Download pdf - Določanje anionov v realnih vzorcih z ionsko kromatografijo · Svetovna proizvodnja tara je 5,5 milijonov ton, od tega je 1/3 namenjena za hrano ljudi, ki ţivijo v tropskih predelih

Anka Hotko

Določanje anionov v realnih vzorcih z ionsko

kromatografijo

Diplomsko delo

Maribor, september 2014

Določanje anionov v realnih vzorcih z ionsko kromatografijo

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Anka Hotko

Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemija

Predvideni strokovni naslov: diplomirana kemičarka (UN)

Mentor: doc. dr. Mitja Kolar

Somentor: doc. dr. Janja Kristl

Maribor, september 2014

Določevanje anionov v realnih vzorcih z ionsko kromatografijo

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Web of Knowledge, Web of Science

Gesla: Število referenc

Ions: chlorite, oxalate, nitrate 26

Taro 18

Determination ions with IC 12

Vir: COBIB-COBISS (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)

Gesla: Število referenc

Instrumental Analysis 2

Liquid and Ion Chromatography 8

Separation 1

HPLC 2

Statistics for analytical chemistry 1

Skupno število pregledanih člankov: 56

Skupno število pregledanih knjig: 14

Maribor, september 2014 Anka Hotko


Zahvala

Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Mitju Kolarju ter

somentorici doc. dr. Janji Kristl s Fakultete za kmetijstvo

in biosistemske vede za vso pomoč, nasvete in vodenje

skozi eksperimentalni del.

Zahvaljujem se tudi Andreju Mergedušu za nasvete in

pomoč pri delu, ter celotnemu kolektivu Analizne kemije

na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo.

Največja zahvala gre mojemu očetu, ki mi je dajal pogum

in brez katerega uspeh ne bi imel pomena.

Zahvaljujem se mami za potrpljenje.


DOLOČEVANE ANIONOV V REALNIH VZORCIH Z IONSKO

KROMATOGRAFIJO

Povzetek

Namen diplomskega dela je bila optimizacija analizne metode po ekstrakciji, s katero smo

določili vsebnost kloridnih, nitratnih in oksalatnih anionov v ekstraktu tara (Colocasia

esculenta (L.) Schott)) s pomočjo ionske kromatografije (IC).

Ekstrakcijo smo optimirali glede: načina izvedbe, temperature in učinkovitosti Tween-

reagenta.

Za realni vzorec, ekstrakt tara, smo študirali sestavo mobilne faze in sicer tako, da smo

dobili zadovoljivo ločljivost pikov, ki jih ţelimo kvantitativno ovrednotiti.

Analizno metodo smo tudi delno validirali, saj smo določili: linearnost, mejo zaznavnosti,

mejo določljivosti, natančnost, pravilnost, vpliv matrice in časovno stabilnost standardov.

V realnih vzorcih tara, smo določili vsebnost kloridnih, nitratnih in oksalatnih ionov v

koncentracijskem območju od 197 mg/kg do 2 930 mg/kg SS, od 11 mg/kg do 10 868

mg/kg SS in od 761 mg/kg do 2 680 mg/kg SS.

Ključne besede: IC, anioni, validacija, realni vzorci

UDK: 544.354-128.2(043.2)


Determination of anions in real samples by ion chromatography

Summary

The purpose of the diploma thesis was the optimisation of analytical method, for the

determination of chloride, nitrate and oxalate anions content in taro (Colocasia esculenta

(L.) Schott) extracts usng ion chromatography (IC).

The extraction was optimised with regard to manner of performance and extraction

temperature. Teh efficiency of Tween 80-reagent for the extraction of nitrate ions was also

studied.

We optimised the composition of the mobile phase for a real extract of taro sample in order

to obtain complete separation od chromatographic peaks for anions of interest.

The analytical method was also partly validated. We determined: linearity, limit of

detection and quantification, precision, trueness, matrix influence and temporal stability of

standard solutions.

The contents of chloride, nitrate and oxalate ions were in the ranges from 197 mg/kg to

2 930 mg/kg DM, 11 mg/kg to 10 868 mg/kg DM and 761 mg/kg to 2 680 mg/kg DM,

respectively

Key words: IC, anions, validation, real samples

UDK: 544.354-128.2(043.2)


Kazalo

1 Uvod .............................................................................................................................. 14

2 Teoretični del ................................................................................................................. 15

2.1 Taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) .................................................................. 15

2.1.1 Genetski izvor tara .......................................................................................... 15

2.1.2 Botanični opis tara .......................................................................................... 15

2.1.3 Kormus tara .................................................................................................... 16

2.1.4 Sestava tara ..................................................................................................... 17

2.1.5 Priprava tara .................................................................................................... 18

2.2 Vloga anionov v rastlinskih vzorcih ...................................................................... 19

2.2.1 Kloridni ion ..................................................................................................... 19

2.2.2 Nitratni ion ...................................................................................................... 21

2.2.3 Oksalatni ion ................................................................................................... 23

2.3 Ekstrakcijski postopki za izolacijo anionov ........................................................... 25

2.3.1 Dejavniki, ki vlivajo na hitrost ekstrakcije: .................................................... 25

2.4 Ionska kromatografija ............................................................................................ 27

2.4.3 Kromatografska separacija ............................................................................. 29

2.4.4 Sestavni deli ionskega kromatogrfa ................................................................ 31

2.5 Osnove statistike in statistični testi ........................................................................ 37

2.5.1 Osnovni statistični parametri .......................................................................... 37

2.5.2 Osnovni statistični testi in merilna negotovost ............................................... 37

2.5.3 Linearna regresija ........................................................................................... 39

2.6 Validacija ............................................................................................................... 41

2.6.1 Natančnost ...................................................................................................... 41

2.6.2 Pravilnost ........................................................................................................ 41


2.6.3 Meja zaznavnosti (LOD) in meja določljivosti (LOQ)................................... 41

2.6.4 Linearnost in območje metode........................................................................ 42

2.6.5 Koeficient kvalitete ......................................................................................... 42

2.6.6 Stabilnost ........................................................................................................ 43

3 Eksperimentalni del ....................................................................................................... 44

3.1 Reagenti ................................................................................................................. 44

3.2 Instrumenti ............................................................................................................. 45

3.3 Analizni postopki ................................................................................................... 46

3.3.1 Ekstrakcija ...................................................................................................... 46

3.3.2 Razvoj metode na IC ...................................................................................... 47

4 Rezultati in diskusija ..................................................................................................... 50

4.1 Ekstrakcija .............................................................................................................. 51

4.1.1 Vpliv postopka ................................................................................................ 51

4.1.2 Vpliv temperature ........................................................................................... 52

4.1.3 Vpliv Tween 80-reagenta ............................................................................... 53

4.1.4 Izkoristek ekstrakcije ...................................................................................... 53

4.2 Vpliv mobilne faze na obliko kromatograma in čas analize .................................. 55

4.2.1 Sestava mobilne faze ...................................................................................... 55

4.2.2 Kvalitativna določitev anionov v vzorcu s pomočjo standardne raztopine .... 57

4.2.3 Vpliv pretoka na čas analize in obliko kromatograma ................................... 58

4.3 Validacija ............................................................................................................... 61

4.3.1 Natančnost ...................................................................................................... 61

4.3.2 Pravilnost ........................................................................................................ 66

4.3.3 Meja zaznavnosti (LOD) in meja določljivosti (LOQ)................................... 68

4.3.4 Linearnost in delovno območje ...................................................................... 70

4.3.5 Stabilnost ........................................................................................................ 75


4.3.6 Grubbs-Beckov test ........................................................................................ 77

5 Zaključek ....................................................................................................................... 78

6 Literatura ....................................................................................................................... 79

7 Priloge ........................................................................................................................... 84

7.1 Kromatogram standardne raztopine ....................................................................... 84

7.2 Kromatogram vzorca 52 A ..................................................................................... 86


Seznam tabel

Tabela 1: Primerjava ekstrakcije s stresalnikom in z »Ultra-Turraxom« ............................. 51

Tabela 2: Vpliv priprave na ekstrakcijo ................................................................................ 52

Tabela 3: Vpliv temperature na ekstrakcijo .......................................................................... 52

Tabela 4: Tween 80-reagent ................................................................................................. 53

Tabela 5: Dodatek anionov za učinkovitost ekstrakcije ....................................................... 54

Tabela 6: Učinkovitost ekstrakcije ....................................................................................... 54

Tabela 7: Stabilnostni parametri analitske metode ............................................................... 56

Tabela 8: Ponovljivost standardnih raztopin ........................................................................ 61

Tabela 9: Ponovljivost vzorca .............................................................................................. 62

Tabela 10: Obnovljivost ....................................................................................................... 63

Tabela 11: Pravilnost ............................................................................................................ 67

Tabela 12: LOD in LOQ za kloridne ione ............................................................................ 68

Tabela 13: LOD in LOQ za nitratne ione ............................................................................. 69

Tabela 14: LOD in LOQ za oksalatne ione .......................................................................... 69

Tabela 15: Umeritvena krivulja za kloridne ione ................................................................. 71

Tabela 16: Homoscedastičnost kloridnih ionov ................................................................... 72

Tabela 17: Umeritvena krivulja za nitratne ione .................................................................. 73

Tabela 18: Homoscedastičnost nitratnih ionov ..................................................................... 73

Tabela 19: Umeritvena krivulja za oksalatni ion .................................................................. 74

Tabela 20: Homoscedastičnost oksalatnih ionov .................................................................. 75


Seznam slik

Slika 1: Colocasia esculenta (L.) Schott var. Esculenta ...................................................... 16

Slika 2: Raznolikost kultivarjev tara..................................................................................... 17

Slika 3: Vstop klora v rastlino .............................................................................................. 20

Slika 4: Resonančne strukture nitratnega iona...................................................................... 21

Slika 5: Razporeditev dušika v tleh ...................................................................................... 22

Slika 6: Oksalatna kristala: raphide in druse ........................................................................ 24

Slika 7: Shema ekstrakcije trdno-tekoče ............................................................................... 26

Slika 8: Ločitev komponent .................................................................................................. 30

Slika 9: Eluiranje komponent ............................................................................................... 30

Slika 10: Shema enokolonskega sistema .............................................................................. 34

Slika 11: Shema dvokolonskega sistema .............................................................................. 35

Slika 12: Samo-regeneracijski supresor Dionex ASRS®-ULTRA ....................................... 35

Slika 13: Linearna regresija .................................................................................................. 39

Slika 14: Ionski kromatograf ProStar (Varian®) in CD20 Dionex® ................................... 46

Slika 15: Kromatogram vzorca 32 A .................................................................................... 50

Slika 16: Kromatogram vzorca 35 A mobilne faze 1 ........................................................... 55

Slika 17: Kromatogram vzorce 35 A mobilne faze 2 ........................................................... 56

Slika 18: Kromatogram standardne raztopine 4 ................................................................... 57

Slika 19: Kromatogram vzorca 37 A pri pretoku 0,8 mL/min ............................................. 58




Seznam grafov

Graf 1: Umeritvena krivulja za kloridne ione ....................................................................... 71

Graf 2: Umeritvena krivulja za nitratne ione ........................................................................ 72

Graf 3: Umeritvena krivulja za oksalatne ione ..................................................................... 74

Graf 4: Časovna stabilnost kloridnih ionov .......................................................................... 76

Graf 5: Časovna stabilnost nitratnih ionov ........................................................................... 76

Graf 6: Časovna stabilnost oksalatnih ionov ........................................................................ 77


Uporabljeni simboli in kratice

A površina pod kromatografskim vrhom

Ac presek kolone

n mnoţina (mol)

M mol/L

X interval zaupanja

tr retencijski čas

tm čas, ki ga molekula prebije v mobilni fazi

t`r čas, ko se molekula nahaja na stacionarni fazi

k` masno porazdelitveno razmerje ali kapacitivni faktor

K porazdelitveni koeficient

l dolţina kolone

h proporcionalni faktor in višina teoretskega poda

n število teoretskih podov in število meritev

H višina efektivnega teoretskega poda

R ločljivost ali resolucija

Wi širina vrha komponente i

G tab odčitana G vrednost

G izr izračunana G vrednost

povprečna masna koncentracija

povprečje meritev

i indeks ponovitev

yi izmerjen odziv

yî odziv, ki ga predvideva model

povprečje izmerjenih odzivov


s(y/x) standardni odmik od y-ostankov

sb1 standardni odmik naklona

sb0 standardni odmik odseka

b1 naklon linearne premice

b0 odsek linearne premice

signal slepega vzorca

standardni odmik slepega vzorca

( ) retencijski čas komponente A

( ) retencijski čas komponente B

u hitrost mobilne faze

Rd odzivni faktor detektorja

Vr retencijski volumen

Vm prazen volumen, ki je na razpolago molekulam topila

2n diploidno št. kromosomov

cm koncentracija mobilne faze

cs koncentracija stacionarne faze

N število efektivnih teoretskih podov

s standardni odmik (SD)

t enostranski/obojestranski test z (n-1)/(n-2) prostostnih stopenj

tizr izračunan koeficient

ttab tabelarični koeficient, ki je lahko enostranski ali obojestranski

x0 prava vrednost

r korelacijski faktor

y enačba premice y na x

p. a čistost kemikalije


Grški simboli

masna koncentracija (g/L)

ʋ varianca

α selektivnost in nivo zaupanja

σ standardni odmik

η izkoristek

T temperatura

Kratice

IC ionska kromatografija

G Grubbsov test

S/DVB stiren-divenilbenzen

LOD meja detekcije

LOQ meja kvantitativne določitve

RSD relativni standardni odmik

SD standardni odmik

QC koeficient kvalitete

BIAS ± odstopanje od 100 %

SS suha snov

S/N odziv/šum


14

1 Uvod

Taro ima dandanes pomembno vlogo v azijski, avstralski in novozelandski prehrambni verigi.

Svetovna proizvodnja tara je 5,5 milijonov ton, od tega je 1/3 namenjena za hrano ljudi, ki

ţivijo v tropskih predelih sveta. Energijska vrednost tara je 390 kcal/100 g SS s 6 %

beljakovin. Glavna ovira pri uţivanju tara so oksalatni kristali, ki pospešujejo nastanek

ledvičnih kamnov. Prekomerno uţivanje oksalatov predstavlja strupenost, vendar se vsebnost

oksalatov s kuhanjem zniţuje. [1]

S Fakulteto za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru smo se odločili, da bomo

analizirali kormuse (korenaste gomolje) tara, ter primerjali vsebnost nekaterih hranil po

celotnem gomolju. Taro se večinoma razmnoţuje vegetativno, redko cveti in razvije seme.

Za vegetativno razmnoţevanje se uporablja zgornji del kormusa skupaj z listnimi peclji. To je

najmlajši del kormusa, iz katerega takoj po zasaditvi izrastejo korenine in sluţi za prehrano v

zgornjih stadijih razvoja rastline.

Zanimalo nas je tudi, ali razmnoţevalni material vsebuje snovi, ki ga dodatno ščitijo. Ta

zaščita pa so večinoma oksalatni kristali, ki povzročajo akridnost.

Vzorce smo primerno shranili, da so lahko počakali na čas ekstrakcije in analize, ki se je

izvajala na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo.

Da bi lahko kvantitativno določili hranila v gomolju, smo morali vzorec ustrezno pripraviti in

razviti metodo določevanja anionov. Pri predpripravi vzorca prihaja do največjih napak. Da bi

vsa hranila iz rastlinskih tkiv spravili v ustrezno obliko, smo izvedli trdno-tekočo ekstrakcijo.

Ker tako pripravljeni vzorci še vedno vsebujejo veliko trdnih delcev, ki lahko blokirajo oz.

zamašijo kolone ali ovirajo detekcijo, uporabljamo predkolone.

Analizirali smo nitratne, kloridne in oksalatne ione. Zraven omenjenih anionov se v ekstraktu

nahajajo še H2PO4-, SO4

2- in drugi anioni.

Na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru je potekal razvoj ekstrakcijske

metode, medtem ko je na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo v Mariboru potekal

razvoj IC metode in analiza vzorcev.


15

2 Teoretični del

Teoretični del zajema opis realnega vzorca in pomembnejših anionov, ki jih analiziramo, opis

posameznih metod in aparature, ki nam omogočajo kvalitativno in kvantitativno določevanje

hranil v rastlini.

2.1 Taro (Colocasia esculenta (L.) Schott)

2.1.1 Genetski izvor tara

Taro je skupno ime za jedilne kačnikovke, ki predstavljajo pomembno osnovno ţivilo v

mnogih delih sveta, zlasti v Aziji in na Pacifiških otokih. [3]

Taro kot enokaličnica pripada druţini Araceae (kačnikovke), poddruţini Colocasioideae in

rodu Colocasia. [4] Druţina Araceae je sestavljena iz najmanj 100 rodov in več kot 1500 vrst.

[5] Zaradi velike genetske in morfološke raznolikosti obstaja precej nejasnosti v taksonomiji

tega rodu. Kultiviran taro je uvrščen v vrsto Colocasia esculenta, a se vrsta zaradi

polimorfnosti običajno deli na več botaničnih podvrst. Viri navajajo najpogosteje dve:

Colocasia esculenta (L.) Schott var. esculenta, imenovana 'dasheen', in Colocasia esculenta

(L.) Schott var. antiquorum (Schott) Hubbard & Rehder, imenovana 'eddoe'. Taro tipa

'dasheen' ima en velik centralni gomolj (korenasti gomolj oz. kormus) in včasih manjše

stranske gomolje ali pa so le-ti odstotni. Taro tipa 'eddoe' pa ima zelo majhen centralni gomolj

in zelo izrazite oz. odebeljene stranske gomolje, ki izraščajo iz centralnega gomolja. [4]

Najnovejši podatki o domestifikaciji in izvoru kaţejo, da obstajata dva različna genska bazena

oz. centra izvora tara: eden v jugovzhodni Aziji in eden v Melaneziji. [6, 7] To hipotezo je

podprlo več avtorjev z analizo izoencimskih variacij. [8, 9, 10]

Študije so pokazale, da se taro loči na dipolno, tripolno ali tetraploidno število kromosomov z

osnovo x = 14. Genske razlike se kaţejo tudi v različnih vsebnostih beljakovin, antocianov, v

intenzivnosti barve in času zrelosti. [5] Genotipi, ki so diploidni (2n = 28), so divji in v večini

cvetijo ter razvijejo seme. V Aziji in Oceaniji so kultivarji tipa 'dasheen' običajno diploidi (2n

= 28), medtem ko so kultivarji tipa 'eddoe' večinoma triploidi (3n = 42). [6]

2.1.2 Botanični opis tara

Taro je trajnica, visoka pribliţno 0,5–1,5 m. Rastlina se deli na osrednji oz. centralni korenasti

gomolj (zaradi specifične zgradbe običajno uporabljamo naziv kormus), ki najpogosteje leţi

tik pod površino zemlje, korenine, ki izraščajo iz korenastega gomolja, in liste, ki rastejo na

vrhu kormusa. Korenine izraščajo lateralno (izjema so sejanci, rastline, ki se razvijejo


16

neposredno iz semen). Listni peclji so lahko različno dolgi in različnih barv. Listne ploskve

imajo srčasto ali ščitasto obliko in so različne barve. Dolge so med 30 in 80 cm ter široke do

50 cm. Novi listi se stalno obnavljajo v osrednjem delu, medtem ko starejši listi na obrobju

odmirajo. Maksimalna razvitost listov je v času cvetenja. Ko se taro pribliţuje zrelosti, to je

najpogosteje med sedmim in devetim mesecem, listni peclji postajajo krajši, listne ploskve pa

manjše. Barva listov se lahko giblje od svetlo zelene, rumene, rdeče, do temno vijoličaste, ki

daje rastlinam videz 'črne' barve. Barva je genetsko kontrolirana, vsaj delno pa je odvisna tudi

od starosti rastline in okolja. [11]

Taro (Slika 1) je škrobno bogata rastlina, ki tehta med 1 in 1,5 kg in je glavni vir hrane za

ţivali, predvsem za prašiče. [12]

Slika 1: Colocasia esculenta (L.) Schott var. Esculenta

2.1.3 Kormus tara

Kormus je najpomembnejši del rastline, ki se uporablja za prehrano. Je velik (v glavnem)

podzemni organ, v katerem se nahajajo škrob in ostale hranilne snovi. Večinoma je

podolgovato elipsaste oblike. Sestavljen je iz dveh glavnih delov: zunanjega periderma oz.

korteksa in notranjega parenhimskega tkiva. Zunanji del je običajno rjavkaste barve in sestoji

iz peridermalnega tkiva. Lahko je bolj ali manj gladek, luskast ali vlaknast. Na njem so vidni

ostanki izraščanja listov mesečaste oblike. Iz števila teh ostankov je moţno določiti starost

kormusa. Korteks je del med peridermalno plastjo in začetkom izraščanja korenin. Tako

korteks kot tudi osrednji del kormusa sta sestavljena iz parenhimskega tkiva, napolnjenega s


17

škrobom. V notranjosti se nahajajo tudi različna vlakna, ki so pri nekaterih genotipih lahko

obarvana. Zreli kormus je različnih velikosti. Barva parenhima kormusa je lahko zelo

različna, odvisno od kultivarja: od bele, rumene, oranţne, roţnate, rdeče do purpurno rjave,

lahko pa je tudi večbarven (Slika 2). [13]

Slika 2: Raznolikost kultivarjev tara

Avtor: Andrej Mergeduš

2.1.4 Sestava tara

Čeprav imajo mnoge rastline kristale kalcijevega oksalata v svojih nadzemnih in podzemnih

delih, so po tem najbolj znane kačnikovke, saj imajo zelo visoke koncentracije oksalatov v

koreniki in stebelnih gomoljih. Oksalatni kristali se med seboj razlikujejo po obliki in

velikosti; taro ima npr. 120 000 kristalov kalcijevega oksalata/cm3. [3]

Koncentracija kalcijevega oksalata se v nekuhanih gomoljih močno razlikuje (265,2–552,5

mg/100 g SS). [14] Vrednost oksalata v sveţem taru je 278–574 mg/10g sveţe snovi, kar

predstavlja ţe mejno vrednost dnevnega vnosa. [15]

Dokumentirano je tudi, da se vsebnost oksalatov spreminja z vrstami in med sortami. Oksalna

kislina in njene soli imajo škodljive učinke na ljudi, kot je zmanjšana absorpcija kalcija in

nagnjenost k nastanku ledvičnih kamnov. [16]

Taro ima dobre prehranske lastnosti, vendar ni prehransko popolna hrana. Izgube mineralov

in vitaminov so velike, kadar taro obdelamo. Čeprav vsi načini kuhanja zniţujejo hranilno

vrednost, je kuhanje nujno potrebno pred uţivanjem. Taro vsebuje veliko ogljikovih hidratov

in malo maščob ter beljakovin. Sveţe korenike so sestavljene iz pribliţno 69 % vlage, 25 %


18

škroba, 1,5 %, prehranskih vlaknin, 1,1 % beljakovin in 1 % sladkorja. Vlaknine sestavljajo

celične stene rastlin in stenskih komponent ter vlaken. [17]

Uţitni gomolji so znani po lahko prebavljivem škrobu, veliki količini proteinov, vitaminu C,

tiaminu, prehranskih vlakninah, nikotinski kislini in vitaminu B2. Listi so tudi pomemben vir

beljakovin in vitaminov. [16]

V taru se nahajajo aminokisline, med njimi tudi esencialne aminokisline. Te so v kormusih

razmeroma visoko zastopane, kar pomeni, da so kormusi tara bolj zaţeleni v prehrani kot

druge tropske gomoljevke. [14]

2.1.5 Priprava tara

Prisotnost kristalov kalcijevega oksalata v koreniki in listih tara je povezana z bolečim

draţenjem v ustih in na koţi, kadar ljudje pridejo v stik z ţivilom. [18] Večina tarovih

kultivarjev ima oster okus in lahko povzroči otekanje ustnic, ust in grla, če se le-ta uţije

surov. To akridnost povzročajo igličasti kristali kalcijevega oksalata, ki z lahkoto predrejo

mehko koţo. Vsi uţitni deli tara povzročajo isto reakcijo, vendar se ta učinek zmanjša s

kuhanjem ali pečenjem. [19] V ţivilu se zelo zniţa koncentracija topnih oksalatov, kadar ga

izpostavimo toplotni obdelavi pri povišani temperaturi. Vrednost topnih oksalatov se v tkivu

zmanjša v povprečju za 56 %, če ga kuhamo 40 min, ker se topni oksalati ekstrahirajo v

topilo. [20] Kuhanje lahko predstavljajo: blanširanje, parjenje, dušenje, cvrtje in kuhanje pod

povečanim pritiskom. Prekuhavanje, namakanje in fermentacija hrane lahko zmanjšajo le

topne oksalate v ţivilu. Pri peki ţivila se koncentracija oksalatov zaradi izparele vode iz ţivila

še dodatno poviša. [19] Učinke kuhanja na vsebnost oksalatov je potrebno še dodatno

raziskati, da lahko podamo napotke ljudem, ki jim taro predstavlja glavni vir hrane, in jih

opozorimo glede škodljivih učinkov uţivanja neprekuhanega tara. [20]


19

2.2 Vloga anionov v rastlinskih vzorcih

2.2.1 Kloridni ion

Soli kloridov so najpogostejše in najbolj komercialno dostopne. Zanje je značilno, da so topne

in se pogosto uporabljajo kot vir kovinskih kationov v raztopini (npr. AgCl, KCl). [20]

Rastline vedno sprejmejo klor iz talne raztopine kot kloridni anion (Cl-). Praviloma v tla pride

z NaCl kot s postransko sestavino nekaterih gnojil ali s padavinami. [22] Glavni vir klora se v

tleh nahaja v obliki topnih soli, kot so: KCl, NH4Cl, NaCl. Anorganska hranila so rastlinam

dostopna le v obliki ionov. [23] Kloridni ione se praviloma kopičijo v suhih, vročih in dolgo

namakanih tleh. [22] Kloridni ioni ne tvorijo kompleksov in ne kaţejo velike afinitete do

adsorpcije na talne koloide. [24] Manjša adsorpcija klorida poteka na pozitivnih glinenih

delcih, kadar so tla bazična ali nevtralna. Vezava prihaja prek elektrostatičnih privlačnih sil.

Na podoben način se veţeta tudi NO3- in ClO4

-, ki predstavljata konkurenco pri vezavi na

talne delce. [23]

Kloridni ion vstopa v rastlino pasivno ali aktivno, prek koreninskih laskov – plazemske

membrane (Slika 3). Rastline, ki so sposobne sprejeti v vakuole veliko kloridnih ionov,

imenujemo halofitske rastline. V vakuolah se lahko kopiči tudi do 500 mM kloridnih ionov.

Višje koncentracije kloridnih ionov vsebujejo starejši listi. Da imajo mlajši listi manj

kloridnih ionov, je posledica hitre rasti s stalnim črpanjem talne raztopine in z nizko

transpiracijo. Kloridni ioni predstavljajo esencialno mikrohranilo za višje rastline in se po

rastlini transportirajo prek osmoze. V citoplazmi se vključuje v delovanje encimov ter

sodeluje pri stabilizaciji membranskega potenciala in električne razdraţljivosti. Kloridni ioni

so rastlinskim celicam dostopni prek asimilacijskega toka, ki poteka prek ksilema. Da pride

ion do ksilemskega tkiva, ločimo dva načina: citoplazemski in ekstracelularni; prevladuje

citoplazemski. [24]

Kloridni ioni nadzirajo rast nekaterih patogenih organizmov in s tem preprečuje nastanek

bolezni. Za razliko od drugih mikrohranil klorid ni toksičen, če se kopiči v visoki

koncentraciji. [25]

Kloridni ion deluje kot protiion za kation, kadar prihaja do izmenjave hranil v celici.

Koncentracija kloridnih ionov se od rastline do rastline spreminja in variira med 0,13–5,7

mg/g SS. Kadar koncentracija NO3-

v rastlini narašča, se koncentracija kloridnih ionov


20

linearno zmanjšuje, saj bo rastlina raje vsrkala nitratni ion kakor kloridnega. To je še posebej

vidno pri rastlinah, ki so občutljive na zasoljena tla. [23]

Slika 3: Vstop klora v rastlino

Vstop

Cl- v

rastlino

Izstop iz

rastline


21

2.2.2 Nitratni ion

Vsi nitrati so v vodi dobro topni, zato pogosto zaidejo v podtalnico in pitno vodo. Zdravju

sicer niso škodljivi, če se nahajajo nizkih koncentracijah. V obliki produktov redukcije,

nitritov, pa lahko preidejo v prebavni trakt, kjer povzročajo nastanek strupenega

methemoglobina, skupaj s sekundarnimi amini pa nastanejo kancerogeni nitrozamini. [26]

Nitrat (Slika 4) je najpomembnejši vir mineralnega dušika za rastline, ki rastejo v aerobnih

tleh. Zraven nitrata predstavlja vir dušika še NH4+. Rastline ju pridobivajo iz talne raztopine z

absorpcijo čez plazemsko membrano, povrhnjico in skorjo korenin. Ko se adsorbira NO3-, je

zmanjšana adsorpcija NH4+. V rastlinskih koreninah se kopiči zelo malo NO3

-, neabsorbirani

ioni pa potujejo po ksilemu do drugih zelenih delov rastlin. Največ se ga adsorbira v

poganjkih. Najvišja koncentracija NO3- se kopiči v vakuoli. [27]

Amonijev in nitratni ion se adsorbirata na aktivni način pri zelo nizki talni koncentraciji. [28]

Koliko nitrata se bo vsrkalo v rastlino, ni odvisno samo od razpoloţljivosti v tleh, ampak je

regulirano tudi s stopnjo rasti, fotosintezo in z drugimi procesi. [29]

Oba dušikova iona (NH4+, NO3

-) sta pomembna vira dušika za rastlino. Amonijeva oblika

prevladuje v tleh, ki so bogata z vodo, saj je NO3- podvrţen izpiranju v podtalnico in se

njegova koncentracija z globino zmanjšuje. [30]

Razpoloţljivi dušik za rastline je po tleh razporejen zelo heterogeno (Slika 5), kar je glavni

razlog za pomanjkanje hranila. Talna zaloţenost s hranili se spreminja dnevno in sezonsko,

kar vpliva na rast in razvoj rastlin. [23]

Slika 4: Resonančne strukture nitratnega iona

Kopičenje nitratov v rastlinah je pomembno, saj vplivajo na zdravje ljudi in ţivali. Določeni

predeli rastline vsebujejo zelo visoke koncentracije nitrata. Ugotovljeno je bilo, da je lahko do

60 % celotnega dušika v rastlini v obliki NO3-. Koncentracija nitrata po rastlini, med sortami

in znotraj istih sort zelo variira. Najvišja koncentracija nitratov je v starih listih. [31]


22

Anorganski dušikovi ioni v rastlinskih celicah sluţijo kot hranilne snovi, regulirajo osmozo in

signalizacijo ter sluţijo kot rezervna hrana. Če ni dovolj dušika na zalogi, so te funkcije

onemogočene. Dušik je zelo pomemben element, saj se nahaja v vseh delih rastlin ter sodeluje

pri mnogih reakcijah in procesih. Najdemo ga v aminokislinah, amidih, proteinih, nukleinskih

kislinah, nukleotidnih koencimih, heksoaminih. V študiji absorpcije dušika v paradiţnik je

bilo dokazano, da je 50 % dušika v rastlini v obliki amonijevega iona, čeprav je ta ion

predstavljal le 10 % razpoloţljivega dušika v tleh. Rastlina ima različno afiniteto do

nitratnega in amonijevega iona, glede na čas sprejema v dnevu. [28] Vendar je rast mnogih

rastlin oslabljena, kadar je glavni vir dušika izključno v obliki amonijevega iona (NH4+).

[32]

Koncentracija dušika močno vpliva na koncentracije drugih hranilnih snovi in mineralnih

ionov v rastlini. Koncentracija fosforja se poveča, kadar je prevladujoči vir dušika NH4+. Ob

povišani koncentraciji NO3-, pa se koncentracija fosforja v koreninah zniţa. [33]

Slika 5: Razporeditev dušika v tleh

[34]


23

2.2.3 Oksalatni ion

Oksalatne soli so praviloma slabo topne ali netopne v vodi. Izjema so soli, ki vsebujejo

alkalne kovine in Mg. Oksalatni ioni tvorijo stabilne komplekse s kovinskimi kationi. Vse

oksalatne soli so topne v kislem, nap. v 1,0 M HCl. Te raztopine so brezbarvne in počasi

oksidirajo v CO2. [21] Oksalna kislina je organska kislina, ki je prisotna v številnih rastlinskih

vrstah v obliki soli in tudi v najštevilčnejši prehransko pomembni zelenjavi. Oksalate najdemo

v obliki topne in netopne soli. Topne soli so kalijeva, natrijeva in amonijeva sol; netopne pa

kalcijeva, magnezijeva in ţelezova sol. [12]. Z vodno ekstrakcijo lahko ekstrahiramo le topne

oksalate, medtem ko se netopni oksalati ne ekstrahirajo v vodnem mediju. [35]

Razmerje med topnimi in netopnimi oksalati je v mladih in starih listih podobno. Topni

oksalati prispevajo pribliţno 74 % celotnih oksalatov. Vendar pa so študije Hollowaya s sod.

(1989) podale drugačne vrednosti, kjer so topni oksalati predstavljali le 30 %. Zmanjšana

vrednost topnih oksalatov je lahko posledica predobdelave listov – pranje z vodo. Dubois in

Savage (2006) sta pokazala, da namakanje listov v hladni vodi za 18 h povzroči 26 %

zmanjšanje topnih oksalatov. [35]

Oksalati imajo velik vpliv na obrambni mehanizem proti škodljivcem, shranjevanje rezerve in

preseţek kalcija. [14] Povzroča akridnost, zato obstaja ravnoteţna povezava med oksalno

kislino in akridnostjo. [17] Visoke koncentracije topnega oksalata v prehrani povzročajo

zdravstvene nevšečnosti, kot je nastanek ledvičnih kamnov. Zaradi tega se bolnikom, ki so

nagnjeni k nastanku ledvičnih kamnov, odsvetuje uţivanje hrane, ki je bogata z oksalati.

Predhodne študije so pokazale, da listi tara vsebujejo visoke vrednosti topnih in netopnih

oksalatov. [12] V velikih količinah je oksalna kislina strupena za ljudi in lahko tudi zmanjša

hranilno vrednost ţivila, tako da se poveţe s kalcijem in tvori kalcijev oksalat. [17]

Kalcijevi oksalatni kristali se v rastlinah nahajajo v obliki raphides in druses (Slika 6). [3]

Druses so kristali, ki so sferične oblike in merijo v premer povprečno do 40 µm, medtem ko

so raphides kristali iglaste oblike, ki so poravnani vzporedno, tako da zapolnijo skoraj celotno

površino celice. Obeh oksalatnih kristalov ni bilo zaznanih niti po 25 min kuhanja v

limoninem soku, ker je prišlo do popolne hidrolize in raztapljanja kristalov. Popolno akridnost

izgubimo ţe po 5 min kuhanja v limoninem soku (isti učinek bi se s prekuhavanjem v vodi

pokazal po 10 min). [36]


24

Slika 6: Oksalatna kristala: raphide in druse

[36]


25

2.3 Ekstrakcijski postopki za izolacijo anionov

Ekstrakcija je postopek, s katerim s tekočin ali iz trdnih zmesi odstranjujemo topne

komponente s topilom. Ekstrakcija je sestavljena iz dveh zaporednih postopkov. V prvem

spravimo zmes v intenziven stik s topilom, v drugem pa obe fazi ločimo.

Kot topila lahko uporabljamo vodo, hlapna organska topila ali mešanice različnih topil.

V kolikor ali kadar je topljenec enakomerno dispergiran v trdni snovi, poteka raztapljanje

najprej na površini, nato pa topilo penetrira skozi sloj v notranjost delca, preden doseţe

topljenec. Zato se hitrost ekstrakcije zmanjša. Če imamo v trdnem materialu prevelik deleţ

topljenca, lahko zaradi velike poroznosti pride do zdrobitve strukture. Pri tem nastane

neprepusten sloj za topilo.

Proces lahko razdelimo na tri stopnje:

fazna sprememba pri raztapljanju topljenca,

difuzija topljenca v topilu, ki se nahaja v porah trdnega materiala, na površino delca,

prenos topljenca skozi tekočinski film na površini delca v glavni tok topila.

Katerakoli stopnja lahko omejuje hitrost ekstrakcije.

2.3.1 Dejavniki, ki vlivajo na hitrost ekstrakcije:

Velikost delcev: manjši kot so delci, hitrejša je ekstrakcija, saj je stična površina med topilom

in topljencem večja. Premajhni delci lahko ovirajo ekstrakcijo, tako da se sprimejo v večje

agregate, ki ne prepuščajo topila.

Topilo: biti mora z nizko viskoznostjo in selektivno. Med ekstrakcijo koncentracija topljenca

v topilu narašča. Ekstrakcijska hitrost pa pada, ker se spremeni koncentracijski gradient in

deloma tudi viskoznost, ki narašča.

Temperatura: v večini primerov viskoznost narašča s temperaturo, zato narašča tudi

ekstrakcijska hitrost. Na hitrost ekstrakcije vpliva tudi difuzijski koeficient, ki s temperaturo

narašča.

Mešanje raztopine: poveča snovni prenos s površine materiala v glavno maso topila in

onemogoča sedimentacijo delcev in povezovanje v večje agregate. Če je topljenec porazdeljen

po trdni snovi, ki je neprepustna za topilo, moramo material zdrobiti na manjše delce. S tem

topljenec izpostavimo topilu. V tem primeru ima velikost delcev in porazdelitev topljenca

odločujoč vpliv ne le na hitrost ekstrakcije, temveč tudi na njen izkoristek. [37]


26

Na Sliki 7 je uprizorjen celoten postopek ekstrakcije.

Slika 7: Shema ekstrakcije trdno-tekoče


27

2.4 Ionska kromatografija

Ionska kromatografija je sodobna analitska tehnika za določevanje ionskih zvrsti in je del

tekočinske kromatografije. Uporablja se večinoma za določevanje organskih in anorganskih

ionov, organskih kislin, organskih fosfatov, enostavnih biokemijskih spojin - aminokislin,

teţkih kovin, alkalijskih in zemljoalkalijskih kovin in prehodnih kovin. Pri analizi se po

navadi uporabljajo vodni mediji. Vse komponente se lahko določujejo tudi z drugimi

metodami, kot so: spektrometrija, spektroskopija, ionoselektivnimi elektrodami in kapilarno

elektroforezo. [40]

Ločevanje pri kapilarni elektroforezi temelji na različni mobilnosti ionov, ki je pogojena z

nabojem in radijem iona. Metoda je zelo ekonomična, visoko ločljiva, hitra, potrebujemo

malo količino vzorca in reagentov v primerjavi IC. Problem je le v občutljivosti in detekciji

ionov, saj mali ioni ne absorbirajo v UV ali VIS območju. Problem detekcije je rešen s

posredno fotometrično detekcijo (IPD). [38] S spektrometrijo lahko določamo: Cl-, Br

-, I

-, F

-,

NO3-, SO4

2-, PO4

2-, ClO4

- idr. UV-VIS spektrometrija se uporablja v vodnih matricah, tako da

se doda reagent, ki reagira z določevalno spojino v produkt, ki je obarvan. Z intenziteto

obarvanja se določi koncentracija substance. UV-VIS spektrometrija se uporablja za: Cl-,

NO3-, SO4

2-, PO4

2- , medtem ko se AAS uporablja večinoma za kovinske anione. Vsak anion

absorbira pri točno določeni valovni dolţini - zato rabimo za vsak anion drugo ţarnico.

Spektrofluorometrične metode se uporabljajo za določevanje: Cl-, NO3

-, prostih CN

-, SO4

2-

idr. Anioni reagirajo s primernimi reagenti v fluorescentne produkte. Ionoselektivne elektrode

so primerne za določanje: Br-, Cl

-, F

-, NO3

-, NO2

-, SO4

2-.. Temelj metode je merjenje napetosti

galvanskega člena preko referenčne elektrode, vzorca in indikatorske elektrode. Z merjenjem

potencialne razlike med indikatorsko in referenčno elektrodo se določi aktivnost analita. [39]

Kromatografija je splošni pojem za različne fizikalno-kemične separacijske tehnike, kjer se

komponenta porazdeli med fazama. Za vse kromatografske ločitve velja, da je vzorec

raztopljen v mobilni fazi, ki je lahko tekočina, plin ali superkritični fluid. [40]

Kromatografska analiza je postopek, kjer najprej ločimo posamezne komponente vzorca in jih

nato zaznamo z ustrezno detekcijo s ciljem kvalitativne ali kvantitativne določitve. V praksi

skušamo doseči čim boljšo separacijo v čim krajšem času, z optimizacijo vseh parametrov in

komponent kromatografskega sistema. [41]

Za ločevanje ionov se uporabljata stacionarna faza z ustreznimi kemijskimi lastnostmi in

ustrezna mobilna faza. Ločevanje temelji na procesu ionske izmenjave. Ioni vzorca prehajajo


28

med mobilno in stacionarno fazo. Slednja predstavlja ionski izmenjevalec, ki je vezan na

nosilec v koloni in na katerega so vezane funkcionalne skupine. Mobilna faza pa teče skozi

kolono pod vplivom gravitacije ali tlaka črpalke.

Ioni vzorca imajo različno afiniteto do funkcionalnih skupin in mobilno fazo. Ioni se na

stacionarni fazi reverzibilno, a močno veţejo, nato pa zopet preidejo v mobilno fazo, po kateri

se premikajo proti dnu kolone. Določeni ioni se lahko tudi adsorbirajo na stacionarno fazo.

Kolona, ki je napolnjena s stacionarno fazo predstavlja glavni element IC. Pod visokim

tlakom skozi kolono potiskamo raztopljen vzorec s posebnimi batnimi črpalkami.

Komponente vzorca različno hitro potujejo skozi kolono in se iz nje ločeno eluirajo. Eluente

zaznamo s specifičnimi detektorji (prevodnost je splošna lastnost ionskih zvrsti, zato se v IC

najpogosteje uporablja detektor električne prevodnosti).

Kromatografski vrhovi so posledica električnih signalov, ki jih posreduje detektor. Z njegovo

pomočjo se nam na ekranu izriše krivulja, ki jo imenujemo kromatogram. Čas, ki je potreben,

da posamezna komponenta pri idealnih pogojih zapusti kolono, imenujemo retencijski čas.

Retencijski čas je za vsako komponento konstanten, če imamo ves čas enake kromatografske

pogoje. S primerjavo retencijskih časov znanih spojin lahko ugotavljamo kvalitativno sestavo

vzorca. Površina pod vrhom je sorazmerna koncentraciji in podaja kvantitativno informacijo.

[40]


29

2.4.3 Kromatografska separacija

Za uspešno kromatografsko ločitev je treba poiskati kompromis med ločljivostjo med

posameznimi vrhovi, hitrostjo ločitve in kapaciteto kolone.[40]

2.4.3.1 Retencijski čas

Retencijski čas (tr) razdelimo na dva dela: na čas, ko se molekula nahaja v stacionarni fazi ( )

in na čas, ki ga molekula prebije v mobilni fazi (tm). Če se retencijska časa eluiranih

komponent razlikujeta, sta komponenti ločeni. Retencijski čas je za določeno komponento

karakteristična vrednost, zato jo uporabljamo pri konstantnem pretoku za identifikacijo.

(2.1)

Razmerje med t`r in tm je pomembna značilnost, ki opisuje termodinamsko povezavo med

topljencem v določenem kromatografskem sistemu (sistem je mobilna in stacionarna faza). To

razmerje se imenuje kapacitivni faktor (k`). [41]

˙ (2.2)

2.4.3.2 Separacija

Razmerje kapacitivnih faktorjev dveh topljencev se imenuje separacijski faktor oz.

selektivnost (α). Če se k` vrednosti dveh komponent razlikujeta in α 1, sta komponenti

ločeni. Selektivnost je odvisna od lastnosti stacionarne in mobilne faze. Velja:

. [40]

(2.3)

2.4.3.3 Ločljivost

Optimizacija kromatografskega procesa mora upoštevati pogoje separacije in minimizacijo

disperzije. Razmerje teh dveh efektov nas pripelje do ločljivosti ali resolucije. Razmerje med

razdaljo med dvema sosednjima vrhovoma in aritmetično sredino njunih širin na bazni liniji je

je definirano kot ločljivost (R). [40]

Ločljivost kolone Rs zagotavlja kvantitativno vrednost komponente v vzorcu. Ločitev nam

omogoča prehajanje molekul med mobilno in stacionarno fazo. Slika 8 predstavlja tri kolone,

ki imajo različno resolucijo za komponenti A in B. Slednjo izboljšujemo s spreminjanjem

pogojev, glede na karakteristike kolone. [2]


30

Slika 8: Ločitev komponent

Resolucija (Rs = 1,5) tretje kolone podaja popolno ločitev. Pri Rs.= 1,0 predstavlja površina

komponente A 4 % površine komponente B in obratno. Resolucijo stacionarne faze v koloni

lahko izboljšamo, tako da slednjo podaljšamo. S tem posledično povečamo število teoretskih

podov, kar je negativno za separacijo. To omilimo, če podaljšamo retencijski čas analize.

Resolucija ima povezavo z retencijskim časom. Ti spremenljivki sta med sabo odvisni in ju ne

moremo po ţelji spreminjati pri istih pogojih. Čas, ki je potreben za separacijo, je določen s

hitrostjo počasneje premikajoče se komponente. [2]

Da smo zadovoljni pri analizah z ločbo in posledično retencijskem časom vseh signalov

analitov (Slika 9), moramo zraven pretoka, retencijskega časa spremeniti tudi sestavo mobilne

faza ali celo kolono. [2] Prednost tekočinske pred plinsko kromatografijo je v tem, da lahko

kapacitivni in separacijski faktor enostavno spreminjamo s spremembo mobilne faze. V praksi

izberemo takšne pogoje, da je k` med 1 in 5. Večja vrednost le daljša retencijski čas. [40]

Slika 9: Eluiranje komponent


31

2.4.4 Sestavni deli ionskega kromatogrfa

2.4.4.1 Mobilna faza

Na prevodnost ozadja vpliva mobilna faza in tudi na moţnost detekcije posameznih ionov.

Izbrati moramo ustrezni eluent, ki nima previsoke prevodnosti, kar pa je tudi odvisno od vrste

detektorja in vrste kolone. Eluent moramo vedno pripraviti z deionizirano in s prefiltrirano

vodo, ki ima upornost 18,2 MΩcm. Pred uporabo je zaţeleno, da ga prepihamo z dušikom, ter

po potrebi izpostavimo UV-svetlobi. V eluent ni zaţeleno, da pride plin, saj bi lahko motil

analizo. Zelo pozorni moramo biti pri skladiščenju eluenta in standardnih raztopin, saj obstaja

verjetnost, da se razvijejo mikroorganizmi. Zaradi zapisanega moramo vse pripravljalne

reagente shranjevati v hladilniku pri 4°C. [40] Za določevanje anionov se kot mobilna faza

najpogosteje uporablja raztopina soli Na2CO3 in NaHCO3 ali NaOH. [41]

2.4.4.2 Črpalka

Črpalkina naloga je, da zagotavlja konstanten pretok mobilne faze skozi kromatografski

sistem, ne glede na spreminjanje tlaka. Črpalke so narejene iz inertnih materialov. Poznamo

več sistemov zagotavljanja enakomernega in konstantnega pretoka: s pomočjo plina pod

tlakom, črpalke z rezervoarjem in batom, membranske črpalke, recipročne črpalke z eno,

dvema ali več črpalnimi glavami. [40] Ponovljivost analiz je zelo odvisna od stabilnosti

pretoka. Retencijski čas je ravno tako odvisen od pretoka. Nihanje bazne linije je velikokrat

posledica sprememb pretoka. [41]

2.4.4.3 Injektor

Kromatografska ločitev je kontinuirani proces, pri katerem pomeni vsakršen vnos dodatnih

količin v sistem motnjo stacionarnih pogojev. Doziranje vzorca v sistem mora predstavljati

čim manjši deleţ, saj tako zmanjšamo motnjo sistema, hkrati pa zagotovimo ponovljivost in

dobro definirano volumsko količino vzorca. Vzorec moramo injicirati v sistem pred kolono,

pri tem pa ne smemo vplivati na ločbo na stacionarni fazi. Najpogosteje uporabljena metoda

je injiciranje v tok ali pretok mobilne faze. Injektor je poseben tripolni ventil, ki omogoča, da

zanko napolnimo z vzorcem pri zračnem tlaku, ko pa ventil preklopimo, eluent izpere vzorec

v kolono. Zanka je kapilarna in ima konstanten notranji premer in dolţino. S tem zagotovimo,

da s vsakim injiciranjem vnesemo v sistem enako količino vzorca. Tovrstni injektorji dajejo

odlično ponovljivost pri visokih tlakih in omogočajo avtomatizacijo injiciranja vzorcev pri

različnih volumnih. [40]


32

Z dozirnimi iglami ali brizgami vnašamo vzorce v injektor in prek zanke v sistem. Ventil ima

manšeto, ki tesno objame iglo. Poznamo brizge dveh vrst: dozirne in izpiralne.

Dozirne brizge imajo skalo v µL. Najbolj so znane Hamilton-brizge z izvrtanim rezervoarjem

v steklu in s kovinskim batom. Njihova slabost je kontaminacija vzorca s prejšnjim, saj

prihaja do velike adsorpcije komponent vzorca na grobe stene stekla. Izpiralne brizge imajo

večji volumen do 100 µL. Treba je paziti, da prek zanke zmeraj spustimo večji volumen

vzorca, kot je volumen same zanke. [41]

2.4.4.4 Predkolona in kolona

Ker se stacionarna faza nenehno v manjšem obsegu raztaplja v mobilni fazi, še posebej pri

visokih pH vrednostih, uporabimo predkolono. Nenehno raztapljanje stacionarne faze

sčasoma vodi do padca ločljivosti in posedanja kolone. Mobilna faza predstavlja nenehno

kontaminacijo kolone, kljub temu da jo pred uporabo prefiltriramo in pri pripravi uporabljamo

čista topila. Najbolj kontaminiran del kolone je začetek kolone, zaradi sestave vzorca.

Posebno močno kontaminacijo predstavljajo ekstrakti. Posledica kontaminacije vrha kolone je

padec učinkovitosti kolone in povišan tlak na njej. Da pojave minimiziramo se posluţujemo

predkolon. Predkolone so ponavadi krajše in polnjene z delci večjih dimenzij, s čimer

doseţemo, da nam tlak v sistemu ne naraste preveč. Pedkolona je nameščena tik pred

analitsko kolono in mora biti napolnjena s stacionarno fazo istega tipa. Zaradi mrtvih

volumnov se vrhovi spojin nekoliko razširijo in čas analize se ponavadi podaljša. Če se

predkolona kontaminira, jo zamenjamo z novo. Pri določenih analizah je uporaba predkolon

nujna, pri nekaterih pa kontaminacija manj vpliva na rezultate analiz.[41]

Najpomembnejši del kromatografskega sistema je kolona in omogoča učinkovito ločitev

posameznih anorganskih ionov. Kolone so napolnjene z različnimi ionskimi izmenjevalci, ki

predstavljajo stacionarno fazo in izdelane iz primernega inertnega materiala. Običajno kolone

v IC niso termostatirane in jih uporabljamo pri sobni temperaturi. [40]

Kolone so tudi različno dolge. Pri daljših kolonah prihaja do večjega padca tlaka v sistemu,

pri krajših kolonah pa do slabše separacije. [41] Kolone ne smejo biti prekratke, da se pod

sam vrh preiskovane komponente ne bi »skrila« ali dodatno eluirala še kakšna druga

komponenta. Nečistoče prihajajo iz nečistosti spojin, s katerih pripravimo mobilno fazo in

samega vzorca. [40] Kolona je na obeh straneh zaprta s posebnimi vijaki in tesnilnimi obročki

– ferulami. Pozorni moramo biti na mrtve volumne, kjer nastajajo turbulence, ki nastanejo

zaradi vezave posameznih delov. Vezave morajo biti čim krajše, da ne prihaja do širjenja


33

vrhov ali celo do cepljenja in popolne deformacije vrha. Mrtvi volumen (1 % volumna prazne

kolone) predstavlja vrtine v vijakih in deli kolone. S tem doseţemo enakomerno porazdelitev

vzorca po celotni površini stacionarne faze. Kapilare, ki sluţijo za povezavo kolone z

injektorjem in detektorjem, so izdelane iz enake zlitine kot kolone.

Stacionarna faza

Dandanes se najpogosteje uporabljajo ionsko-izmenjevalne stacionarne faze, ki so

pripravljene s pomočjo ustreznih silanov na silikagel veznih ionsko-izmenjevalnih skupin.

Kationske izmenjevalce predstavljajo fenilne ali alkilsulfonske skupine. Kot anionski

izmenjevalci so pa uporabljene kvarterne amonijeve skupine. Stacionarne faze so močno kisle

in močno bazične, če pa imamo klasično ionsko izmenjavo pa so prisotne tudi šibke

modifikacije. Slednji materiali imajo še zadostno kapaciteto. Kapacitivni faktor se veča z

večanjem kapacitete ionskega izmenjevalca. [41]

Organski polimeri ali pa tudi silikatni nosilci na osnovi (Al2O3)x, se uporabljajo kot osnovni

ionski izmenjevalci v anionski izmenjevalni kromatografiji. Za polimerne anionske

izmenjevalce se najpogosteje uporabljajo stiren-divenilbenzenski kopolimeri (S/DVB). [48]

Z določeno kemijsko reakcijo lahko na kopolimere veţemo različne funkcionalne skupine in

tako dobimo močna oz. šibko kisla in močno bazična izmenjevala. Lateksne anionske smole

so poseben tip izmenjevalcev, kamor se ioni vzorca z različno afiniteto reverzibilno veţejo.

Smole slovijo po visoki kromatografski učinkovitosti in nizki anionski izmenjevalni

kapaciteti, kar omogoča uporabo eluentov z nizkimi koncentracijami, s tem pa dobimo

občutljivejšo detekcijo preko električne prevodnosti. Ko imamo čim manjše in enakomernejše

porazdeljene delce polnila, dobimo največjo efektivnost kolone. Če delce pretirano

zmanjšamo dobimo velik padec tlaka na kolonah,kar pa ni smiselno. [40, 48]

2.4.4.5 Supresor

Če ionsko kromatografijo poimenujemo glede na supresorski sistem ne upoštevamo

predkolone, ker je običajno ţe upoštevana pri enokolonskem in dvokolonskem sistemu.

Ionsko kromatografijo delimo na: enokolonsko oz. nesupresirano ionsko kromatografijo in

dvokolonsko oz. supresirano ionsko kromatografijo. Vzorec se skupaj z mobilno fazo

neposredno iz kolone izpere v supresor. [40]


34

Enokolonski sistem

Pri enokolonskem sistemu (Slika 10) je prevodnostna celica takoj za kolono. Veliko vlogo

ima polnilo kolone (nizka kapaciteta) in ustrezni eluent, ki ne sme imeti previsoke

prevodnosti. To tehniko lahko uporabljamo samo v primerih, ko je mogoče izbrati dovolj

veliko razliko med prevodnostjo ionov vzorca in prevodnostjo eluenta.[40]

Slika 10: Shema enokolonskega sistema

Dvokolonski sistemi

Pri dvokolonskem sistemu (Slika 11) uporabimo dodaten supresor, s katerim povečamo

občutljivost meritev s prevodnostnim detektorjem. Zraven kolone imamo vgrajeno še

supresorsko kolono, ki je pri določevanju kationov polnjena z močno bazičnim ionskim

izmenjevalcem, pri določevanju anionov pa kolono, ki je polnjena z močno kislim

izmenjevalcem. Uporaba teh kolon ni doţivela širše uporabe, predvsem zaradi pogoste

regeneracije in same neponovljivosti rezultatov. Prišlo je do razvoja mikromembranskih

supresorjev z majhnim volumnom in do razvoja elektrodializne supresorske kolone.

Dvokolonski sistemi so praviloma manj občutljivi pri izbiri mobilne faze. Prevodnost ozadja

je odvisna od sestave eluenta in bistveno vpliva na moţnost detekcije posameznih ionov z

detektorjem prek električno prevodnost. Zmanjšanje kemijske prevodnosti ozadja nam

omogoča gradientno separacijo komponent, pri separaciji večkomponentnega vzorca. [40]

Supresorska kolona pretvori mobilno fazo v nedisociirano obliko, analit pa pretvori v

popolnoma disociirano obliko, tako da je prevoden, saj celica ne more razlikovati med ioni

vzorca eluenta. Poznamo kemijski in elektrokemijski supresor. [44]

Če imamo v vzorcu npr. nitratne ione in jih eluiramo z NaHCO3, se v raztopini natrijevi ioni

izmenjajo s protoni in tako prevedejo močno prevoden NaHCO3 v manj prevoden NaHCO3 ter

v malo disociirano ogljikovo kislino:

R-SO-3H

+ + NaHCO3 ↔ R-SO3

-Na

+ + (CO2 +H2O)

Po izmenjavi natrijevega nitrata iz vzorca nastane dušikova kislina:

R - SO3-H

+ + NaNO3 ↔ R − SO3

-Na

+ + HNO3


35

Slika 11: Shema dvokolonskega sistema

Mikromembranski supresorji

Klasična kemijska supresija je sestavljena iz reagenta, ki je lahko kislina, kadar določujemo

anione (anionski supresor) ali baza, kadar določujemo katione (kationski supresor). Novi

mikromembranski supresorji pa doseţejo supresijo z generiranjem OH- oz. H3O

+ ionov

z

elektrolizo vode. Poznamo dva načina: avto-supresorski kroţni način, ki uporablja kot vir

deionizirane vode iztok iz nevtralizirane prevodnostne celice in avto-supresorski način z

zunanjim dotokom vode (Slika 12), ki uporablja konstanten izvor deionizirane vode iz

steklenice pod tlakom s pretokom 5-10 mL/min. Z zunanjim dotokom vode odstranimo

moţnost dovoda ionov, ki bi lahko kontaminirali eluent. [40]

Slika 12: Samo-regeneracijski supresor Dionex ASRS®-ULTRA

2.4.4.6 Detektor

Substance ločene na koloni so »vidne« s pomočjo detektorja. Detektorji so osnovani tako, da

merijo spremembo neke fizikalne količine, ki jo povzroči prehod substance skozi merilno

pretočno celico detektorja, ki je vstavljena v kolono. Prevladuje mnenje, da je detekcija

najšibkejši člen kromatografskega sistema.

Detektorje delimo na specifične in nespecifične. Nespecifični zazna vsako substanco, ki se

eluira skozi kolono – interference posameznih nesepariranih komponent. Ker so specifični

detektorji veliko bolj občutljivi z njimi dosegamo najniţje meje detekcije. [41]


36

Detektorje delimo na integralne in diferencialne. Največ detektorjev je diferencialnega tipa, to

se pravi, da daje znak ničlo, če teče skozi detektor mobilna faza. Detektor daje sorazmerni

signal koncentraciji komponente, ko skozi pretočno celico teče komponentni vzorec. Detektor

integralnega tipa daje kontinuiran signal, ki je proporcionalen celokupni mnoţini substanc, ki

se eluirajo.

Detektor more izpolnjevati naslednje pogoje: mora biti zelo občutljiv, kar pomeni, da mora

zaznavati najmanjše sledove tujih substanc v nosilni fazi, njegova reakcija na spremembe v

sestavi iztoka iz kolone mora biti zelo hitra in njegova registracija mora biti kvantitativna.

V IC najpogosteje uporabljamo detektor za merjenje električne prevodnosti, saj je električna

prevodnost osnovna lastnost vseh ionskih zvrsti in je občutljiv je le za šibko disociirane zvrsti.

Detekcija je hitro izvedljiva. Volumen pretočne celice detektorja je majhen (4 – 20µL), da ne

bi prišlo do ponovne zdruţitve ţe ločenih zvrsti.

Raztopina elektrolitov je elektroprevodna, ter prevaja električni tok med dvema elektrodama,

če je med njima električna napetost. Preko izmenične napetosti doseţemo, da na elektrodah ne

steče elektrokemijska oksidacija ali redukcija. Izmenični tok pa je premosorazmeren s

koncentracijo in mobilnostjo ionov v merjeni raztopini. Prevodnostne celice morajo biti

termostatirane, saj se pri višji temperaturi viskoznost raztopine zniţa, sočasno pa se poveča

hitrost gibanja ionov in tako pride do sprememb električne prevodnosti raztopine. Prevodnost

vedno zaznamo kot vsoto pozitivnih in negativnih ionov.

Poleg merjenja električne prevodnosti in UV/VIS spektrometrije so v uporabi tudi druge

detekcijske tehnike kot so: elektrokemijska detekcija, atomska absorpcijska spektrometrija,

atomska emisijska spektrometrija, atomska emisijska spektrometrija z induktivno sklopljeno

plazmo ICP-AES, masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo ICP-MS in druge.

[40]

2.4.4.7 Zapis signala

Detektorji so v bistvu vmesnik za pretvorbo časovne spremembe neke fizikalne lastnosti, ki jo

povzroči prehod eluenta skozi detektorsko celico, v električni signal. Nato tega s pomočjo

pretvornikov pretvorimo v digitalni zapis. Najpogosteje uporabimo rekorderje in integratorje.

Danes pa se v večini primerov uporablja računalnik z ustrezno programsko upremo. [41]


37

2.5 Osnove statistike in statistični testi

Statistične metode nam pomagajo kadar moramo vrednotiti rezultate, podajati rezultate, pri

iskanju različnih statističnih napak, ocenjevanju slučajnih napak, ocenjevanju ustreznosti

metode za določevanje substance, primerjavi različnih metod, analitikov, načina dela,

vzorcev. [45]

2.5.1 Osnovni statistični parametri

Ker vsak rezultat podajamo s napako, meritve izvajamo v najmanj šestih ponovitvah, kjer

imamo prisotne enake pogoje. S pomočjo n-ponovitev na določenem koncentracijskem

območju, kjer sta i indeks ponovitev in xi vrednosti posameznih ponovitev, izračunamo

osnovne statistične pojme. [45]

Povprečna vrednost

Je povprečje, ki je v dani populaciji objektov najbolj verjetna vrednost.

∑ (2.4)

Standardni odmik

Pove nam, za koliko vrednosti statističnega znaka odstopajo od povprečja.

√

∑ ( ) (2.5)

Relativni standardni odmik ali koeficient variacije

RSD podajamo v odstotkih. Pogosto se uporablja za primerjavo natančnosti rezultatov, kadar

imamo različne enote. [47]

(2.6)

2.5.2 Osnovni statistični testi in merilna negotovost

Odstopanje oz. BIAS je sistematična napaka, ki jo podaja merilni instrument. Je razlika med

pričakovanim – pravim – in dobljenim rezultatom. [46]

2.5.2.1 T-test

T-test: primerjava prave vrednosti in poprečja skupine meritev

Primerjava vrednosti in poprečja skupine meritev naredimo pogosto takrat, ko določamo

točnost analitske metode. Pri tem merimo vzorec z znano količino snovi.


38

Če ugotovimo, da je tteoretičen > tizračunan, sta metodi med sabo enakovredni. [40]

2.5.2.2 F-test

Gre za primerjavo – natančnost varianc dveh ali več vzorcev. Izračunano vrednost F

primerjamo s tabelarično vrednostjo F. Kadar imamo Fteoretični > Fizračunan, med metodama ne

obstaja razlika.

( ) (2.7)

V števcu je vedno večja varianca, zato je Fizračunan vedno večji ali kvečjemu enak ena.

V tabelah je vrednost F odvisna od treh parametrov: meje zaupnosti α in prostostnih stopenj

obeh vzorcev. [49]

2.5.2.3 Test ubežnikov

Pri obdelavi podatkov moramo biti posebej pozorni na vrednosti, ki nam lahko predstavljajo

»ubeţnike«. Za ugotavljanje ubeţnikov poznamo Dixonov in Grubbsov test ubeţnikov.

Grubbsov test primerja odstopanje sumljive vrednosti na podlagi standardnega odklona vseh

vrednosti. Kritične vrednosti za G (α = 0,05) podaja Tabela A.5 [49], ki zajema funkcijo

Število meritev. [49] Pred uporabo kateregakoli testa, moramo n-vrednosti xi v vzorcu urediti

po velikosti od najmanjšega xi, do največjega xi. Za ubeţno meritev največkrat preverimo

najmanjšo in največjo vrednost. [49]

Grubbsov test:

| |

(2.8)

G izračunan < G tabela ni ubeţnik (ne izločimo)

G izračunan > G tabela ubeţnik (izločimo)


39

2.5.3 Linearna regresija

Analitik vzame serijo vzorcev (vsaj 4) pri katerih je koncentracija analita znana. Kalibracijski

standardi se v analiznem instrumentu vedno merijo pod enakimi pogoji, kot se kasneje

uporabijo za test vzorcev. Ko je kalibracijski graf narejen, lahko z interpolacijo dobimo

koncentracijo analita pri kateremkoli vzorcu. [50] Vrednosti v umeritveno krivuljo ne smemo

nikoli ekstrapolirati preko intervala, ki smo ga pokrili s standardnimi raztopinami. Pogosta

napaka je tudi, da vzorec ni pripravljen v istem topilu kot standardne raztopine. [40]

2.5.3.1 Linearna odvisnost

Med analiznim signalom (y) in koncentracijo (x) obstaja linearen odnos (Slika 13) s katerega

lahko narišemo graf. Vsaka točka na grafu je predmet eksperimentalne napake na y.

Premico, ki je oblike: y = b1 x + b0, imenujemo regresijska premica y na x. Odvisnost med y

in x podajamo običajno tako, da je analizni signal vedno prikazan na y osi in koncentracija na

x osi. b1 je naklon in b0 odsek premice na y-osi

∑ *( )( )+

∑ ( )

(2.9)

(2.10)

Slika 13: Linearna regresija

Korelacijski koeficient

Z uporabo korelacijskega koeficienta (r) ocenimo kako dobro se eksperimentalne točke

grafičnega prikaza prilegajo linearni regresije. Vrednost r je vedno v območju –1 ≤ r ≤ +1. Če

korelacije ni med x in y, je vrednost r nič. V analizni praksi je korelacijski koeficient skoraj

vedno več kot 0,99. [45]


40

2.5.3.2 Napake naklona in odseka regresijske premice

Preko regresijske premice, bomo v praksi ocenjevali koncentracije vzorcev z interpolacijo, ter

določili detekcijsko mejo analiznega postopka. Statistični sy/x, je podan z:

{∑ ( )

}

(2.11)

Preko vrednosti sy/x lahko izračunamo standardne odmike. sb1 je standardni odmik za naklon

in sb0 standardni odmik za odsek. V našem primeru uporabimo napake naklona in odseka

linearne premice pri izračunu LOD in LOQ

√∑ ( )

(2.12)

{∑

∑ ( )

}

(2.13)

Ostanek je razlika med opazovano vrednostjo spremenljivke in vrednostjo, dobljeno z

regresijskim modelom in predstavlja nepojasnjena odstopanja. Uporabimo ga pri izračunu

QC. [50]

( ) (2.14)


41

2.6 Validacija

Vrednotenje analitske metode

Vsako novo analitsko metodo, ki jo uporabimo v laboratoriju, moramo ovrednotiti. Z nekaj

parametri z vrednotenjem metode prikaţemo, da je metoda ustrezna za analizo določene

substance v danem vzorcu in da daje zanesljive rezultate. Optimizacija analitske metode je

sestavljena iz izbire topil, mobilne faze, izbire kolone, temperature kolone, tlaka, priprave

vzorcev, standardnih raztopin in vzorčnih raztopin za primerjavo rezultatov.

Validacija vključuje testiranje metode glede na: natančnost, pravilnost, mejo detekcije (LOD),

mejo določitve (LOQ), delovno območje, linearnost, občutljivost, selektivnost, koeficient

kvalitete, robustnost in stabilnost.

2.6.1 Natančnost

Je stopnja skladanja med posameznimi testnimi rezultati, če je analiza opravljena na več

paralelkah istega homogenega vzorca. Običajno se izraţa s standardnim odmikom ali z

relativno standardno deviacijo (RSD). [40]

2.6.2 Pravilnost

Je merilo, s katerim pokaţemo, da z uporabo določene analitske metode dobimo pravilne

rezultate. Izraţamo jo lahko kot % izkoristka med znano dodano količino analizirane snovi

(delovni standard) in količino, izračunano iz rezultatov testa, ali pa kot % odstopanja,

dobljenega od dodane vrednosti. [40]

(2.15)

( )

(2.16)

2.6.3 Meja zaznavnosti (LOD) in meja določljivosti (LOQ)

Meja zaznavnosti je najmanjša koncentracija analizirane snovi v vzorcu, ki se jo z določeno

metodo še lahko zazna, vendar ne nujno tudi kvantizira. [42]

Meja določljivosti ali meja kvantitativne določitve je najniţja koncentracija merjenega

elementa, ki jo še lahko določimo z zadovoljivo točnostjo in natančnostjo. Po navadi je meja

določljivosti najniţja točka umeritvene krivulje oz. najniţja koncentracija standardne

raztopine, ki smo jo merili. [42]


42

Določitev LOD in LOQ preko linearne regresije

Linearna krivulja nam predstavlja odvisnost pripravljenih koncentracij standardnih raztopin

od signala, ki nam ga poda aparatura ( y = b1 x +b0).

LOD in LOQ se izraţata s pomočjo vrednosti umeritvene premice kot:

(2.17)

(2.18)

Kjer je - standardni odmik odseka in b1- naklon linearne premice. [51]

2.6.4 Linearnost in območje metode

Linearnost je lastnost metode, da v določenem območju daje proporcionalne rezultate,

odvisno od koncentracije vzorca. Določimo jo tako, da izmerimo standardne raztopine vzorca

različnih koncentracij po celotnem delovnem območju in izračunamo regresijsko premico z

metodo najmanjših kvadratov. Linearnost preverimo z risanjem umeritvene krivulje, ki podaja

linearno odvisnost koncentracije od merjene količine. Če je koeficient korelacije vsaj 0,99,

pravimo da je metoda linearna. Linearnost lahko preverimo tudi z računanjem koeficienta

kvalitete (QC). Vrednost izračunanega koeficienta kvalitete ne sme presega 3–5 %, da je

linearnost dobra. [40]

Delovno območje metode je interval, v katerem predpisana metoda daje rezultate, ki imajo

ustrezno ponovljivost, točnost in linearnost. Določimo ga z merjenjem vzorcev, ki vsebujejo

različne koncentracije merjenega elementa. Velikokrat se delovno območje ujema z linearnim

območjem. Delovno območje je lahko širše od linearnega območja, če je določitev v tem

območju kvantitativna, ter doseţe zahtevano točnost in natančnost meritev. [40]

2.6.5 Koeficient kvalitete

Koeficient kvalitete je merilo poprečnega odstopanja meritev od regresijske premice, kjer je:

√∑ (

)

(2.19)

yi – izmerjen odziv,

yî – odziv, ki ga predvideva model,

– povprečje izmerjenih odzivov

n – število koncentracijskih nivojev.


43

Ker pokaţe celotno odstopanje in ne le velikosti eksperimentalne napake in napake zaradi

neujemanja z modelom, ga ponavadi uporabljamo v rutinskih preiskavah. [40]

2.6.6 Stabilnost

Stabilnost podaja velikost odstopanj v analitskih rezultatih, narejenih v različnih časovnih

intervalih. Stabilnost snovi moramo preverjati, ker mnogo snovi razpade ţe med pripravo

vzorca ali med analizo (med ekstrakcijo, čiščenjem, shranjevanjem). Stabilnosti je

sprejemljiva, če relativni standardni odmik v časovnih intervalih ne presega 20 % celotne

natančnosti. [40]


44

3 Eksperimentalni del

Eksperimentalni del diplomske naloge smo opravljali na Fakulteti za kemijo in kemijsko

tehnologijo in na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede na Univerzi v Mariboru. Na

slednji smo si pripravili vzorce za analizo in le-to izvedli v laboratoriju za analizno kemijo in

industrijsko analizo na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo v Mariboru. V

eksperimentalni del smo vključili razvoj ekstrakcije kloridnih, nitratnih in oksalatnih ionov,

optimizacijo sestave mobilne faze, ter validacijo analizne metode na IC.

3.1 Reagenti

Za izvedbo ekstrakcije in validacije smo uporabili naslednje reagente:

Natrijev hidrogenkarbonat – NaHCO3 p. a, 99 %, Kemika ®

Natrijev karbonat – Na2CO3 p. a, 99 %, Kemika ®

Standard solution Cl- 1000 mg/L, Certipur

®

Standard solution NO3- 1000 mg/L, Certipur

®

Standard solution C2O3 2-

1000 mg/L, Certipur ®

Tween®

80, Reagent Grade

Milli-Q voda z upornostjo 18,2 MΩcm in s povprečno temperaturo 23 °C

Pripravljeni vzorci tara

Dodatna aparatura ter oprema pri izvajanju analize in pripravi vzorcev:

50-mL centrifugirke

puhalka z Milli-Q vodo

merilne bučke z zamaški: 50 ± 0,06 mL, 100 ± 0,1 mL in 1000 ± 0,4 mL, Schott Duran®

parafilm

filtri: Chromofil Xtra PVDF – 20/13; 0,20 µm; filter – 13mm

1,5-mL mikrocentrifugirke in 1,5-mL viale z zamaški

stekleni lijak, premer 40 mm

1000-µL in 200-µL nastavljiva pipeta s »tipsi«

steklene čaše, 250 mL, Schott Duran®

100-mL prahovke

pipete z nastavkom za pipetiranje: 5 ± 0,03 mL in 10 ± 0,05 mL, Isolab®

steklena tehtiča, Schott Duran®

3-mL brizga z injekcijo


45

3.2 Instrumenti

Analitska tehtnica

Na analitski tehtnici Metller® AE 100 smo zatehtali vzorce in soli za pripravo standardnih

raztopin, ki smo jih potrebovali pri pripravi mobilne faze. Njena natančnost je ± 0,0001 g.

»Ultra-Turrax«

»Ultra-Turrax« smo uporabili pri postopku ekstrakcije. Vzorce smo zatehtali v centrifugirke

in jih po dodatku 15 mL Milli-Q vode homogenizirali na »Ultra-Turraxu«. S tem poenotimo

pogoje za ekstrakcijo.

Vodna kopel

Uporabimo jo pri postopu ekstrakcije, kjer je temperatura vode 90 °C.

Sušilna peč

V sušilni peči smo 24 h na 105 °C sušili soli (NaHCO3 in Na2CO3) za mobilno fazo.

Hladilnik z zamrzovalno skrinjo

V hladilniku pri 4°C smo hranili standardne raztopine, v zamrzovalni skrinji pri -20°C pa

ekstrakte tara za analizo.

Ionski kromatograf

Aparatura za ionsko kromatografijo (Slika 14) ProStar (Varian®) je sestavljena iz:

1 1000-mL rezervoarja za mobilno fazo,

2 črpalke z nizkim pulzirajočim efektom,

3 ročnega injektorja,

4 predkolone, Ion Pac CG15 – 4mm (10 – 32), serijske številke: 52200, Dionex®,

5 kolone, Ion Pac CS15 – 4mm (10 – 32), serijske številke: 51795, Dionex®,

6 konduktivnega detektorja, CD20, Dionex®

7 inertnega plina – dušika,

8 anionskega supresorja ASRS® - ULTRA II 4-mm, serijske številke: 061561, Dionex

®,

9 izvora deionizirane vode in

10 odpada.


46

Kromatografski pogoji:

- Injiciran volumen: 20 µL

- Pretok: 1,5 mL/min

- Tlak: 140 atm

- Mobilna faza: 2,0 mM Na2CO3 in 1,0 mM NaHCO3, 15 min izpostavljena UZ-kopeli

Slika 14: Ionski kromatograf ProStar (Varian®) in CD20 Dionex®

3.3 Analizni postopki

3.3.1 Ekstrakcija

Izvajali smo trdno-tekočo ekstrakcijo. Pri tem smo uporabili vzorec tara, ki je bil pred

pripravljen na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru.

Kormusi so bili narezani na tanke, čipsu podobne 4 mm debele in 13 cm široke rezine.

Narezane kolobarje so stehtali. Za nadaljnjo pripravo so uporabil 300 g sveţega vzorca.

Rezine so liofiliziral tri dni. Proces liofilizacije omogoča sušenje pri zniţani temperaturi (-50

°C) in zniţanem tlaku (0,2 mBar), ne da bi se pri tem uničile termolabilne spojine, kot so

sekundarni metaboliti. Po treh dneh so suhe vzorce ponovno stehtal, določil deleţ suhe snovi

in po 200 g vzorca vakuumsko zapakiral v PE-vrečke. Na ta način so bili vzorci pripravljeni

za daljše shranjevanje in pošiljanje v Slovenijo, kjer so vzorce zmleli za nadaljnje raziskave.

V centrifugirko smo zatehtali pribliţno 0,45 g zmletega vzorca in dolili pribliţno 20 mL

Milii-Q vode s temperaturo 90 °C. Z »Ultra-Turraxom« smo vzorec homogenizirali.

10

9

1

2

3

4 5

6

7

8


47

Suspenzijo smo kvantitativno, preko lijaka, prenesli v 50-mL bučko in pri tem pazili, da smo

dobro sprali rezilo in centrifugirko. Dolili smo še toliko Milli-Q vode, da je bil skupni

volumen raztopine 45 mL in počakali, da se je raztopina ohladila. S pipeto smo razbili nastale

pene, ter do oznake dopolnili z Milli-Q vodo. Bučke smo postavili v vodno kopel na 90 °C za

30 min. Vsakih 10 min smo bučke premešali. Raztopino smo prenesli v centrifugirke in

centrifugirali na 7 500 obratih 10 min. 25 mL supernatant smo prelili v centrigugirke in

ponovno centrifugirali na 7 500 obratih 15 min. Supernatant smo odpipetirali v

mikrocentrifugrke in še enkrat centrifugirali na 11 500 obratih za 15 min. Raztopino smo

prefiltrirali skozi HPLC-filtre v mikrocentrifugirke. Tako pripravljene vzorce smo globoko

zmrznili na -20 °C. Vse vzorce smo delali v paralelkah, da bi se prepričali o natančnosti

ekstrakcije.

3.3.1.1 Izkoristek ekstrakcije

Prvo paralelko vzorca smo pripravili po osnovnem načinu, drugi dve paralelki vzorca pa smo

pripravili na enak način, le da smo dodali še znano količino anionov v raztopino.

Preden smo postavili 50-ml bučke v vodno kopel, smo jim dodali še kloridne, nitratne in

oksalatne anione z osnovne standardne raztopine. Vse standardne raztopine vsebujejo 1000

mg/L omenjenih anionov.

V drugi dve paralelki smo dodali 50 % in 100 % kloridnih, nitratnih in oksalatnih ionov glede

vsebnost anionov v vzorcu 102.

3.3.1.2 Priprava vzorca s Tween 80-reagentom

Ekstrakcijski postopek je bil enak, kot je opisan v poglavju 3.3.1, le da smo pred dajanjem

bučke v vodno kopel dodali 0,625 ml 80 % Tween 80-reagenta/50-ml bučko. Končna

koncentracija Tween 80-reagenta v raztopini je bila 1 %.

3.3.2 Razvoj metode na IC

3.3.2.1 Priprava standardne 0,3 mol/L raztopine Na2CO3

V 50-mL čašo smo zatehtali 3,1797 g soli, ki smo jo 24 h sušili na 105 °C in dolili toliko

Milli-Q vode, da smo sol raztopili. Raztopino smo kvantitativno prelili skozi lijak v 100-mL

bučko in do oznake dopolnili z vodo. Raztopina je vsebovala 0,3 mol/L Na2CO3. Raztopino

smo hranili v hladilniku pri 4 °C in tako omogočili obstojnost do 1 meseca.


48

3.3.2.2 Priprava standardne 0,3 mol/L raztopine NaHCO3

V 50-mL čašo smo zatehtali 2,5205 g soli, ki smo jo 24 h sušili na 105°C in dolili toliko

Milli-Q vode, da smo sol raztopili. Raztopino smo kvantitativno prelili skozi lijak v 100-mL

bučko in do oznake dopolnili z vodo. Raztopina je vsebovala 0,3 mol/L natrijevega NaHCO3.

Raztopino smo hranili v hladilniku pri 4 °C in tako omogočili obstojnost do 1 meseca.

3.3.2.3 Priprava osnovne raztopine za kalibracijsko krivuljo kloridnih in nitratnih ionov

Pripravili smo si raztopino, ki je vsebovala 100 mg/L kloridnih in nitratnih ionov iz

standardne raztopine (1000 mg/L).

V 50-mL bučko smo odpipetirali po 5 mL vsake standardne raztopine nitratnih in kloridnih

ionov ter do oznake napolnili z Milli-Q vodo. Pripravljena raztopina s Cl- in z NO3

- nam je

sluţila za nadaljnje redčenje v 50-mL bučkah. Razredčene raztopine smo uporabili za

umeritveno krivuljo.

3.3.2.4 Priprava osnovne raztopine za kalibracijsko krivuljo oksalatnih ionov

Pripravili smo si raztopino, ki je vsebovala 200 mg/L oksalatnih ionov iz standardne raztopine

(1000 mg/L). V 50-mL bučko smo odpipetirali 10 mL oksalatnih ionov in do oznake napolnili

z Milli-Q vodo. Pripravljena raztopina C2O42-

nam je sluţila za nadaljnje redčenje v 50-mL

bučkah. Razredčene raztopine smo uporabili za umeritveno krivuljo.

3.3.2.5 Priprava umeritvene krivulje za kloridne in nitratne ione

Umeritveno krivuljo nitratnih in kloridnih ionov smo si pripravili v območju od 1 do 12 mg/L.

Masne koncentracije raztopin so: 1 mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L in 12 mg/L.

V tri 50-mL bučke smo odpipetirali 0,5 mL, 1 mL in 2 mL osnovne raztopine s koncentracijo

100 mg/L kloridnih in nitratnih ionov in dodali še določene volumne oksalatnega standarda

(200 mg/L) ter do oznake dopolnili z Milli-Q vodo. V drugi dve 50-mL bučki pa smo

odpipetirali 0,4 mL in 0,6 mL osnovne standardne raztopine s koncentracijo 1000 mg/L,

oksalatni ion (1000 mg/L) ter do oznake dopolnili z Milli-Q vodo.

3.3.2.6 Priprava umeritvene krivulje za oksalatne ione

Umeritveno krivuljo za oksalatni ion smo pripravili v koncentracijskem območju od 1 mg/L

do 20mg/L. Pripravili smo si 5 standardnih raztopin s koncentracijami: 2 mg/L, 4 mg/L, 8

mg/L, 12 mg/L in 20 mg/L.


49

V tri 50-mL bučke, kamor smo ţe odpipetirali določen volumen Cl- in NO3

- ionov, smo

odpipetirali še 0,5 mL, 1 mL in 2 mL pripravljenega standarda s koncentracijo 200 mg/L ter

dopolnili do oznake z Milli-Q vodo. V dve 50-mL bučki, kamor smo ravno tako ţe

odpipetirali določen volumen Cl- in NO3

- ionov, pa smo odpipetirali še 0,6 mL in 1 mL

standardne raztopine s koncentracijo 1000 mg/L ter do oznake dopolnili z Milli-Q vodo.

Raztopine različnih koncentracij, v katerih so se nahajali kloridni, nitratni in oksalatni ioni, so

nam omogočile konstruiranje umeritvene krivulje na IC v veliko krajšem času, kot če bi bila

vsaka raztopina iona injicirana posebej.

3.3.2.7 Priprava mobilne faze

Dnevno smo si pripravili mobilno fazo (2,0 mM Na2CO3 in 1,0 mM NaHCO3), tako da smo v

1000-mL bučko odpipetirali 6,67 mL 0,3 mol/L Na2CO3 in 3,33 mL NaHCO3 ter do oznake

dopolnili z Milli-Q vodo. Raztopino smo dobro premešali in za 15 min postavili na

ultrazvočno kopel, da smo odstranili morebitne mehurčke.


50

4 Rezultati in diskusija

V prvem delu diplomske naloge smo optimizirali ekstrakcijo (trdo-tekoče) in nato analizno IC

metodo za določevanje anionov. Določili smo anione nitratnega, kloridnega in oksalatnega

iona v pripravljenem ekstraktu tara. Ob ţe omenjenih anionih je vzorec vseboval še druge

anione, vendar jih nismo ne kvalitativno ne kvantitativno določali. Kot slepi vzorec smo

analizirali Mili-Q vodo. (Priloga 7.1: Kromatogram vzorca 52 A)

Najprej smo posneli kromatogram standardne raztopine nitratnega, kloridnega in oksalatnega

iona (Priloga: 7.2 Kromatogram standardne raztopine). Koncentracija injicirane standardne

raztopine je bila 1 mg/L za kloridni in nitratni ion ter 2 mg/L za oksalatni ion. S tem smo

ugotovili, pri katerem retencijskem času se določeni ion eluira iz kolone. Pozneje smo

injicirali še vzorec, da smo ugotovili, kateri vrh pripada določenem ionu. Nato smo začeli

spreminjati sestavo mobilne faze.

Če imamo pretok 1,5 mL/min in sestavo mobilne faze 1,0 mM NaHCO3 in 2,0 mM Na2CO3,

dobimo pri 2,618 min vrh, ki pripada kloridnemu ionu (Cl-), pri 5,244 min vrh nitratnega iona

(NO3-) in pri 9,335 min vrh oksalatnega iona. Iz kromatograma vzorca 32 A opazimo še ostale

vrhove, ki predstavljajo H2PO4-, SO4

2- in ostale anione, vendar jih ne določamo.

Slika 15: Kromatogram vzorca 32 A

C2O42-

NO3

-

Cl-


51

4.1 Ekstrakcija

Ekstrakcijo smo razvijali glede na način postopka dela oz. priprave vzorca in različno

temperaturo.

4.1.1 Vpliv postopka

Ekstrakcijo smo izvajali na dva različna načina: na stresalniku in mešalniku ali mlinu »Ultra-

Turraxu« zraven obeh pa smo vključili še UZ-kopel.

Medsebojno smo primerjali povprečne vrednosti analiziranih anionov na izbranem vzorcu, ki

je bil pripravljen na različna načina. Med sabo smo primerjali vzorce z oznakami: 31A, 32A

in 51A, 52A ter povprečne vrednosti 41B, 42B in 61B, 62B.

A31 in A32 sta vzorca, pripravljena na enak način, v paralelki. Vzorce vedno pripravljamo na

takšen način, da lahko preverimo pravilnost ekstrakcije.

Tabela 1: Primerjava ekstrakcije s stresalnikom in z »Ultra-Turraxom«

Način/ion γ (Cl-) [mg/kg] γ (NO3

-) [mg/kg]

»Ultra-Turrax« 41B, 42B 1210 250,7

Stresalnik 61B, 62B 785,3 210,4

Odstopanje [%] 35,1 (U-T) 16,1(U-T)

»Ultra-Turrax« 31A, 32A 1372,2 715,3

Stresalnik 51A, 52A 1342 369,5

Odstopanje [%] 2,2 (U-T) 10,6 (U-T)

Na podlagi rezultatov smo ugotovili, da je priprava vzorca z »Ultra-Turraxom« veliko bolj

učinkovita, kot če vzorce pripravljamo na stresalniku. V povprečju na »Ultra-Turraxu«

dobimo do 20 % višje ekstrakcije kloridnega iona in do pribliţno 15 % višje nitratnega iona.

Zaradi tega se v nadaljevanju vsi vzorci pripravljajo s postopkom »Ultra-Turraxa«. Takšne

rezultate smo predvidevali, saj smo z uporabo »Ultra-Turraxa« homogenizirali vzorec, s tem

pa pospešili in poenotili ekstrakcijo iz vsakega delca posebej.

Ekstrakcijo smo prilagajali glede na način izvedbe:

A- UZ-kopel, 30 min, 75 °C, filter papir

B- Vodna kopel, 30 min, 75 °C, centrifugiranje (7 500 obr/15 min + 11 500 obr/20 min)


52

C- Vodna kopel, 30min, 75 °C, centrifugiranje (dvakrat na 7 500 obr/15 min + 11 500 obr/15

min), HPLC filter

Tabela 2: Vpliv priprave na ekstrakcijo

Način/ion γ (Cl-) [mg/kg] γ (NO3

-) [mg/kg] γ (C2O4

-2) [mg/kg]

A 509 558 2067

B 418 522 2287

C 461 588 2206

Nadaljnji postopek priprave vzorca je bil sledeč: preden smo ga globoko zmrznili, smo ga

morali prefiltrirati skoz HPLC-filter in ga dvakrat centrifugirati na 7 500 obratih za 15 min in

enkrat na 11 500 obratih za 15 min. S takšnim načinom priprave vzorca smo zagotovili

odsotnost delcev.

4.1.2 Vpliv temperature

Ekstrakcijo tara smo izvajali pri: 55 °C, 75 °C in 90 °C. Medtem, ko ostalih pogojev nismo

spreminjali.

Tabela 3: Vpliv temperature na ekstrakcijo

T [°C]/ion γ (Cl-) [mg/kg] γ (NO3

-) [mg/kg] γ (C2O4

-2) [mg/kg]

55 °C 439 530 1923

75 °C 573 599 1957

90 °C 691 706 1943

Glede na dobljene rezultate smo se odločili, da ekstrakcijo izvajamo pri najvišji temperaturi

(90 °C), saj je učinkovitost ekstrakcije nitratnih ionov povišala za skoraj 25 % in kloridnih za

več kot 35 %. Sprememba temperature na ekstrakcijo oksalatnih ionov nima izrazitega vpliva.


53

4.1.3 Vpliv Tween 80-reagenta

Po pregledu literature smo ugotovili, da podaja podatek, da uporaba Tween 80-reagenta

izboljšuje ekstrakcijo nitratnega iona. [52]

Vzorca 24A in 24B sta bila pripravljena z metodo »Ultra-Turraxa« in vodne kopeli pri 75 °C,

brez uporabe Tween 80-reagenta.


z 1-% koncentracijo Tween 80-reagenta.


z 1-% koncentracijo Tween 80-reagenta.

Tabela 4: Tween 80-reagent

Vzorec γ (Cl

-) [mg/kg] γ (NO3

-) [mg/kg] γ (C2O4

-2) [mg/kg]

24A 909 487 54078

24B 900 496 55081

905 492 54580

26A 900 517 57378

26B 915 465 51559

908 491 54469

27A 906 479 53147

27B 864 476 52742

885 478 52945

Iz Tabele 4 je razvidno, da uporaba Tween 80-reagenta bistveno ne izboljša ekstrakcije

nitratnih anionov, zato ga pri nadaljnjem eksperimentalnem delu nismo dodajali.

4.1.4 Izkoristek ekstrakcije

Izkoristek smo izračunali tako, da smo izračunali razliko med koncentracijami osnovnega

vzorca in koncentracijami vzorca, ki smo mu dodali znano količino anionov (50 % in 100 %

dodatek vseh anionov, glede na prvotno koncentracijo v vzorcu). Dobljeno razliko smo

primerjali z znano dodano koncentracijo, ki predstavlja 100 %.


54

Vzorec 102 v pred analizi vsebuje: (NO3-) = 9,5 mg/l, (Cl

-) = 11,5 mg/l, (C2O4

2-) = 12

mg/l.

Tabela 5: Dodatek anionov za učinkovitost ekstrakcije

Standardna raztopina (γ0 = 1000 mg/L) VCl- [µL] VNO3

- [µL] V C2O4

2- [µL]

50 % dodatek 288 238 300

100% dodatek 575 475 600

Tabela 6: Učinkovitost ekstrakcije

Vzorec/ion γ (Cl

-) [mg/kg] γ (NO3

-) [mg/kg] γ (C2O4

-2) [mg/kg]

102 A 10,4 11,3 18,6

102 B 10,5 11,2 18,6

(102A + 102B) 10,4 11,2 18,6

102A + 50 % 16,8 14,8 23,3

102B + 50 % 16,9 14,5 23,4

((102A +50 %) + (102B+50 %)) 16,8 14,7 23,4

102A + 100 % 23,4 19,6 29,1

102B + 100 % 23,9 19,9 29,0

((102A +100 %) + (102B+100 %)) 23,7 19,8 29,1

∆γ (50 %) [mg/kg] 6,4 3,5 4,8

Ŋ (50 %) [%] 112 74 80

∆γ (100 %) [mg/kg] 13,3 8,6 10,5

Ŋ (100 %) [%] 115 90 88

Ugotovili smo, da je izkoristek ekstrakcije zadovoljiv in se nahaja v območju predvidenega

odstopanja 100 ± 15 %.


55

4.2 Vpliv mobilne faze na obliko kromatograma in čas analize

4.2.1 Sestava mobilne faze

Mobilno fazo moramo vedno prilagoditi vzorcu, ki ga analiziramo, tako da dobimo čim večjo

ločljivost za ione, ki jih kvantitativno določamo.

Mobilna faza 1

c (Na2CO3)= 2,7 mM

c (NaHCO3)= 0,3 mM

Mobilno fazo 1 smo pripravili tako, da smo v 1-L bučko odmerili 9 mL 0,3 mol/L Na2CO3 in

1 mL 0,3 mol/L NaHCO3 ter do oznake napolnili z Milli-Q vodo. Bučko smo nato dali v UZ-

kopel za 15 min, ter raztopino prenesli v rezervoar za mobilno fazo, ki je bila del sistema.

Iz sike 16 je lepo razvidno, da se vrhova, ki se eluirata pri 5,259 min in 5,695 min, prekrivata

in ne dajeta ustrezne ločljivosti, da bi ione lahko kvantitativno določili, zato smo sestavo

mobilne faze spremenili.

Slika 16: Kromatogram vzorca 35 A mobilne faze 1

Cl-

NO3-

C2O42-


56

Mobilna faza 2

c (Na2CO3)= 2,0 mM

c (NaHCO3)= 1,0 mM

Mobilno fazo 2 smo pripravili tako, da smo v 1-L bučko odmerili 6,67 mL 0,3 mol/L Na2CO3

in 3,33 mL 0,3 mol/L NaHCO3 ter do oznake napolnili z Milli-Q vodo. Bučko smo nato dali v

UZ-kopel za 15 min, ter raztopino prenesli v rezervoar za mobilno fazo, ki je bila del sistema.

Slika 17: Kromatogram vzorce 35 A mobilne faze 2

Uporaba mobilne faze 2 nam daje ţeleno ločljivost za kloridne, nitratne in oksalatne ione.

Vsak vrh je ločen od naslednjega, njihove površine pa se ne prekrivajo.

Tabela 7: Stabilnostni parametri analitske metode

Ion/ Parameter tr W1/2 N k` R

Cl- 2,618 4,0 4925 1,0 3,3

NO3- 5,244 9,0 3849 2,98 10,0

C2O42-

9,335 19,4 2723 6,19 3,1

NO3- C2O4

2-

Cl-


57

4.2.2 Kvalitativna določitev anionov v vzorcu s pomočjo standardne raztopine

Kateri vrh pripada kateremu anionu smo določili tako, da smo v sistem injicirali standardno

raztopino, ki je vsebovala določevalne anione. Pri enakih pogojih smo nato injicirali še vzorec

in tako ugotovili, pri katerem času se določen anion eluira.

Slika 18 prikazuje kromatogram standardne raztopine 4, ki nam daje osnovne podatke o ionih.

Realni vzorec z uporabljenimi podatki prikazuje Slika 17.

Slika 18: Kromatogram standardne raztopine 4

(NO3-) = 8 mg/l, (Cl

-) = 8 mg/l, (C2O4

2-) = 12 mg/l

tr (Cl-) = 2,638 min

tr (NO3-) = 5,237 min

tr (C2O4-2

) = 9,272 min

Cl-

NO3-

C2O42-


58

4.2.3 Vpliv pretoka na čas analize in obliko kromatograma

Ko smo izbrali optimalno sestavo mobilne faze, smo študirali še vpliv pretoka, ki ga izberemo

tako, da je čas analize čim krajši, ločljivost pikov pa še zmeraj nespremenjena.

Pretok: 0,8 mL/min

Slika 19: Kromatogram vzorca 37 A pri pretoku 0,8 mL/min

tr (Cl-) = 5,177 min

tr (NO3-) = 10,385 min

tr (C2O4-2

) = 19,822 min

Pri pretoku 0,8 mL/min je čas analize nad 20 min in retencijski faktorji (k`) vseh ionov se

povišajo, kar ni zaţeleno.

Cl-

NO3-

C2O42-


59

Pretok: 1,3 mL/min


tr (Cl-) = 3,183 min

tr (NO3-) = 6,375 min

tr (C2O4-2

) = 12,215 min

Kadar imamo pretok 1,3 mL/min je retencijski faktor (k`) oksalatnega iona nezadovoljiv, saj

presega optimalni dovoljeni interval [1 < k` < 5] in tudi čas, ki je potreben za eno analizo je

nad 13 min.

Cl-

NO3-

C2O42-


60

Pretok: 1,8 mL/min


tr (Cl-) = 2,280min

tr (NO3-) = 5,237 min

tr (C2O4-2

) = 9,272 min

Na kromatogramu ni videti eluiranega oksalatnega aniona.

Pretok 1,8 mL/min zadovolji vse analizne pogoje, kot so dobra ločljivost in kratek čas analize,

vendar smo za delo izbrali pretok 1,5 mL/min, pri katerem so vsi retencijski faktorji

sprejemljivi, čas analize pa pod 10 min.

Cl-

NO3-


61

4.3 Validacija

Validacijske parametre vedno preverimo, kadar uvajamo novo analizno metodo. Z njimi

potrdimo pravilnost analiznih rezultatov.

4.3.1 Natančnost

Običajno jo podajamo kot standardni odmik (s). Čim manjši je standardni odmik, bolj

natančna je metoda. Ločimo dve vrsti natančnosti: ponovljivost in obnovljivost.

4.3.1.1 Ponovljivost

Ponovljivost je natančnost, dobljena na podlagi rezultatov meritev pri ponovljivih pogojih

(ista metoda, isti reagent, isti analitik, isti laboratorij in ista oprema). Za določitev

ponovljivosti smo izvedli 6 ponovitev injiciranj standardne raztopine 3 v čim krajšem obdobju

ob čim bolj konstantnih merilnih pogojih.

Standardna raztopina 3 vsebuje: (NO3-) = 4 mg/l, (Cl

-) = 4 mg/l, (C2O4

2-) = 8 mg/l.

Tabela 8: Ponovljivost standardnih raztopin

γ [mg/L] Standardna raztopina 3

n Std 3 Cl- NO3

- C2O4

2- (Cl

-) (NO3

-) (C2O4

2-)

1

A

(Površina)

139164 72482 151798 4,1 4,1 7,8

2 133762 69498 150269 3,9 4,0 7,8

3 134574 70631 156975 4,0 4,0 8,1

4 135694 69239 152391 4,0 4,0 7,9

5 138956 71126 151589 4,1 4,1 7,8

6 134594 70691 153954 4,0 4,0 7,9

Povprečje 136124 70611 152829 4,0 4,0 7,9

SD 2357 1174 2358 0,1 0,1 0,1

RSD [%] 1,7 1,7 1,5 1,6 1,4 1,4


62

Tabela 9: Ponovljivost vzorca

n/ (Cl-)

1 53,7 123,2

2 52,7 126

3 53,9 130,3

4 56,2 132,6

5 56 134,1

6 51,7 136

54 130,4

SD 1,8 4,9

RSD [%] 3,3 3,8

Tabela 8 nam podaja površine in izmerjene koncentracije standardnih raztopin kloridnih in

nitratnih ionov prek linearne regresije. Relativni standardni odmik (RSD) je v obeh primerih

primerljiv in znaša od 3,3 % do 3,8 %. S tem smo potrdili in dosegli ustrezno ponovljivost.

Na podlagi tega podatka lahko sklepamo, da je metoda ponovljiva.

4.3.1.2 Obnovljivost

Obnovljivost je natančnost, dobljena na podlagi rezultatov meritev pri obnovljivih pogojih

(ista metoda, isti vzorec, drugi analitik, daljše časovno obdobje analize, različni laboratorij,

različna oprema). Obnovljivost obravnavamo podobno kot ponovljivost; 9 dni smo injicirali

po izbrano standardno raztopino.

V roku 9-ih dni smo vsak dan injicirali standardno raztopino 3, ki vsebuje: (NO3-) = 4 mg/l,

(Cl-) = 4 mg/l, (C2O4

2-) = 8 mg/l.


63

Tabela 10: Obnovljivost

Standardna raztopina 3

dan / ion Cl- NO3

- C2O4

2- (Cl

-) (NO3

-) (C2O4

2-)

1

. dan

A

(Površina)

111988 56937 131783 4,3 4,2 8,7

101835 53698 128309 3,9 4,0 8,5

102031 53764 126704 3,9 4,0 8,4

Povprečje 105285 54799 128932 4,0 4,0 8,5

SD 5806 1851 2596 0,2 0,1 0,2

RSD [%] 5,5 3,4 2,0 5,4 3,3 1,8

2

. dan

A

(Površina)

119058 60138 144828 3,7 3,8 8,1

133652 63523 144896 4,1 4,0 8,1

126855 64852 143891 3,9 4,1 8,1

Povprečje 126521 62838 144538 3,9 4,0 8,1

SD 7303 2431 562 0,2 0,1 0,0

RSD [%] 5,8 3,9 0,4 5,6 3,6 0,4

3

. dan

A

(Površina)

129102 67170 156303 3,9 3,8 8,3

131578 69394 151848 4,0 3,9 8,0

133486 71091 157156 4,0 4,0 8,3

Povprečje 131389 69218 155102 4,0 3,9 8,2

SD 2198 1966 2850 0,1 0,1 0,1

RSD [%] 1,7 2,8 1,8 1,6 2,9 1,8


64

4

. dan

A

(Površina)

131752 90578 162036 3,7 4,5 8,3

132125 67027 156385 3,7 3,5 8,1

134185 70007 158240 3,7 3,7 8,1

Povprečje 132687 75871 158887 3,7 3,9 8,2

SD 1310 12823 2881 0,0 0,5 0,1

RSD [%] 1,0 16,9 1,8 0,8 14,0 1,7

5

. dan

A

(Površina)

139164 72482 151798 4,1 4,1 7,8

133762 69498 150269 3,9 4,0 7,8

134574 70631 156975 4,0 4,0 8,1

Povprečje 135833 70870 153014 4,0 4,0 7,9

SD 2913 1506 3514 0,1 0,1 0,2

RSD [%] 2,1 2,1 2,3 2,0 1,8 2,1

6

. dan

A

(Površina)

128663 66347 147067 3,8 3,8 8,3

140690 72251 157202 4,1 4,2 8,8

135997 70522 155758 4,0 4,1 8,7

Povprečje 135116 69707 153342 4,0 4,0 8,6

SD 6062 3035 5482 0,2 0,2 0,3

RSD [%] 4,5 4,4 3,6 4,6 4,4 3,3

7. dan

A

(Površina)

118090 57537 139183 3,9 3,8 8,5

117738 57323 137349 3,9 3,8 8,4


65

120513 62276 144913 4,0 4,1 8,8

Povprečje 118780 59045 140482 3,9 3,9 8,5

SD 1511 2800 3946 0,1 0,2 0,2

RSD [%] 1,3 4,7 2,8 1,3 4,6 2,8

8

. dan

A

(Površina)

136211 55394 157218 3,9 3,8 9,1

136997 55369 150705 3,9 3,8 8,7

138910 56899 153297 4,0 3,9 8,9

Povprečje 137373 55887 153740 4,0 3,8 8,9

SD 1388 876 3279 0,0 0,1 0,2

RSD [%] 1,0 1,6 2,1 1,0 1,7 2,2

9

. dan

A

(Površina)

142730 72465 145387 3,9 4,0 8,8

143796 71097 147102 4,0 3,9 8,9

142663 70628 144207 3,9 3,9 8,7

Povprečje 143063 71397 145565 4,0 4,0 8,8

SD 636 954 1456 0,0 0,1 0,1

RSD [%] 0,4 1,3 1,0 0,4 1,3 1,0

Tabela 10 nam podaja podatke o površinah in koncentracijah kloridnih, nitratnih in oksalatnih

ionov, ki smo jih dosegli prek linearne premice, tako da smo vsakodnevno določali

koncentracije standardnih raztopin in vzorcev. Ugotovljeno je, da relativni standardni odmiki

(RSD) vsakodnevnih meritev v območju od 0,4 % do 14 %.


66

4.3.2 Pravilnost

Pravilnost določimo z dodajanjem znane koncentracije merjene komponente v matrično

raztopino in z merjenjem pripadajočih signalov.

Pravilnost metode smo določili tako, da smo v vzorec dodali znano količino analita, in sicer

na ustreznem koncentracijskem nivoju. Zanesljivost smo podali kot odstotek izkoristka med

dodano in z analizo izmerjeno vsebnostjo.

V vzorec 84 A smo dodali standardno raztopino 4 ( (NO3-) = 8 mg/l, (Cl

-) = 8 mg/l,

(C2O42-) = 12 mg/l) v razmerju 1:1. V vialo smo odmerili 0,5 ml vzorca in dodali še 0,5 ml

standardne raztopine 4. S tem smo v vzorec dodali 4 mg/L Cl- in NO3

- ter 6 mg/L C2O4

2-.

Pripravljeno raztopino in sam vzorec (84 A) smo injicirali v treh ponovitvah.

Kot rezultat so v Tabeli 12 podane vrednosti vseh injiciranj, povprečne vrednosti, standardni

odmik, relativni standardni odmik, BIAS in izkoristek (η), ki lahko odstopa za 100 ± 15 % in

ga podajamo prek vrednosti BIAS.


67

Tabela 11: Pravilnost

A (vzorec) – dobljeno A (Vzorec : Std 4= 1:1) – dodano

n A (Cl-) A (NO3

-) A (C2O4

2-) A (Cl

-) A( NO3

-) A (C2O4

2-)

1 441173 279246 176349 364027 240269 146061

2 423676 280327 166675 411789 245893 152696

3 449825 295079 164050 393286 266589 146296

Povprečje 438225 284884 169025 389701 250917 148351

SD 1332 8846 6477 24082 13861 3765

RSD [%] 3,0 3,1 3,8 6,2 5,5 2,5

n/Parameter η (Cl-) η (NO3

-) η (C2O4

2-) BIAS (Cl

-) BIAS (NO3

- ) BIAS (C2O4

2- )

1 121,2 116,2 120,7 21,2 16,2 20,7

2 102,9 114,0 109,2 2,9 14,0 9,2

3 114,4 110,7 112,1 14,4 10,7 12,1

Povprečje 112,8 113,6 114,0 12,8 13,6 14,0

SD 9,3 2,8 6,0 9,3 2,8 6,0

RSD [%] 8,2 2,5 5,3 72,1 20,3 43,7

V Tabeli 11 so podatki, ki nam podajajo vrednosti, s katerimi lahko izračunamo BIAS in

izkoristek. Izkoristki koncentracij vseh ionov sovpadajo ţeleno vrednostjo 100 ± 15 %.


68

4.3.3 Meja zaznavnosti (LOD) in meja določljivosti (LOQ)

Meja zaznavnosti je najmanjša koncentracija analizirane snovi v vzorcu, ki jo kvalitativno

zaznamo. Meja določljivosti je najniţja koncentracija merjenega elementa, ki jo kvantitativno

določimo z zadovoljivo točnostjo in natančnostjo.

Zavedati se moramo, da sta to teoretična podatka, ki lahko v praksi mnogokrat zatajita.

LOD in LOQ smo določili z linearno regresijo. Takšno določevanje LOD in LOQ se lahko

aplicira v vseh primerih validacije, saj nima predpisanih omejitev in je tudi najbolj

uporabljena, kadar aparatura, na kateri izvajamo analize, ne daje šumov v ozadju. [49]

LOD in LOQ lahko izračunamo, tudi s pomočjo naslednjih enačb [51]:

(2.20)

(2.21)

4.3.3.1 LOD in LOQ za kloridne ione

Tabela 12: LOD in LOQ za kloridne ione

Parametri Vrednosti

s(y/x): 2969,5

sb0 2203,2

n 5

b1 26761

LOD 0,3 mg/L

LOQ 0,8 mg/L

= 0,1 + 3 * 0,074 = 0,3 mg/L

= 0,1 + 10 * 0,074 = 0,8 mg/L

S pomočjo standardnega odmika naklona linearne premice in podanih enačb smo določili

mejo zaznavnosti in določitve kloridnega iona. Meja zaznavnosti je 0,3 mg/L, meja določitve

pa 0,8 mg/L. Opazimo, da med načinoma računanja LOD in LOQ ne pride do razlik.


69

4.3.3.2 LOD in LOQ za nitratne ione

Tabela 13: LOD in LOQ za nitratne ione

Parametri Vrednosti

s(y/x) 524,4

sb0 389,1

n 5

b1 13920

LOD 0,1 mg/L

LOQ 0,3 mg/L

= 0,1 + 3 * 0,02 = 0,2 mg/L

= 0,1 + 10 * 0,02 = 0,3 mg/L

Meja zaznavnosti za kloridni ion je 0,1 mg/L in meja določitve 0,3 mg/L po obeh izračunanih

načinih.

4.3.3.1 LOD in LOQ za oksalatne ione

Tabela 14: LOD in LOQ za oksalatne ione

Parametri Vrednosti

s(y/x) 13145

sb0 10294,2

n 5

b1 16587

LOD 1,8 mg/L

LOQ 6,2 mg/L

= 1,3 + 3 * 0,1 = 1,6 mg/L

= 1,3 + 10 * 0,1 = 2,3 mg/L

Meja zaznavnosti, izračunana preko standardnega odmika, znaša 2,0 mg/L in meja določitve

6,2 mg/L. Z uporabo enačb pa je meja zaznavnosti 1,6 mg/L in meja določitve 2,3 mg/L. Do

odstopanj pride zaradi večje začetne koncentracije pri linearni regresiji.


70

4.3.4 Linearnost in delovno območje

Linearnost smo določili tako, da smo izmerili različne koncentracije pripravljenih standardnih

raztopin za nitratne, kloridne in oksalatne ione.

Linearno območje za kloridne in nitratne ione je med 1 mg/L in 12 mg/L, za oksalatne ione pa

med 2 mg/L in 20 mg/l. Masne koncentracije so nam podale linearno odvisnost od površine

pikov (A) pod kromatografskim vrhom. Na podlagi dobljenih podatkov smo izračunali

regresijsko premico z metodo najmanjših kvadratov.

Vsako standardno raztopino smo injicirali trikrat in kot uporabljeno vrednost za linearnost

uporabili njihovo povprečje. Izračunali smo standardni odmik (SD) in relativni standardni

odmik (RSD). Rezultati so podani v tabelah in grafih.

Delovno območje smo ugotovili, ko smo naredili širšo analizo vzorcev. Ker so masne

koncentracije vzorcev ustrezale linearnosti, je delovno območje enako linearnosti. V tem

območju so meritve vzorcev ponovljive in obnovljive.

Preverili smo tudi homoscedastičnost za posamezen ion, in sicer tako, da smo osemkrat

injicirali najniţjo in najvišjo koncentracijo pri enakih pogojih. Iz ponovitev smo izračunali

standardni odmik (SD).


71

4.3.4.1 Umeritvena krivulja za kloridne ione

Graf 1: Umeritvena krivulja za kloridne ione

Tabela 15: Umeritvena krivulja za kloridne ione

A/Std 1 2 3 4 5

A1 23095 53464 111988 206800 326448

A2 24312 50201 101835 210978 321503

A3 23159 58835 102031 207420 315945

23522 5416 105285 208399 321299

SD 685 4360 5806 2255 5254

RSD [%] 2,9 8,0 5,5 1,1 1,6

Umeritvena premica: y = b0 + b1 x

Naklon premice: b1 = 26761

Odsek na ordinati: b0 = -1941

Korelacijski faktor: R2

= 0,9996

Koeficient kvalitete QC= 0,81 %

y = 26761x - 1941 R² = 0,9996

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0 2 4 6 8 10 12 14

Po

vrši

na

γ(mg/L)


72

Homoscedastičnost

Tabela 16: Homoscedastičnost kloridnih ionov

A (1 mg/L) 23095 23312 23159 23659 23698 23596 23187 22544

SD 381,4

A (12 mg/L) 326448 326503 326945 326495 326985 326962 326159 326485

SD 303,6

Ftab (0,05; 7,7) = 4,99

Ugotovili smo, da je v izbranem območju koncentracij od 1 mg/L do 12 mg/L standardne

raztopine kloridnih ionov umeritvena krivulja linearna, saj je korelacijski koeficient 0,9996.

4.3.4.2 Umeritvena krivulja za nitratne ione

Graf 2: Umeritvena krivulja za nitratne ione

y = 13920x - 1346,6 R² = 0,9999

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 2 4 6 8 10 12 14

Po

vrši

na

γ(mg/L)


73

Tabela 17: Umeritvena krivulja za nitratne ione

A/Std 1 2 3 4 5

A1 10344 26348 56937 109101 168254

A2 13253 25375 53698 112523 167320

A3 12399 28109 53764 109507 160419

11999 26611 54800 110377 165331

SD 1495 1386 1851 1870 4280

RSD [%] 12,5 5,2 3,4 1,7 2,6



Odsek na ordinati: b0 = -1346,6


= 0,9999

Koeficient kvalitete QC = 0,28 %

Homoscedastičnost

Tabela 18: Homoscedastičnost nitratnih ionov

A (1 mg/L) 13244 13253 12399 13458 11591 12487 13625 11248

SD 886

A (12 mg/L) 168541 167322 167419 166895 167914 167523 165497 168213

SD 935,3

Ftab (0,05; 7, 7) = 4,99


raztopine nitratnih ionov umeritvena krivulja linearna, saj je korelacijski koeficient 0,9999.


74

4.3.4.3 Umeritvena krivulja za oksalatne ione

Graf 3: Umeritvena krivulja za oksalatne ione

Tabela 19: Umeritvena krivulja za oksalatni ion

A/Std 1 2 3 4 5

A1 28272 28242 131783 182447 324710

A2 32597 33692 128309 192553 318090

A3 30261 35373 126704 189825 309228

30377 32436 128932 188275 317343

SD 2165 3728 2596 5228 7768

RSD [%] 7,1 11,5 2,0 2,8 2,4



Odsek na ordinati: b0 = -12544


=0,9909

Koeficient kvalitete QC= 3,63 %

y = 16587x - 12544 R² = 0,9909

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0 5 10 15 20 25

Po

vrši

na

γ(mg/L)


75

Homoscedastičnost

Tabela 20: Homoscedastičnost oksalatnih ionov

A(1mg/L) 28272 32597 30261 29651 28459 29365 31023 30125

SD 1401,7

A(12mg/L) 324710 328090 324228 325597 325954 325155 322452 324526

SD 1611,2

1,32

Ftab (0,05; 7,7) = 4,99


raztopine nitratnih ionov umeritvena krivulja linearna, saj je korelacijski koeficient 0,9909.

Homoscedastičnost

S pomočjo F-testa smo primerjali standardne odmike na najvišjem (12 mg/L) in najniţjem (1

mg/L) koncentracijskem območju za nitratni in kloridni ion ter na najniţjem (2 mg/L) in

najvišjem (20 mg/L) koncentracijskem območju za oksalatni ion. Za podatke za izračune smo

uporabili površine pod krivuljo.

Ugotovili smo, da se variance na zgornjem in spodnjem koncentracijskem nivoju bistveno ne

razlikujejo pri vseh omenjenih ionih. Meritve vseh ionov zadostujejo homoscedastičnosti, saj

Fizrač < Ftab.

4.3.5 Stabilnost

V delo smo vključili tudi študijo stabilnosti, ki nam podaja podatek, ali je analit skozi daljše

časovno obdobje stabilen. Pripravljeno standardno raztopino smo injicirali devet dni v treh

ponovitvah. Standardno raztopino smo hranili v hladilniku pri 4 °C. Kot rezultat smo izrisali

diagrame, ki predstavlja koncentracije standardnih raztopin v odvisnosti od časa analiz in

izračunali standardni odmik (SD), relativni standardni odmik (RSD) in povprečno

koncentracijo.


76

4.3.5.1 Stabilnost kloridnih ionov

Koncentracija pripravljene standardne raztopine kloridnega iona je 4 mg/L.

SD (Cl-) = 0,1

RSD (Cl-)= 2,6 %

= 3,9 mg/L

Graf 4: Časovna stabilnost kloridnih ionov

4.3.5.2 Stabilnost nitratnih ionov

Koncentracija pripravljene standardne raztopine nitratnega iona je 4 mg/L.

SD (NO3-) = 0,07

RSD (NO3-) = 1,8 %

= 3,9 mg/L

Graf 5: Časovna stabilnost nitratnih ionov

0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ko

nce

ntr

acija

Cl-

(m

g/L)

Čas (dan)

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ko

nce

ntr

acija

NO

3- (m

g/L)

Čas (dan)


77

4.3.5.3 Stabilnost oksalatnih ionov

Koncentracija pripravljene standardne raztopine oksalatnega iona je 8 mg/L.

SD (C2O42-

) = 0,33

RSD (C2O42-

) = 3,9 %

= 8,4 mg/L

Graf 6: Časovna stabilnost oksalatnih ionov

Relativni standardni odmiki za vse anione so v območju od 1,8 % do 3,9 %. S tem smo

potrdili stabilnost standardnih raztopin skozi daljše časovno obdobje (9 dni).

4.3.6 Grubbs-Beckov test

Grubbs-Beckov test smo preverili pri:

ponovljivosti standardnih raztopin (Tabela 5: Ponovljivost standardne raztopine)

ponovljivosti vzorca (Tabela 6: Ponovljivost vzorca)

pravilnosti (Tabela 10: Pravilnost)

Statistični test je pokazal, da ni meritev, ki bi se signifikantno razlikovale od ostalih meritev.

Dokazano med njimi ni ubeţnikov.

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9Ko

ncn

trac

ija C

2O4 2-

(mg/

L)

Čas (dan)


78

5 Zaključek

Realne vzorce tara smo ekstrahirali po postopku trdno-tekoče ekstrakcije. Na ionski

kromatografiji (IC) smo validirali analizno metodo za analiziranje tarovega ekstrakta. Z

omenjeno metodo smo analizirali kloridni, nitratni in oksalatni ion.

Ekstrakcijo smo prilagodili tako, da smo dobili največji izkoristek vseh preiskovalnih ionov.

Ekstrakcijo smo izvajali tako, da smo pri pripravi vzorca uporabili »Ultra-Turrax« in nato

bučko dali na vodno kopel, ki je imela 90 °C. Končani ekstrakt vzorca smo trikrat

centrifugirali in ga prefiltrirali skozi HPLC-filter. Uporaba Tween 80-reagenta ni bistveno

izboljšala ekstrakcije anionov, zato ga nismo uporabili. Izkoristek ekstrakcije je v območju

100 ± 15% (Tabela 6).

Linearno območje za kloridne in nitratne anione je od 1 mg/L do 12 mg/L in za oksalatne od 2

mg/L do 20 mg/L. LOD znaša za nitratne anione 0,1 mg/L, za kloridne 0,3 mg/L in oksalatne

2,0 mg/L. LOQ za nitratne, kloridne in oksalatne ione je 0,3 mg/l, 0,8 mg/L in 6,2 mg/L.

Obstojnost standardih raztopin kloridnih, nitratnih in oksalatih ionov, ki jih hranimo v

hladilniku na -2°C je 30 dni. Ponovljivost, obnovljivost in pravilnost anionov (Tabela 8,

Tabela 9, Tabela 10 in Tabela 11) je ustrezna, saj je RSD za vse določevalne anione v

območju 100 ± 15 %.


79

6 Literatura

[1] Sefa-Dedeh S., Agyir-Sackey E. K. Chemical composition and the effect of processing on

oxalate content of cocoyam Xanthosoma sagittifolium and Colocasia esculenta cormels. Food

Chemistry, 85, 479–487, 2004.

[2] Katz E. Quantitative Analysis using Chromatograaphc Techniques. John Wiley &

Sons,1987

[3] Horrocks M., Grant-Mackie J., Matisoo-Smith E. Introduced taro (Colocasia esculenta)

and yams (Dioscorea spp.) in Podtanean (2700–1800 years BP) deposits from Me´ Aure´

Cave (WMD007), Moindou, New Caledonia. Journal of Archaeological Science, 35 (1) 169–

180, 2008.

[4] O’Sullivan J. N., Asher C. J., Blamey F. P. C. Nutritional disorders of taro. Canberra:

Australian Centre for International Research, 1996.

[5] Irwin S. V., Kaufusi P., Banks K., de la Pen a R., Cho J. J. Molecular characterization of

taro (Colocasia esculenta) using RAPD markers. Euphytica 99, 183–189, 1998.

[6] Lebot V. Biomolecular evidence for plant domestication in Sahul. Genetic Resources and

Crop Evolution, 46, 619–628, 1999.

[7] Lebot V., Aradhya K. M. Isozyme variation in taro Colocasia esculenta (L.) Schott from

Asia and Oceania. Euphytica, 56, 55–66, 1991.

[8] Noyer J. L., Billot C., Weber A., Quero-Garcia J., Lebot V. Genetic diversity of taro

(Colocasia esculenta (L.) Schott) assessed by SSR markers. V: Guarino L., Taylor M. (ur.)

Proc. of the 3rd Int. Taro Symp. (SPC-IPGRI-FAO-CIRAD), Nadi, Fiji. 21–23 May 2003.

Secretariat of the Pacific Community, Noumeá, New Caledonia, 2006.

[9] Kreike C. M., Van Eck H. J., Lebot V. Genetic diversity of taro, Colocasia esculenta (L.)

Schott, in Southeast Asia and the Pacific. Theoretical and Applied Genetics, 9, 761–768,

2004.

[10] Lebot V., Prana M. S., Kreike N., Van Eck H., Pardales J., Okpul T., Gendua T.,

Thongjiem M., Hue H., Yap T. C. Characterisation of taro (Colocasia esculenta (L.)Schott)

genetic resources in Southeast Asia and Oceania Genetic Resources and Crop Evalution.

51(4), 381–392, 2004.


80

[11] Deo P. C., Harding R. M., Taylor M., Tyagi A. P. , Becker D. K. Somatic embryogenesis,

organogenesis and plant regeneration in taro (Colocasia esculenta var. esculenta). Plant

Cell, Tissue and Organ Culture, 99, 61–71, 2009.

[12] Hanga D. T., Vanhanen L., Savage G. Effect of simple processing methods on oxalate

content of taro petioles and leaves grown in central Viet Nam. LWT – Food Science and

Technology, 50 (1), 259–263, 2013.

[13] Ivancic A., Lebot V. The Genetics and Breeding of Taro. Séries Repéres MAD,

Montpellier, France, 2000.

[14] Huang C.-C., Chen W.-C., Wang C.-C. R. Comparison of Taiwan paddy- and upland-

cultivated taro (Colocasia esculenta L.) cultivars for nutritive values. Food Chemistry, 102,

250–256, 2007.

[15] Savage G. P., Vanhanen L., Mason S. M., Ross A. B. Effect of Cooking on the Soluble

and Insoluble Oxalate Content of Some New Zealand Foods. Journal of Food Composition

and Analysis, 13 (3), 201–206, 2000.

[16] Lewu M. N., Adebola P. O., Afolayan A. J.. Effect of cooking on the mineral contents

and anti-nutritional factors in seven accessions of Colocasia esculenta (L.) Schott growing in

South Africa. Journal of Food Composition and Analysis, 23 (5) 389–393, 2010.

[17] Ramanatha Rao V., Matthews P. J., Eyzaguirre P. B., Hunter D The Global Diversity of

Taro: Ethnobotany and Conservation. Rim: Bioversity International, 2010.

[18] Sunell L. A., Healey P. L. Distribution of calcium oxalate crystal idioblasts in corms of

taro (colocasia esculenta). American Journal of Botany, 66 (9), 1029–1032. 1979.

[19] Savage G. P., M rtensson L., Sedcole J. R. Composition of oxalates in baked taro

(Colocasia esculenta var. Schott) leaves cooked alone or with additions of cows milk or

coconut milk. Journal of Food Composition and Analysis, 22 (1) 83–86, 2009.

[20] Catherwood D. J., Savage G. P., Mason S. M., Scheffer J. J. C., Douglas J. A., Oxalate

content of cormels of Japanese taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) and the effect of

cooking. Journal of Food Composition and Analysis 20, 147–151, 2007.

[21] Slowinski E. J., Masterton W. L. Qualitative Analysis and the Properties of the Ions in

Aqueous Solutions. W.B. Saunders Company, 1971.

[22] Leskošek M. Gnojenje. Ljubljana: Kmečki glas, 1993.


81

[23] Xu G., Magen H., Tarchitzky J., Kafkafi U. Advances in Chloride Nutrition of Plants.

Advances in Agronomy, 68, 2000.

[24] White P. J., Broadley M. R. Chloride in Soils and its Uptake and Movement within the

Plant: A Review. Annals of Botany, 88: 967–988, 2001.

[25] Esna–Ashar M, Gholami M. The effect of increased chloride Cl-) Content in nutrient

solution on yield and Quality of strawberry (Fragaria Ananassa Duch.) Fruits. Journal of

Fruit and Ornamental Plant Research, 18 (1), 37–44, 2010

[26] Kač M. Kemija. Trţič: Tisk Euroadria d.o.o, 2007 (zbirka Tematski leksikoni).

[27] Forde B. G. Nitrate transporters in plants: structure, function and regulation.

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1465 (1–2), 219–235, 2000.

[28] Glass A. D. M., Britto D. T., Kaiser B. N., Kinghorn J. R., Kronzucker H. J., Kumar A.,

Okamoto M., Rawat S., Siddiqi M. Y., Unkles S. E., Vidma J. J. The regulation of nitrate and

ammonium transport systems in plants. Journal of Experimental Botany, 53 (370), Anorganic

Nitrogen Assimilation: Special Issue, 855–864, 2002.

[29] Lejay L., Tillard P., Lepetit M., Olive F. D., Filleur S., Daniel-Vedele F., Gojon A.

Molecular and functional regulation of two NO3- uptake systems by N- and C-status of

Arabidopsis plants. The Plant Journal, 18 (5), 509–519, 1999.

[30] Tylova-Munzarova E., Lorenzen B., Brix H., Votrubova O. The effects of NH4+ and NO3

-

on growth, resource allocation and nitrogen uptake kinetics of Phragmites australis and

Glyceria maxima. Aquatic Botany, 81 (4), 326–342, 2005.

[31] C rdenas-Navarro R., Adamowicz S., Robin P. Nitrate accumulation in plants: a role for

water. Journal of Experimental Botany, 50 (334), 613–624, 1999.

[32] Kant S., Kant P., Lips H., Barak Albert S. Partial substitution of NO3-

by NH4+

fertilization increases ammonium assimilating enzyme activities and reduces the deleterious

effects of salinity on the growth of barley. Journal of Plant Physiology, 164, 303–311, 2007.

[33] Dan T. H., Brix H. Growth responses of the perennial legume Sesbania sesban to NH4

and NO3 nutrition and effects on root nodulation. Aquatic Botany, 91 (3), 238–244, 2009.

[34] Kilironomos et al. Applied Soil Ecology 12, 1999.


82

[35] Oscarsson K. V., Savage G. P. Composition and availability of soluble and insoluble

oxalates in raw and cooked taro (Colocasia esculenta var. Schott) leaves. Food Chemistry,

101 (2), 559–562, 2007.

[36] Aboubakar, Njintang N. Y., Scher J., Mbofung C. M. F. Texture, microstructure and

physicochemical characteristics of taro (Colocasia esculenta) as influenced by cooking

conditions. Journal of Food Engineering, 91 (3) 373–379, 2009.

[37] Knez Ţ., Škrget M. Termodifuzijski separacijski procesi, Maribor: Tiskarna tehniških

fakultet, 2009

[38] P. Kuban and B. Karlberg. Simultaneous Determination of Small Cations and Anions by

Capillary Electrophoresis. Anal. Chem, 70, 360-365, 1998

[39] Crompton T. R. Determination of Anions: A Guide for the Analytical Chemis. Berlin:

Springer, 1996

[40] Brodnjak Vončina D. Analizna kemija I. Zbrano gradivo. Maribor: Fakulteta za kemijo in

kemijsko tehnologijo, 2011.

[41] Ţorţ M. HPLC. Ljubljana: samozaloţba, 1991.

[42] Krajnc D. Merilna negotovost pri določevanju anionov z ionsko kromatografijo.

Diplomsko delo. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2001.

[43] McMahon G. Analytical Instrumentation: A Guide to Laboratory, Portable and

Miniaturized Instruments, 1st ed., Wiley, 2007.

[44] Kolar M. Instrumentalna analiza. Zapiski predavanj, 2012.

[45] Zalar L. Določanje anionov z ionsko kromatografijo. Diplomsko delo. Maribor: Fakulteta

za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2012

[46] Analytical Chemistry

https://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_sens.html (dostop 15. 7. 2014).

[47] Slovenska akreditacija Merilna negotovost pri kemijskem preskušanju v skladu s

standardom sist en iso/iec 1702, tretja izdaja, 2005.

[48] Jackson P. E., Ion chromatography principles and applications. Elsevier Science B.V,

1990


83

[49] Miller J. N., Miller J. C. Statistics and Chemomoetrics for Analytical Chemistry, 6th

ed.

Pearson, 2010.

[50] Brodnjak Vončina D. Industrijska analiza. Zbrano gradivo, Maribor, 2007.

[51] Shrivastava A., Gupta V. B. Methods for the determination of limit of detection and limit

of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists, 2 (1), 21–25, 2011.

[52] Natsuko I. K., Keitaro T., Atsushi H., Takayuki S., Akihiko N.,Naoko I., Akimasa

Nakano, Satoru N., and Tomoko M. N. Analysis of the Mineral Composition of Taro for

Determination ofGeographic Origi. J. Agric. Food Chem, 59, 4412–4417, 2011


84

7 Priloge

7.1 Kromatogram standardne raztopine


85


86

7.2 Kromatogram vzorca 52 A


87

Curriculum vitae

OSEBNI PODATKI Anka Hotko

Veliki Obreţ 32, 8257 Dobova

031 331 966

[email protected]

Spol Ženski

Datum rojstva 01.08.1992

Državljanstvo Slovensko

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

Vpišite datum (od - do)

2012- Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru

2011-2014 Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo v Mariboru

2007-2011 Gimnazija Brežice

2000-2006 Glasbena šola Brežice

1999- 2007 Osnovna šola Dobova

KOMPETENCE - Sodelovanje v projektu: Po kreativni poti do praktičnega znanja, preko UM FKKT, (april-september 2014). Sklop: Razvoj in validacija kromatografskih metod za določevanje analitov v realnih sistemih.

- Praktično usposabljanje: Tanin Sevnica d.d (avgust, 2013)

Materni jezik Slovenščina

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

Angleščina B1 B1 B1 B1 B1

Nemščina A1 A1 A1 A1 A1

Hrvaščina C1 C1 C1 C1 B2

Računalniške kompetence obvladovanje orodij Microsoft Office™

Vozniško dovoljenje B