Nanoparticule multifunctionale pe baza de siliciu pentru tratamentul

A 10-a editie a Seminarului National de nanostiinta si nanotehnologie 18 mai 2011, Biblioteca Academiei Romane

Nanoparticule multifunctionale pe baza de siliciu pentru

tratamentul cancerului

IMT Bucuresti, Laboratorul de Nanobiotehnologii

Adina Bragaru, Irina Kleps, Teodora Ignat, Mihaela Miu, Monica Simion, Mihai Danila, Florea Craciunoiu

INSB Bucuresti

Mirela Diaconu

IOB Bucuresti

Sabin Cinca, Eugenia Tirifon


In terapia cancerului o problema importanta o constituie distrugerea celulelor canceroase fara sa fie afectate

tesuturile vecine sanatoase.

- Radioterapia constituie o metoda prin care tumoarea este iradiata, insa sunt afectate si tesuturile invecinate sanatoase.

- Chemoterapia presupune utilizarea medicamentelor puternice insa din pacate sunt afectate si alte tesuturi invecinate

datorita toxicitatii ridicate a acestora, iar in multe cazuri pacientul nu poate tolera dozele de medicamente anticancerigene

datorita toxicitatii ridicate.

Cadrul general al cercetarii

Dezvoltarea de noi tehnici prin care substanta activa sa fie eliberata selectiv, direct la organele

afectate, a devenit o etapa importanta pentru a ajunge la tratarea eficienta a cancerului.

S-a dezvoltat un sistem nanostructurat pe baza de siliciu pentru vectorizarea

si cedarea monitorizata a substantelor active biologic, de interes terapeutic.

ContributiaNanostructured silicon particles for medical applications, Kleps Irina, Ignat Teodora, Miu Mihaela, Craciunoiu Florea, Trif

Mihaela, Monica Simion, Adina Bragaru, Journal of Nanoscience and Nanotechnology (JNN), Vol.9, 1-7, 2009;

Study of the Micro- and Nanostructured Silicon for Biosensing and Medical Applications, Irina Kleps, Mihaela Miu, Monica Simion, Teodora Ignat, Adina Bragaru, Florea Craciunoiu, Mihai Danila, J. Biomed. Nanotechnol. 5, 300-309 (2009)


Siliciu poros modificat cu nanoparticule cu proprietati superparamagnetice (SPION),

acoperit cu strat polimeric biocompatibil si impregnat cu agent terapeutic

Structura sistemului obtinut

Imersie in dextran, 20 h


Experimente tehnologice de realizare a diferitor tipuri de microparticulelor de siliciu nanostructurat

S-au incercat mai multe metode de obtinere a siliciului poros:

- Porozificarea selectiva Si n/p prin masca fotolitografica- Porozificare in mai multi pasi a Si tip p+ prin masca fotolitografica- prin masca de Si3N4 deoarece solutia de porozificare este concentrata in HF, HF:C2H5OH (3:1) si masca de SiO2 nu rezista.

Imagine optica a microparticulelorde Si obtinute prin porozificareafolosind ca masca Si3N4, urmat de un proces ultrasonare

Imagini SEM ale microparticlulelor de Si nanostructurat

(a) n-epi/p+ Si si (b) n-difuzie in p+Si

0 50 100 150 200 250 3000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Curent (A) Potential (V)

Timp (sec)

Cur

ent (

A)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Potential (V)

Programul de porozificare multistrat este: 0.570 A (densitatea de curent 9mA/cm2); 10.0 sec si 3.000 A (densitatea de curent 50 mA/cm2); 10.0 sec (30 cicluri)


Obtinere de microparticule de siliciu poros cu proprietatisuperparamagnetice

Pentru micsorarea dimensiunii nanocristalitelor de Fe si pentru obtinerea magnetitei Fe3O4 (forma de Fe care ii confera proprietati SPION), experimentele de preparare a Fe au fost realizate utilizand Fe3+/Fe2+ (in raport stoichiometric 1:2), coprecipitarea facandu-se cu NH4OH la valori de pH alcalin (11 si 12-13).

F e 2+ / F e 3

+ + N H 4 O H F e 3 O 4

(a) (b)

Nanoparticule de oxid de fier preparate din saruri Fe3+ si Fe2+ precipitate prin adaugare de NH4OH: pH 11 (a), pH>11 (b).

Probele de PS impregnate cu nanoparticule de oxid de fier au fost analizate prin SEM si EDAX.

• Analizele SEM - particule de oxid de fier de 30 nm, neuniform distribuite pe suprafata PS. • Nanoparticule de oxid de fier se gasesc si in interiorul porilor in cazul probelor preparate in prezenta citratului de sodiu.

Spectru de difractie de raze X pentru PS cu particule de oxid de fier

(b)

Imagine SEM (a) si EDAX (b) a nanoparticulelor de oxid de Fe pe suprafata PS

(a)


Functionalizarea microparticulelor de siliciu in vederea atasariisubstantelor farmacologic active

Functionalizarea microparticulelor de siliciu in vederea atasarii substantelor farmacologic active

SiSi

Si Si

Si Si

B

A

B

ASpectrul FTIR inregistrat pentru nanoparticula de siliciu dupa tratamentul cu APTES (A) si (B)-nanoparticula de siliciufunctionalizata cu grupari de tip Si-OH

Spectrele FTIR inregistrate pentru A-chitosan; B-nanoparticulafunctionalizata cu chitosan A

B

-1400 cm-1 - atat in spectrul inregistrat pentru nanoparticula functionalizata cu chitosan, cat si in spectrul chitosanului se datoreaza vibratiei de intindere din gruparea –C-O a alcoolului primar;- In cazul spectrului inregistrat pentru nanoparticula functionalizata cu chitosan se constata o deplasare a benzii de la 1659 cm-1, caracteristica vibratiei de deformare din gruparea N-H si care sugereaza formarea legaturii de tip C=N, datorita agentului de reticulare, glutaraldehida si gruparea -NH2din molecula chitosanului.

- 3430 cm-1 –vibratia gruparii -NH2. -2928 cm-1 –vibratia gruparii –CH-. -1616 cm-1 si 1509 cm-1 –deformarilor gruparii -NH2 din molecula de APTES


Testarea in vivo a biocompatibilitatii si functionalităţii microparticulelor de siliciu functionalizate cu chitosan

Cerinţe de biocompatibilitate - mecanismele prin care nanoparticulele de siliciu generează sau nu, anumite efecte asupra organismuluigazdă:- dacă induce toxicitate asupra ţesuturilor înconjurătoare; - dacă deteriorează ţesutul gazdă prin inducerea unui stres mecanic.

Experimentul - pe un numar de 3 loturi sobolani Wistar inoculaţi intramuscular la nivelul trenului posterior cu 0,2 ml solutie/animal, urmarindu-se biocompatibilitatea si efectele asocierii dintre chitosan si particulele de siliciu

! nanoparticulele nu sunt hidrosolubile si compatibile cu organismul gazda si raman cantonate la locul de inoculare

Reactia locala la 48 ore dupa inocularea nanoparticulelor de siliciu:-reactie de iritabilitate, prurit;- leziuni hemoragice

La aproximativ o saptamana de la inoculare, efectul iritativ este redus, cu eliminarea crustelor si cicatrizarea zonei de inoculare

! reactia organismului de a respinge un corp strain


Experimente tehnologice de realizare a diferitor tipuri de microparticulelor de siliciu nanostructurat

Multistraturi de PS obtinute prin corodarea anodica a Si - p+

0 50 100 150 200 250 3000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Curent (A) Potential (V)

Timp (sec)

Cur

ent (

A)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Potential (V

)

Diagrama curent-potential-timp pentru 30 cicluri(0.570 A: 10.0 sec si 3.000 A: 10.0 sec)

Solutie electrolit - 30% HF

Densitate de curent: > 10 mA/cm2 - 10 sec;

> 100 mA/cm2 - 4 sec150 cicluri

~ 50 nm dimensiunea porilorSolutie electrolit - 30% HF

Densitate de curent: > 9 mA/cm2 - 10 sec;

> 50 mA/cm2 - 10 sec30 cicluri


Impregnarea microparticulelor de siliciu cu substante biologic active in vederea studierii procesului de difuzie a microparticulelor

Realizarea si caracterizarea sistemului hibrid microparticulelor de siliciu / dacarbazina

1000 1500 2000 2500 3000 3500

0,4

0,6

0,8

1,0 800

33192964

2869

1921

16621499

1269

1384

1327

1192

1030

1039

781876

Tran

smita

nce

(%)

Wavenumber (cm-1)

--SiNP-dacarbazine-- dacarbazine

Spectrele IR ale SiNP impregnate cu medicament comparative cu cel al medicamentului

- maximele corespunzatoare benzilor specifice legaturii Si-O-Si din particulele de siliciuin intervalul 1030 - 1039 cm-1. - vibratia simetrica a gruparii Si-O-Si la 800 si 876 cm-1, precum si prezenta maximelor de la 1269 si 1384 cm-1 caracteristice dacarbazinei, fapt care indica impregnarea microparticulelor de siliciu cu medicament.

Realizarea si caracterizarea sistemului hibrid polimer (dextran)- microparticule de Si – medicament

(dacarbazina)

1000 1500 2000 2500 3000 35000,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1087

3355

1647

Tran

smita

nce

(%)

Wavenumber (cm-1)

--SiNP-dacarbazina-dextran--SiNP-dacarbazina-APTES-dextran

Spectre IR corespunzatoare microparticulelor de siliciu impregnate cu medicament si inglobate in polimer, cu si fara functionalizare cu APTES

eficacitatea functionalizarii cu APTES a microarticulelor de siliciu impregnate cu medicament.


Studiul difuziei de medicament (dacarbazina) in SBF prin metoda FTIR

a

a, b- spectrul IR in cazulmicroparticulelor de Si difuzate in SBF;c- variatia transmitanteiin functie de timpul de diuzie

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Tran

smita

nce

(%)

Wavenumber (cm-1)

--SiNP-SBF 20h--SiNP-SBF 25H--SBF

0 5 10 15 20 25

0,00

0,01

0,02

0,03

Tran

smita

nta

(%)

Timpul pentru difuzie (ore)

Rata difuziei microparticulelor in SBF

Domeniul 1

Domeniul 2 950 1000 1050 1100 1150 1200

0,88

0,90

0,92

0,94

1066

1066

Tran

smita

nce

(%)

Wavenumber (cm-1)

--SiNP-SBF 20h--SiNP-SBF 25H--SBF

• Domeniul 1 - difuzia de Si prin membrana polimerica, • Domeniul 2- degradarea microparticulei de Si fara membrana polimerica protectoare. • Initial procesul de difuzie al medicamentului este lent datorita protejarii microparticulei de Si cu polimer, dar dupa 20 ore rata de difuzie creste datorita biodegradarii polimerului


a

Experimente de obtinere a sistemului hibrid de tip SPION folosind microparticule de siliciu nanostructurat impregnate cu nanoparticule de oxizi de fier cu proprietati superparamagnetice-medicament- polimer

Prepararea nanoparticulelor magnetice de oxid de fier

Imagine SEM ale nanoparticulelor magnetice de oxid de fier

Prepararea microparticulelor de siliciu nanostructurat cu nanoparticule de oxizi de fier cu proprietati

superparamagnetice

20 40 60 80

14000

21000

28000

Fe3O4(400)

Fe3O4(311)

Fe3O4(220)Fe3O4(511)

Fe3O4(440)Fe3O

4(111

)

Si(311)

Si(220)

I [cp

s]

2θ [o]

Magnetite SiO2/Magnetite

Glass holder

SiO2, lowCrystobalite,

Si(111)

Analiza prindifractometrie cu

raze X a sistemuluiSPION

Modificarea microparticulelor de siliciu de tip SPION cu APTS

600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 3300 3600

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tran

smita

nce

T %

Wavenumber cm-1

PSNP-Fe3O4 PSNP-Fe3O4-APTS586

598

29611549

1341

793

Comparatie intrespectrul IR al particulelor de tip SPION simple simodificate cu APTS

Obtinerea sistemului hibrid de tip SPION

a

500 1000 1500 2000 2500 3000 35000,75

0,80

0,85

0,90

0,95

1,00

Tran

smita

nce

T%Wavenumber cm-1

SPION-Dcz-Dextran Dextran1085

1002

1171

3440

793

1650

2925

1451

1365

Comparatie intre spectrele IR ale dextranului si cel al sistemului SPION-Dcz-dextran


Testarea “in vivo” a biocompatibilitatii agentului terapeutic

Studiile in vivo au fost realizate pe sobolani Wistar. Experimentele au fost realizate atât pe animele sănătoase, cât şi pe animale cu tumori experimentale induse – hepatom RS1.In cazul nanoparticulelor acoperite cu Dacarbazină, s-au realizat două suspensii iniţiale, de concentraţii 16 mg/ml, respectiv 8 mg/ml; din aceste suspensii s-au administrat câte 0,2 ml/animal

S-au administrat 6 doze, câte 2 doze / saptămână, durata de administrare fiind astfel de 3 săptămâni. Animalele uu fost inoculate intramuscular la nivelul trenului posterior, cu 0,2 ml suspensie nanoparticule/ animal, corespunzător diluţiilor menţionate. Pentru urmărirea efectelor imediate, din fiecare lot de studiu a fost sacrificat câte un animal la 48 h de la prima administrare, apoi sacrificarea animalelor s-a efectuat la intervale sptămânale, cu prelevarea de probe biologice.

Sunt prezente imaginile a două animale - unul din lotul ND2 (animale sănătoase tratate cu nanoparticule acoperite) şi unul din lotul TD – animale cu tumori experimentale. Pentru ambele animale nu se observă afectări ale organelor interne.

Aspect organe interne la animal din lotul TD1Aspect organe interne la animal din lotul ND2

! Uşoara iritaţie locală, datorată stresului mecanic de inoculare – prezentă numai la 2/36 animale la concentraţie maximă dispare la maxim 48 h. Examinarea organelor interne ale animalelor sacrificate nu a relevat prezenţa de afecţiuni, produsele administrate fiind bine acceptate.


! Se poate aprecia că sistemul ce contine microparticulele de siliciu nanostructurat de tipul SPION, impreuna cu medicamentul si polimerul biodegradabil pot acţiona ca vectori de transport ai unor produşi antitumorali, rezultat ce sugerează continuarea acestui studiu pentru testarea altor compuşi medicamentoşi legaţi de nanoparticule, precum şi a altor forme de tumori experimentale.

Concluzii

Va multumesc pentru atentie!

www.imt.ro/nanosic

Multumiri:

• Dr. Adrian Dinescu, IMT Bucuresti• Chim. Veronica Schiopu, IMT Bucuresti

Documents

Nanoparticule multifunctionale pe baza de siliciu pentru tratamentul