sita
te o
pti
ca
Timp (ore)
0 10 20 30 40 50
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Den
sita
te o
pti
ca
Timp (ore)
Contro
AgI (1g/ml)
AgI (5g/ml)
AgI (50g/ml)
AgII (1g/ml)
AgII (5g/ml)
AgII (50g/ml)
15
Prin microscopie DF și SEM s-au pus în evidență prezența
nanoparticulelor de argint în mediul de cultură și inducerea unor modificări în
morfologia celulei. Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect
antibacterian chiar și la concentrații mai mici decât cele din literatură. Polimerul de
acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului
bacterian, datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor. Eficiența
bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor,
aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă.
Control Ag I, 10 μg/mL Ag II, 10 μg/mL
a b c
d e f
Fig. 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I – 29 nm şi Ag II – 23
nm asupra morfologiei celulelor de E. coli (a, b, c) şi S. aureus (d, e, f).
Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat
proprietăţi antibacteriene eficiente, pare a fi datorat formării de aglomerări şi
ancorării la suprafaţa celulei bacteriene, ceea ce ne determină să credem că
dispersia nanoparticulelor în polimer se menține chiar și în formele aglomerate.
Studiul își propune, de asemenea, să evalueze biocompatibilitatea
nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse
de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini
bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor în condiții de stres. S-a
folosită o tulpină test (LPS, 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă
bacteriană comună, produsă de bacteriile Gram negative.
16
După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μg/ml, 10
μg/ml şi polimer (grupului de control), în analizele de laborator s-a observant ca nu
au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare, GOT, GPT şi
a nivelurilor de LDH, nici a parametrilor imunitari (OC, PC, BC. ).
Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul
toxic indus de LPS (figura 135), prin creșterea nivelului anticorpilor.
Fig. 135 Nivelul anticorpilor în a 9-a zi,
postimunizate cu (LPS, 250 μg/kg) la
administrarea AuNP1 și AuNP2.
Fig. 137. Indicele de fagocitare in vitro al
neutrofilelor circulante în a 9-a zi
postimunizate cu (LPS) la administrarea
AuNP1 și AuNP2.
Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de
fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura
137).
În urma inducerii stresului electric, s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la
animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2, sugerându-se că nanoparticulele
de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138). Rezultate
experimentale similare au fost observate și în cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare
individuală în tub (figura 139), însă efectele sunt mai pronunțate.
Fig. 138 Nivelul anticorpilor evaluat în a
4-a zi postimunizate cu (LPS, 250 μg/kg)
la administrarea AuNP1 și AuNP2, pentru
animalele supuse stimuluilui electric
Fig.139 Nivelul anticorpilor în a 4-a zi
postimunizate cu (LPS, 250 μg/kg) la
administrarea AuNP1 și AuNP2, pentru
animalele supuse izolării.
17
Studii de comportament și modificări neurocomportamentale, la șoareci, au
sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint.
Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului
de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag. De asemenea rezultatele de
limitare a toxicității induse de LPS, de către nanoparticulele de Au împachetate în
chitosan, la şobolanii de laborator, au sugerat investigarea efectului acestora asupra
creierului și a ficatului.
S-a constatat, la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag, cum coeficienţii
creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28]. Putem spune că
nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate în
procesele memoriei, în loturile tratate cu nanoparticule de Ag, indiferent de
dimensiunea acestora.
Fig. 144 Imagini de microscopie optică în DF indică formarea de aglomerări de
nanoparticule de Ag în creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)
Fig. 145 Histopatologia creierelor. Control (A), Ag I – 5 µg/ml (B), Ag I – 10 µg/ml (C), Ag
II – 5 µg/ml (D), Ag II – 10 µg/ml (E). Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul
cu nanoparticule de argint.
18
În cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari
AuNP2 și LPS, ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală,
comparativ cu controlul. S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a
greutății creierului în raport cu greutatea corporală numai în cazul LPS + AuNP2
comparativ cu controlul. Cu toate acestea în grupurile tratate cu LPS şi cu ambele
tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative în creier.
AuNP1(în insert Controlul) (a) AuNP (b)
Fig. 146 Imaginile de microscopie optică în DF indică formarea de aglomerări de
nanoparticule AuNP2 în creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte
puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (în insert).
Fig. 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după
expunerea la AuNP1 şi AuNP2. A. control; B. LPS; C. LPS + AuNP1; D. LPS + AuNP2.
A
B
C
D
19
Concluzii generale
În această lucrare mi-am propus să obțin în condiții blânde, vezicule de
dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme în biomedicină.
Pentru a împiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe
suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea
unor monomeri biocompatibili.
Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și
chitosanul, un biopolimer cationic, care poate interacţiona atât cu bistratul lipidic al
veziculelor cât și cu membranele anionice ale celulelor. Pentru ajustarea pH-ului,
la nivel fiziologic, toate sistemele coloidale au fost dializate, stabilitatea acestora
fiind medie – acceptabilă pentru aplicațiile propuse.
Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile
datorită polimerului de acoperire, carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat
o încărcare cu sarcină pozitivă a acestora.
Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus în evidență
următoarele:
procesul de eliberare se prelungește în timp față de substanța
neîncorporată;
momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul
chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel
gastric s-a obținut cu întârziere față de obținerea maximului de
concentrație din sânge, de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul
sistemului nervos după administrarea de magneziu încorporat în vezicule,
a suferit intârzieri și mai mari).
Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu
polimer și prezintă o bună stabilitate.
Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori
fizici externi (încălzire, răcire) a arătat că soluțiile suferă în timp un proces de
oxidare care se manifestă mai rapid la înghețare și care în final poate fi considerat
un proces de îmbătrânire mai lentă.
Sub acțiunea unor formulări chimice, nanoparticulele suferă un proces de
oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal. Prin iradiere
în vizibil, am reușit să întârziem procesul de oxidare în soluțiile coloidale,
provocând intensificarea efectului LPR.
20
Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că:
- atât nanoparticulele de argint cât și cele de aur în cei doi polimeri prezintă o bună
biocompatibilitate cu organismul.
- creșterea activității antibacteriene, datorită prezenței polimerului de asociere în
soluțiile cu nanoparticule de argint, a permis obținerea unor rezultate superioare
pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele
studiate în literatură. Mai mult decât atât s-a observat că argintul cu dimensiunea
medie de 23 nm este mult mai activ decât argintul de 29 nm.
- soluțiile cu nanoparticule de aur în chitosan acționează împotriva toxicității
induse de (un factor nociv) LPS, fapt demonstrat prin analiza detaliată a
parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi în serul animalelor experimentale.
Sub acțiunea celor două forme de stres, nanoparticulele de aur, nu au
putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin
administrarea LPS.
- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) în PAmHU au prezentat
efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan. Ambele soluțiil de aur în chitosan
nu au produs efecte neurotoxice, chiar dacă la aurul de 22,22 nm s-au manifestat
ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului.
Evaluarea histopatologică a creierelor în vederea determinării
neurotoxicităţii induse de nanoparticule, a arătat modificări sub formă de clivaj
local al neuronilor în cazul nanoparticulelor de Ag în PAmHU și lipsa totală a
modificărilor patologice în cazul nanoparticulelor de Au în chitosan.
Comparând comportamentul nanoparticulelor de metale nobile în cei doi
polimeri se poate spune că:
Nanoparticulele stabilizate în chitosan prezintă modificări de
comportament la interacțiunea cu mediul în care ajung, datorită
comportamentului diferit al chitosanului în funcție de pH.
Nanoparticulele de metale nobile stabilizate în PAmHU sau în chitosan au
produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape
comparabile, atât în mediile de cultură cât și în testele pe șobolani.
21
Lucrări științifice
Lucrări publicate ISI
1. M. Stefan, L. Hritcu, M. Mihasan, Daniela Pricop, Irina Gostin, R-I. Olariu,
Simona Dunca, V.Melnig, Enhanced antibacterial effect of silver
nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-
hydroxyurethane) media, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,
Volume 22, Issue 4 (2011), Pages 789-796, DOI 10.1007/s10856-011-4281-z,
ISSN:0957-4530 (print version). ISSN: 1573-4838 (electronic version),
Article;ISI Factor 2.325 (2010) Influence Score 0.597
2. Laura Obreja, Dana Pricop, N. Foca, V. Melnig, Platinum nanoparticles
synthesis by sonoelectrochemical methods, Materiale Plastice, 47(1), 2010, p.
42 - 47. ISSN 0025/5289.
3. L. Hritcu; M. Stefan; Daniela Pricop; Anca Neagu; M. Mihasan; Liliana
Tartau; V. Melnig, Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate
LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats,
Materials Science and Engineering C, 2011 (Impact factor 2,407), Influence
Score 0,61 (trimisa spre publicare ).
4. D. Bîndar, C. Ionescu, V. Melnig, Study of Aging and Thermal Stability of
Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions, J.
Colloid. Interf. Sci. (trimisă spre publicare)
Abstracte publicate în reviste ISI
5. L. Tartau, D. Bindar, D. Ciubotariu, V. Melnig, Evaluation of
poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on
morphine-induced place preference in rats, Conference:24th Congress
Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location: Paris,
FRANCE Date: SEP 03-07, 2011, Sponsor(s): European Coll
Neuropsychopharmacol,Source:European Neuropsychopharmacology
Volume: 21 Supplement: 3 Pages: S267-S267, Published: SEP 2011, Impact
Factor: 4,201; AIS 1,208 (2010). http://dx.doi.org/10.1016/S0924-
977X(11)70416-3(Influence Score 1,5779)
6. L. Tartau, D. Bindar, V. Melnig, The effects of ketoprofen and dexketoprofen
soft matter vesicles in an experimental pain model in mice, European
Neuropsychopharmacology, Vol 20 Supplement 3, 2010, p. S276 - Papers of
the 23rd Congress Meeting of European-College-of-
Neuropsychopharmacology, AUG 28-SEP 01, 2010 Amsterdam, Netherlands,
22
ISSN 0924-977X. (Abstract) Impact Factor: 4,201; AIS 1,208 (2010).
http://dx.doi.org/10.1016/S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 1,5779)
7. Daniela Bîndar, Ana Garlea, Liliana Tartău, Viorel Melnig, Design of
magnesium chloride soft vehicle carrier, Magnesium Research 22(3) 2009, p.
185S, ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor: 1.246 (2009))( Influence
Score 0,267).
8. Liliana Tarţău, Daniela Bîndar, Raoul Vasile Lupuşoru, Viorel Melnig, The
effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in
mice, Magnesium Research 22(3) 2009, p. 212S, ISSN 0953-1424 (Abstract)
(Impact Factor: 1.246 (2009)) (Influence Score 0,267) .
Publicații non-ISI publicate
1. Liliana Tartau, Daniela Bindar, V. Melnig, Morphologic analysis and in vivo
subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid
agonist U50488, Acta Chemica Iasi, Vol 18(2)
2. A. Cazacu, D. Bîndar, L. Tarțău, L. Hrițcu, M. Ștefan, L. Niță, C. Ionescu, V.
Nica, G.Rusu, M. Dobromir, V. Melnig (2011): Effect on nerve structures of
functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis.
Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza, Secțiunea Genetică
și Biologie Moleculară, XII(1), pg.45-51.
3. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarțău, V. Melnig, Acetaminophen entrapped in soft
matter vesicles design based on nociceptive model in mice, Academic Journal
of Manufacturing Engineering, vol.8 Issue 1, 2010, pp. 12-17 ISSN 1583-
7904.B+
4. D. Pricop, M. Ștefan, M. Mihasan, L. Hriţcu, R. Olariu, V. Melnig,
Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical
synthesis, The 16th International Conference the Knowledge-Based
Organization: Applied Technical Sciences and Advanced Military
Technologies, November 25-27 2010, Sibiu, Romania, Conference
Proceedings Book Series: Knowledge Based Organization International
Conference Volume: 7, ISSN 1843-6722. ISI Thomson Reuters Conference
Proceedings Citation Index.B+
5. D. Bîndar, L. Tarţău, A. Gârlea, L. Niţă, V. Melnig, Effects of magnesium soft
matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice, Romanian
Journal of Biophysics, vol. 20, nr. 1, p. 23–35, 2010.B+
6. L.Tarţău, R.V. Lupuşoru, D.Bîndar, V.Melnig, Experimental researches on
the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model
in mice, Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology, Volume XIV,
Number 2, June 2010, pp. 113-117.B+
http://dx.doi.org/10.1016/S0924-977X(10)70359-Xhttp://thomsonreuters.com/products_services/science/science_products/a-z/conf_proceedings_citation_index
23
7. L.Tarţău, C.E Lupuşoru., D.Bîndar, V.Melnig, Biocompatibility investigation
and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles, Annals of the
Romanian Society for Cell Biology, Volume XVIII, Issue 2, December
2010.B+
8. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A. Chiriac, L. Niţă, V. Melnig, Effect of
acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice,
Annals of the Romanian Society for Cell Biology, Vol. XIV, Issue 2, p. 256-
260, 2009 .B+
Participări la conferințe/congrese internaționale și naționale:
9. D. Pricop, M. Ștefan, M. Mihașan, L. Hriţcu, R. Olariu, V. Melnig
Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical
synthesis. The 16th International Conference the Knowledge-Based
Organization: Applied Technical Sciences and Advanced Military
Technologies, November 25-27 2010, Sibiu, Romania (prezentare orală).
10. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A. Chiriac, V. Melnig, Acetaminophen
entrapped in soft matter vesicles design based on nociceptive model in mice
effects correlation, The 2nd
International Conference on Polymers Processing
in Engineering, Galați, 22 – 23 octombrie 2009 (prezentare orală).
11. L. Tartau, D. Bîndar, R. V. Lupusoru, V. Melnig , The effects of magnesium
soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in mice International
magnesium symposium, Romania, The XII – th International Magnesium
Symposium 22-25 Septembrie 2009 Iasi (prezentare orală).
12. L.Tarțău, L.V. Lupușoru, D.Bîndar, V. Melnig, Experimental Reseaches on
the effects of tramadol soft matter vesicles in a somatic pain model in mice.
Post.Satelite to the 46-th EUROTOX Meeting, Inovation Trough
Nanotechnology and Nanomaterials- Current Aspect of Safety Assesment and
Regulation, 22-24 april 2010, Dresden Germany (prezentare orala)
13. L.Tarțău, D.Bîndar, V.Melnig, Experimental researches on the effects of
original tramadol loaded nanoparticulate formulations in visceral nociception
, Joint meeting of 2-nd Hungarian Symposium on Neurostimulation,
Hungarian Pain Society and Teaching course on Neuromodulation for Central
and Eastern Europe , Greece and Israel, 30sept -2oct 2010, Pecs
Hungary.(prezentare orala)
14. L. Tarţău, C. E. Lupuşoru, D. Bîndar, V. Melnig Biocompatibility
investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles
Al XXVIII Simpozion Stiintific SRBC 9-12 Iunie 2010 , Constanţa
(prezentare orală).
24
15. L. Tarţău, C.E. Lupuşoru, D.Bîndar, V.Melnig, Designul, evaluarea toxicităţii
acute şi studierea eliberării in vivo a ketoprofenului trapat în nano-vezicule
lipidice, , A XXVIII-a Sesiune Anuala a SRBC, 9-12 iunie 2010, Constanţa
(prezentare orală)
16. L. Tarţău, R.V. Lupuşoru, D. Bîndar, V Melnig, In vivo release and visceral antinociceptive effect evaluation of ketoprofen loaded vesicles in mice 11-th
International Congres of Clinical Pharmacology, Therapeutics and Toxicology
8-11 June Oradea 2010 (prezentare orală).
17. V. Melnig, L. Obreja A. Garlea, D. Bîndar, Quantum nanoparticles effects used for biological application. The X-th National Coference of Biophysics
“CNB 2009 „1-3 october 2009 Cluj (prezentare orala).
18. V.Melnig, N.Foca, L.Obreja, D. Pricop Size-controled synthesis of
monodisperse platinum nanoparticle by sonoelectrochemical methods. 3-rd
International Confertence „ Biomaterials & Medical Devices” BioMed 2008,
13-16 november 2008 Bucuresti
Participări cu poster
1. L. Tarțău, D. Bîndar, V. Melnig The effect of ketoprofen and dexketoprofen
soft matter vesicles in an experimental pain model in mice,The 23rd
ECNPCongres, Amsterdam, The Netherlands, 28 august-1 september 2010
(poster).
2. L. Tarțău, R.V. Lupusoru, D. Bîndar, C. Lupusoru, V Melnig Experimental
researches on the effects of tramadol soft vesicles in a somatic pain model in
mice „Inovation through nanotechnhology and nanomaterials”Dresden 22-24
April 2010 (poster).
3. D. Bîndar, A. Garlea, L. Tartau, V. Melnig, Design of magnesium chloride
soft vehicle carrier, 12th International Magnesium Symposium, Iasi 22-25
septembrie 2009 (poster).
4. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A.Chiriac, L Nită, V Melnig, Eeffect of
acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice
The 15 th International Scientific Conference Land Force Academy 26-28
November 2009 Sibiu (poster).
5. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarțău, A. Chiriac, L. Niță, V. Melnig, Soft vesicle
carrier containing magnesium chloride self-assemble characterization,
NanoRomania International Workshop Iasi, 2-5 iunie 2009 (poster).
6. A. Gârlea, D. Pricop, V. Melnig, M. I. Popa, Paracetamol Nanocontainers
Obtained in Cationic Polymer-Surfactant Self-Assembling Matrices, 8th
International Conference on Physics of Advanced Materials, Iasi, 4-7 iunie,
2008 (poster).
25
7. L.Tarțău, D.Bîndar, V.Melnig, Mophologic analysis and in vivo subacute
toxicity evolation of nano-vesicles encapsulating the k-opioid agonist U50488,
1-er Colloque Franco-Romain de Chimie Medicinale, Iasi 07-08 oct 2010
(poster)
8. M. Viorel, Ș. Marius, H. Lucian, M. Mihășan, C. Irina, D.Pricop, Antibacterial
activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in
Poly(amide-hydroxyurethane) media. Al III-lea Congres Internaţional şi a
XXIX-a sesiune anuală a S.R.B.C., 8-12 iunie 2011, Arad
9. D. Bîndar, L. Tarțău, A. Gârlea, L. Niță, V. Melnig, Effects of magnesium soft
matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice, National
Conference on Biophysics, Cluj-Napoca, 1-3 octombrie 2009 (poster).
10. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarţău, A. Chiriac, L. Niţă, V. Melnig, Soft vesicle
carrier containing magnesium chloride self-ansamble characterization,
Romanian Society of Pure and Applied Biophysics (RSPAB), Xth edition.
Cluj Napoca 1-3 october 2009 (poster).
11. A. Cazacu, L. Ursu, D. Pricop, L. Hrițcu, S. Marius, V. Melnig, Silver
nanoparticles plasmon – resonant applications in biological microscopy,
Conferinţa Naţională de Fizică CNF 2010 - Iaşi 23-25 septembrie 2010,
Rezumatele Lucrarilor p.174 (poster)
12. D. Bîndar, A. Gârlea, L. Tarțău, A. Chiriac, V. Melnig, Efectele
acetaminofenului transportat in vezicule moi in modelul somatizari durerii la
soareci, 21-22 octombrie 2009, Bucuresti (prezentare poster)
Contract de cercetare
PN II Idei cod 1996 nr. 509/2008: Sinteza in conditii blande prin
nanodimensionarea particulelor metalice in matrice de copolimeri bloc amfifilici
de nanoparticule active biologic - platforme in bioinginerie
26
Bibliografie selectivă
1. D.D. Lasic, Elsevier, New York, 1998. 2. El-Sayed, I. H.; Huang, X.; EL-Sayed, M. A. Nano letters, 5, 821, 2005 3. Mie G (1908) Ann Phys 25:377 4. El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34:257 5. Kreibig U, Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters, Vol. 25. Springer,
Berlin
6. P. Buseck, J. M. Cowley, L. Eyring eds., High resolution transmission electron microscopy and associated techniques, New York, London, Amsterdam, Oxford
University Press 1988).
7. Douglas B. Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging, a John Wiley & Sons, Inc., Publication.
8. D. Cullity, Elemnts of X-Ray Diffraction, Reading, Addison-Wesley Publishing Co. Inc., 1978.
9. J. P. Glusker, M. Lewis, M. Rossi, Crystal Structure Analysis for Chemists and Biologists, VCH Publishers, New York, 1994.
10. R. Griffiths, J. A. De Haseth, Fourier Transform Infrared Spectrometr, Wiley, N York, 1986
11. J. R. Ferraro, K. K. Krishnan, Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Industrial and Laboratory Chemical Analysis, Academic Press, San Diego, 1990.
12. R. K. Poole, Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption: visible and ultraviolet spectra, în Michael. G. Gore (ed.), Spectrophotometry and
Spectrofluorimetry Oxford University Press
13. Gârlea, A., M.I. Popa, V. Pohoaţă, V. Melnig, Ibuprofen/ketoprofen entrapment in chitosan based vesicle carrier, Rom. J. Biophys, 2007, 17, 157-168.
14. Daniela Bîndar, Ana Garlea, Liliana Tartău, Viorel Melnig, Design of magnesium chloride soft vehicle carrier, Magnesium Research 22(3) 2009, p. 185S, ISSN 0953-
15. Tarţău L., Lupuşoru C.E., Bîndar Daniela, Melnig V., Biocompatibility investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles, Annals of the
Romanian Society for Cell Biology, Volume XVIII, Issue 2, December 2010
16. Sánchez-Carpena, J., Domínguez-Hervella, F., García, I., Gene, E., Bugarín, R., Martín, A., Tomás-Vecina, S., García, D., Serrano, J.A., Roman, A., Mariné M,
Mosteiro ML. Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal
colic. Eur J Clin Pharmacol. 63 (8):751-60, 2007
17. Zippel, H, Wagenitz, A., A multicentre, randomised, double-blind study comparing the efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the
symptomatic treatment of acute low back pain. Clin Drug Investig, 27 (8):533-43,
2007.
18. Jiménez-Martínez, E., Gasco-García, C., Arrieta-Blanco, J.J., Gomez del Torno, J., Bartolome Villar, B.. Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol
25mg. vs. Ibuprofen 600mg. after their administration in patients subjected to oral
surgery. Med Oral, 9 (2):143-8, 138-43, 2004.
19. L.Tartau, D. Bindar,V.Melnig, The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter vesicles in an experimental pain model in mice, European Neuropsychopharmacology,
Vol 20 S.3- Papers of the 23rd ECNP Congress,p. S276, ISSN 0924-977X
20. Obreja, l., Foca, N., Popa, M. I., Melnig, V., Analele Univ. Al. I. Cuza, 7, 2008, p. 31.
21. Cismaru, l., Hamaide, T., Popa, M., Materiale Plastice, 44(3), 2007, p. 243.
27
22. Laura Obreja, Daniela Pricop, Neculai Foca, Viorel Melnig, Platinum nanoparticles
synthesis by sonoelectrochemical methods, Materiale Plastice, 47 (1) pg.42-47 2010
23. Obreja, L., Foca, N., Popa, M. I., Melnig, V., Analele Univ. Al. I. Cuza, 7, 2008, p. 3
Obreja L, Dorohoi DH, Melnig V, Foca N, Nastuta A (2008)
Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic
assay synthesis. Mater Plast 3: 261-2641
24. Melnig, V., Ciobanu, C., J Optoelectron Adv Mater, 7(6), 2005, p. 2809.
25. Ana Cazacu, Daniela Bîndar, Liliana Tarțău, Lucian Hrițcu, Marius Ștefan, Loredana
Niță, Cezar Ionescu, Valentin Nica, George Rusu, Marius Dobromir, Viorel Melnig
(2011): Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles
obtained by one pot synthesis. Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan
Cuza, Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară, XII(1), pg.45-51
26. Bîndar Daniela, Cezar Ionescu , V. Melnig, Study of Aging and Thermal Stability of
Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions, J. Colloid.
Interf. Sci. (trimisă spre publicare)
27. M. Baia, F. Toderas, L. Baia, J. Popp, S. Astilean, Chem. Phys. Letters 422, 127, 2006
28. Panacek A, Kevitek I, Prucek, R, Kolar M, VecerovaR, Pizorova M, Sharma VK,
Nevena T, Zeboril R. Silver colloid nanoparticles: synthesis,characterization, and their
antibacterial activity
29. Ming-Hua Hoa, Pei-Yun Kuoa, Hsyue-Jen Hsieha, Tzu-Yang Hsienb, Lein-Tuan
Houc,Juin-Yih Laid, Da-Ming Wanga, Preparation of porous scaffolds by using freeze-
extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129–138)
30. L.D. Burke, A.M. O'Connell, A.P. O'Mullane, J. Appl. Electrochem. 33 (2003) 1125.
31. B. Bozzini, G. Giovannelli, S. Natali, Scr. Mater. 43 (2000) 877.
32. O'.M. Bockris, Z. Minevski, Int. J. Hydrogen Energy 25 (2000) 747.
33. J. Das, S. Patra, H. Yang, Chem. Commun. (2008) 4451
34. Hyun Ju Kang, Srikanta Patra, Jagotamoy Das, Abdul Aziz, Jinkyung Jo, Haesik Yang
Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles H.J. Kang et al. /
Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245–1248
35. Lucian Hritcu; Marius Stefan; Daniela Pricop; Anca Neagu; Marius Mihasan; Liliana
Tartau; Viorel Melnig, Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -
induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare
in Materials Science and Engineering C.
36. D. Pricop, M. Ștefan, M. Mihasan, L. Hriţcu, R. Olariu, V. Melnig, Antibacterial
activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis, The 16th
International Conference the Knowledge-Based Organization: Applied Technical
Sciences and Advanced Military Technologies, November 25-27 2010, Sibiu,
Romania, Conference Proceedings Book Series: Knowledge Based Organization
International Conference Volume: 7, ISSN 1843-6722. ISI Thomson Reuters
Conference Proceedings Citation Index
37. Garner J.P., Mason G.J., Behav Brain Res. 2002; 136(1):83–92.
38. L. Hritcu, A. Ciobica, L. Gorgan, 2009, Nicotine-induced memory impairment by
increasing brain oxidative stress. Cent. Eur. J. Biol., 4(3), 335–342.
http://admin-apps.webofknowledge.com/JCR/JCR?RQ=RECORD&rank=1&journal=J+COLLOID+INTERF+SCIhttp://admin-apps.webofknowledge.com/JCR/JCR?RQ=RECORD&rank=1&journal=J+COLLOID+INTERF+SCIhttp://thomsonreuters.com/products_services/science/science_products/a-z/conf_proceedings_citation_index