STERILIZACIJA Mikrobiološki procesi se po pravilu izvode pomoću čiste kulture na hranljivoj podlozi, uz obezbedjenje odgovarajućih fizičko-hemijskih prametara okoline. Ukoliko se u hranljivoj podlozi, koja se pravi od prirodnih sirovina, zadrže sve kulture koje se inače u njoj u prirodnom ambijentu nalaze, tokom procesa će doći do njihovog rasta i razvoja. To se višestruko odražava na željeni proces, pa se pored željene kulture u sistemu mogu razviti i neželjene kulture ¨kontaminanti¨ koje dovode do sledećih pojava:

1. U fermentacionoj tečnosti (podlozi) se odvija paralelno rast više mikroorganizama, pa dolazi do pada proizvodnosti

2. Pri kontinualnim procesima može doći do potpunog eliminaisanja željenog proizvoda 3. Kontaminanti se mogu naći u finalnom proizvodu, što dovodi do smanjenja njegovog

kvaliteta 4. Kontaminanti otežavaju izdvajanje finalnog proizvoda pri separaciji proizvoda 5. Kotaminanti mogu da razgrade finalni proizvod, na primer antibiotici 6. Kontaminacije bakterijskih populacija dovode do autolize ćelija

Kontaminacija se može sprečiti na sledeći način:

a) Upotrebom čistih kultura (inokuluma) za pokretanje nekog mikrobiološkog procesa

b) Sterilizacijom hranljive podloge c) Sterilizacijom opreme i bioreaktora d) Sterilizacijom svih komponenata koje se naknadno dodaju u bioreaktor e) Održavanjem sterilnih uslova tokom trajanja mikrobiološkog procesa

Postoje primeri da se kontaminacija može sprečiti i održavanjem vrednosti pH na odredjenom nivou. Na primer pri proizvodnji piva se koristi hmelj koji sadrži gorke materije koje, pored toga što daju pivu karakterističan ukus, deluju inhibitorno na rast bakterija. Najčešće korišćeni termini koji se odnose na inaktivaciju mikroorganizama: Sterilizacija – postupak uništavanja ili inhibicije životnih aktivnosti bilo kojeg oblika života Dezinfekcija – postupak uništavanja živih organizama koji izazivaju razne bolesti i infekcije Antiseptik – hemijsko jedinjenje koje se koristi za uniztavanje patogenih organizama, a koristi se za zaštitu ljudi i životinja Dezinficijens – opšti izraz za hemijsko jedinjenje koje se upotrebljava za uništavanje nepoželjnih organizama Pasterizacija – postupak kojim se termički smanjuje broj mikroorganizama, odnosno uništavaju se ili inaktiviraju samo neke vrste mikroorganizama koji izazivaju kvarenje hrane. Postupak se sastoji u zagrevanju namirnica do temperature 62-80 oC, koje se na toj temperaturi zadržavaju obično oko 30 min, a zatim naglo hlade do temperature čuvanja. Delimična sterilizacija je termin koji se koristi umesto pasterizacije ili dezinfekcije, a predstavlja postupak kojim se smanjuje koncentracija mikroorganizama u nekoj sredini. Sterilna tehnika je obavljanje nekog mikrobiološkog procesa bez prisustva nepoželjnih mikroorganizama tj. kontaminanata. Osnovni principi sterilne tehnike su:

1. hranljiva podloga se steriliše 2. sterilna podloga, ohladjena do temperature fermentacije, se inokuliše sa proizvodnim

mikroorganizmom

3. sterilna podloga više nije ¨sterilna¨ jer se u njoj nalaze proizvodni mikroorganizmi ali bez kontaminanata.

Sterilišu se:

a) čvrsti materijali, uredjaji i oprema, bioreaktori b) tečni materijali (hranljive podloge) voda, tečni finalni proizvodi c) gasovi, najčešće vazduh koji se uduvava u bioreaktor tokom procesa

Metode sterilizacije Za proces sterilizacije se koriste sledeće metode:

(1) Razaranje strukture ćelija (destrukcija), pomoću jakih oksidacionih sredstava (azotna, sumporna, hromsumporna kiselina ili toplotom (plamen)). Koristi se najčešće u laboratorijskim uslovima premda se i u industriji ponekad koriste razblaženi rastvori kiselina za pranje opreme i bioreaktora.

(2) Uništenje ili inaktivacija mikroorganizma, tako da više ne postoji mogućnost njihovog razmnožavanja. Pri ovome spoljašnje karakteristike ćelija mogu da ostanu u izvornom obliku. Inaktivacija se izvodi pomoću: toplote ( suva – pregrejan vazduh ili vlažna – vodena para), UV ili X zraka, ultrazvukom, ili pomoću hemijskih jedinjenja (formaldehid, alkohol, hlor, etilenoksid... Deterdženti i dezinficijensi se koriste za pranje uredjaja i prateće opreme pre konačne sterilizacije.

(3) Uklanjanje mikroorganizama fizičkim metodama, sterilizacija pomoću filtracije. Ovaj postupak se koristi za gasove i tečnosti koje su termolabilne (vitamini). Razlikuju se dva osnovna načina: a) apsolutna filtracija (filtri su kompaktni sa definisanim veličinama pora, pr. Filter za reversnu osmozu) i b) delimična filtracija koja se izvodi pomoću filtera napunjenih vlaknima, čija sposobnost filtracije zavisi od režima pod kojima rade.

Kinetika sterilizacije Suština sterilizacije je u razgradnji nekih od složenijih molekula ćelije koji su bitni i neophodni za vitalne životne funkcije, čiji je krajnji efekat sprečavanje razmnožavanja tj. povećanja koncentracije mikroorganizama u bioreaktoru. Brzina inaktivacije se može opisati kinetičkim modelima koji su analogni sa modelima za odvijanje hemijskih reakcija. Odumiranje populacije mikroorganizama pod dejstvom toplote ili nekim drugim načinom, je reakcija prvog reda i može se objasniti na sledeće načine:

1. Pod dejstvom toplote se ključni molekul (C) razlaže na proizvode rekcije X, Y, Z prema jednačini

ZYXC

2. Pod uticajem pregrejanog vazduha se ključno jedinjenje (C) inaktivira pomoću O2 koji je u višku, pa je i ovo reakcija prvog reda

ZYXOC 2

3. Pod uticajem pregrejane vodene pare (vlažna sterilizacija) ključno jedinjenje (C) se razlaže, sa vodom u višku, po reakciji prvog reda

ZYXOHC 2 Brzina odvijanja reakcije odumiranja ili inaktivacije mikroorganizama se prati promene reaktanta (C) sa vremenom, pa je za: t=0 ; C=a t=t ; C=a-x gde je x – inaktivirani deo ključnog organskog molekula nakon nekog vremena (t) Brzina nestajanja (C), ako se uzme u obzir da se radi o jednačini prvog reda, je:

kCdt

dC

gde je k – konstanta brzine inaktivacije mikroorganizama (vreme –1). Razdvajanjem promenljivih i integracijom, uz pretpostavku da je T=const:

xa

akt ln

Pošto je poznata koncentracija (C) na početku (a), onda se merenjem (a-x) može odrediti konstanta brzine inaktivacije mikroorganizama (k).

Kostanta brzine reakcije (k) se menja sa temperaturom (T) po Arenijusovom zakonu, k=f(T), pa je:

RT

Ea

eAk gde je: A - konstanta karakteristična za mikroorganizam, sa jedinicama [vreme -1], Ea - energija aktivacije karakteristična za mikroorganizam, sa jedinicama [kJ/mol] R - gasna konstanta [kJ/mol K] Integrisani oblik prethodne jednačine je:

RT

EAk a lnln

Pošto je koncentracija ključnog organskog molekula (C) u ćeliji, uglavnom konstantna, onda se kinetika sterilizacije može izraziti preko broja mikroorganizama (N). Brzina odumiranja ili inaktivacije mikrorganizama se izražava saglasno jednačini:

kNNNkdt

dN )( `

0

gde je: N- broj preživelih ćelija nakon vremena t (broj/zapremina) No – početni broj mikroorganizama (broj/zapremina) N' - uništeni mikroorganizmi nakon vremena t (broj/zapremina) Ukoliko se uvedu početni uslovi:

t=0 N(0)=No t=t N(t)=Nt

Onda je integrisani oblik prethodne jednačine:

tN

Nkt 0ln

odnosno u obliku:

ktN

N t 0

ln

gde se nakon antilogaritmovanja prethodne jednačine, uz uslov T=const, dobija

)(0

ktt eNN

Decimalno vreme odumiranja

U praksi se često koristi termin ¨decimalno vreme odumiranja¨ i označava tD. Ono predstavlja vreme zadržavanja na temperaturi sterilizacije (obično 121 oC) za koje se broj prisutnih mikroorganizama smanji na 1/10 od početnog broja N0, odnosno to je vreme za koje se uništi 90% mikroorganizama od početnog broja, pa se korišćenjem već definisane jednačine i zamenom dobija:

Dt kt

N

N

N

N

10

1ln10lnln

0

0

0

odakle je:

kkt D

303.210ln

U tabeli su date vrednosti k i tD za neke spore baktaerija Mikroorganizam k (min-1) tD (min ) Bacillus subtilis FS 5230 2.6-3.3 0.6-0.9 B. stearothermophilus FS 1518 0.77 3 Clostridium sporogenes PA 3679 1.3 1.8 Kao što je već pokazano, veličine k i tD su medjusobno povezane i u isto vreme zavisne od temperature, pa se vrednosti predstavljne u gornjoj tabeli, odnose na temperaturu T=121 oC. Takodje je jasno da što je manja vrednost konstante brzine inaktivacije to je mikroorganizam otporniji i sterilizaciju je teže izvesti. Sterilizacija hranljivih podloga Sterilizacija hranljivih podloga se obično u praksi izvodi pomoću toplote, pa se u praksi za projektovanje koristi prethodna analiza. Kako je već pokazano broj preživelih ćelija nakon vremena t se izračunava po jednačini:

)(0

ktt eNN

odakle se sredjivanjem dobija:

)(

0

ktt eN

N

Obe jednačine se grafički mogu prikazati grafički u normalnom i logaritamskom obliku:

Sa dijagrama se može uočiti i da se vrednosti Nt/No i ln(Nt/No) smanjuju eksponencijalno sa vremenom, odnosno da se broj aktivnih ćelija mikroorganizama smanjuje eksponencijalno sa vremenom. Iz zavisnosti ln(Nt/No) od t, se dobija prava linija a nagib prave linije predstavlja konstantu brzine inaktivacije mikroorganizama (-k). Drugi bitan zaključak je da ako Nt→0 onda treba t→∞, odnosno za potpunu sterilizaciju je potrebno beskonačno vreme, tj. ona se nikad ne ostvaruje u realnim uslovima. Takodje se može zaključiti da nakon odredjenog vremena Nt može biti manje od 1; Nt<1, što fizički nije moguće. Zato se ovo treba shvatiti kao verovatnoća da jedna ćelija ostane u aktivna nakon obavljene sterilizacije. Tako na primer ako je Nt=10-3, to znači da da je verovatnoća da je jedna ćelija ostala aktivna 1/1000. U praksi to znači da je od 1000 obavljenih diskontinualnih sterilizacija jedna kontaminirana. Kao i sve drugo i sporogeni mikroorganizmi odstupaju od idealnog stanja, pa je na slici predstavljeno odstupanje izmedju teoretske i stvarne brzine inaktivacije mikroorganizma.

Prikazani dijagrami pokazuju da postoji odstupanje od linearne zavisnosti u početku klijanja spora, pod uticajem toplote i vlage. U slučaju (a) veći je broj novoformiranih ćelija iz

spora nego što se inaktivira, u slučaju (b) broj novoformiranih je jednak broju inaktiviranih i u slučaju (c) veća je brzina inaktivacije od brzine formiranja novih ćelija iz spora. Konstanta brzine inaktivacije živih ćelija mikroorganizama (k), odnosno specifična brzina odumiranja se menja sa temperaturom sterilizacije po zakonitosti koja je data pomoću prethodno već date jednačine:

RT

Ea

eAk iz koje se integracijom dobija jednačina:

RT

EAk a lnln (A)

Grafičkim prikazivanjem zavisnosti ln k =f (1/T) u koordinatama ln k;1/T, dobija se linearna zavisnost, gde se iz nagiba prave može odrediti vrednost energije aktivacije Ea. Kombinacijom jednačina koja definiše k i jednačine:

)(

0

ktt eN

N

dobija se: )(

0ln RT

E

t

a

eAtN

N

Ako se sada, član na levoj strani jednačine, označi sa ¨¨ tj.:

tN

N 0ln

dobija se kriterijum sterilizacije ili Del-faktor, koji predstavlja meru inaktivacije (destrukcije) mikrorganizama za odredjeno vreme. Kombinovanjem prethodnih jednačina dobija se:

RT

Ea

eAt koja nakon logaritmovanja prelazi u oblik:

ART

Et a lnln

Ova jednačina je parametarska prava linija u odnosu na parametar , u koordinatama 1/T; ln t. Nagib prave zavisi od energije aktivacije Ea a u zavisnosti od odabranog kriterijuma sterilizacije 1,2, 3….n, dobićemo snop paralelnih pravih kao što je pokazano na slici:

Sa slike se vidi da se ista vrednost može ostvariti za široki interval vremena sterilizacije i temperature. Isti kvalitet sterilizacije se može postići za kraće vreme i više temperature ili obrnuto duže vreme na nižoj temperaturi. Osnovni kriterijum za projektaovanje uredjaja za sterilizaciju je izbor kriterijuma sterilizacije . U praksi se obično biraju uslovi za sterilizaciju na osnovu principa (HTST, high temperature short time) visoka temperatura kratko vreme. Pri projektovanju uredjaja za sterilizaciju, verovatnoća kontaminacije se obično bira u odnosu 1/1000, tj Nt=10-3. Pored ovoga potrebno je znati i termičke karakteristike prisutnih mikroorganizama. Kako je, tokom sterilizacije, najvažnije inaktivisati mikroorganizme koji obrazuju termorezistentne spore, onda se najčešće uzimaju karakteristike spora Bacillus stearothermophylus, čije su karakteristike: A=1.59 1036 s-1, Ea284 kJ/mol Energije aktivacije za većinu mikroorganizama su u opsegu 250-290 kJ/mol, premda ima i izuzetaka sa znatno većim vrednostima, Clostridium botulinum 343 kJ/mol. Hranljiva podloga nije inertan rastvor, već se pod dejstvom povišenih temperatura tokom sterilizacije u njoj odigravaju hemijske reakcije izmedju pojedinih komponenti. Rezultat ovih reakcija obično je smanjenje prinosa proizvoda u odnosu na dužinu trajanja sterilizacije, kao što je predstavljeno na slici:

Postoje dva tipa reakcija koje utiču na smanjenje kvaliteta hranljive podloge zbog sterilizacije:

1. Interakcija izmedju pojedinih komponenata u podlozi, najčešće reakcije šećera i amino kiselina (neenzimsko tamnjenje) što izaziva smanjenje količine izvora ugljenika

2. Razgradnja termolabilnih sastojaka podloge, naročito vitamina Termalna razgradnja pojedinih komponenti iz podloge koje utiču na prinos proizvoda se takodje opisuje reakcijom prvog reda:

Skdt

dSs

odnosno u integrisanom obliku:

tkt seS

S 0

Konstanta brzine razgradnje termolabilne komponente takodje se menja sa temperaturom po Arenijusovom zakonu:

RT

E

ss

s

eAk

odnosno u linearizovanom obliku:

RT

EAk s

ss lnln (B)

Ova jednačina je takodje prava linija u koordinatama 1/T; ln k,, kao i jednačina (A), a iz nagiba se može odrediti energija aktivacija Es za razgradnju ključne termolabilne komponente u hranljivoj podlozi. Energija aktivacije razgradnje ključnih komponenti Es je 42-125 kJ/mol, i lako se uočava da su one znatno niže od energija aktivacije Ea za termalnu inaktivaciju ćelija mikroorganizama (250-290 kJ/mol). Funkcionalne zavisnosti ln k i ln ks od 1/T, su prikazane na slici.

Sa slike se vidi da na višim temperaturama k brže raste od ks zbog vrednosti Ea u odnosu na Es. Prema tome ako se temperatura povećava, ona će imati veći uticaj na inaktivaciju ćelija mikroorganizama nego na razgradnju ključne termolabilne komponente u hranljivoj podlozi. Ova činjenica ide u prilog zaključku da je izborom pogodne temperature i vremena sterilizacije moguće svesti razgradnju ključnih komponenti hranljive podloge na najmanju meru. Pri izvodjenju sterilizacije hranljivih podloga pomoću toplote, obično se držimo pravila da se ona obavlja na visokoj temperaturi kratko vreme, (HTST). Ceo proces se izvodi uz brzo zagrevanje do željene temperature sterilizacije, kratko drži na toj temperaturi, a potom brzo ohladi. Izbor temperature sterilizacije je od esencijalne važnosti za odigravanje celog procesa. Poznato je da su spore mnogo otpornije na uticaj toplote od vegetativnih oblika ćelija. Odavde sledi zaključak da je konstanta k, veća za vegetativne ćelije nego za spore. Tabela - Konstante brzina inaktivacija za sterilizaciju toplotom: T ( oC) k (s-1) Ea (kJ/mol) Bacillus subtilis

110 450 10-3 309

Spore B. Stearothermophilus

104 0.57 10-3 284

Spore Clostridium Botulinum

104 7 10-3 343

Pri izboru temperature sterilizacije veoma je važno znati da li mikroorganizam sporuliše ili ne. Kao primer poslužiće uporedna analiza ponašanja bakterija Escherichia coli koja ne sporuliše i Bacillus stearothermophilus koja sporuliše.

Inaktivacija E. Coli

Inaktivacija B.stearothermophilus

Diskontinualna (šaržna) sterilizacija toplotom Diskontinualna sterilizacija hranljive podloge se odvija u tri faze:

1. zagrevanje do početne temperature sterilizacije, Ts 2. zadržavanje na temperaturi sterilizacije odredjeno vreme, tj. T=const i 3. hladjenje do temperature fermentacije, Tf. Promena temperature hranljive podloge sa vremenom je predstavljena na sledećoj slici.

Diskontinualna ili šaržna sterilizacija se najčešće izvodi u samom bioreaktoru, gde se kasnije nastavlja odvijanje biotehnološkog procesa. Da li će se sterilizacija obavljati u bioreaktoru ili posebnom uredjaju zavisi od sledećih faktora:

- ako su bioreaktori malih dimenzija do 3 m3 onda se po ravilu sterilizacija izvodi u bioreaktoru (in situ)

- ukoliko imamo više bioreaktora ili velike dimenzije reaktora onda se obično jedna posuda korsti za sterilizaciju, a ostali bioreaktori se snabdevaju sterilnom hranljivom podlogom

Nedostaci ovog načina rada su:

- cena posebne posude u kojoj se izvodi sterilizacija a u njoj se ne odvija proces - kada se dogodi kvar u posudi za sterilizaciju onda može da dodje do prekida rada

celog postrojenja Sve dileme pri projektovanju uredjaja se rešavaju tehnoekonomskom analizom kompletnog postrojenja. Tokom diskontinualne sterilizacije toplotom mikroorganizmi se inaktivišu u sve tri faze, tj. zagrevanjem, zadržavanjem i hladjenjem podloge. Zagrevanje i hladjenje podloge su nestacionarni procesi, tj. T=f(t), dok je u fazi zadržavanja T=Ts=const i proces je stacionaran. Dužina vremena zagrevanja i hladjenja zavise od tipa uredjaja za sterilizaciju i radnih uslova. S toga se proračun sterilizacije svodi na odredjivanje vremena zadržavanja na temperaturi sterilizacije. Osnovni parametar koji se zadaje pre proračuna diskontinualne sterilizacije je , koji se odredjuje iz jednačine:

dteAN

N tRT

E

t

a

0

0ln

gde je: t - ukupno vreme sterilizacije T=f(t) – temperatura koja se menja sa vremenom u fazi zagrevanja i fazi hladjenja Ukupan početni broj mikroorganizama N0 zavisi od zapremine podloge tj.

LVNN `00

gde je: No

- početni broj mikroorganizama (broj mikroorganizama/zapremina) VL – zapremina hranljive podloge (zapremina) Na taj način kriterijum sterilizacije zavisi od radne zapremine bioreaktora, VL. Uz uslov da je jedna šarža kontaminirana od 1000 izvedenih, tj Nt=10-3, kriterijum sterilizacije u diskontinualnim uslovima je:

3

`00

10lnln

L

t

VN

N

N

Ukupni kriterijum sterilizacije koji se odvija u diskontinualnim uslovima je:

hlzadzag

a promena broja mikroorganizama sa vremenom se grafički može prikazati kao:

Ukoliko se poznaje broj mikroorganizama na početku i kraju svakog perioda, zagrevanja, zadržavanja i hladjenja, dobijaju se jednačine:

t a

a

a

t

t

RT

E

thl

t

t

RT

E

zad

tRT

E

zag

dteAN

N

dteAN

N

dteAN

N

2

2

1

1

2

2

1

01

0

ln

ln

ln

Izraz za kriterijum sterilizacije u periodu zadržavanja se pojednostavljuje kad se uzme u obzir da je Ts=const i da je t2-t1=ts, pa postaje:

sssRT

E

zad tTkteAN

N a

2

1ln

Iz ove jednačine se odredjuje dužina zadržavanja ts na temperaturi sterilizacije Ts:

ss T

hlzag

T

zads kk

t

Iz ovoga sledi da za proračun diskontinualne sterilizacije je potrebno da znamo: N0 - početni broj mikroorganizama k(Ts) – termičke karakteristike termostabilnih spora Nt – rizik od kontaminacije zag – kriterijum sterilizacije u zoni zagrevanja hl – kriterijum sterilizacije u zoni hladjenja i T=f(t) - promene temperature tokom zagrevanja i hladjenja sa vremenom Promene temperature u fazama zagrevanja i hladjenja zavise od tipa sterilizatora, temperature grejnog medijuma (vodena para), temperature rashladnog medijuma i njihovih masenih protoka. Na slici su predstavljena četiri osnovna tipa diskontinualnih sterilizatora:

Zavisnost temperature hranljive podloge u reaktoru tokom sterilizacije od vremena, pri različitim načinima zagrevanja i hladjenja je prikazana na slici:

Tabela - Jednačine za temperaturne profile navedenih razmenjivača toplote. Izvor toplote Temperaturni profil Parametri u jednačini Barbotiranje vodene pare

t

tTT

110

hiperbolni profil, gde je T (oK)

m

Q

CmT

Qhh

vp

p

vppvp

0

h entalpije; Q protok vodene pare; indeks p se odnosi na podlogu, a vp na paru

Električno zagrevanje

tTT 10

linearni profil pCmT

q

0

q brzina izmene toplote, J/s Izmenjivač toplote (zagrevanje vodenom parom) Ts=const

th eTT 1

eksponencijalni profil Th temperatura medija za zagrevanje

h

h

p

T

TT

mC

KA

0

K koef. prolaza toplote J/m2sK A površina za razmenu toplote

Razmenjivač toplote (hladjenje)

tc eTT 1

eksponencijalni profil Tc temperatura medija za hladjenje

C

C

WC

KA

p

T

TT

emC

WC

0

,,

1

W protok medija za hladjenje C' specifična toplota medija za hladjenje

Kriterijumi sterilizacije za tipične temperaturne profile Konstantna temperatura

RT

EtA aexp

Linearni profil

02

02 1 RT

EE

t

RTEE

RT

Ek aa

o

a

Hiperbolni profil

mEmpt

tEe

p

A m 222 1

1

gde je: =E/RTo

p=+mp Eksponencijalni profil

tt eEEe

A

eEE

A

1111 1111

E1 i E2 su vrednosti eksponencijalnog integrala, definisanog sledećom jednačinom, za n=1, odnosno n=2, koji se mogu naći u matematičkim priručnicima:

dx

x

xzE

znn

exp

sa rešenjima:

22

1

x

eE

x

eE

x

x

Obično se realni temperaturni profili razlikuju od teoretskih profila koji su dati u tabeli, pa se u fazama zagrevanja i hladjenja uzimaju eksperimentalne zavisnosti T=f(t). Na osnovu poznatog temperaturnog profila se može odrediti zavisnost k=f(t), te i onda ts, što je bio krajnji cilj proračuna diskontinualne sterilizacije:

ss Tk

ttt

12

Iako je ts obično kraće od tzag i thl najveći broj mikroorganizama se uništava u fazi zadržavanja zbog relativno visoke temperature. Tipične vrednosti raspodele kriterijuma sterilizacije po fazama u celom ciklusu diskontinualne sterilizacije su:

%505.0

%7575.0

%202.0

hl

zad

zag

Ričardsova metoda (nastala 1968) Neka je profil temperature hranljive podloge sa vremenom tokom peroda zagrevanja prikazan na slici.

Način grafičkog integraljenja je takav da se ukupni vremenski period zagrevanja podeli na n jednakih vremenskih intervala, odnosno:

nk ttt

n

ttt

...21

0

Tačnost je veća ako se uzme bar 30 inkremenata. Za odredjivanje termolabilnih karakteristika mikroorganizama odnosno konstante brzine inaktivacije k, se uzima srednja vrednost temperature intervala, pa se izračunava doprinos svakog intervala u periodu zagrevanja. Vrednost konstante brzine inaktivacije za pojedini period su:

i

a

RT

E

i Aek

a kriterijum sterilizacije za odabrani interval je:

tkii

Pri tome je ukupni doprinos sterilizacije u periodu zagrevanja

n

iizag

1

ili

tktk

tktk

tktk

nnnn

...2222

1111

Na osnovu ovih jednačina se izračunava kriterijum sterilizacije u periodu zagrevanja, zag. Kriterijum sterilizacije za period hladjenja se izračunava potpuno analogno, kao za period zagrevanja, stim što se mora voditi računa da su temperaturni profili drugačiji. Kada se izračunaju ova dva kriterijuma zag i hl, onda se na osnovu jednačine

ss T

hlzag

T

zads kk

t

izračunava zad, a potom i ts. ------------------------ ------------------------- ---------------------------------------- ------------------- Primer: Početni broj mikroorganizma Bacillus Stearothermophilus je No=1011, a na kraju sterilizacije je Nt= 10-3. Izračunati vreme sterilizacije bez i uz zanemarivanje udela faza zagrevanja i hladjenja. Ukupni kriterijum sterilizacije je:

2.3210ln10

10lnln 14

3

110

tN

N

Ako se sada pretpostavi da je udeo faza zagrevanja i hladjenja:

1.0

3.0

hl

zag

onda je kiterijum sterilizacije u fazi zadržavanja:

32.191.03.012.32 zad

Za spore B. stearothermophilus je k=2.54 min-1 na 121 oC, pa je onda:

min6.754.2

32.19

kt zad

s

Ako bi se zanemarili doprinosi ukupnom kriterijumu sterilizacije u fazama zagrevanja i hladjenja, onda bi se dobilo vreme zadržavanja:

min7.1254.2

2.32

kts

Vidi se da su razlike značajne, te se moraju uzeti u obzir efekti sterilizacije koji se postižu u fazama zagrevanja i hladjenja.

------------ ------------------- ----------------------- -------------------------------------- ------ Ričardsova "brza metoda" Jednostavnija metoda u odnosu na Ričardsovu metodu, za proračun šaržne sterilizacije, kojom se izbegava grafičko i numeričko integrisanje, sa prihvatljivom tačnošću izračunavanja kriterijuma sterilizacije je "Ričardsova brza metoda".

Ona se zasniva na dve pretpostavke: - Inaktivacija spora odigrava se samo na temperaturi višoj od 100oC i - temperaturni profil za periode zagrevanja i hladjenja iznad 100 oC su linearni

U tabeli su date vrednosti specifične brzine inaktivacije i kriterijuma sterilizacije za spore B.stearothermophilus za period zagrevanja ili hladjenja u opsegu 100-130 oC, koje važe pod uslovom da je brzina promena temperature 1oC/min. Ako je stvarna brzina zagrevanja ili hladjenja 1 oC/min, vrednost kriterijuma sterilizacije se može uzeti direktno iz tabele, a ako je stvarna brzina zagrevanja ili hladjenja različita od 1 oC/min, onda se vrednost kriterijuma sterilizacije iz tabele preračunava jednostavnom proporcijom. T oC k

(min-1) T oC k

(min-1) T oC k

(min-1)

100 0,019 107 0.105 0,420 114 0,531 2,488 101 0,025 0,044 108 0.133 0,553 115 0,666 3,154 102 0,032 0,076 109 0.168 0,720 118 1,307 6,341 103 0,040 0,116 110 0,212 0,932 121 2,538 12,549 104 0,051 0,168 111 0,267 1,199 124 4,881 24,518 105 0,065 0,233 112 0,336 1,535 127 9,293 47,373 106 0,083 0,316 113 0,432 1,957 130 17,524 90,591 Povećanje razmere šaržnog strilizatora (scale-up) Povećanje razmere šaržnog sterilizatora vrši se uz uslov da se rizik od kontaminacije ne poveća, a kvalitet hranljive podloge ne pogorša na različitim nivoima od laboratorijskog do industrijskog bioreaktora. Povećanje veličine bioreaktora utiče na efekat sterilizacije jer od zapremine hranljive podloge zavise kriterijum sterilizacije i konstrukcione karakteristike bioreaktora zbog kojih se menjaju temperaturni profili u periodu zagrevanja i hladjenja. Rešavanje problema povećanja razmere sterilizacije zavisi od više faktora, čiji efekti na kvalitet hranljive podloge moraju da budu pažljivo analizirani.

1. Sa povećanjem zapremine hranljive podloge povećava se vreme potrebno da se ona zagreje i ohladi do izabrane temperature. Ovo povećava doprinos perioda zagrevanja i hladjenja ukupnom efektu sterilizacije pod uslovom da se održi geometrijska sličnost, a način zagrevanja ostane isti.

2. Kada prinos proizvoda zavisi od tretiranja hranljive podloge toplotom, u obzir se mora uzeti i zavisnost izmedju kriterijuma sterilizacije i kvaliteta hranljive podloge. Zbog dužeg izlaganja visokoj temperaturi veća je razgradnja termolabilnih komponenti hranljive podloge, pa se sastav hranljive podloge mora optimizovati, pri povećanju dimenzija uredjaja. (vidi grafičku ilustraciju na sledećoj slici)

3. Sa povećanjem zapremine hranljive podloge povećava se verovatnoća preživljavanja spora. Da se rizik od kontaminacije u većem bioreaktoru ne bi povećao, sterilizacija se mora produžiti. (sledeća slika)

4. Razlike u geometriji i promene temperature grejnog medijuma mogu u velikoj meri iskomplikovati postupak povećanja razmera sterilizatora.

Kriterijum sterilizacije zavisi od zapremine hranljive podloge. Kad se veličina bioreaktora poveća, početni broj spora se povećava, pa se kriterijum sterilizacije mora povećati da bi se zadržao isti rizik od kontaminacije. Ovo duže trajanje sterilizacije se može negativno odraziti na sastav sterilne hranljive podloge. Upotreba kriterijuma sterilizacije , u postupku projektovanja uredjaja većih kapaciteta a na osnovu podataka iz uredjaja manjih kapaciteta (scale-up) je uvedena 1979. godine od strane Banks-a i saradnuika. Pošto factor , nije vezan za zapreminu, nego za ukupni broj mikroorganizama onda se povećanjem zapremine diskontinualnog sterilizatora povećava i količina kontaminanata u podlozi na početku sterilizacije tj. No. Na primer ako je diskontinualni sterilizator radne zapremine VL=1000 l, a u njemu se steriliše hranljiva podloga sa koncentracijom mikroorganizama na početku No=109 broj m.o./l, onda je ukupni kriterijum sterilizacije uz pretpostavku da je, uobičajeno, Nt=10-3 jednak:

5.3410

1010lnln

3

39,0

t

L

N

VN

Ako se traži ista verovatnoća kontaminacije, a sud se poveća 10 puta tj. VL=10000 l, onda je:

8.3610

1010lnln

3

49,0

t

L

N

VN

Iz ovoga sledi da se ukupni kriterijum sterilizacije povećao sa povećanjem zapremine suda u kome se vrši sterilizacija iste podloge, iako je tražena ista verovatnoća kontaminacije pojedinih šarži. Projektovanje sistema sa diskontinualnom sterilizacijom Kod diskontinualne sterilizacije dolazi do degradacije hranljive podloge. Osnovni kriterijum je minimalna razgradnja ključnih komponenti za dati kriterijum sterilizacije . Najviša temperatura na kojoj se izvodi diskontinualna sterilizacija je 121 oC. Koliko će se dugo zadržati hranljiva podloga na temperaturi sterilizacije zavisi od više faktora, jer se u obzir moraju uzeti i period zagrevanja i hladjenja, koji traju relativno dugo. Njihov zbirni doprinos je uobičajeno 25-30%, pa se ne može zanemariti pri projektovanju sterilizatora. Metode proračuna uzimaju u obzir sledeće karakteristične odrednice:

1. profil promene temperature hranljive podloge tokom perioda zagrevanja i hladjenja 2. početni broj mikroorganizama No pre sterilizacije i sastav mikroflore 3. termalne karakteristike mikroorganzama k, Ea, tD, koji se nalaze u podlozi se uzimaju

kao da je u podlozi i B. Stearothermophilus. 4. verovatnoća kontaminacije neke od šarži uzima se obično da je 1/1000

Prvo se izračuna kriterijum sterilizacije, , pošto znamo početni broj mikroorganizama No kao i rizik od kontaminacije Nt. Ako se pretpostavi da je No=1011, a Nt=10-3, onda je kriterijum sterilizacije:

2.3210ln10

10lnln 14

3

110

tN

N

Za izračunavanje vremena zadržavanja ts na temperaturi sterilizacije (obično 121 oC) potrebno je da izračunamo i zag ,hl i zad po jednačinama:

3

2

1

1

2

01

0

ln

ln

t

t

RT

E

hl

tRT

E

zag

dteAN

N

dteAN

N

a

a

sTsRT

E

zad tktAeN

Ns

s

a

2

1ln

Ako ne znamo profile promene temperature sa vremenom u periodu zagrevanja i hladjenja tokom diskontinualne sterilizacije onda se na osnovu okvirnih pretpostavki može definisati odnos:

%505.0

%7575.0

%202.0

hl

zad

zag

na osnovu čega se može izračunati vreme sterilizacije ts, ako je prethodno definisan ukupni kriterijum sterilizacije. Da bi se integrisao izraz za kriterijum sterilizacije , treba da znamo zavisnost T=f(t), odnosno

dteAkdtt t

RT

Ea

0 0

za period zadržavanja, kada temperatura nije funkcija vremena tj. Tf(t), pa se prethodna jednačina lako rešava, a za periode zagrevanja i hladjenja se uzima neka od ranije predloženih jednačina iz Tabele, koje pretpostavljaju linearnu, hiperboličnu ili eksponencijalnu zavisnost. Najsigurniji je način da se nadju eksperimentalne vrednosti funkcije T=f(t), koji pak mogu da se ekstrapolišu polinomom n-tog reda

nntatataaT .....2

210

Ako ne postoji mogućnost da se prethodna jednačina za , reši, onda se pribegava grafičkom ili numeričkom načinu rešavanja definisanog integrala po Richardsovoj grafičkoj metodi.

Kontinualna sterilizacija Kontinualna sterilizacija se bazira na principu visoka temperatura-kratko vreme. Pri kontinualnoj sterilizaciji hranljiva podloga se zagreva do visoke temperature za kratko vreme, drži kratko vreme na konstantnoj visokoj temperaturi a zatim brzo hladi do temperature bioprocesa. Potreban kriterijum sterilizacije može se postići kombinacijom temperature i vremena držanja na maksimalnoj temperaturi. Naravno da se sterilizacija kontroliše promenom temperature, a ne trajanjem perioda držanja na konstantnoj temperaturi, jer je neuporedivo lakše kontrolisati temperaturu nego menjati zapreminu dela sterilizatora u kome se podloga drži na konstantnoj temperaturi. U odnosu na šaržnu sterilizaciju, kontinualna ima niz prednosti:

a) povoljniji su uslovi za sterilizaciju toplotno osetljivih podloga b) ekonomičniji proces, usled manjeg utroška vodene pare i rekuperacije toplote c) lakša kontrola i regulacija procesa d) pouzdaniji proces sa aspekta povećanja razmera uredjaja e) povećava se ukupni kapacitet uredjaja, posebno u sistemu sa više bioreaktora

Potrošnja vodene pare pri kontinualnoj sterilizaciji je 20 do 25% manja nego pri šaržnoj sterilizaciji, dok je ukupno vreme sterilizacije kraće. Za primenu kontinualne sterilizacije su veoma bitna fizička svojstva hranljive podloge, tako da se na primer veoma viskozne podloge ne mogu kontinualno sterilisati. Osnovni princip kontinualne sterilizacije je da se podloga koja protiče što pre zagreje do temperature sterilizacije, koja je viša nego kod šaržne sterilizacije (oko 140 oC) a zatim brzo ohladi na temperaturu odvijanja bioprocesa (28-37 oC). Veoma je važno da se na temperaturi sterilizacije podloga zadrži što kraće vreme (princip HTST), kako bi podloga pretrpela što manje promena u odnosu na polazni sastav. U praksi se najčešće koriste dva tipa kontinualnih sterilizatora:

1. sterilizator sa direktnim zagrevanjem pomoću parnog injektora 2. sterilizator sa razmenjivačem toplote

Sterilizacija sa parnim injektorom se vrši tako što se hranljiva podloga direktno meša sa vodenom parom visokog pritiska u mešaču pomoću Venturi efekta. Usled intenzivnog mešanja i visoke temperature pare, podloga se relativno brzo (takoreći trenutno) dovodi do željene temperature sterilizacije. Tako zagrejana podloga se provodi kroz cev, a dužina cevi i protok hranljive podloge odredjuju vreme zadržavanja na temperaturi sterilizacije. Po izlasku iz cevi za zadržavanje, hranljiva podloga prolazi kroz ekspanzioni ventil u vakuum komoru. Para trenutno ekspanduje, a temperatura hranljive podloge se brzo smanji. Hranljiva podloga se razblažuje kondenzatom vodene pare. Šematski prikaz opreme pri ovom tipu sterilizatora je dat na slici kao i temperaturni profil na osnovu koga je lako zaključiti da se periodi zagrevanja i hladjenja kao veoma kratki pri proračunu mogu zanemariti.

Kontinualni sterilizator sa indirektnim zagrevanjem pomoću razmenjivača toplote, zagreva i hladi hranljivu podlogu u setu razmenjivača toplote. Saglasno usvojenom principu HTST, zagrevanje se odvija što brže moguće kao i hladjenje, ali u poredjenju sa sterilizatorom sa direktnim zagrevanjem, vreme zagrevanja i hladjenja je mnogo duže, ali je doprinos ovih perioda u ukupnom ciklusu od 1-2 %, mnogo manje nego u slučaju šaržnog sterilizatora. Šema kontinualnog sterilizatora sa indirektnim zagrevanjem kao i temperaturni profil je dat na sledećoj slici.

Izmenjivači toplote koji se koriste kod sistema za kontinualnu sterilizaciju hranljive podloge su obično: pločasti, spiralni i tipa cev u cevi. Pločasti izmenjivači se koriste kada su hranljive podloge malog viskoziteta i ako nema suspendovanih čestica. Kod ovih tipova izmenjivača je veoma dobar prenos toplote zbog izrazitog turbulentnog strujanja koje obezbedjuje dobre koeficijente prenosa toplote. Nedostatak ovog tipa sterilizatora je relativno malo rastojanje izmedju ploča, pa pri prolazu hranljive podloge može doći do zapušavanja, pa ih je potrebno češće čistiti i prati. Spiralni izmenjivači toplote se koriste za sterilizaciju relativno gustih i viskoznih hranljivih podloga, kao i podloga koje sadrže suspendovane čestice. Izmenjivači toplote tipa cev u cevi su veoma pogodni za industrijsku primenu, a koriste se naročito za sterilizaciju gustih suspenzija. Imaju široku primenu zbog jednostavnosti konstrukcije a kao zagrevni medijum se koristi pregrejana para a kao rashladni medijum voda. Turbulencija hranljive podloge u cevi se obezbedjuje definisanjem protoka kroz cev i izborom pogodnih pumpi za tu svrhu. Kada se porede diskontinualna i kontinualna sterilizacija onda i jedna i druga imaju odredjene i prednosti i nedostatke: Prednosti kontinualne sterilizacije:

- Dobijanje i održavanje standardnog kvaliteta hranljive podloge - Jednostavno projektovanje uredjaja i moguć scale-up uredjaja - Može biti uradjena kompletna automatizacija uredjaja - Ravnomerno trošenje pare tokom čitavog procesa, bez pikova u potrošnji pare - Smanjenje trajanja ciklusa sterilizacije

Kontinualna sterilzacija se koristi pri sterilizaciji podloga sa termolabilnim komponentama, ili onim koje medjusobno reaguju na povišenim temperaturama. Takodje se preporučuje za bioprocese velikih kapaciteta i gde nema visokih kriterijuma sterilizacije. Prednosti diskontinualne sterilizacije:

- Manja cena koštanja kompletnog postrojenja - Manji rizik od kontaminacije zbog manipulacije hranljivom podlogom - Jednostavnija manuelna regulacija - Lakša sterilizacija podloga u obliku suspenzije

Projektovanje sistema sa kontinualnom sterilizacijom Principi projektovanja su praktično isti kao i kod diskontinualne sterilizacije, pošto imamo opet tri faze tj. zagrevanje, zadržavanje i hladjenje, medjutim udeo zagrevanja i hladjenja je daleko manji, a posebno kod sistema sa direktnim zagrevanjem. Traženi kriterijum sterilizacije se može postići kombinacijom temperatura i vremena u mnogo širem opsegu nego kod diskontinualne sterilizacije, pa ovo olakšava projektovanje. Pri proračunu kontinualne sterilizacije sa direktnim zagrevanjem se vreme zagrevanja i hladjenja može zanemariti, dok se kod sistema sa indirektnim zagrevanjem to ne može učiniti, a princip proračuna tj. izračunavanja ts je potpuno isti kao kod diskontinualne sterilizacije.

Ako bi se usvojila neka vrednost =const, onda se može utvrditi funkcionalna zavisnost izmedju ts=f(Ts) za tu konstantnu vrednost kriterijuma sterilizacije . Takvo jedno ispitivanje za =45.7 je pokazano u sledećoj tabeli:

Temperatura Ts (oC) Vreme zadržavanja ts (s)

130 150.0 135 51.9 140 18.9 150 2.7

Koja će se temperatura odabrati zavisi od termostabilnosti podloge tj. da li sadrži termolabilne komponente ili komponente koje će medjusobno reagovati na povišenim temperaturama. Ako se slično kao kod sterilizacije uvede kriterijum kvaliteta, kao mera razgradnje termolabilnih ključnih komponenti pod uticajem visokih temperatura, pri čemu je kvalitet sterilisane podloge bolji ukoliko on ima manju vrednost, on se može definisati kao odnos početne i krajnje koncentracije termolabilnih komponenti u hranljivoj podlozi:

tkS

Ss

t

0ln

i ako se uzme u obzir Arenijusova jednačina za ks onda ova jednačina postaje:

teAS

S RT

E

st

s

0ln

odakle sledi:

s

s

ART

Et

lnln

Ovom jednačinom se definiše familija paralelnih pravih linija u koordinatama (1/T, ln t) sa nagibom E/R. Ove prave su parametarske u odnosu na kriterijum kvaliteta hranljive podloge . Prave sa parametrima i u istim koordinatama imaju različite nagibe kao što je predstavljeno na slici.

Na osnovu prikazanih dijagrama se može videti kako se kombinacijom temperature za =const može sterilisati podloga da daje maksimalni prinos proizvoda u odnosu na termoabilnu komponentu. Kada je koncentracija termolabilne komponente jednaka početnoj tj. St=So, onda se ostvaruje maksimalni prinos proizvoda Ymax. Ako St0 onda se ostvaruje minimalan prinos, Ymin. Sve ostale vrednosti prinosa koje se realno mogu očekivati u praksi se nalaze izmedju linija Ymax, min i Ymin, max. Odabiranjem kriterijuma sterlnosti 2 imamo slučajeve:

1. minimalni prinos Ymin i maksimalna razgradnja termolabilne komponente S, ako odaberemo Tmin i tmax

2. maksimalni prinos Ymax i minimalna razgradnja termolabilne komponente S, ako odaberemo Tmax i tmin

3. slučajevi za odabrane uslove T, t, za 2 =const, prinos Y2 će biti manji od Y1 pošto je T1 T2 a t1 t2.

Ponovo se potvrdjuje princip HTST. U kontinulanoj sterilizaciji imamo tri radna ciklusa: 1. sterilizacija uredjaja za kontinualnu sterilizaciju 2. sterilizacija hranljive podloge 3. čišćenje i pranje postrojenja za sterilizaciju U novije vreme se svi procesi pre bioreaktora, priprema hranljive podloge, transport podloge, sterilizacija podloge, sterilizacija postrojenja, vazduha i dodataka bioprocesu se nazivaju procesi pre bioprocesa, (up stream processes) a procesi obrade fermentacione tečnosti, izolacija, prečišćavanje, koncentrisanje, stabilizacija, pakovanje i čuvanje se nazivaju procesi nakon bioprocesa ili (down stream processes). Da bi se izračunalo vreme zadržavanja hranljive podloge tokom kontinualne sterilizacije, važno je znati tip i režim strujanja tečnosti kroz sterilizator. Najčešće se pretpostavlja idealno klipno strujanje sa uzdužnim mešanjem (disperzijom) tj. disperzioni model. Disperzioni model Pri proticanju fluida kroz cev, pretpostavlja se da fluid protiče klipno a da dolazi do uzdužnog mešanja (disperzije, disperzionog strujanja). Termin uzdužnog mešanja se koristi da bi se napravila razlika izmedju mešanja u pravcu proticanja i mešanja u bočnom ili radijalnom pravcu. Na primer pri laminarnom proticanju fluida kroz cevi, aksijalno mešanje je uglavnom posledica gradijenta brzine fluida, dok je radijalno mešanje posledica samo molekulske difuzije.

Molekulska difuzija u x pravcu opisana je diferencijalnom jednačinom prema Fick-ovom zakonu:

2

2

x

CD

t

C

gde je D koeficijent molekulske difuzije. Analogno, svi doprinosi povratnom mešanju fluida koji protiče u x pravcu su:

2

2

Dx

C

t

C

gde je D koeficijent uzdužne ili aksijalne disperzije ili koeficijent uzdužnog mešanja. Ako se gornja jednačina izrazi u bezdimenzionom obliku, uz uvodjenje zamena:

L

tuθ

L

xutz

dobija se:

z

C

z

C

uL

C

2

2D

što predstavlja osnovnu diferencijalnu jednačinu disperznog modela. D/uL predstavlja bezdimenzionu grupu koja se zove disperzioni broj suda. Eksperimenti pokazuju da disperzioni model podjednako dobro opisuje proticanje u kolonama sa nepokretnim slojem, kao i turbulentno proticanje u cevima. U tim slučajevima postoji zavisnost izmedju veličine koja se definiše kao intenzitet disperzije, meren odnosom D/ud i osobina sistema. Za porozni nepokretni sloj važi:

ud

fud

D p

p

Re

za proticanje u cevima:

ud

fud

D t

t

Re

gde su dp i dt prečnici čestica odnosno cevi, a D koeficijent uzdućnog mešanja (disperzije). Disperzioni broj suda ili reaktora je proizvod intenziteta disperzije (koji se nalazi sa dijagrama 1/Pe; Re) i geometrijskog faktora.

L

d

ud

D

uL

D

gde su: D/uL disperzioni broj D/ud intenzitet disperzije

d/L geometrijski faktor Stepen uzdužnog mešanja procenjuje se na osnovu Bodenštajnovog (Bodenstain) kriterijuma Bo, (koji se ponekad naziva i Pekleov kriterijum Pe, naročito kada se prečnik usvoji za karakterističnu dužinu), a definiše se kao:

D

uLBoPe

gde je u- srednja brzina tečnosti, L- dužina sterilizatora i D - koeficijent uzdužnog mešanja. Funkcionalna zavisnost recipročne vrednosti Pe broja u funkciji Rejnoldsovog broja je data na sledećoj slici:

Ako Bo0, disperzija je velika, odnosno radi se o strujanju sa idealnim mešanjem. Ako Bo disperzija je zanemarljiva, odnosno radi se o idealnom klipnom strujanju. Režim strujanja je izmedju laminarnog i razvijenog turbulentnog strujanja sa srednjom brzinom od 50-80% od maksimalne brzine strujanja. Poželjno je da strujanje bude bliže razvijenom turbulentnom strujanju (Re20.000) da bi rizik od pregrevanja tečnosti blizu zida i stepen povratnog mešanja bili manji. Jedinice sterilizatora za zagrevanje i hladjenje zanemaruju se u odnosu na ukupnu dužinu sterilizatora, a pretpostavlja se da je konstantna temperatura u delu sterilizatora uniformna. U prvom koraku pretpostavlja se da je strujanje turbulentno (Re20.000) , a potom se bira prečnik cevi kroz koju protiče hranljiva podloga, d, i izračuna brzina tečnosti, u:

du

Re

gde su naravno viskozitet i gustina članovi jednačine. Za date uslove strujanja Bodenštajnov Bo ili Pekleov Pe, kriterijum se odredi eksperimentalno ili izračuna pomoću odgovarajuće korelacije, da bi se nakon toga odredio koeficijent uzdužnog mešanja.

Ako je strujanje laminarno, koeficijent uzdužnog mešanja može se izračnati pomoću sledeće korelacije:

DD

192D

22d

gde je D koeficijent molekulske difuzije. Za turbulentni režim strujanja, efektivni koeficijent aksijalne disperzije se može odrediti pomoću zavisnosti recipročne vrednosti Pekleovog kriterijuma od Rejnoldsovog kriterijuma kao što je prikazano na slici. Sledeći korak je izabrati kriterijum sterilizacije tj. odnos Nt/No. Usvoji se koncentracija spora u nesterilnoj hranljivoj podlozi, No=106 spora/cm3, a rizik od kontaminacije 0.001, tako da kriterijum sterilizacije iznosi:

VN

N

t

150 10lnln

gde je V- zapremina nesterilne podloge u m3. Ako se za analizu proticanja hranljive podloge kroz sterilizator usvoji disperzioni model onda se odnos Nt/No može izračunati pomoću sledeće jednačine:

2222

2

011

4y

Boy

Bo

Bo

t

eyey

ye

N

N

gde je:

u

kLDa

Bo

Day

je gde

41

nazvan Damkelerov kriterijum. Ako je odstupanje od idealnog klipnog strujanja malo, Bo , onda se odnos Nt/No može izračunati pomoću jednostavnije jednačine:

Bo

DaDa

t eN

N2

0

Na slici su prikazane zavisnosti Nt/No od Damkelerovog kriterijuma za različite vrednosti Bodenstainovog kriterijuma. U slučaju idealnog klipnog proticanja, Bo, željeni stepen sterilnosti se može postići u najkraćem sterilizatoru, tj poželjno je da disperzija bude minimalna. Sa izborom kriterijuma sterilizacije i poznatim Bodenstajnovim kriterijumom može se odrediti Damkelerov kriterijum, koristeći podatke sa slike, a zatim izračunati specifična brzina destrukcije, k, i temperatura sterilizacije, ts. Na sličan način se odredjuje dužina sterilizatora potrebna za postizanje sterilnosti hranljive podloge na zadatoj temperaturi.

Sterilizacija hranljive podloge filtracijom U odredjenim industrijskim uslovima kada hranljive podloge sadrže komponente koje na povišenim temperaturama reaguju ili se razgradjuju, sterilizacija toplotom nije pogodna. U tim slučajevima se za sterilizaciju koristi postupak filtracije. Ova metoda se zasniva na izdvajanju mikrobnih ćelija iz hranljive podloge propuštanjem hranljive podloge pod pritiskom kroz filter, čije su pore manje od mikrobnih ćelija. Filteri su najčešće membranski, porcelanski, od sinterovanog stakla i drugih materijala. Filter se prethodno steriliše u autoklavu na temperaturi od 121 oC, u trajanju od 10-45 min. Filamentni mikroorganizmi (plesni) čija je najmanja dimenzija veća od 7 m a najveća dimenzija je nekoliko milimetara, veoma se lako izdvajaju filtracijom. Dimenzije jednoćelijskih organizama su znatno manje: - kvasci oko 3.5 m - bakterije 0.5 do 2 m Izdvajanje ovako malih mikroorganizama predstavlja problem, jer pore filtra moraju biti manje od najmanje dimenzije mikroorganizama, 0.22-0.45 m. U filtraciji se koriste dve vrste filtera:

- apsolutni filtri i - filtri sa dubinskim slojem

Apsolutni filtri potpuno izdvajaju mikrobne ćelije iz hranljive podloge, zadržavanjem na filtru. Delimično začepljene pora filtra sa zadržanim mikrobnim ćelijama na zidovima šupljina filtra povećavaju njihovu efikasnost. Koriste se ultrafiltracione, mikroporozne i makroporozne membrane. Filtri sa dubinskim slojem prave se od poroznog ili vlaknastog materijala, kao što je porozna keramika, sinterovani metali, infuzorijska zemlja, staklena vuna, celulozna vlakna.

Pore ili rastojanja izmedju vlakana su veće od najmanjih mikrobnih ćelija. Izdvajanje mikrobnih ćelija se zasniva na verovatnoći da će one pri prolazu kroz filtarsku masu biti zadržane, po jednom od sledećih mehanizama:

- intercepcijom, - inercionom impakcijom, - difuzijom, - elektrostatskim privlaćenjem i - gravitacijom

Intercepcija se zasniva na činjenici da mikrobna ćelija prodre u stagnantni sloj tečnosti oko vlakna, gde je brzina jednaka nuli i tu biva prikačena za vlakno. Pri ovom mehanizmu nije poželjno povećavati protok kroz filtar jer se prikačene ćelije mogu otkačiti, čime se umanjuje efikasnost filtracije. Inerciona impakcija je mehanizam po kome će mikrobne ćelije koje nosi struja hranljive podloge, nastaviti pravolinijsko kretanje i tako udariti na vlakno filtra, čime će biti zadržani na vlaknu. Pri većoj brzini proticanja hranljive podloge veća je verovatnoća da dodje do efikasnog izdvajanja mikrobnih ćelija. Difuzija ili Braunovo kretanje je karakteristično za ćelije koje su ušle u stagnantni sloj tečnosti oko vlakna, pri čemu one usled svog kretanja nalete na vlakno i bivaju izdvojene iz tečnosti. Mehanizmi elektrostatskog privlačenja i gravitacije su poznati.

Primena apsolutnih filtera se ne preporučuje ako je koncentracija mikrobnih ćelija veća od 106 cm-3. U ovom slučaju se primenjuje kombinovani sistem prvo dubinskog filtriranja a potom apsolutnog filtriranja.

Sterilizacija vazduha Većina industrijskih fermentacija se obavlja pod aerobnim uslovima uz intenzivan dovod vazduha, koji mora biti sterilisan. Broj čestica i mikroorganizama u vazduhu, zavisi od lokacije pogona strujanja vazduha i njegovog predtretmana. Prosečno, spoljni vazduh sadrži: 10-100.000 čestica/m3 5-2.000 mikroorganizama/m3 od čega su 50% spore gljiva i 40% gramnegativne bakterije. Fermentacija se uobičajeno obavlja sa protokom vazduha od: 0.5-1 (zapremina vazduha)/(zapremina tečnosti)(min) Stoga se kao orijentaciona veličina uzima za fermentor od 50 m3 sa aeracijom od 1 zapremine vazduha/zapremini tečnosti i minutu, vrednost od 3000 m3 vazduha na čas. U biohemijsko inženjerstvu se sterilni vazduh višestruko koristi. Njegovo najčešće korišćenje je:

- kao izvor kiseonika u aerobnim procesima - za sterilno pretakanje sterilnih rastvora iz jedne u drugu posudu pod pritiskom - za sušenje sterilnog materijala i - za održavanje nadpritiska u sterilnim prostorijama

Sterilizacija vazduha se vrši: - topotom - filtracijom - hemijskim i fizičkim sredstvima i - elektrostatičkim taloženjem

U industrijske svrhe najčešće se koristi sterilizacija filtracijom, dok su ostali postupci prisutni u laboratoriskim uslovima. Pri izboru opreme kojom će se izvršiti filtracija vazduha moraju se zadovoljiti dva osnovna kriterijuma:

1. mora se obezbediti dovoljna količina sterilnog vazduha za odredjeni proces 2. proces se mora odvijati u uredjaju sa što manjim padom pritiska

Najčešće korišćeni tipovi filtra su apsolutni filtri i vlaknasti filtri.

Sam postupak filtracije u apsolutnom filtru zahteva da se u odredjenom vremenu filterska membrana zameni kako bi se održavao potreban kvalitet i kapacitet filtracije. Korišćenje relativno skupih materijala nije ekonomično pa je razvojem novih plastičnih materijala, koji imaju dobre karakteristike a nisku cenu, dovelo do veće primene apsolutnih filtera, jer se češćom zamenom membrana mogu prevazići osnovni nedostaci u pogledu cene i povećanog pada pritiska pri većim protocima. Vlaknasti filtri do sada imaju znatno veću primenu, jer su jednostavniji za proizvodnju i imaju prednosti pri većim protocima. Ovi filtri se prave od vlaknastih materijala poput pamuka ili staklene vune. Kod ove vrste filtera mikrobne ćelije mogu da prodru u filter pa čak i da prodju kroz filter bez obzira na njegovu debljinu, što je njihov osnovni nedostatak u odnosu na apsolutne filtre. Razlikuju se dva osnovna tipa vlaknastih filtera: filtri sa dubinskim slojem i filterski ulošci. Prvi se sastoji od presovanog homogenog sloja vlaknastih materijala smeštenog u metalnom cilindru sa omotačem za sterilizaciju toplotom. Filterski ulošci sastoje se od jednog

ili više tankih slojeva finih vlakana u omotaču, od tekstila, postavljenih u metalno kućište, radi sterilizacije toplotom ili formaldehidom. Zadržavanje čestica iz vazduha u vlaknastim filtrima se odvija po već navedenim mehanizmima impakcijom, intercepcijom, difuzijom i elektrostatskim privlačenjem.

Šema vlaknastih filtera: a) filter sa dubinskim slojem b) filterski uložak

Da bi se proračunao vlaknasti filer polazi se od dve pretpostavke:

- čestica koja dotakne vlakno ostaje vezana za vlakno - raspodela čestica u filtru je uniformna

Uvažavajući ove pretpostavke, smanjenje koncentracije čestica u vazduhu pomoću filtra se može izraziti kinetičkom jednačinom prvog reda:

NkdL

dNf

gde su: N broj čestica u vazduhu u filtru L debljina filtra kf konstanta filtra Integracijom prethodne jednačine se dobija:

Lkf feN

N 0

gde je: N0 broj čestica koje ulaze u filter Nf broj čestica koje napuštaju filter Iz ove jednačine je jasno da je za potpuno uklanjanje svih čestica bila potrebna beskonačna dužina filtra. Logaritmovanjem prethodne jednačine se dobija tzv. logaritamska jednačina penetracije

LkN

Nf

f 0

ln

Pošto je većnaznačeno da je nemoguće obezbediti potpuno izdvajanje čestica iz struje vazduha, potrebno je definisati željenu efikasnost filtra

0N

NNE fo

f

odnosno

0

1N

NE f

f

gde se zamenom dobija Lk

ffeE 1

U industrijskoj praksi je karakteristična efikasnost filtra od 0.9 odnosno 90%. Ovo znači da je 90% od ukupnog broja čstica koje udju u filter zadržano u filteru. Ako je Ef=0.9 onda je iz pretprošle jednačine Nf/N0=0.1. Ako se debljina filtra koji izdvaja 90% čestica označi kao L90, onda je:

900

303.21.0lnln LkN

Nf

f

odavde sledi da je:

fkL

303.290

Konstanta filtra, kf i debljina filtra L90, zavise od prirode materijala od koga je napravljen kao i od brzine strujanja vazduha kroz filter, kao što je predstavljeno na slici.

Sa slike se može videti da postoji neka optimalna debljina filtra za odabrani protok , kada je k=const. Pri malim brzinama strujanja gasa, Ug, javlja se nestacionarno stanje, da bi posle neke minimalne brzine (Ug)min nastupilo staconarno stanje , tj. stabilan rad filtra. Nakon neke maksimalne brzine vazduha (Ug)max dolazi do naglog pada k, što je najverovatnije posledica stvaranja velikih kanala, vibracije vlakana i odvajanja već vezanih čestica za vlakno. Za stabilan rad filtra treba da odaberemo optimalnu brzinu (Ug)opt koja se nalazi u intervalu izmedju minimalne i maksimalne vrdnosti.

U tabeli su date vrednosti za debljinu filtera L90 za različite materijale: Materijal Prečnik vlakna

m Mikroorganizam Brzina strujanja

vazduha cm/s L90 cm

Staklena vuna 16 Spore B. subtilis 3 15 30 150 300

4 9 11,5 1,5 0,4

Staklena vuna 8.5 Escherichia coli 3 15 30 150 300

0.4 0.6 0.7 0.8 1.1

Aktivni ugalj - B. cereus 18 28.5

1.7 8.7

Proračun vlaknastog filtra se zasniva na logaritamskoj jednačini penetracije i prihvatljivom riziku kontaminacije. Obično se usvaja rizik kontaminacije p=0.001, a potrebna dužina filtra se izračunava pomoću jednačine:

ff N

N

kL 0ln

1

Broj čestica u ulaznom vazduhu je:

00 ctQN fg

gde je: Qg protok vazduha tf vremenski period rada filtra c0 koncentracija čestica u ulaznom vazduhu Broj čestica koji napušta filter je:

pN f

Druga važna karakeristika filtera je prečnik filtra. On se izračunava iz protoka vazduha i optimalne linearne brzine vazduha ug.

2/14

g

gf u

Qd

Filtri velikog poprečnog preseka zahtevaju veći prostor i veća početna ulaganja ali su zato padovi pritisaka i operativni troškovi manji. Mehanizam inercione impakcije

Ako se u vazdušnoj struji, koja se kreće brzinom Ug, nalazi čestica koja se kreće brzinom Up, a ima prečnik dp i gustinu p, onda je moguće prihvatiti da otpor kretanju čestice može biti izražen Stoksovom jednačinom:

gppp

pp UUC

d

dt

dUd

3

63

odnosno

gpppp UU

dt

dUdC

18

2

uvodjenjem bezdimenzionih veličina koje se odnose na koordinate, brzinu i vreme koje se odnose na koordinate, brzinu i vreme, koje u sebe uključuju i prečnik vlakna df, kao i početnu vrednost brzine vazduha Ug0, dobija se član:

f

gpp

d

UdC

18

02

koji se naziva inercioni parametar, gde su: C - Kaningamov koeficijent df - prečnik vlakna Prema analizi Lengmira, efikasnost uklanjanja čestica i mikroorganizama ima vrednost 0, kada je :

016

1 fE

Iz ovoga sledi da postoji kritična brzina vazduha:

2125.1

pp

fgC

dC

dU

na osnovu koje se zamenom vrednosti za i za vazduh na 20 oC dobija vrednost prikazana na dijagramu:

Za poznate i odgovarajuće parove vrednosti moguće je odrediti treću, nepoznatu, vrednost. Kod izdvajanja čestica mehanizmom intercepcije, primenjuje se pojednostavljeni oblik efikasnosti:

161

2

Re

f

pf d

dE

gde je:

gf Ud

Re

Kod mehanizma difuzije, tj. Braunovog kretanja, koristi se izraz:

1811

32

Re

ScE f

gde je:

D

Sc

pri čemu je D koeficijent difuzije definisan kao:

pd

CkT

3D

gde je: T - temperatura izražena u oK C - Kaningamov korekcioni faktor k - Bolcmanova konstanta k=1.38 10-23 J/K

Ukupna efikasnost izdvajanja čestica u filtru je suma efikasnosti izdvajanja svakog vlakna posebno, pa se u svrhe izračunavanja efikasnosti koristi zavisnost:

18

13

1

0 RePed

dfPe

d

dE

f

p

f

pf

gde je Pe=ScRe.

Za usvojenu vrednost ukupne efikasnosti celog filtra se zavisnosti L=f(Ef), odredjuje debljina filtra.

Pad pritiska na filtru za sterilizaciju se odredjuje iz koeficijenta trenja CD=f(Re), koji je definisao Kimura:

mg

fD

LU

PgdC

12 2

pri čemu se za set vrednosti df, 1- i m, može dobiti zavisnost CD od Re, grafički prikazana na slici:

Postrojenje za sterilizaciju vazduha Svako postrojenje za sterilizaciju vazduha uključuje: predfilter, kondicioner za regulisanje vlažnosti vazduha i filter sa dubinskim slojem. Najčešći problem kod sterilizacije

vazduha filtracijom je pojava kondenzata u vazdušnoj struji po izlasku iz kompresora. Ovaj kondenzat može dospeti u filter i time izazvati loš rad filtera. S toga se o tome mora voditi računa pri projektovanju uredjaja i najbolji način je nakon kompresora ugraditi hladnjak kojim će se kondenzat izdvojiti iz struje vazduha a potom uputiti ka postrojenju za filtraciju (sterilizaciju).

Drugi načini sterilizacije vazduha Sterilizacija toplotom- Veliki broj spora i bakterija je otporan na temperaturu i mogu biti inaktivisani samo pri dovoljno visokim temperaturama. Decker i saradnici (1954) pokazali da spore bakterija u vazduhu mogu biti inaktivisani tek pri temperaturi od 218 oC u trajanju od 24 s. Poznato je da se pri sabijanju vazduha u kompresoru javlja i visoka temperratura pa je koristeći taj efekat Stark konstruisao sterilizator vazduha prikazan na donjoj šemi.

Pri povećanju pritiska vazduha temperatura se diže od 150-220 oC, u zavisnosti od ulazne temperature vazduha i tu se zadržava potrebno vreme da bi došlo do destrukcije spora a potom se odvodio u rezervoar odakle se vršilo snabdevanje fermentora. Ovakav sistem je sa uspehom upotrebljen u sintezi acetona i butanola, amilaze i 2,3-butilen glikola. (ulazna i

izlazna temperatura vazduha su bile 21 i 187 oC, izlazni prisak vazduha 7 atm, zapremina fermentora od 1 do 30 m3, a protok vazduha je bio od 0.1 do 3 m3/min). Medjutim ova tehnika je opterećena mnoštvom tehničkih problema koje treba rešiti kako bi se proces kontinualno i efikasno odvijao, pre svega sa aspekta lokacije kompresora uz fermentor, dužine potrebnih cevi, kvaliteta opreme i obezbedjenja sterilnosti dodatne opreme tokom kontinualnog procesa koji znatno poskupljuju ovakav postupak. Ultraljubičasto zračenje - Još je ranije utvrdjeno da ultraljubičasto zračenje sa talasnim dužinama od 2265 do 3287 A, veoma efikasno inaktiviše mikroorganizme koji se nalaze u vazduhu. Sterilne sobe u fabrikama i bolnicama su opremljene lampama koje emituju ovo zračenje i sa uspehom se primenjuju, medjutim problematično je njegovo korišćenje kada je potrebno sterilisati vazduh koji ide u proces fermentacije, usled uobičajeno visokih zahteva u pogledu kvaliteta vazduha. Germicidni sprej - Redukciju bakterija u vazduhu je moguće postići i korišćenjem sprejova, kod kojih je odredjena količina germicida, poput fenola, etilen oksida ili soli teških metala rastvorenih u vodi, rasprskavana u struju vazduha koji je kondicioniran. Na ovaj način se može postići odredjena destrukcija mikroorganizama ali je u isto vreme teško ukloniti i tragove ovih materijala pre upotrebe tretiranog vazduha, pa se i ovaj metod najčešće koristi za pripremu vazduha radnog prostora u kome se obavlja odredjeni proces. Sterilizacija bioreaktora Pre dodavanja hranljive podloge u bioreaktor, koja je sterilisana ili u posebnom sudu ili u kontinualnom sterilizatoru, sam bioreaktor se mora sterilisati. Svaki bioreaktor mora imati ili omotač ili zmijasti razmenjivač kojim se vrši zagrevanje bioreaktora. Istovremenim zagrevanjem biorekatora i dovodjenjem vodene pare u biorekator, vrši se sterilizacija bioreaktora. Vodena para se uvodi kroz sve otvore, izuzev kroz otvor za izlaz vazduha kroz koji para napušta bioreaktor. Pritisak pare u sudu se drži oko 20 min na 2 bar. Na kraju se sterilan vazduh produvava kroz bioreaktor uz održavanje nadpritiska, kako se u toku hladjenja ne bi stvorio vakuum i time usisao nesterilan vazduh. Svi drugi priključci koji se nalaze na bioreaktoru (cevovodi, priključci za održavanje pH, dodavanje inokuluma, prihranjivanje) sterilišu se nezavisno od biorekatora, primenom dvostrukih ventila, pa i tokom odvijanja bioprocesa u reaktoru. Takodje se svi dodaci koji ulaze u bioreaktor tokom reakcije moraju sterilisati kao i priključci kojim se to vrši.

Tehnološke operacije u biotehnologiji U toku biotehnološke proizvodnje, u funkciji željenog proizvoda moguće je primeniti sve tehnološke operacije koje neće smanjiti efikasnost i produktivnost proizvodnje i koje neće smanjivati kvalitet proizvoda. Sve tehnološke linije se projektuju tako da se najpovoljnijom kombinacijom različitih operacija dodje do proizvoda na najefikasniji a što ekonomičniji način za date uslove. U procesu proizvodnje, prehrambene i farmaceutske industrije, najčešće primenjivane tehnološke operacije su:

Ekstrakcija Filtriranje

Filter prese Rotirajući vakuum filtri

Mešanje Centrifugiranje Fermentacija Uparavanje Destilacija Membranska separacija

o Ultrafiltracija o Nanofiltracija o Reversna osmoza

Sušenje o Konduktivno (sušenje na valjcima) o Konvektivno

Tunelske sušnice Sprej sušnice Sušenje na pokretnim inertnim nosačima (fluidizovani i fontanski sloj)

o Liofilizacija Mlevenje Mešanje praškastih materijala (mikseri)

Tehnološke operacije u izolovanju i prečišćavanju proizvoda bioprocesa Na kraju svakog bioprocesa, fermentaaciona tečnost se podvrgava obradi radi izolovanja i prečišćavanja željenog proizvoda. Koji će se postupak primeniti zavisi od:

- oblika u kome se proizvod nalazi i njegove koncentracije( intra ili ekstra ćelijski proizvod)

- fizičkih i hemijskih osobina proizvoda - vrste nečistoća koje prate proizvod - upotrebe proizvoda - zahtevane čistoće proizvoda - cene proizvoda

Šema jednog tehnološkog procesa sa uključenim tehnološkim operacijama je data na sledećoj slici.

Pri odredjivanju postupka izolovanja proizvoda mora se birati optimalni postupak jer su troškovi izolacije i prečišćavanja u opsegu 20-60% od ukupnih troškova proizvodnje. Pri izboru postupka najčešći problemi su: mala koncentracija proizvoda, prisustvo mikrobnih ćelija, ostatak ćelija i rastvornih i nerastvornih jedinjenja, nestabilnost proizvoda, razgradnja proizvoda pod

uticajem kontaminanta itd. Izbor procesa mora biti optimalan, premda je često sam process ograničen raspoloživom opremom. U postupku izolovanja i prečišćavanja proizvoda primenjuju se tehnike koje se koriste u hemijskoj tehnologiji prilagodjene specifičnim zahtevima bioprocesa. Pored opštih postupaka razvijene su i specijalne tehnike za odredjene bioprocese. Pri razvoju postupka izolovanja i prečišćavanja proizvoda treba imati na umu ukupan biotehnološki postupak i interakcije izmedju pojedinih faza. Zbog ovih interakcija nijedna faza biotehnološkog postupka se ne može razvijati nezavisno, kao na primeru dobijanja ekstraćelijskog enzima, čiji prinos zavisi od vremena trajanja biosinteze, sinteze pigmenata, jonske jačine fermentacione tečnosti i sastava hranljive podloge. Opšti postupak izolovanja i prečišćavanja proizvoda je dat na šemi.

FERMENTACIONA TEČNOST

PRIPREMA FERMENTACIONE TEČNOSTI

podešavanje pH zagrevanje/hladjenje

dodatak enzima

IZDVAJANJE MIKROBNIH ĆELIJA

filtracija centrifugiranje

Intraćelijski proizvod

DEZINTEGRACIJA ĆELIJA

Ekstraćelijski proizvod

SEPARACIJA ĆELIJSKOG OSTATKA

KONCENTRISANJE PROIZVODA taloženje

ekstrakcija adsorpcija

dijaliza uparavanje destilacija

PREČIŠĆAVANJE PROIZVODA kristalizacija

hromatografija FINALNA OBRADA PROIZVODA

sušenje mlevenje sejanje

umešavanje PROIZVOD

Po završetku sinteze mora se izvršiti priprema fermentacione tečnosti, da bi se olakšalo izdvajanje mikrobne biomase. Vrsta pripreme zavisi od vrste proizvoda, vrste ćelija ili sastava tečnosti a može biti podešavanje pH, zagrevanje, dodatak enzima koji razaraju ćelijski zid ili sredstva za flokulaciju ćelija itd. Takodje se na samom početku pravilnom upotrebom sojeva i postupka može unapred olakšati faza pripreme za izolaciju proizvoda.

Iz fermentacione tečnosti se odvaja biomasa, najčešće postupkom filtracije ili centrifugiranjem, a dalji postupak zavisi od toga gde se proizvod nalazi, u biomasi ili tečnosti. Ako je mikrobna masa proizvod ona se dalje može sušiti mleti i potom umešavati sa drugim sirovinama, a ako je proizvod intraćelijski onda se moraju ćelije prvo razoriti a potom izvršiti separacija. Proizvod se u filtratu koncentriše precipitacijom, ekstrakcijom, adsorpcijom, dijalizom, ultrafiltracijom, uparavanjem, destilacijom itd. Često je potrebno kombinovati više postupaka da bi se dobio željeni stepen koncentrisanja proizvoda. Posle izolacije i koncentrisanja proizvoda vrši se prečišćavanje proizvoda, najčešće pomoću hromatografskih metoda, kristalizacijom i drugim. Nakon toga se vrši finalna obrada proizvoda do njegove komercijalne vrednosti, a ona obuhvata, sušenje, mlevenje, sejanje, mešanje sa drugim sirovinama i pakovanje. Filtriranje

Filtriranje je odvajanje suspendovane čvrste faze od tečnog medijuma. Proces filtracije se odvija zahvaljujući razlici u pritisku ispred i iza filtracionog medijuma, a on se postiže ili hidrostatičkim pritiskom, nadpritiskom iznad suspenzije ili vakuumom iza filtracionog medijuma.

Za pospešivanje procesa filtriranja u suspenziju se mogu dodavati i materije koje neće narušiti hemijske karakteristike proizvoda (elektroliti), ali će pospešiti koagulaciju koloidnih čestica u suspenziji i time olakšati filtraciju. Filtracija može biti:

- Filtracija kroz filtracionu pogaču, - Unakrsna filtracija - Filtracija na rotirajućim vakuum filtrima

Filtracija kroz filtracionu pogaču se vrši tako što tečnost, odredjene zapremine, protiče normalno na filtracioni medijum, obrazuje se filtraciona pogača, a brzina filtracije zavisi od razlike pritiska ispred i iza filtracionog medijuma, filtracione površine, otpora filtracione pogače i mase sakupljene biomase, viskoziteta tečnosti i otpora filtracionog medijuma.

Čvrsta faza se odvaja u vidu pogače koja i sama pomaže filtraciju, ali koju je potrebno povremeno ili kontinualno odstranjivati iz filtra kako bi se proces nesmetano odvijao, jer nagomilavanje čvrste faze povećava potreban pritiska koji je potrebno savladati tokom filtracije što na kraju može dovesti do njenog prekida.

Filtracija se izvodi kroz sloj materijala odredjene granulacije (pesak, diatomejska zemlja (kiselgur), ...) ili kroz posebno konstruisane medijume za filtraciju (papir, tekstil, keramika...) čije pore moraju biti manje od veličine čestica suspendovane čvrste faze. Stišljivost biomase može stvoriti probleme pri filtraciji i ispiranju pogače pa se u cilju prevazilaženja ovog problema u fermentacionu tečnost dodaje infuzorijska zemlja ili perlit kako bi se zadržala odredjena struktura filtracione pogače.

Ovaj postupak se primenjuje u slučajevima relativno malih količina materijala za suspenziju ili sa relativno malim sadržajem suspendovanih materija u odnosu na ukupnu količinu tečne faze (filtriranje piva, filtriranje vina...), jer se povremeno moraju čistiti.

Osnovna veličina koja se pri filtraciji odredjuje je brzina filtracije. Ona zavisi od površine za filtraciju, materijala kroz koji se vrši filtracija, viskoziteta fluida, razlike pritisaka na filtru i otpora filtriranju od filtracionog medijuma i materijala koji se na njemu zadržava.

mc

f

f

rA

M

P

dt

dV

A

1

gde je: A filtraciona površina Vf zapremina profiltrirane tečnosti t vreme filtracije P pad pritiska kroz filtar f viskozitet trčnosti Mc ukupna masa u filtracionoj pogači specifična otpornost filtracione pogače rm specifična otpornost filtracionog medijuma Kada je filtraciona pogača stišljiva (kompresibilna) onda se njena specifična otpornost menja sa promenom pada pritiska tokom filtracije, pa je:

sP , gde je: , konstantna vrednost zavisna od morfologije čestica u filtracionoj pogači s kompresibilnost pogače (jednaka je 0 za čvrste nekompresibilne medijume) Spesifična otpornost filtracione pogače zavisi od karakteristika čestica u njoj pa je:

p

v aK

3

2 1

gde je: Kv faktor oblika čestica u filtracionoj pogači a specifična površina čestica u pogači poroznost pogače p gustina čestica Kada se u prethodnoj jednačini zameni Mc = cVf, gde je c masa čvrste faze izdvojena po zapreimini profiltrirane tečnosti, onda se dobija:

m

f

f

f

rA

cV

P

dt

dV

A

1

Kako se ceo problem kod filtracije, zapravo, svodi na eksperimentalno odredjivanje veličina i rm, to se nakon integraljenja i preuredjenja gornje jednačine, dobija:

PA

rV

PA

c

V

t mf

f

f

f

22

odnosno:

21 KVKV

tf

f

gde su K1 i K2 konstante tokom filtracije i praćenjem promene t/Vf sa Vf tokom filtracije, dobija se prava sa nagibom K1 i odsečkom K2, gde su:

PA

cK

f

212

PA

rK

mf

2

Nagib K1 zavisi od pada pritiska i karakteristika filtracione pogače, dok odsečak K2 zavisi samo od pada pritiska a ne zavisi od karakteristika filtracione pogače. Unakrsna filtracija se vrši tako što suspenzija struji preko filtracione površine tangencijalno odnoseći čvrste čestice sa fermentacionog medijuma, pa se ostvaruju i 100 do 1000 puta veće brzine filtracije nego klasičnom filtracijom kroz filtracionu pogaču. Posebni slučajevi unakrsne filtracije su mikrofiltracija i ultra filtracija a konstruktivne karakteristike su date na sledećeoj šemi:

Rotirajući vakuum filtri se šire koriste, pošto mogu raditi kontinualno uz istovremenu filtraciju i odvajanje čvrste faze. Grade se u obliku horizontalnog cilindra dužine 0.5 do 3 m, koje je se okreće brzinom 0.1 do 2 obrtaja/min. Filtraciono platno je obavijeno oko cilindra unutar koga se obezbedjuje vakuum. Delimično potopljen cilinder u suspenziji rotira i usled vakuuma tečnost prolazi unutar cilindra odakle se kao čista odvodi a čvrsta faza se zadržava na površini filtracionog platna pod dejstvom vakuuma i polako rotira sa njim. Često se na tom putu ugradjuju i mlaznice za ispiranje čvrste faze kako bi se ona potpuno prečistila od tečne faze iz suspenzije, a potom se neposredno pre ponovnog kvašenja u suspenziji, pomoću strugača ona skida sa filtracionog platna, koje sada ponovo ulazi u suspenziju i proces teče kontinualno.

Centrifugiranje

Koristi se za odvajanje materijala različite gustine koje zahtevaju silu veću od sile zemljine teže i kada je filtracija spora ili nedovoljno efikasna. U bioprocesima se koristi za uklanjanje ćelija iz fermentacione tečnosti, ćelijskih ostataka, prikupiti istaložene materije, ili izbistriti fermentacionu tečnost, ili pak u mesnoj industriji odvojiti krvnu plazmu iz krvi itd.

Oprema za izvodjenje centrifugiranja je složenija pa samim tim i skuplja od opreme za filtraciju, ali je u isto vreme i efikasnija. Centrifuge se dele na filtracione i taložne a najčešće se koriste cevne, višekomorne i filtracione dobošaste centrifuge.

Cevna centrifuga je najjednostavnija ali je relativno malog kapaciteta u odnosu na čvrstu fazu. Višekomorna centrifuga, odvaja čvrstu fazu po istom principu kao i cevna, ali ima veći kapacitet u odnosu na cevnu, ali imaju manju brzinu obrtanja zbog većeg prečnika. Primenjuje se za separaciju suspenzija sa najviše 5% čvrste faze veličine od 0.1 do 200 mikrona.

Dobošasta centrifuga se koristi kao filtraciona centrifuga, ali ima ograničen kapacitet i može doći do zapušavanja biološkim materijalom. Kod ovakve konstrukcije centrifuge se može postići sila od 13 do 16 sila zemljine teže.

Ultracentrifuge su još složenije konstrukcije, manjeg su kapaciteta a postižu silu od 105 do 106 sile zemljine teže, pri čemu se radi u inertnoj atmosferi da bi se smanjile sile trenja i generisanje toplote. Njačešća primena je kod proizvodnje vakcina gde treba odvojiti ćelijske ostatke iz tečnosti. Tanjiraste centrifuge su alternativa cevnim centrifugama, rade se u više tipova a mehanizam je predstavljen na prethodnoj slici. Izvode se sa kontinualnim odvajanjem čvrste faze, uz eventualno pranje uredjaja bez prekidanja procesa.

Mehanizam odvajanja čestica pri centrifugiranju se objašnjava na sledeći način.

Kod taloženja, kao efekta koji se centrifugiranjem ubrzava, terminalna brzina ili brzina taloženja je:

gDu p

fp

g2

18

dok je brzina taloženja pri centrifugiranju:

rwDu p

fp

c22

18

Odnos, brzine u centrifugi prema brzini pri taloženju je

g

rwZ

2

i naziva se efekat centriguge ili g-broj. Za poredjenje karakteristika centrifuga koristi se tzv. sigma faktor, , koji fizički predstavlja površinu poprečnog preseka taložnika koji bi imao ite karakteristike kao centrifuga razmatranih karakteristika, a definiše se kao:

gu

Q

2

gde je: Q zapreminski protok tečne faze ug brzina taloženja u gravitacionom taložniku Takodje, poredjenje dve centrifuge je moguće odrediti na osnovu jednakosti:

2

2

1

1

QQ

a proračun vrednosti sigma faktora: - za tanjiraste (disk) centrifuge je

31

32

2

tan3

12rr

g

Nw

gde je: N- broj tanjira u centrifugi, r2 i r1 spoljni i unutrašnji poluprečnik tanjira, a je ugao pod kojim tanjir (disk) stoji.

- a za cevne centrifuge

21

22

2

32

rrg

bw

gde je: b- dužina cevi , r2 -poluprečnik cevi a r1 -poluprečnik do tečnog filma Dezintegracija mikrobnih ćelija Kod proizvoda koji se sintetišu u ćelijama i tu ostaju neophodno je razoriti ćelijski zid fizičkim, hemijskim ili nekim enzimskim postupkom, kako bi se proizvod oslobodio u okolnu sredinu. Postupci dezintegracije su dati na sledećoj šemi: DEZINTEGRACIJA MIKROBNIH ĆELIJA NEMEHANIČKI MEHANIČKI POSTUPCI

LIZA SMICANJE U ČVRSTOM

STANJU

SMICANJE U TEČNOSTI

Fizička Osmotski šok Pritisak Hemijska Deterženti Rastvarači Enzimska

DESIKACIJA Sušenje zamrzavanjem

Presa Kuglični mlin

UltrazvukVisoko pritisni homogenizator

Koncentrisanje proizvoda Najčešće korišćeni procesi u cilju koncentrisanja proizvoda su: Uparavanje, najčešće se koristi vakuum uparavanje.

Zamrzavanje, primenjuje se kod termolabilnih proizvoda, a postupak je u nekoliko uzastopnih stupnjeva zamrzavanja vode i uklanjanja leda iz rastvora centrifugiranjem. Taloženje, najčešće se dodaju hemijski reagensi koji pospešuju taloženje (so koja smanjuje rastvorljivost proteina i time olakšava taloženje, isoljavanje). Kod visokomolekulskih jedinjenja se dodaju organski rastvarači (dekstran se taloži u prisustvu metanola ili etanola iz fermentacione tečnosti) Ekstrakcija rastvaračem se obično koristi nakon destrukcije ćelija i ćelijskih delova, tako što se koristi nemešljivi rastvarač u što manjoj mogućoj zapremini. Primenjuju se različita konstruktivna rešenja: ekstrakcione kolone, mešač-odvajač, centrifugalni ekstraktor i drugo. Prečišćavanje proizvoda U cilju prečišćavanja proizvoda najčešće se koriste postupci kristalizacije i hromatografije. Kristalizaciji prethodi uparavanje a potom se na sniženim temperaturama izvodi proces kao u slučaju limunske kiseline, amino kiselina ili antibiotika. Hromatografija bazira na različitom zadržavanju molekula rastvorenih jedinjenja pri prolazu rastvora kroz kolonu sa nepokretnim slojem čvrstih čestica i ispiranju zadržanih molekula rastvaračem (eluiranju). Za rad hromatografske kolone važan je izbor punjenja, a vrši se na osnovu osobina komponenata rastvora i zahtevanih radnih uslova. Sušenje proizvoda Proizvodi bioprocesa se suše radi pogodnijeg i sigurnijeg čuvanja, pakovanja i smanjenja troškova transporta. Način sušenja zavisi od osetljivosti proizvoda na povišenu temperaturu, uticaja vazduha na proizvod i nivoa kvaliteta proizvoda. U osnovi se razlikuju tri tipa sušara koje se primenjuju u biotehnologiji, a to su:

- kontaktne sušare - konvektivne sušare - sublimacione sušare

Kod kontaktnih sušara se proizvod suši u tankom sloju u direktnom kontaktu sa zagrejanom površinom. Iako ove sušare najčešće rade šaržno moguće je u odredjenim uslovima primeniti i kontinualni postupak, poput sušenja na valjcima. Najčešće primenjivane su konvektivne sušare, koje daju zadovoljavajući kvalitet uz optimalne kapacitete, a sušenje se vrši direktnim kontaktom vazduha (ili nekog drugog gasa) koji konvektivnim načinom prima vlagu iz proizvoda koji se suši. Vlažan proizvod može biti u:

- nepokretnom sloju, lociran u tavama koje pak mogu biti nepokretne kada su u pitanju komorne sušare ili se blago kretati kada su u pitanju tunelske sušare,

- potom se proizvod može naći u obliku kapi u struji vazduha (spray sušionici) - u novije vreme se primenjuju trofazni sistemi sa inertnim punjenjem od kojih su

najčešći fluidizovani i fontansko-fluidizovani sušionici Opšte karakteristike sistema za sušenje suspenzija i rastvora Sušenje rastvora i suspenzija materija je veoma važno u procesnoj, prehrambenoj i farmaceutskoj industriji. Postoji više načina, da se ukloni tečna faza i dehidratacijom dodje do suvog, praškastog materijala, sa zadržanim funkcionalnim karakteristikama. U ovom radu će biti razmatran konvektivni postupak sušenja, koji se primenjuje i kod sušenja u tavama, na pokretnim valjcima u kombinaciji sa konduktivnim postupkom, sušenja raspršavanjem i sušenja u fluidizovanom sloju.

Pokušaj zamene postupka sušenja u tavama, doveo je do razvoja sistema za sušenje na pokretnim valjcima. Svodi se na postupak razlivanja tečnog medijuma u vidu tankog filma na zagrejane valjke, koji se relativno sporo okreću, gde dolazi do sušenja tankog filma koji se u odredjenoj poziciji valjaka, strugalicama skida sa njihove površine. Kvalitet osušenog materijala, obično, ne zadovoljava propisane norme u pogledu granulacije čestica, tako da se mora raditi njegova dorada tj. dodatno mlevenje i granulacija. Postojanje mehaničkih i pokretnih delova u ovakvoj liniji otežavaju i poskupljuju održavanje čitavog sistema.

Sušenje raspršavanjem (spray drying), pretstavlja efikasan i do sada najrasprostranjeniji postupak. Zasniva se na tretmanu raspršenog tečnog medijuma u struji toplog vazduha. Usled male veličine raspršenih kapi, kontaktna površina sa toplim vazduhom je veoma velika, pa se

odvija intenzivan kontakt i prenos toplote i mase. U definisanoj zapremini uredjaja dolazi do sušenja kapi koje na putu naniže dobijaju praškastu strukturu, da bi se mehaničkim separatorima odnosile iz sušionika i zajedno sa delom praha iz struje vazduha prikupljale kao gotov proizvod. Ovaj postupak ne zahteva doradu dobijenog praškastog materijala, pa se proizvod dobija u jednom koraku.

Slika Prikaz sušionika sa raspršavanjem Osnovni nedostatak ovih uredjaja je potreba za veoma velikim dimenzijama uredjaja. Naime, potrebno je obezbediti dovoljan slobodni put raspršenoj kapljici da ne dopre do zida uredjaja, pre nego izgubi vlagu i sposobnost lepljenja, što povećava investicione troškove pri instaliranju ovakvog postupka. Sušenje u fluidizovanom sloju, je pre svega korišćeno za sušenje zrnastih materijala. Poštujući prirodu fluidizovanog sloja pokušalo se sušenje supenzija i rastvora pomoću sloja već osušenog praškastog materijala na koji se raspršavao tečni medijum, uz simultano odvodjenje osušenih čestica. Ovakav tip sušionika se može koristiti za relativno male kapacitete, jer je, umesto sušenja, ovo, pre postupak oblaganja zrnastog materijala (coating), gde je i našao primenu. Dovodjenjem raspršene tečnosti na fluidizovan sloj različitih nosača i istovremenim sušenjem toplim vazduhom, vrši se njihovo oblaganje.

Slika Sušenje suspenzija i rastvora u fluidizovanom sloju

Ovakvi procesi se najčešće primenjuju u farmaceutskoj industriji, za oblaganje tableta različitim materijalima koji se različito rastvaraju, čime se omogućava produženo delovanje leka u organizmu korisnika. Sušenje suspenzija i rastvora bez lepljivih karakteristika je dalo odredjene rezultate, pre svega kod neorganskih soli i preparata za zaštitu bilja, medjutim u biotehnologiji su mahom svi mediji sa relativno lepljivim karakteristikama koje onemogućavaju primenu ovakvih sistema. Razvojem fontanskog sloja i proučavanjem fenomena prenosa toplote i mase stvoreni su uslovi za njihovu primenu u različitim procesima i postupcima. Jedan od procesa je sušenje suspenzija i rastvora. Fontanovanjem inertnog sloja čestica toplim vazduhom formira se ciklično kretanje čestica u sloju. Raspršavanjem tečnosti po površini prethodno zagrejanih čestica formira se tanki film na njihovoj površini. Istovremenim prenosom toplote sa zagrejane inertne čestice i toplog vazduha, kojim se čestica fontanuje, na film tečnosti, dolazi do sušenja filma i njegovog pretvaranja u skramu osušenog materijala, (spouted bed thin film drying). Pod dejstvom trenja čestica-čestica i čestica-vazduh suvi materijal se skida sa površine i strujom vazduha nosi u separator. Inertna čestica, kao teža, pada na vrh sloja i ponovnim dolaskom u zonu

Slika Sušenje na tankom filmu u fontansko-fluidizovanom sloju sa inertnim punjenjem

kvašenja proces se nastavlja. Proces dobijanja praškastog proizvoda se takodje odvija u jednom koraku i nije potrebna njegova dorada. Sušenje suspenzija u fontanskom sloju je nastalo kao posledica pokušaja da se prevazidju neki od nedostataka sušionika sa raspršavanjem, koji se pre svega ogledaju u velikim dimenzijama i nemogućnosti efikasnog sušenja pri niskim temperaturama kada su u pitanju toplotno-osetljivi materijali. Kako se sušenje odvija u tankom filmu ( ~3-5 x10-6 m, T&R.S.A (1986)) na česticama inertnog punjenja to je dodirna površina za prenos toplote i mase veoma velika, a toplotni kapacitet inertnih čestica u maloj zapremini čini uredjaj znatno efikasnijim u poredjenju sa drugim. Sušionik sa raspršavanjem istog kapaciteta ima preko 20 puta veću zapreminu, što znatno povećava investicione troškove pri gradnji ovakvih sistema. U sušioniku sa fontanskim slojem se može odvijati proces sušenja i pri relativno niskim temperaturama što omogućava sušenje temperaturno osetljivih materijala, uz zadržavanje njihovih funkcionalnih, nutritivnih ili aromatskih karakteristika. Tako je moguće dobiti prah temperature 30 oC sa ulaznom temperaturom vazduha od 100 oC i temperaturom sloja od 60 oC, pri izlaznom sadržaju vlage od 5%, što se postiže relativno kratkim vremenom boravka materijala u sušioniku i efikasnim korišćenjem toplote samo na isparavanje tečnosti a ne i na zagrevanje produkta. Tako se vreme boravka materijala u sušioniku kreće od nekoliko sekundi do 1 do 2 min. Značaj kratkog vremena boravka materijala u sloju se ogleda u nemogućnosti denaturacije proizvoda dužim izlaganjem na povišenoj temperaturi. Poredjenjem promene rastvorljivosti proteina, kao jedne od osnovnih mera kvaliteta dobijenog praškastog proizvoda, sušenih u različitim tipovima sušionika, utvrdjeno je da je, rastvorljivost proizvoda dobijenih u pokretnom sloju sa kratkim vremenom boravka u sušioniku, daleko veća u odnosu na sušenje u tavama ili valjkastim sušionicima. Takodje ispitivanja i u odnosu na sušionik sa raspršavanjem, pokazuju veću rastvorljivost proteina dobijenih u sušioniku sa fontanskim slojem. Do sada nema industrijskih jedinica za sušenje suspenzija u fontanskom sloju. Ispitivanja na eksperimentalnim i poluindustrijskim jedinicama, u odnosu na druge tipove sušionika, pri

sušenju suspenzija i rastvora, su pokazala da su osnovne prednosti sušionika sa fontanskim slojem: fleksibilnost u pogledu kapaciteta, laka regulacija, jednostavna manipulacija i relativno niža cena instaliranja i eksploatacije. Centralni deo sušionika čini kolona prečnika 250 mm, visine 1.5 m, koja na dnu ima perforirano konično dno ugla 45oC. U osi kolone postavljena je cev prečnika 65 mm i promenljive dužine, koja se kretala od 600 do 900 mm, sa mogućnošću da se menja aksijalno rastojanje početka cevi od dna kolone. Dovod vazduha za obrazovanje fontansko-fluidizovanog sloja je vršen putem mlaznog i anularnog priključka.

Slika.- Sušionici sa fluidizovanim i fontansko fluidizovanimslojem (eksperimentalne jedinice) Mlazni priključak, unutrašnjeg prečnika 50 mm, je postavljen osno na dnu kolone dok je anularni priključak postavljen bočno na dnu kolone u zoni ispod perforiranog konusa. Posebna konstrukcija pokretne mlaznice, je omogućavala korišćenje ventilatora koji ostvaruju relativno male pritiske, jer se ovim sistemom izbegavaju izražene maksimalne vrednosti pritiska pri obrazovanju klasičnog fontanskog ili fontansko-fluidizovanog sloja. Naime, pokretna mlaznica ulazi u centralnu cev i pravi fizičku barijeru izmedju centralne cevi i čestica sloja. Sistem se obrazuje tako da se pusti protok vazduha kroz mlaznicu i potom se ona postepeno spušta ka dnu kolone uz uvlačenje čestica iz sloja u delu ispod sentralne cevi. Zaustavljanje sloja se vršilo obrnutim redom. Ovakva konstrukcija je posebno važna u mogućim industrijskim rešenjima, jer se znatno smanjuju instalacioni i eksplatacioni troškovi. Kolona je snabdevana vazduhom ventilatorima snage 2.2 kW, nezavisno za mlazni i anularni tok. Merenje protoka vazduha je vršeno standardnim prigušnim pločama, a njegova regulacija pomoću klapni, koje su se nalazile na cevovodima neposredno pre razmenjivača toplote. U eksperimentima sa toplim vazduhom, zagrevanje je vršeno setovima grejača sa po 11.2 kW snage, nezavisno za svaki vod, a locirani su neposredno pre uvodjenja u kolonu. Na izlazu iz kolone nalazio se visokoefikasan ciklon za sakupljanje praha prilikom sušenja suspenzija i rastvora.

Suspenzija je dovodjena u kolonu na dva načina. U prvom slučaju to je vršeno setovima dvofluidnih mlaznica koje su bile postavljene iznad vrha anulusa, dok je u drugom slučaju to vršeno jednom dvofluidnom mlaznicom na "ustima" mlaznog toka na dnu kolone. Termin dvofluidna malznica se odnosi na konstrukciju mlaznice kojom se jednim tokom dovodi tečna faza, da bi aksijalnim tokom komprimovanog vazduha bila raspršena na izlazu iz mlaznice. Na čitavoj jedinici su bila predvidjena merna mesta za merenje protoka, padova pritisaka i temperatura. Svi materijali korišćeni za izradu ove opreme su zadovoljavali visoke standarde predvidjene za korišćenje u prehrambenoj industriji. Ukupno instalisana snaga ove eksperimentalne jedinice je iznosila oko 30 kW. Liofilizacija Kod sublimacionih sušara (liofilizacija), proces se odvija tako što se vlažan materijal zamrzne na –15 do –50 oC a zatim se kristali leda sublimišu pri blagom zagrevanju u visokom vakuumu. Prednost ove metode je:

- dobra rekonstitucija dehidratisanih proizvoda - produžena stabilnost proizvoda - uklanjanje vode iz proizvoda bez prekomernog zagrevanja - brzo i dobro rastvaranje pri rekonstituciji proizvoda (ponovno kvašenje)

a nedostaci su:

- relativno mali kapacitet - dužina procesa i - investicioni i operativni troškovi

Liofilizacija je stabilizirajući proces u kojem se supstanca prvo zamrzva, a onda se smanjuje količina rastvarača (najčešće vode), prvo sublimacijom (primarno sušenje), onda desorpcijom (sekundarno sušenje), do vrednosti koja više ne podržava biološku aktivnost ili hemijske reakcije. Faze liofilizacije: Prva faza – zamrzavanje Cilj ove faze je zamrzavanje proizvoda, tako da aktivna komponenta ostane nepromenjena. Rastvarač kristališe i formiranjem kristala rastvorena supstanca se potiskuje u prostor izmedju kristala-intersticijalno područije. Zamrzavanjem se na taj način odvaja rastvarač od rastvorene supstance. Brzina hladjenja utiče na strukturu zamrznutog matriksa. Ako se voda zamrzava brzo, kristali leda su mali, što dovodi do porozne strukture proizvoda sa visokim otporom prema protoku vodene pare i tako se produžava vreme primarnog sušenja. Ako je zamrzavanje sporo, ledeni kristali rastu od površine koja se hladi i veći su. Zamrzavanje se obično završava na eutektičkoj temperaturi suspenzije za liofilizaciju. Eutektička temperatura je tačka na faznom dijagramu u kojoj se temperatura sistema ili koncentracija rastvora ne može promeniti bez promene broja prisutnih faza. Zamrzavanje je završeno kada je rastvorena supstanca u čvrstom stanju i kada je pokretljivost vode, u intersticijalnom područiju, nula. Voda koja je neophodna za održavanje stabilnosti finalnog proizvoda (posebno proteina ili hidrata) je vezana voda, koja ne učestvuje u zamrzavanju.

Druga faza – primarno sušenje Primarno sušenje je druga faza liofilizacije tokom koje led koji je formiran u fazi zamrzavanja sublimira. U literature se označava i kao vakuum sušenje ili kriosušenje. Sublimacijom leda voda se najvećim delom uklanja i zaostaje rastvorena supstanca. Ukoliko se sublimacija odvija na atmosferskom pritisku, proces je spor jer molekuli gasa pronalaze put kroz atmosferske gasove koji bombarduju površinu leda. Molekuli vode napuštaju površinu leda difuzijom. Sublimacija se može ubrzati smanjenjem pritiska iznad površine leda, kada se materijal ubaci u komoru pod vakuumom, pošto su prethodno gasovi već uklonjeni pomoću vakuuma. Kada pritisak u komori postane manji od pritiska pare, definisanog temperaturom leda, brzina sublimacije značajno raste, a vodena para se uklanja putem kondenzatora. Tok ove faze u velikoj meri odredjuje izgled liofilizata (nazivanog i kolač) koji je porozne strukture nastale sušenjem intersticijalnih konstituenata. Izgled "kolača" je rezultat procesa primarnog sušenja u kojem je temperatura rastvorenih supstanci dovoljno niska tako da nema značajnih količina mobilne vode. Ukoliko zaostane molbilna voda, rastvorena supstanca se ugiba i "kolač" se kompletno topi. Dobar izgled "kolača" ukazuje na dobro očuvanu poroznu strukturu, nepromenjene fizičke osobine i očuvanje aktivnih komponentu, nakon rekonstitucije. Treća faza – sekundarno sušenje Tokom treće faze liofilizacije, temperatura raste da bi sadržaj vode dostigao optimalnu vrednost koja garantuje stabilnost proizvoda. Dužina ove faze i finalna rezidualna vlaga zavise od vrste proizvoda koji se liofilizuje. Proteini i peptidi zahtevaju veći procenat vlage jer se time čuva njihova sekundarna i tercijerna struktura. U tim slučajevima pažljivo se kontroliše procenat rezidualne vlage u proteinskom proizvodu. Ukoliko se liofilizuju bakterijske ćelije postavlja se zahtev za maksimum 1% rezidualne vlage u finalnom proizvodu. Faktori koji utiču na uspešnost liofilizacije:

- priprema suspenzije za liofilizaciju - vodjenje postupka liofilizacije - uslovi čuvanja liofilizovanog kolača

Priprema suspenzije za liofilizaciju Suspenzija za liofilizaciju je smeša aktivne komponente, inertne komponente i krioprotektanata koja se neposredno po pripremanju liofilizuje. Postupak liofilizacije treba da očuva specifičnu specifičnu aktivnost aktivne komponente , koja može biti hemijske ili biološke prirode. U farmaceutskoj industriji aktivna komponenta je definisana potencom, a u dijagnostici svojom reaktivnošću. Aktivna komponenta u proizvodnji startera za mlečnu industriju izražava se preko vijabilnosti ćelija mikroorganizama. Inertne komponente su vezivna sredstva koja obezbedjuju stabilnu tečnu sredinu u suspenziji za liofilizaciju, a istovremeno mogu da imaju i ulogu krioprotektanata. Krioprotektanti su jedinjenja koja štite aktivnu komponentu tokom zamrzavanja, time što štite ćelijske membrane od ivica kristala leda. U tu svrhu se najčešće koriste saharoza, glukoza, dekstran trehaloza, natrijum glutamat, glicerol, adonitol, pepton konjski serum,

vitamini B kompleksa, natrijum acetat itd. Izbor krioprotektanta zavisi od njegove efikasnosti i ekonomske isplativosti u okvirima date proizvodnje i opreme. Suspenzija za liofilizaciju predstavlja izbalansiranu smešu navedenih komponenti, pa, kao primer mogu da posluže sledeće smeše:

- kombinacija 10% obranog mleka, 5% glicerola i 0.1% CaCo3 daje 85.9% preživljavanja

- kombinacija 10% obranog mleka, 5% saharoze daje 67.4% preživljavanja Optimalni sadržaj suve mase u formulaciji suspenzije za liofilizaciju je obično do 20%. Nizak sadržaj suve mase u formulaciji može dovesti do pucanja kolača tokom sušenja, a visok sadržaj suve mase, preko 20%, može biti prepreka izdvajanju vode iz kolača tokom sekundarnog sušenja.

Vodjenje postupka liofilizacije

Oprema za liofilizaciju može biti manjeg ili većeg obima, a parametri procesa mogu se kontrolisati manualno ili automatski. Pored osnovnih funkcija opreme (hladjenje, zagrevanje i kontrola vakuuma), u moderne varijante opreme inkorporirani su čišćenje i sterilizacija na licu mesta ,CIP (clean in place) i SIP (sterilize in place) sistemi, kao i kompjuterska kontrola za praćenje procesa.

Uslovi čuvanja liofilizovanog kolača

Kiseonik, vlaga i svetlost su štetni po sušene koncentrovane kulture i zato se one pakuju pod vakuumom ili pod suvim inertnim gasom a čuvaju na temperaturi od 4 do 8 oC (temperatura frižidera). Liofilizovani Lactobacilus acidophilus, čuvan na 4 oC, posle godinu dana pokazuje neznatno smanjenje broja živih bakterija, a čuvan na 22 oC, u toku prva dva meseca pokazuje nagli pad broja živih. Čuvanjem na sobnoj temperaturi, dolazi do bržeg pada vijabilnosti i propadanja kulture. Mlevenje Pošto su proizvodi biotehnološkog procesa obično temperaturno osetljivi, to se u slučajevima kada je potrebno izvršiti granulometrijsko ujednačavanje proizvoda najčešće primenjuju kuglični mlinovi koji rade na principu rotiranja cilindra u kome se nalaze kugle zajedno sa materijalom koji se melje. Pri okretanju cilindra sa odredjenim brojem obrtaja, koji zavisi od konstrukcije mlina i materijala koji se melje (1-3 obrtaja/s), i neprekidnom kotrljanju kugli unutar cilindra zajedno sa materijalom dolazi do njegovog sitnjenja.

Umešavanje praškastih proizvoda Mešanje praškastih proizvoda se izvodi u tzv. V mešaču ili u kocki koja rotira, pri relativno malom broju obrtaja 15-20 obrtaja/min, a najbolji efekti se postižu tako što se pri okretanju suda sa prahom kotrlja sloj preko sloja i time je moguće postići veoma kvalitetno mešanje i dva praškasta proizvoda sa razlikom u redu veličine koncentracije u smeši.

Slika. – V mešač

Slika. – Mešač u obliku kocke Praćenje i kontrola bioprocesa

Svaki biohemijski proces u sebi obuhvata fizičke, hemijske i biološke procese koji doprinose ukupnoj složenosti čitavog sistema. Da bi se takav proces odvijao uz maksimalnu proizvodnost neophodno je permanentno pratiti i kontrolisati sve parametre sistema.

Pored toga da parametri procesa moraju biti poznati u svakom trenutku, da moraju biti na optimalnoj vrednosti i da se moraju neprekidno analizirati, neophodno je kontrolisati i aseptičnost procesa. Praćenje parametara bioprcesa je neophodno da bi se:

a) kontrolisao smer odigravanja bioprocesa b) stekli iskustveni podaci o odigravanju bioprocesa c) odredilo vreme za prekidanje bioprocesa d) podesili okolni parametri sistema e) automatski vodili procesi f) izračunali nemerljivi parametri sistema Za kvalitetno praćenje odredjenog bioprocesa koriste se analitičke metode i merni

instrumenti. Pri korišćenju mernih instrumenata u biotehnologiji javljaju se dva veoma ozbiljna problema:

1. relativno mali broj mernih instrumenata se može pouzdano koristiti pri direktnom kontaktu sa fermentacionom tečnošću

2. većina mernih instrumenata ne može da se steriliše u bioreaktoru na povišenoj temperaturi

Merni instrumenti se dele na tri osnovne grupe: A. off-line instrumenti zahtevaju da se iz fermentacione tečnosti uzmu uzorci za

analizu, poput odredjivanja suve materije u biomasi ili hemijskog sastava biomase, što može trajati i po nekoliko dana, pa se ova vrsta instrumenata ne može koristiti za automatsku kontrolu bioprocesa.

B. On-line merni instrumenti takodje zahtevaju uzimanje uzoraka iz fermentacione tečnosti koji se potom analiziraju, ali relativno kratko, tako da se dobijeni rezultat može koristiti za kontrolu bioprocesa. Kao primer može poslužiti analiza gasne struje koja napušta bioreaktor, pomoću masenog spektrometra ili gasnog hromatografa.

C. In-line merni instrumenti su u direktnom kontaktu sa fermentacionom tečnošću, tako da daju kontinualan i brz signal, koji se direktno upotrebljava za kontrolu bioprocesa, poput merenja temperature, pritiska, pH, rastvorenog kiseonika, itd.

Pri upotrebi bilo kog in-line instrumenta, osnovni zadatak bihemijskog inženjera je da dobije informaciju o otpornosti instrumenta na povišenu temperaturu koja se javlja pri sterilizaciji, pre nego taj instrument ugradi u odredjenu opremu.

Svaki merni instrument koji na služi za merenje parametara u realnom vremenu, ima u sebi četiri osnovne komponente:

1) osetni element (senzor, davač) 2) pojačavač 3) predajnik 4) analizator Osetni element ili senzor daje informaciju o stanju u fermentacionoj tečnosti tako što

odredjenu promenu fizičke veličine transformiše u naponski ili strujni signal. Električni signal iz senzora je veoma slab po intenzitetu struje ili napona i praćen je šumom.

Da bi se šum smanjio i pojačao osnovni signal koristi se filter i pojačavač. Ovako kondicionirani signal se dalje prenosi predajnikom (transmiterom), do

analizatora koji konvertuje dobijeni signal u prepoznatljiv oblik, poput pH, temperature ili neke druge veličine. Merenje fizičkih veličina Temperatura se meri najčešće termoparovima, koji se sastoje od dve na vrhu spojene žice koje se nalaze u posebnom kućištu (metalnom omotaču). U zavisnosti od vrste metala od kojih su žice napravljene razlikuju se različiti tipovi termoparova, koji time i odredjuju svoju osetljivost odnosno opseg merenja. Najčešće korišćeni materijali su Ni-Cr, Pt-Pd i drugi. Osnovna karakteristika termoparova je da se u funkciji temperature na kojoj se stopljeni vrh nalazi na krajevima žica javlja odredjeni napon u mV. Kako se napon i temperatura nalaze u odredjenom odnosu to se na osnovu kalibracione krive ili matematičke zavisnosti definiše temperatura za odredjeni napon. Na tačnost merenja može uticati dužina termopara od mernog mesta do pojačavača, pa je u odredjenim uslovima neophodno uraditi posebnu zaštitu termoparova od uticaja drugih naponskih izvora. Pritisak je veoma važna veličina u biotehnologiji jer direktno utiče na rastvorljivost gasova i isparljivih jedinjenja. Za merenje se koriste manometri i pretvarači pritiska tzv. pressure transducers, koji vrednost pritiska preko specijalno izvedenih silicijumskih pločica pretvaraju u naponsku veličinu sa kojom se postupa kao i u slučaju merenja temperature. Masa ili zapremina tečnosti se meri najčešće direktnim merenjem težine, nivoa ili diferencijalnog pritiska koja se primenjuje za veće bioreaktore. Protok fluida se može meriti na više načina. Za gasovite fluide najčešće se koriste anemometri, rotametri, prigušne ploče, toplotni merači (hotwire anemometer). U zavisnosti od zahtevane preciznosti, primenjuje se jedan od navedenih instrumenata. Toplotni merači

protoka gasova rade na principu merenja razlike u otpornosti izmedju dva usijana vlakna koja zavisi od protoka gasa, na osnovu čega se iz kalibracionih krivih odredjuje vrednost protoka. Pored rotametara i prigušnih ploča za merenje protoka tečnosti se koriste i elektromagnetni merači protoka. Oni registruju promenu elektromagnetnog polja u cevovodu pri proticanju fluida i u zavisnosti od te promene odredjuje se vrednost protoka. Brzina obrtanja i snaga mešanja su značajne veličine u biohemijskom inženjerstvu. Brzina obrtanja se meri direktno na vratilu, izvan sterilne zone, pomoću tahometra, dok se snaga mešanja odredjuje vatmetrima, dinamometrima ili mernim trakama. Detekcija pene se odredjuje tako da se na dva mesta u reaktoru postave jedna elektroda u samoj fermentacionoj tečnosti a druga neposredno iznad nivoa tečnosti. Kada nema pene nema ni strujnog kola. U momentu pojave pene i druga elektroda se nadje u tečnosti čime se zatvara strujno kolo a time se vrši i detekcija pene. Optička gustina se može meriti spektrofotometrima i metoda je primenljiva za relativno mala zamućenja, a metoda je ograničena na bioprocese sa kvascima i bakterijama. Viskozitet fermentacionih tečnosti se može meriti direktno u reaktoru ili uzorkovanjem tečnosti. Prvi način je pogodniji ali nema širu primenu zbog konstruktivnih poteškoća koje se javljaju, dok se pomoću rotacionog viskozimetra u drugom slučaju odrejuje viskozitet tečnosti. Merenje fizičko-hemijskih veličina pH se meri standardnim elektrodama koje se nalaze u posebnim kućištima, tako da se može obaviti sterilizacija "in situ", bez posebnog uticaja na samu elektrodu. Rastvoreni kiseonik se takodje meri kiseoničnim elektrodama koje mogu biti različite konstrukcije, a pored merenja rastvorljivosti kiseonika, primenjuju se i za odredjivanje aeracionog kapacitetta bioreaktora i brzine respiracije mikroorganizama. Redoks potencijal daje informaciju o ravnoteži izmedju oksidacionih i redukcionih sredstava u fermentacionoj tečnosti. Merenje se vrši pomoću redoks elektrode koje su po pravilu sterilizabilne. Interpretacija podataka nije jednostavna jer se praktično u bioprocesu sistem nalazi u oksido-redukcionoj racnoteži tek na kraju procesa. U industrijskim uslovima redoks elektrode se koriste za merenje nivoa rastvorenog kiseonika ispod vrednosti koje se mogu meriti kiseoničnim elektrodama, jer je u aerobnim procesima oksido-redukcioni potencijal u suštini mera koncentracije rastvorenog kiseonika. Ugljen dioksid se meri sterilizabilnom elektrodom, jer je poznato da on inhibira rast mikroorganizama i mora se pratiti tokom procesa. CO2 elektroda se satoji od jedne pH elektrode potopljene u bikarbonatni rastvor, a od fermentacione tečnosti je odvojena polupropustljivom membranom, kroz koju CO2 prolazi difuzijom i menja pH puferskog rastvora. Jon selektivne elektrode koje su razvijene za specifične jone Na+, Ca2+, Mg2+, PO4

3-, NH4+, a

važni su za regulaciju metabolizma, na žalost nisu sterilizabilne i najčešće se koriste u pH opsegu koji nije interesantan za bioprocese, pa stoga i nemaju veću primenu.

Analiza gasova se vrši na ulazu i izlazu iz bioreaktora, u cilju odredjivanja potrošnje kiseonika i brzine stvaranja ugljen dioksida, koji se najčešće i analiziraju, premda se mogu vršiti i analize drugih gasova i isparljivih jedinjenja. Merenje biohemijskih veličina Od biohemijskih veličina najčešće se mere i analiziraju biomasa, koncentracija supstrata i proizvoda metabolizma u fermentacionoj tečnosti i intraćelijskih komponenti. Biomasa se meri direktnim merenjem suve biomase, brojanjem ćelija u jedinici zapremine, praćnjem koncentracije preko zamućenja ili analizom ćelijskih komponenti. U odredjenim uslovima moguće je povezati i potrošnju kiseonika i stvaranje ugljen dioksida sa mikrobnim rastom. Kontrola bioprocesa Tokom bioprocesa postoje tri veoma bitna problema vezana za kontrolu procesa, jer se koriste živi mikroorganizmi.

- ne postoje merni instrumenti koji obezbedjuju on-line kontrolu mnogih značajnih procesnih promenljivih

- u biosistemu postoje brojne složene i medjusobno povezane biohemijske reakcije uz uticaj fenomena prenosa

- mikrobne ćelije imaju sopstveni regulacioni sistem, koji je najčešće nezavisan od spoljnih promena uslova okoline

Kontrola bioprocesa se odvija kroz četiri osnovna elementa kontrolnog sistema: - bioproces - merni instrument - regulator - izvršni element

U kontroli se mogu koristiti manuelna, klasična automatska i kompjuterska kontrola. Manuelna kontrola je najprostija jer radnik sam prati vrednosti na mernim instrumentima i vrši odredjene radnje u cilju održavanja procesa na željenom nivou. Klasična automatska kontrola u bioprocesima je po principu on/off ili PID (proporcionalna, integralna, diferencijalna) kontrola. Kompjuterska kontrola zahteva i posedovanje posebnih programskih paketa programiranih za kontrolu procesa. Kao primer primene kompjuterske kontrole procesa poslužiće sistem koji je bio primenjen na proces sušenja bioloških suspenzija u fontansko-fluidizovanom sušioniku sa inertnim punjenjem. Da bi se proces sušenja uspešno odvijao bilo je potrebno pratiti sledeće parametre: - protok vazduha na dva posebna i nezavisna toka od ventilatora do sušionika - pad pritiska vazduha na tim vodovima - gradijent pritiska na dva mesta u sušioniku - protok kompresorskog vazduha za raspršavanje tečne faze - protok tečne faze koja se sušila - temperature ulaznih tokova vazduha - temperature na dva mesta u sušioniku i - temperature vazduha na izlazu iz sušionika.

Merenje protoka vazduha na dva nezavisna toka je vršeno standardnim kalibrisanim prigušnim pločama, čija je funkcija pada pritiska od protoka bila poznata (ili izračunata).

Merna mesta ispred i iza prigušnice su bila direktno povezana sa elektronskim

pretvaračima pritiska u naponski signal (pressure transducers). Tako transformisana veličina u obliku naponskog signala je vodjena do akvizicionog sistema. Da bi ovako dobijeni signal bio upotrebljiv neophodno je poznavati funkcionalnu zavisnost napona koji pretvarač daje od pritiska koji je detektovao. Ta zavisnost može biti data od proizvodjača ili se odredjuje direktno eksperimentalnom proverom, tako što se pretvarač pritiska paralelno poveže sa nekim standardnim meračem pritiska (najčešće i najpreciznije kosi U manometar) i onda izlaže različitim pritiscima, koji se mere na paralelno povezanom standardnom instrumentu, a u isto vreme beleže vrednosti napona koji elektronski pretvarač daje. Na taj način se formira baždarni dijagram napon-pritisak U=f(P) (Uobičajene vrednosti od 0 do 10V,a kada je umesto naponskog signala odziv pretvarača pritiska strujni signal onda je uobičajeni opseg od 4 do 20 mA, pri čemu su u industrijskim uslovima ti odzivi i najčešće strujni, jer se onda mogu preneti i na veću daljinu, bez bojazni od uticaja okoline, dok se sa naponskim signalima može raditi na relativno kratkom rastojanju, upravo zbog uticaja okoline na tačnost očitavanja signala).

Svi ostali signali, u tretiranom sistemu, koji služe za merenje gradijenata pritiska ili apsolutnih vrednosti pritiska na bilo kom mernom mestu su izbaždareni na identičan način. Tako dobijeni signali se prethodno filtriraju i pojačavaju, a onda dovode na panel na kome se povezuju na odredjena mesta koja su definisana (adrese priključka), a koja programski paket, koji je instaliran na računaru, prepoznaje. Pri aktiviranju programskog paketa ta priključna mesta su definisana i dodeljene su adrese svakog od potencijalnih priključaka. Time se uspostavlja prva komunikacija sa programskim paketom. Pošto se zna koja je fizička veličina merena, a njen električni signal je doveden na odredjeno mesto na panelu, računar ga prepoznaje (Naravno računar "ne zna" koja se fizička veličina meri već samo detektuje na odredjenoj adresi vrednost električnog (u razmatranom sistemu naponskog) signala). Tako dovedeni signali do priključnog panela, dalje prolaze kroz filtre, da bi se smanjio šum, i do pretvarača (A/D konvertora) koji analogne vrednosti signala pretvara u digitalni signal, koji računar prepoznaje. Takav signal i informacija o njegovoj veličini dolazi do programskog paketa. Današnji programski paketi u sebi sadrže mnogobrojne opcije koje se mogu koristiti u cilju načina predstavljanja merenih veličina, njihovog ažuriranja i korišćenja u cilju regulacije procesa. U programskom paketu se definišu sve poznate funkcionalne zavisnosti ili dobijene eksperimentalnim putem, tako da se na osnovu signala sa prigušne ploče koji je od pritiska pretvoren u napon, pa potom u digitalnu veličinu na kraju može izraziti koliko to, na primer, m3/h vazduha protiče našim cevovodom i mi tu veličinu možemo pratiti na monitoru, a u isto vreme ažurirati u odredjenoj bazi podataka. Savremeni programski paketi u znatnoj meri olakšavaju merenje temperature, time što je potrebno samo definisati tip termopara (na primer K-tip, R-tip, J-tip itd, a što je funkcija materijala od koga je napravljen i mernog opsega koji meri ) i pravilno priključiti termopar na za to predvidjena mesta na panelu, a sam paket u sebi sadrži baždarne krive za odredjene tipove i direktno daje informaciju o temperaturi u kojoj se nalazi vrh termopara (ipak, praktičan savet je da uvek pri povezivanju akvizicionog sistema treba eksperimentalno proveriti tačnost, da bi se predupredile greške tokom merenja). Kontrola procesa se vrši na osnovu podataka koji su prikupljeni sa sitema a prema raspoloživim izvršnim organima koji tu kontrolu moraju sprovoditi. U biohemijskim procesima izvršni organi su pre svega grejači, ventili i otpornici kojima se regulišu temperature, protoci i brojevi obrtaja. Da bi se izvršni organi aktivirali potrebno je da poseduju regulatore koji dobijaju odredjene signale prema kojima dalje izvršavaju odredjenu radnju do željenog nivoa. Signali koji mogu doći do regulatora su ili analogni ili digitalni. Konforniji je rad sa anlognim signalima ali su regulatori povezani sa izvršnim organima, u ovom slučaju, daleko skuplji u odnosu na regulatore koji primaju digitalne signale (na primer električne sklopke, koje reaguju na sistem uključeno-isključeno u odnosu na znatno veću cenu cenu anlognog regulatora otvorenosti ventila). Prema prirodi izvršnog organa obezbedjuje se i tip signala koji izlazi iz akvizicionog sistema. Za jednostavniju kontrolu temperature se mogu koristiti digitalni izlazni signali koji se slično kao kod ulaza signala, sa odredjene adrese vode ka odgovarajućim relejima koji aktiviraju električne sklopke, koje uključuju ili isključuju grejače i time regulišu temperaturu na odredjenom nivou.