66
UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO Janja Ojsteršek VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA KALCIJA V VZORCIH APNENČEVE MOKE IN OVREDNOTENJE MERILNE NEGOTOVOSTI REZULTATA DOLOČITVE KALCIJA Diplomsko delo Maribor, marec 2013

VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

  • Upload
    others

  • View
    17

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

Janja Ojsteršek

VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA

DELEŽA KALCIJA V VZORCIH APNENČEVE MOKE

IN OVREDNOTENJE MERILNE NEGOTOVOSTI

REZULTATA DOLOČITVE KALCIJA

Diplomsko delo

Maribor, marec 2013

Page 2: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 2 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa

VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA KALCIJA V VZORCIH

APNENČEVE MOKE IN OVREDNOTENJE MERILNE NEGOTOVOSTI REZULTATA

DOLOČITVE KALCIJA

Študentka: Janja Ojsteršek

Študijski program: Visokošolski strokovni, Kemijska tehnologija

Smer: Kemijska tehnologija

Predvideni strokovni naslov: dipl. inž. kem. tehnol.

Mentorica: red. prof. dr. Darinka Brodnjak-Vončina

Somentor: doc. dr. Mitja Kolar

Delovni mentor: Jurij Pustinek, univ. dipl. kem.

Page 3: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 3

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Web of Knowledge (apps.isiknowledge.com)

Gesla: Število

referenc

Complexometric titration 12800

EDTA 163

Phototrode 150

Vir: COBIB-COBISS (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)

Gesla: Število

referenc

Kalcijev karbonat 104

Apnenčeva moka 9

Kompleksometrične titracije 16

EDTA 7

Izračun merilne negotovosti 22

Skupno število pregledanih člankov: 21

Skupno število pregledanih knjig: 10

Maribor, marec 2013 _____________

Podpis študentke

Page 4: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 4 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Page 5: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 5

ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Darinki Brodnjak Vončina za pomoč in vodenje pri

opravljanju diplomskega dela. Prav tako se zahvaljujem somentorju doc. dr. Mitji Kolarju.

Iskrena hvala tudi vodstvu Cinkarne Celje, ki mi je omogočilo dokončati izredni študij.

Hvala vodji Službe kakovosti mag. Karmen Rajer Kanduč in delovnemu mentorju univ.

dipl. kem. Juriju Pustinku za pomoč, podporo, spodbudne besede in strokovne nasvete.

Hvala lepa Boštjanu, Heleni, Romanu, Cilki, Jasmini, Renati, Suzani, Vesni, Gospi, Jožici,

Marjani, Margiti, Mojci, Ireni, Tatjani, Božotu, Moniki, Borisu, Aneju, Tini, Taji, Jožiju za

vse trenutke, ko sem čutila, da ste z mano.

Posebej hvala Nuši in Tajčiki, ki sta tako iskreno in zvesto držali pesti zame.

In na koncu, posebna zahvala mojima staršema in moji družini. Hvala vam, ker brez vas

mi ne bi uspelo. Vaše geslo »Saj bo…« izrekam tokrat jaz, saj bo, imela bom več časa za

vas, ki mi največ pomenite.

Še enkrat, hvala lepa vsem.

Page 6: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 6 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA

KALCIJA V VZORCIH APNENČEVE MOKE IN OVREDNOTENJE

MERILNE NEGOTOVOSTI REZULTATA DOLOČITVE KALCIJA

POVZETEK

Namen diplomske naloge je bil razviti in validirati kompleksometrično metodo za določanje

masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke z avtomatskim titratorjem in

fotometrično določitvijo končne točke s fototrodo.

V prvi stopnji razvoja preskusne metode smo pregledali obstoječo literaturo, priskrbeli

referenčni material in kemikalije ter pripravili ustrezne raztopine. Z upoštevanjem

optimalnih pogojev delovanja fototrode in z definiranjem titracijskih parametrov smo na

avtomatskem titratorju izdelali dve kompleksometrični metodi: metodo za standardizacijo

titracijske raztopine EDTA in metodo za določanje masnega deleža kalcija v vzorcih

apnenčeve moke. Po izbiri ustreznih parametrov validacijskega postopka preskusne

metode smo izvedli eksperimente, potrdili njeno primernost za predvideno uporabo in

ovrednotili merilno negotovost rezultata določitve kalcija.

Ugotovili smo, da je postopek določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve

moke primeren za predvideno uporabo. Z validacijo smo dokazali, da je preskusna

metoda natančna, točna, linearna in selektivna. Z ovrednotenjem merilne negotovosti

rezultata določitve kalcija smo določili kakovost in lažjo primerljivost rezultatov.

Ključne besede: kalcij, kalcijev karbonat, apnenčeva moka, fotometrična določitev,

fototroda, kompleksometrična titracija, končna točka, EDTA.

UDK: 543.245:[666.364:553.55](043.2)

Page 7: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 7

VALIDATION AND MEASUREMENT UNCERTAINTY FOR

DETERMINATION OF MASS FRACTION OF CALCIUM IN CALCITE

SAMPLES

ABSTRACT

The purpose of this diploma thesis was to develop and validate a complexometric method

for determination of the mass fraction of calcium in calcite samples using an automatic

titrator and a photometric endpoint detection using a phototrode.

During the initial phase of test method development the existing literature data was

explored. The acquired reference materials and chemicals, as well as the preparation of

the appropriate solutions were selected. Taking into account the optimal operating

conditions of the phototrode and by defining the titration parameters, two complexometric

methods using the titrator have been developed; namely the standardization of titrant

EDTA method and the determination of the mass fraction of calcium in calcite samples

method. After choosing the adequate characteristics of the test method validation

procedure the experiments were conducted, which confirmed the suitability of the

proposed method for its intended use. Measurement uncertainty of the results of calcium

determination was evaluated.

We established that the process for determination of mass fraction of calcium in calcite

samples is suitable for its intended use. We have shown, through validation, that the test

method is precise and accurate, as well as linear and selective. By evaluating the

measurement uncertainty of the result of calcium determination the quality and easier

comparability of the result have been established.

Keywords: calcium, calcium carbonate, calcite, photometric determination, phototrode,

complexometric titration, endpoint, EDTA.

UDC: 543.245:[666.364:553.55](043.2)

Page 8: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 8 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

VSEBINA

1. UVOD ...................................................................................................................................... 12

2. TEORETIČNI DEL................................................................................................................. 13

2.1. KOMPLEKSOMETRIČNE TITRACIJE ...................................................................... 13

2.1.1. Etilendiamintetraocetna kislina – EDTA ........................................................ 13

2.1.2. Vpliv pH na tvorbo kompleksa ......................................................................... 14

2.1.3. Princip kompleksometričnih titracij ............................................................... 15

2.1.4. Selektivnost kompleksometričnih titracij ..................................................... 16

2.1.5. Indikatorji ............................................................................................................... 16

2.1.6. Tipi kompleksometričnih titracij ...................................................................... 16

2.1.7. Titracija z avtomatskim titratorjem ................................................................. 17

2.1.8. Titracije s fototrodo ............................................................................................ 18

2.2. OSNOVE STATISTIKE ................................................................................................ 19

2.2.1. Statistični testi ..................................................................................................... 20

2.3. VALIDACIJA PRESKUSNIH METOD ....................................................................... 25

2.3.1. Selektivnost .......................................................................................................... 25

2.3.2. Linearnost ............................................................................................................. 25

2.3.3. Točnost .................................................................................................................. 25

2.3.4. Natančnost ............................................................................................................ 26

2.4. OVREDNOTENJE MERILNE NEGOTOVOSTI ....................................................... 27

3. EKSPERIMENTALNI DEL ................................................................................................... 31

3.1. MERILNA OPREMA ..................................................................................................... 31

3.2. PRIPRAVA RAZTOPIN ................................................................................................ 31

3.2.1. Raztopina klorovodikove kisline (HCl), 1:1 .................................................. 31

3.2.2. Raztopina natrijevega hidroksida, c(NaOH) = 5 mol/L .............................. 32

3.2.3. Raztopina etilendiamintetraocetne kisline, c(EDTA) = 0,03 mol/L ......... 32

3.2.4. Referenčna raztopina kalcijevega karbonata, (CaCO3) = 1,0000 g/L .... 32

3.2.5. Mureksid, indikator v prahu .............................................................................. 32

3.3. PRIPRAVA FOTOTRODE ........................................................................................... 33

3.4. IZDELAVA METOD ...................................................................................................... 34

3.4.1. Standardizacija raztopine EDTA, c(EDTA) = 0,03 mol/L ............................ 34

3.4.2. Določitev masnega deleža kalcija ................................................................... 35

Page 9: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 9

4. REZULTATI IN DISKUSIJA ................................................................................................ 37

4.1. VALIDACIJA METODE ................................................................................................ 38

4.1.1. Selektivnost .......................................................................................................... 38

4.1.2. Linearnost ............................................................................................................. 41

4.1.3. Točnost .................................................................................................................. 42

4.1.4. Natančnost ............................................................................................................ 43

4.2. IZRAČUN MERILNE NEGOTOVOSTI ...................................................................... 47

4.2.1. Definicija merjenca ............................................................................................. 47

4.2.2. Identifikacija izvorov negotovosti ................................................................... 47

4.2.3. Kvantifikacija komponent negotovosti .......................................................... 48

4.2.4. Izračun kombinirane in razširjene negotovosti ........................................... 53

5. ZAKLJUČEK .......................................................................................................................... 55

6. LITERATURA IN VIRI .......................................................................................................... 56

7. PRILOGE ................................................................................................................................ 57

7.1. Priloga A: Značilne aplikacije fototrode Mettler DP5 ......................................... 57

7.2. Priloga B: Izpis metode za določitev titra EDTA ................................................. 58

7.3. Priloga C: Izpis metode za določitev kalcija ........................................................ 61

7.4. Priloga D: Izpis titracijskih krivulj za določitev titra EDTA............................... 64

7.5. Priloga E: Izpis titracijskih krivulj za določitev kalcija ...................................... 64

7.6. Priloga F: Certifikat RM CaCO3 ................................................................................ 65

8. ŽIVLJENJEPIS ...................................................................................................................... 66

Page 10: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 10 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

SEZNAM SLIK

Slika 2 – 1: EDTA (popolnoma ionizirana oblika Y4-)

Slika 2 – 2: Strukture kompleksov EDTA s kovinskimi ioni

Slika 2 – 3: Fototroda

Slika 2 – 4: Diagram vzrokov in učinkov

Slika 3 – 1: Avtomatski titrator Mettler® T 70

Slika 3 – 2: Titracija kalcija pred (levo) in po določitvi končne točke (desno)

Slika 4 – 1: SEM analiza vzorca apnenčeve moke

Slika 4 – 2: Interferenčni učinek (% I) Fe

Slika 4 – 3: Interferenčni učinek (% I) Al

Slika 4 – 4: Prikaz linearne odvisnosti volumna KT od zatehte

Slika 4 – 5: Izmerjene vrednosti WCa v odvisnosti od zatehte

Slika 4 – 6: Standardni odmiki ponovitev meritev različnih vzorcev pod pogoji ponovljivosti

Slika 4 – 7: Standardni odmiki ponovitev meritev različnih vzorcev pod pogoji obnovljivosti

Slika 4 – 8: Diagram vzrokov in učinkov za postopek določitve kalcija

Slika 4 – 9: Prikaz deleža vpliva posameznih izvorov negotovosti na celotno negotovost

SEZNAM TABEL

Tabela 2 – 1: Disociacijske konstante EDTA

Tabela 2 – 2: Logaritemske vrednosti konstant stabilnosti za komplekse EDTA in kationov

Tabela 4 – 1: Vpliv Fe na določitev masnega deleža Ca

Tabela 4 – 2: Vpliv Al na določitev masnega deleža Ca

Tabela 4 – 3: Meritve RM CaCO3 po celotnem območju zatehte

Tabela 4 – 4: Meritve RM CaCO3 za oceno točnosti

Tabela 4 – 5: Preskus izkoristka (vzorec apnenčeve moke z dodatkom RM CaCO3)

Tabela 4 – 6: Meritve in izračuni za oceno ponovljivosti na realnih vzorcih

Tabela 4 – 7: Meritve in izračuni za oceno obnovljivosti na realnih vzorcih

Page 11: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 11

UPORABLJENE KRATICE

npr. - na primer

RM - referenčni material

CRM - certificiran referenčni material

RSD - relativni standardni odmik

KT - končna točka

SEM - vrstični elektronski mikroskop

EDTA - etilendiamintetraocetna kislina

Ca - kalcij

CaCO3 - kalcijev karbonat

UPORABLJENI SIMBOLI IN ENOTE

T temperatura °C

m masa mg, g

V volumen mL, L

n množina snovi mol

c množinska koncentracija mol/L

masna koncentracija g/L

w masni delež %

M molska masa g/mol

Page 12: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 12 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

1. UVOD

V Cinkarni Celje, d.d. proizvajamo pigmentni titanov dioksid (TiO2) po sulfatnem postopku.

Pri proizvodnji TiO2 po sulfatnem postopku iz rude ilmenita in titanove žlindre nastaja ob

primarnem produktu, pigmentu TiO2, odpadna razredčena žveplova(VI) kislina v obliki

kislih odplak. Kisle odplake ločeno zbiramo kot močno kisle in šibko kisle odplake. Del

močno kislih odplak ponovno uporabimo na razklopu, del pa pri raztapljanju sulfatov po

razklopu. Preostale močno kisle odplake in šibko kisle odplake nevtraliziramo v čistilni

napravi v dveh stopnjah z apnenčevo moko (kalcijev karbonat) in hidriranim apnom.

Pri nevtralizaciji kislih odplak z apnenčevo moko in hidriranim apnom nastaja suspenzija

sadre (CaSO4 . 2H2O) in kovinskih hidroksidov, pretežno Fe(OH)2. V Cinkarni Celje se je

nastala sadrina gošča do nedavnega v celoti odlagala na odlagališče sadre Za Travnikom.

S postavitvijo novega procesa proizvodnje Cegipsa in vgradnjo centrifuge pa smo po več

letih intenzivnega raziskovanja uspeli pričeti vrednotiti sadro (Cegips). Iz nevtralizata po

prvi stopnji nevtralizacije tako izločeni delež bele titanove sadre ustrezno obdelamo ter

uspešno prodajamo industriji gradbenih materialov.

V Službi kakovosti izvajamo kontrolo vzorcev surovin apnenčeve moke in hidriranega

apna. V vzorcih apnenčeve moke določamo vsebnost kalcijevega in magnezijevega

karbonata.

V Službi kakovosti Cinkarne Celje, d.d. smo vpeljali novo metodo za določitev kalcija v

vzorcih apnenčeve moke. Metoda je zasnovana na kompleksometrični titraciji z EDTA in

fotometrični določitvi končne točke s fototrodo.

Namen diplomske naloge je bil validirati nov postopek določitve masnega deleža kalcija v

vzorcih apnenčeve moke in ovrednotiti merilno negotovost rezultata določitve kalcija.

Pri postopku validacije smo preverili selektivnost, linearnost, točnost, ponovljivost ter

obnovljivost preskusne metode:

Selektivnost: Za preverjanje selektivnosti metode smo raziskali vpliv dveh

motečih elementov - interferentov, železa in aluminija, na rezultate določitve

kalcija.

Linearnost: Za oceno linearnosti smo izvedli meritve sekundarnega referenčnega

materiala po celotnem območju zatehte.

Točnost: Točnost preskusnega postopka smo preverili z meritvami na

sekundarnem referenčnem materialu in realnem vzorcu z dodatkom referenčnega

materiala (izkoristek).

Ponovljivost: Za oceno ponovljivosti določitve smo izvedli ponovitve meritev pod

pogoji ponovljivosti na različnih realnih vzorcih.

Obnovljivost: Za oceno obnovljivosti določitve smo izvedli ponovitve meritev pod

pogoji obnovljivosti (ponovitve v različnih časovnih obdobjih z več analitiki) na

različnih realnih vzorcih.

Page 13: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 13

2. TEORETIČNI DEL

2.1. KOMPLEKSOMETRIČNE TITRACIJE

Kompleksometrične titracije so volumetrične - titrimetrične metode, ki so osnovane na

nastanku koordinacijskih ali kompleksnih spojin. Pri kompleksometričnih titracijah poteče

reakcija med kationi in ustreznimi ligandi, ki so donorji elektronskega para kompleksne

spojine. Zelo stabilne koordinacijske ali kompleksne spojine nastanejo, kadar ima ligand

več funkcionalnih skupin. Te spojine imenujemo kelati. Najpogosteje uporabljamo ligande

z dvema aktivnima mestoma (oksalatni ion, etilendiamin, diacetildioksim, acetilacetonatni

ion), tremi (dietilentriamin – DIEN), štirimi (trietilentetraamin) in šestimi aktivnimi mesti

(etilendiamintetraocetna kislina – EDTA) [1].

2.1.1. Etilendiamintetraocetna kislina – EDTA

EDTA (C10H16N2O8) je najpomembnejši predstavnik poliaminokarboksilatov oz.

poliaminokarboksilnih kislin. Je brezbarvna spojina, na sobni temperaturi je v trdnem

agregatnem stanju in v vodi se dobro topi. Za pripravo standardnih raztopin EDTA

najpogosteje uporabljamo dinatrijevo sol EDTA (Na2H2Y).

EDTA ima šest aktivnih mest (šestvezni ligand), vsak proton na acetatni funkcionalni

skupini predstavlja po eno aktivno mesto, dve dodatni mesti pa prosta elektronska para na

dveh dušikovih atomih (slika 2 – 1).

Slika 2 – 1: EDTA (popolnoma ionizirana oblika Y4-)

EDTA tvori s številnimi kationi komplekse tako, da jih veže v stabilno oktaedrično obliko, v

kateri je kation centralni atom oktaedra. EDTA je tako zaradi strukturnih lastnosti

najpogosteje uporabljen titracijski reagent pri kompleksometričnih titracijah.

Stehiometrijsko razmerje med kovinskimi ioni in EDTA je vedno 1:1, ne glede na naboj

kovinskih ionov [1].

Strukture nastalih kompleksov z dvo-, tri- in tetra- valentnimi kovinskimi ioni vsebujejo tri,

štiri in pet obročev (slika 2 – 2) [2].

Page 14: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 14 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Slika 2 – 2: Strukture kompleksov EDTA s kovinskimi ioni

2.1.2. Vpliv pH na tvorbo kompleksa

EDTA (H4Y) je štiri protonska kislina in zato disociira v štirih stopnjah (tabela 2 – 1).

Tabela 2 – 1: Disociacijske konstante EDTA

Enačba reakcije Konstanta disociacije pK vrednost

H4Y → H+ + H3Y- Ka1 = 1,02 10-2 pK1 = 1,99

H3Y- → H+ + H2Y

2- Ka2 = 2,14 10-3 pK2 = 2,67

H2Y2- → H+ + HY3- Ka3 = 6,92 10-7 pK3 = 6,16

HY3- → H+ + Y4- Ka4 = 5,50 10-11 pK4 = 10,26

Pri nastanku kompleksa ima glavno vlogo popolnoma ionizirana oblika Y4-, zato se

kompleksi uspešneje tvorijo in so bolj stabilni v alkalnih raztopinah. V primeru, da je

topnostni produkt kovinskega hidroksida nizek, lahko pride do obarjanja, če je

koncentracija hidroksidnega iona prevelika. Pri nizkih pH vrednostih je koncentracija

ionizirane oblike Y4- nižja in je zato stabilnostna konstanta kompleksov manjša. Kompleksi

večine dvovalentnih kovin so stabilni v amonijalkalni raztopini. Nekatere kovine kot so Cu,

Pb in Ni so stabilne do pH 3 in jih zato lahko selektivno titriramo v prisotnosti

zemljoalkalijskih kovin. Kompleksi trivalentnih kovin so ponavadi še močneje vezani in

Page 15: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 15

zato stabilni v močno kislih raztopinah. Večina kompleksov je stabilna v širokem pH

območju, zato raztopine pri titracijah zapuframo pri pH pri katerem je kompleks stabilen in

je barvni preskok indikatorja najbolj izrazit [2].

2.1.3. Princip kompleksometričnih titracij

Pri kompleksometričnih titracijah se koncentracija prostega kovinskega iona v raztopini

zmanjšuje, ko se ta veže v kompleks z EDTA. Na grafu odvisnosti pM (negativni log

koncentracije kovinskega iona) proti volumnu titranta (EDTA) vidimo, da v končni točki pM

strmo naraste. Ta nenaden skok je posledica odstranitve sledov prostih kovinskih ionov iz

raztopine.

Pri kompleksometričnih titracijah je preskok v končni točki določitve odvisen od:

stabilnosti kompleksa: Večja kot je konstanta stabilnosti kompleksa, bolj izrazita je

končna točka;

števila stopenj nastanka kompleksa: Manj stopenj kot je potrebnih za nastanek

kompleksa, večji bo skok titracijske krivulje v ekvivalentni točki;

pH raztopine: Stabilnost kompleksa je odvisna od pH raztopine. Nižji kot je pH, nižja

bo stabilnost kompleksa. Samo kovine, ki tvorijo zelo stabilne komplekse, lahko

titriramo v kislih raztopinah. Kovine, ki tvorijo šibke komplekse pa lahko uspešno

titriramo samo v alkalnih raztopinah.

Tabela 2 – 2: Logaritemske vrednosti konstant stabilnosti za komplekse EDTA in kationov

Kation log K Kation log K

Ba2+

7,8 Cd2+

16,5

Mg2+

8,7 Pb2+

18,0

Ca2+

10,7 Ni2+

18,6

Mn2+

13,8 Cu2+

18,8

Fe2+

14,3 Hg2+

21,8

Al3+

16,1 Sn2+

22,1

Co2+

16,3 Fe3+

25,1

Zn2+

16,5 Bi3+

27,9

Za določitev končne točke pri kompleksometričnih titracijah uporabimo metodo, ki lahko

zazna odstranitev prostih kovinskih ionov iz raztopine. Končno točko ponavadi določamo z

uporabo indikatorjev ali instrumentalno s potenciometrično ali elektrokemično metodo [1 -

3].

Page 16: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 16 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

2.1.4. Selektivnost kompleksometričnih titracij

EDTA je zelo neselektiven reagent, ker tvori komplekse z večino kovinskih ionov.

Selektivnost titracije dosežemo z izbiro ustreznega pH območja, z uporabo selektivnega

kovinskega indikatorja, z odstranitvijo interferenčnega iona ali z uporabo maskirnega

reagenta.

Maskirni reagenti lahko delujejo na principu obarjanja interferenčnih ionov ali na principu

tvorbe kompleksa z interferenčnim ionom, ki je bolj stabilen kot kompleks interferenčnega

iona z EDTA.

Kot maskirni regenti se uporabljajo: amonijev fluorid, askorbinska kislina, kalijev cianid,

kalijev jodid, trietanolamin in drugi.

Trietanolamin tvori brezbarven kompleks z aluminijem, rumen kompleks z železom(III), ki

se skoraj popolnoma razbarva z dodatkom raztopine natrijevega hidroksida in zelen

manganov(III) kompleks [2].

2.1.5. Indikatorji

Ker kompleksne spojine kovinskih ionov z EDTA niso obarvane, lahko za ugotavljanje

končne točke titracije uporabljamo poleg instrumentalnih načinov tudi indikatorje.

Indikatorji, ki jih uporabljamo pri kompleksometričnih titracijah, so organske spojine, ki s

kovinskimi ioni tvorijo intenzivno obarvane komplekse. Stabilnost indikatorskega

kompleksa mora biti manjša od stabilnosti kompleksa kovinskega iona z EDTA.

Ker vodne raztopine večine indikatorjev niso stabilne, si indikatorje pripravljamo kot suho

zmes z NaCl (indikator : NaCl = 1 : 250).

Pred ekvivalentno točko je raztopina obarvana v barvi kompleksa kovine z indikatorjem,

po ekvivalentni točki pa se raztopina obarva v barvi prostega indikatorja, saj se kovinski

ion veže s titracijskim reagentom (EDTA) in ni več vezan z indikatorjem. Barvni odtenki

indikatorjev so zelo odvisni od izbranega pH območja, intenziteta obarvanja raztopine pa

je odvisna od količine dodanega indikatorja. Kadar izvajamo klasične titracije, moramo

dodati male količine indikatorjev, ker so tako barvni preskoki bolj izraziti in lažje opazni.

Najpogosteje uporabljamo indikatorje: eriokrom črno T, mureksid, metil timol modro,

kalcein, kalcon karboksilna kislina in ftalein.

Z indikatorjem eriokrom črno T lahko neposredno določamo Mg2+, Cd2+, Zn2+, Hg2+ in Pb2+

ione. Nastale koordinacijske spojine se obarvajo rdeče. Z indikatorjem mureksid se

raztopine Co2+, Cu2+ in Ni2+ ionov v alkalnem mediju (NH4OH) obarvajo rumeno, s Ca2+

ioni (NaOH) pa rožnato rdeče [1, 3].

2.1.6. Tipi kompleksometričnih titracij

Titracijsko raztopino EDTA uporabljamo pri titracijah, ki so lahko direktne, povratne,

izmenjalne in posredne:

Page 17: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 17

Direktne titracije: Pri direktnih titracijah titriramo kovinske ione v raztopini neposredno

s standardno raztopino EDTA z ustreznim indikatorjem v določenem pH območju. Če

se kovinski ioni pri izbranem pH obarjajo, predhodno dodamo ligand, ki veže kovinske

ione v koordinacijsko spojino. Stabilnost te spojine mora biti nižja kot stabilnost

kompleksa titriranega kovinskega iona z EDTA.

Povratne titracije: Povratno titracijo (retitracijo) izvedemo, če so reakcije med

kovinskimi ioni in EDTA počasne, če pri izbranih pogojih nimamo ustreznega

indikatorskega preskoka ali pa se kovinski ioni obarjajo. Raztopini kovinskih ionov

dodamo znano prebitno količino standardne raztopine EDTA in njen prebitek titriramo

s standardno raztopino kovinskih ionov. Pogoj za uspešno uporabo povratnih titracij je,

da je stabilnost določanih kovinskih ionov z EDTA večja kot stabilnost titracijske

raztopine kovinskih ionov z EDTA.

Izmenjalne titracije (substitucijske titracije): Pri teh titracijah raztopini določanih

kovinskih ionov dodamo prebitek raztopine kompleksa kovinskega iona. Nato izločene

kovinske ione v raztopini ob dodatku ustreznega pufra in indikatorja neposredno

titriramo s standardno raztopino EDTA. Pogoj za uspešno uporabo izmenjalnih titracij

je, da je stabilnost določanih kovinskih ionov z EDTA večja kot stabilnost dodanega

kompleksa kovinskih ionov z EDTA.

Posredne titracije: Posredne titracije zajemajo določanje kationov (Au+, Ag+, Pd2+) in

anionov (Cl-, Br-, J-, SCN-, SO42-). Pri določanju anionov te najprej oborimo do netopne

soli z dodatkom kovinskih ionov. Oborino filtriramo, speremo, raztopimo, dodamo

ustrezen pufer in indikator ter kovinske ione titriramo z EDTA. Pri določanju Au+, Ag+ in

Pd2+ direktne titracije z EDTA niso mogoče. Kationi Au+, Ag+, Pd2+ tvorijo zelo stabilne

komplekse s CN- in SCN-, zato raztopinam teh kationov dodamo znan prebitek

kompleksa CN- ali SCN- z drugim kovinskim ionom. Izloči se stehiometrijska množina

dodanih kovinskih ionov, ki jih z izbiro ustreznih pogojev in indikatorja titriramo z EDTA

[1].

2.1.7. Titracija z avtomatskim titratorjem

Titracijo izvajamo na avtomatskem titratorju, ki omogoča avtomatizacijo vseh operacij

titracije. Za posamezno določitev je potrebno najprej definirati metodo (zaporedje operacij)

in jo shraniti v titrator. Optimalni zapis titracijske metode zahteva pravilno definiranje

parametrov v titratorju.

Kontrolni parametri usmerjajo titrator, kako naj dodaja titrant. Možni so trije načini

dodajanja titranta: inkrementno (koračno), dinamično in kontinuirano (nepretrgano).

Parameter pri inkrementni titraciji je ΔVfix, ki predstavlja dodajanje titranta po korakih.

Takšna titracija je nekoliko počasna, ima omejene podatke okoli končne točke,

ponovljivosti postopka so slabše. Je pa še vedno uporabna pri titracijah s strmimi in hitrimi

skoki ali kadar je signal nekoliko nestabilen. Značilne titracije za koračno dodajanje

titranta so določene redoks titracije in določene nevodne kislinsko/bazne titracije.

Page 18: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 18 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Bolj pogoste so dinamične titracije, kjer se velikost dodatka prilagaja obliki titracijske

krivulje. Tako so v ravnih delih krivulje dodatki titranta večji, v bližini ekvivalentne točke pa

manjši. Parametra za dinamično dodajanje titranta sta ΔVmax in ΔVmin. Potencialna razlika,

ki ji titrator sledi z vsakim korakom je določena kot ΔEset. Pri večini titracij omogoča

dinamično dodajanje titranta hitre in natančne titracije.

Kontinuirne titracije so titracije s končno točko, kjer se titrant dodaja, dokler ni dosežen

prej določen potencial. Pri tem načinu dodajanja titranta so dodatki večji v začetku titracije

do kontrolnega pasu, kjer se dodatki začnejo zmanjševati. S tem dosežemo, da je titracija

hitra, vendar ne pride do pretitriranja raztopin. Kontrolna parametra pri kontinuirni titraciji

sta tako kontrolni pas in minimalni dodatek.

Za vsako titracijsko metodo je poleg načina dodajanja titranta potrebno programirati tudi

način pridobivanja izmerjenih vrednosti. Ta podatek titrator uporabi, da samodejno

določi pri kateri točki naj izmeri potencial in doda nov dodatek. Možno je programiranje

fiksnega intervala, kjer titrator vedno počaka, da mine prej določen čas Δt, preden doda

nov dodatek. Ta način se uporablja pri titracijah z nestabilnimi pogoji (nevodne titracije).

Druga tehnika se imenuje ravnotežno kontrolirana, kjer titrator pred vsakim dodatkom

počaka na stabilen signal meritve z elektrodo. Tako se prilagaja hitrost kemijske reakcije

in odzivni čas elektrode. Titratorju je potrebno definirati, kako stabilen naj bo signal, podan

kot maksimalno odstopanje oziroma »lezenje« - »drift« ΔE / Δt. Če titracija ne doseže

ravnotežja, je določen tudi maksimalen čas s tmax, da bi se izognili prehitremu dodajanju,

pa je določen tudi tmin. Pridobivanje izmerjenih vrednosti z ravnotežjem je pogosta tehnika

pri potenciometričnih titracijah [4].

Po zapisu parametrov v titracijsko metodo avtomatski titrator izvaja titracijo po točno

definiranem zaporedju in določitev končne točke je neodvisna od ocene analitika, ki

titracijo izvaja.

2.1.8. Titracije s fototrodo

Fototroda je primerna za vse turbidimetrične titracije in titracije kovinskih ionov z barvnim

preskokom. Fototrodo najprej nastavimo na željeno valovno dolžino – λ (520 nm, 555 nm,

590 nm, 620 nm, 660 nm) in jo nato umerimo na 1000 mV v deionizirani vodi. Z izbiro

ustreznega barvnega indikatorja lahko fototrodo uporabimo kot fotometrični senzor pri

številnih titracijah (priloga A) [5].

Slika 2 – 3: Fototroda

Page 19: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 19

2.2. OSNOVE STATISTIKE

Statistika je veda, ki se ukvarja s kvantitativnim proučevanjem različnih pojavov in s

pomočjo statističnih metod odkriva zakonitosti teh pojavov. Vsaka meritev fizikalnih in

kemijskih količin je podvržena določenim napakam, zato prava ali točna vrednost ostaja

vselej neznana, merski rezultat pa je lahko njen boljši ali slabši približek. Da bi se čim bolj

približali pravi vrednosti, moramo poznati vrste napak, njihov izvor in jih ustrezno

minimizirati. Napake delimo na očitne, sistematične in naključne.

Očitne ali grobe napake so lahko določljive. Očitna napaka je npr. okvara instrumenta,

uničenje vzorca ali kontaminacija reagenta. Kadar v postopku napravimo očitno napako,

rezultat preskusa zavržemo in meritev ponovimo.

Sistematične ali sistematske napake so posledica neočitnih napak v analiznem

postopku in povzročajo odmik celotne serije rezultatov od prave vrednosti. Viri

sistematičnih napak so: napake metod (nepravilna izbira indikatorja, soobarjanje, topnost

oborin), instrumentalne (slaba umerjenost instrumenta, napake pri umerjanju) in osebne

napake (barvna slepota, nepravilno odčitan volumen na bireti). Sistematične napake

odkrijemo z uporabo standardnih metod, referenčnih materialov ali s sodelovanjem na

medlaboratorijskih primerjavah. Sistematične napake vplivajo na točnost, to je na

približanje k pravi vrednosti.

Naključne ali slučajne napake so vedno prisotne in so posledica nenatančnosti

posameznih merilnih stopenj, ki se jim med izvajanjem analiz ne moremo izogniti, kot so:

nihanja temperature, tlaka, vlažnosti, napetosti. Naključne napake povzročijo sipanje

posameznih meritev okrog povprečne vrednosti in jih obravnavamo s statističnimi testi.

Naključne napake vplivajo na natančnost analize, to je ponovljivost in obnovljivost meritev.

Ponovljivost je natančnost dobljena pri optimalnih pogojih (ista metoda, isti analitik, isti

dan analize, iste kemikalije, isti laboratorij, ista oprema).

Obnovljivost je natančnost dobljena pri najbolj različnih možnih pogojih (ista metoda,

različni analitiki, različni dnevi analize, različne kemikalije, različni laboratoriji, druga

oprema).

Povprečna vrednost (x) je definirana kot aritmetična sredina in je vsota vseh meritev,

deljena s številom meritev (n):

n

x

x i

i . (2.1.)

Mediana je vrednost, ki leži v sredini niza meritev (n), če vse vrednosti uredimo po

velikosti od največje do najmanjše, pri čemer moramo vrednosti, ki se ponavljajo,

upoštevati tolikokrat, kolikokrat se ponovijo.

Če je n liho število, vzamemo za mediano srednjo meritev.

Če je n sodo število, vzamemo za mediano povprečno vrednost srednjih dveh meritev.

Page 20: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 20 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Standardni odmik (s) je merilo za odstopanje rezultatov od povprečja. Manjša vrednost

pomeni večjo natančnost, večja vrednost pa manjšo natančnost opravljenih analiz:

1

)( 2

n

xx

s i

i

. (2.2.)

Relativni standardni odmik (RSD ) je kvocient med standardnim odmikom in povprečno

vrednostjo. Podajamo ga v odstotkih in služi za primerjavo natančnosti rezultatov, ki imajo

različne merske enote ali velikosti:

100x

sRSD . (2.3.)

Varianca (VAR ) je pomembna statistična količina:

2sVAR . (2.4.)

Standardni odmik povprečja:

n

ssx . (2.5.)

Interval zaupanja povprečja je območje v katerem lahko z določeno verjetnostjo

pričakujemo, da bo ležala resnična vrednost, ob predpostavki, da so meritve normalno

porazdeljene in da ni prisotnih sistematičnih napak.

xstxn

stx . (2.6.)

Izbrana vrednost t (iz tabele) je odvisna od števila prostostnih stopenj (n-1) in stopnje

zaupanja (po navadi 95 %) [6 - 8].

2.2.1. Statistični testi

Pri interpretaciji eksperimentalnih rezultatov, primerjavi podatkov in iskanju povezav med

različnimi skupinami meritev si pomagamo z različnimi statističnimi testi: t - test, F - test,

parni t - test, Grubbsov test, Dixonov test,…

Page 21: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 21

I. t – test: primerjava povprečne vrednosti meritev s pravo vrednostjo

Pri tem testu preverjamo resničnost postavljene ničelne hipoteze (H0):

»Povprečna vrednost meritev se ne razlikuje od prave vrednosti«, oziroma

»V analizni metodi niso prisotne sistematične napake«.

Izračunamo t-vrednost:

s

nxt )( , (2.7.)

pri čemer je: x povprečna vrednost meritev, prava vrednost, n število meritev in

s standardni odmik meritev.

Izračunan t primerjamo s t-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost t-kritični (iz tabele) je odvisna od števila prostostnih stopenj (n-1) in

stopnje zaupanja (ponavadi 0,05 oz. 5 %). Stopnja zaupanja 0,05 pomeni, da obstaja

5 % verjetnost, da zavrnemo ničelno hipotezo, čeprav je v resnici pravilna.

Če je t-izračunan (po absolutni vrednosti) manjši od t-kritičnega, ničelno hipotezo

sprejmemo (potrdimo), v nasprotnem primeru pa zavrnemo.

II. F – test: primerjava standardnih odmikov

Način testiranja povprečnih vrednostih dveh serij meritev s t-testom je odvisen od tega ali

imata dve seriji meritev statistično primerljive standardne odmike oz. variance.

V primeru, ko dvomimo v enakost varianc dveh normalnih porazdelitev, uporabimo F-test.

Pri tem testu preverjamo resničnost postavljene ničelne hipoteze (H0):

»Varianci dveh serij meritev se med seboj ne razlikujeta«.

Izračunamo F-vrednost:

2

2

2

1

s

sF , (2.8.)

pri čemer sta 1s in 2s standardna odmika meritev.

Če se zgodi, da je 21 ss , moramo standardna odmika meritev v izračunu F

zamenjati, tako da je F vedno 1.

Izračunan F primerjamo z F-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost F-kritični (iz tabele) je odvisna od števila prostostnih stopenj (n1-1 za

števec in n2-1 za imenovalec) in stopnje zaupanja (ponavadi 0,05 oz. 5 %).

Če je F-izračunan manjši od F-kritičnega, ničelno hipotezo sprejmemo (potrdimo), v

nasprotnem primeru pa zavrnemo.

Page 22: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 22 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

III. t – test: primerjava povprečnih vrednosti dveh serij meritev

Način testiranja povprečnih vrednostih dveh serij meritev s t-testom je odvisen od tega ali

imata dve seriji meritev enake standardne odmike oz. variance.

Zato moramo pred izvedbo t-testa testirati enakost varianc z F-testom.

Pri t-testu preverjamo resničnost postavljene ničelne hipoteze (H0):

»Povprečni vrednosti dveh serij meritev se med seboj ne razlikujeta«.

Standardna odmika meritev se razlikujeta:

Izračunamo t-vrednost:

2

2

2

1

2

1

21 )(

n

s

n

s

xxt

, (2.9.)

pri čemer je: x povprečna vrednost meritev, n število meritev in s standardni odmik

meritev (za dve seriji meritev – indeks 1 in 2)

Izračunan t primerjamo s t-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost t-kritični (iz tabele) je odvisna od števila prostostnih stopenj (df) in

stopnje zaupanja (po navadi 0,05 oz. 5 %).

Število prostostnih stopenj izračunamo po formuli:

)1()1( 2

2

2

4

2

1

2

1

4

1

2

2

2

2

1

2

1

nn

s

nn

s

n

s

n

s

df . (2.10.)

Če je t-izračunan (po absolutni vrednosti) manjši od t-kritičnega, ničelno hipotezo

sprejmemo (potrdimo), v nasprotnem primeru pa zavrnemo.

Standardna odmika meritev se ne razlikujeta:

Izračunamo t-vrednost:

21

21

11

)(

nns

xxt

pooled

, (2.11.)

pri čemer je: x povprečna vrednost meritev in n število meritev (za dve seriji meritev

– indeks 1 in 2) ter pooleds skupni standardni odmik dveh serij meritev:

Page 23: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 23

)1()1(

)1()1(

21

2

22

2

11

nn

snsnspooled . (2.12.)

Skupni standardni odmik lahko izračunamo, ker se standardna odmika dveh serij

meritev med seboj signifikantno ne razlikujeta.

Izračunan t primerjamo s t-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost t-kritični (iz tabele) je odvisna od števila prostostnih stopenj (df) in

stopnje zaupanja (po navadi 0,05 oz. 5 %).

Število prostostnih stopenj izračunamo po formuli:

221 nndf . (2.13.)

Če je t-izračunan (po absolutni vrednosti) manjši od t-kritičnega, ničelno hipotezo

sprejmemo (potrdimo), v nasprotnem primeru pa zavrnemo.

IV. Parni t- test

Parni t-test uporabimo takrat, ko so podatki, ki jih obravnavamo, urejeni pari (x, y) in nas

zanima ali lahko trdimo, da med x in y ni razlike (različne vzorce analiziramo po dveh

metodah; za vsak vzorec dobimo par podatkov, to je rezultat po eni in drugi metodi in nas

zanima ali lahko trdimo, da med rezultati dobljenimi po eni in drugi metodi ni razlik –

ničelna hipoteza). S parnim t-testom torej testiramo množico razlik. Pred tem testom ni

potrebno testirati enakosti varianc z F-testom, ker nas zanima samo ena varianca, to je

varianca razlik in ne meritev.

Izračunamo t-vrednost:

ds

ndt

, (2.14.)

pri čemer je: d povprečna vrednost razlik, n število meritev (parov podatkov) in ds

standardni odmik razlik.

Izračunan t primerjamo s t-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost t-kritični (iz tabele) je odvisna od števila prostostnih stopenj (n-1) in

stopnje zaupanja (po navadi 0,05 oz. 5 %).

Če je t-izračunan (po absolutni vrednosti) manjši od t-kritičnega, ničelno hipotezo

sprejmemo (potrdimo), v nasprotnem primeru pa zavrnemo.

Page 24: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 24 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

V. Določanje ubežnikov

Za statistično ovrednotenje naključnih napak potrebujemo zadostno število meritev

(ponovitev). Pred statistično obdelavo pa moramo ugotoviti, če kakšna meritev

signifikantno odstopa od ostalih. Takšne meritve imenujemo ubežniki in lahko zelo vplivajo

na točnost in natančnost meritev. Ubežnike poiščemo s pomočjo Grubbsovega (G) ali

Dixonovega (Q) testa. Pri Dixonovem testu se testna statistika razlikuje glede na število

meritev.

Grubbsov test

Izračunamo G-vrednost:

s

xG

sumljiv, (2.15.)

pri čemer je: x povprečna vrednost meritev in s standardni odmik meritev

(izračunana z vključeno sumljivo meritvijo).

Izračunan G primerjamo z G-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost G-kritični (iz tabele) je odvisna od števila meritev (n) in stopnje

zaupanja (0,05 in/ali 0,01).

Če je G-izračunan manjši od G-kritičnega, sumljiva meritev ni ubežnik. Če pa je G-

izračunan večji od G-kritičnega, je sumljiva meritev ubežnik in jo izključimo iz niza

meritev.

Dixonov test (od 3 do 7 meritev)

Izračunamo Q-vrednost:

MIN)(MAX

najbližjisumljiv

Q . (2.16.)

Od sumljive vrednosti odštejemo njej najbližjo vrednost ter delimo z razliko med

največjo in najmanjšo vrednostjo.

Izračunan Q primerjamo s Q-kritičnim (iz tabele).

Izbrana vrednost Q-kritični (iz tabele) je odvisna od števila meritev (n) in stopnje

zaupanja (po navadi 0,05).

Če je Q-izračunan manjši od Q-kritičnega, sumljiva meritev ni ubežnik. Če pa je Q-

izračunan večji od Q-kritičnega, je sumljiva meritev ubežnik in jo izločimo iz niza

meritev [6 - 9].

Page 25: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 25

2.3. VALIDACIJA PRESKUSNIH METOD

Validacija preskusne metode nam pove, da smo s sistematičnim laboratorijskim

preskušanjem potrdili karakteristike zmogljivosti in omejitve preskusne metode,

identificirali vplive, ki lahko te karakteristike spremenijo in do kakšne mere jih spreminjajo;

hkrati pa je validacija proces preverjanja, da je metoda primerna za točno predvideno

uporabo.

Za uspešno izvedbo validacije preskusne metode mora oprema ustrezati specifikacijam,

biti mora vzdrževana, umerjena in izvajalec mora biti ustrezno usposobljen.

Validacija preskusne metode je tesno povezana z razvojem metode, tako da ne moremo

postaviti ostre meje med obema postopkoma.

2.3.1. Selektivnost

Selektivnost preskusnega postopka lahko potrdimo tedaj, ko ugotovimo, da prisotnost

drugih komponent v vzorcu ne vpliva na rezultat meritve. Pri raziskavi vplivov na rezultat

preskusne metode se ravnamo po priporočilih standarda za preskusno metodo. Vplive

različnih matric in interferenc raziskujemo s pomočjo načrtovanih preskusov, ki so odvisni

od števila matric in interferenc [10].

2.3.2. Linearnost

Linearnost preskusnega postopka pri titrimetričnih metodah nam pove ali metoda daje

prave rezultate v določenem koncentracijskem območju. Ker je pri titracijah poraba titranta

odvisna od koncentracije analita v alikvotu vzorca, linearnost postopka ocenimo s

spreminjanjem zatehte vzorca in s tem koncentracije analita v koncentracijskem območju,

ki nas zanima. Po izvedenih meritvah narišemo grafa:

Volumen porabljenega titranta v končni točki (KT) v odvisnosti od zatehte in

Izmerjene vrednosti analita v odvisnosti od zatehte.

Iz prvega grafa izračunamo linearno funkcijo ter korelacijski koeficient. Da lahko potrdimo

linearnost metode mora biti dobljeni korelacijski koeficient večji od 0,995.

Signifikantno pozitivni ali negativni naklon regresijske premice iz drugega grafa (> 0,1)

nakazuje, da je rezultat določitve odvisen od zatehte vzorca [11].

2.3.3. Točnost

Točnost preskusnega postopka nam pove najbližje ujemanje rezultata s sprejeto

referenčno vrednostjo. Točnost preskusnega postopka ovrednotimo z meritvijo

referenčnega materiala z znano vrednostjo, kar testiramo s t – testom ali intervalno oceno

zaupanja in z izračunom izkoristka. Z metodo standardnih dodatkov znanemu vzorcu

lahko izračunamo izkoristek brez uporabe CRM-ja [10].

Page 26: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 26 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

2.3.4. Natančnost

Določanje natančnosti preskusnega postopka je merilo za velikost slučajnih napak.

Natančnost preskusnega postopka preverimo s preskusom ponovljivosti in laboratorijske

obnovljivosti. Natančnost podamo s standardnim odmikom ponovljivosti in laboratorijske

obnovljivosti ali relativnim standardnim odmikom ponovljivosti in laboratorijske

obnovljivosti.

Za ocenjevanje natančnosti preskusnega postopka lahko uporabimo tako realne vzorce,

kot referenčne materiale. Izbrati moramo takšne vzorce, da pokrijemo celotno območje

določitve. Optimalno je, da izvedemo 10 ponovitev, v posebnih primerih pa se lahko

odločimo za manj, vendar nikoli manj kot 6 ponovitev.

Pred oceno natančnosti izvedemo še testiranje ubežnikov, da zagotovimo čim manjšo

variabilnost meritev. Ubežnike testiramo z Grubbsovim testom in jih po potrebi izločimo.

Pri preverjanju sprejemljivosti RSD ponovljivosti in obnovljivosti uporabimo Horwitzov test,

tako da izračunamo razmerje HORRAT:

HRSD

RSDHORRAT . (2.17.)

Vrednost RSDH izhaja iz Horwitzove funkcije, ki je za:

ponovljivost c

HRSD log5,01267,0 (2.18.)

obnovljivost c

HRSD log5,01275,0 (2.19.)

pri čemer je c koncentracija merjenca izražena kot decimalna frakcija.

Če je HORRAT 2 (95 % območje zaupanja) je relativni standardni odmik sprejemljiv in

preskusni postopek lahko ocenimo kot dovolj natančen.

Meja ponovljivosti r je vrednost, ki jo uporabimo kot merilo sprejemljivosti paralelnih

določitev pri rednem izvajanju preskusov in jo izračunamo po enačbi [10]:

ssr 8,2296,1 . (2.20.)

Page 27: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 27

2.4. OVREDNOTENJE MERILNE NEGOTOVOSTI

Merilna negotovost (angl. measurement uncertainty) je parameter, ki je povezan z

merilnim rezultatom in označuje raztros vrednosti, ki jih je mogoče upravičeno pripisati

merjeni veličini. Merilna negotovost označuje kakovost merilnega rezultata in omogoča

vrednotenje primerljivosti merilnih rezultatov. Merilno negotovost moramo navajati v

primerih, ko je pomembna za pravilno interpretacijo in uporabo rezultata preskušanja, če

to zahteva odjemalec ali če vpliva na skladnost s specifikacijo. Merilno negotovost vedno

navajamo pri rezultatu preskusov za akreditirano področje.

Standardna negotovost (angl. standard uncertainty, u) je negotovost rezultata

meritve, izražena kot standardni odmik.

Kombinirana standardna negotovost (angl. combined standard uncertainty, uc)

rezultata je standardni odmik, enak kvadratnemu korenu celotne variance, ki ga dobimo s

kombinacijo vseh komponent negotovosti, ovrednotenih z upoštevanjem zakona o širjenju

negotovosti.

Razširjena negotovost (angl. expanded uncertainty, U) je interval v katerem se nahaja

rezultat z določeno stopnjo zaupanja. Razširjeno negotovost dobimo z množenjem

kombinirane standardne negotovosti s faktorjem pokritja k. Izbira faktorja k je odvisna od

stopnje zaupanja. Za stopnjo zaupanja 95 % je v primeru normalne porazdelitvene

funkcije k = 2.

Koraki pri postopku ovrednotenja merilne negotovosti so:

definicija merjenca

identifikacija izvorov merilne negotovosti

kvantifikacija komponent negotovosti

izračun kombinirane in razširjene negotovosti

I. Definicija merjenca

Merjenec moramo jasno definirati in opredeliti povezavo med merjencem in odvisnimi

parametri. Nato moramo napisati modelno enačbo (enačba za izračun rezultata) in

vključiti korekcije za znane sistematske napake.

II. Identifikacija izvorov merilne negotovosti

Identificiramo vse možne izvore merilne negotovosti. Za predstavitev izvorov merilne

negotovosti lahko uporabimo diagram vzrokov in učinkov.

Page 28: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 28 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Slika 2 – 4: Diagram vzrokov in učinkov

III. Kvantifikacija komponent negotovosti

Pri postopku kvantifikacije določimo (izmerimo ali ocenimo) velikost komponent

negotovosti. Velikost komponent negotovosti lahko ovrednotimo na dva načina:

Tip A:

Z izvedbo ustreznih eksperimentov izračunamo standardne negotovosti posameznih

komponent.

Tip B:

Vrednost ocenimo iz drugih virov:

negotovost referenčnih materialov

kalibracijski certifikat

sprejeta vrednost konstant

pogoji okolja

validacija metod

rezultati medlaboratorijskih primerjav

kontrolne karte

Vse te vrednosti morajo biti dobljene s statističnimi metodami (v bistvu vedno iščemo

standardne odmike ali variance). Če so vrednosti za negotovost posameznih komponent

podane kot standardni odmik, jih lahko direktno uporabimo.

Parameter 2

1 nivo vpliva

Merjenec

Parameter 1

Parameter 3

2 nivo vpliva

Page 29: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 29

Kadar dobimo vrednosti, ki so podane kot razširjena merilna negotovost posamezne

komponente z določeno stopnjo zaupanja (npr. 95 %), moramo standardne negotovosti za

posamezne komponente izračunati z upoštevanjem stopnje zaupanja in ustrezno

porazdelitveno funkcijo, ki jo vir navaja:

Normalna porazdelitev (angl. Normal distribution)

Če kalibracijski certifikat navaja razširjeno negotovost s

stopnjo zaupanja (npr. 95 %), izračunamo negotovost

za to komponento:

kxu

negotovost razširjena)( (2.21.)

k2 za 95 % stopnjo zaupanja

k3 za 99,7 % stopnjo zaupanja

Pravokotna porazdelitev (angl. Rectangular

distribution)

Če certifikat navaja meje ( a) brez podane stopnje

zaupanja in podatka o obliki porazdelitve, izračunamo

negotovost za to komponento:

3)(

axu (2.22.)

Trikotna porazdelitev (angl. Triangular distribution)

Kadar so vrednosti blizu x (centra) bolj verjetne kot

vrednosti na robovih ( a), izračunamo negotovost za to

komponento:

Primer: Volumen bučke je 100 mL 0,1 mL; Vrednosti

blizu nominalne vrednosti 100 mL so bolj verjetne kot

ekstremne vrednosti.

6)(

axu (2.23.)

Po končani kvantifikaciji komponent negotovosti ocenimo kateri izvori bistveno prispevajo

k kombinirani merilni negotovosti. Komponente, ki so po relativni vrednosti manjše od 1/5

do 1/3 največjega prispevka, lahko zanemarimo.

IV. Izračun kombinirane in razširjene merilne negotovosti

Dobljene prispevke, ki so izraženi kot standardna negotovost, kombiniramo z

upoštevanjem zakona o širjenju negotovosti:

),...,...( 1 ni xxxfy ,

n

i

i

i

komb xux

yyu

1

2

2

. )()( , (2.24.)

kadar so komponente nxxx ,...,, 21 medsebojno neodvisne.

Kadar imata dve vhodni komponenti isti izvor negotovosti (npr. obe sta odvisni od

negotovosti temperature), njuna negotovost ni neodvisna in zato pravimo, da sta

komponenti soodvisni (korelirani):

Page 30: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 30 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

n

jiji

ji

ji

n

i

i

i

komb xxux

y

x

yxu

x

yyu

1,1

2

2

. ),()()( , (2.25.)

kadar so komponente nxxx ,...,, 21 medsebojno odvisne.

V praksi korelacijskega efekta pogosto ne poznamo, zato takrat predpostavimo, da med

komponentami ni korelacije.

Kadar je prispevek k negotovosti povezan s celotnim postopkom ali kadar je negotovost

določene komponente izražena direktno kot vpliv na y, je ix

y

(koeficient občutljivosti)

enak 1.

Enačbo za izračun kombinirane merilne negotovosti (če med komponentami ni korelacije)

lahko v nekaterih primerih zelo poenostavimo:

Modelna enačba Kombinirana merilna negotovost

nxxxxy ...321 22

3

2

2

2

1. ...)( xnxxxkomb uuuuyu (2.26.)

nxxxxy .../ 321

22

3

3

2

2

2

2

1

1. ...)(

n

xnxxxkomb

x

u

x

u

x

u

x

u

y

yu (2.27.)

z

n

ba xxxy ...21

22

2

2

2

1

1. ...)(

n

xnxxkomb

x

uz

x

ub

x

ua

y

yu (2.28.)

Po končanem izračunu kombinirane merilne negotovosti analiziramo kakšen delež vpliva

ima posamezen izvor negotovosti na celotno negotovost. To izračunamo po enačbi:

100)(

)(

2

.

2

2

yu

xux

y

rkomb

i

i

i . (2.29.)

Izračunane negotovosti posameznih komponent (izvorov) in njihove prispevke glede na

celotno negotovost lahko nazorno prikažemo v tabeli in grafu.

Razširjeno merilno negotovost (U) dobimo z množenjem kombinirane standardne

negotovosti s faktorjem pokritja k. Izbira faktorja k je odvisna od stopnje zaupanja (za

stopnjo zaupanja 95 % je v primeru normalne porazdelitvene funkcije k = 2, za stopnjo

zaupanja 99,7 % je v primeru normalne porazdelitvene funkcije k = 3) [12, 13]:

)(. yukU komb . (2.30.)

Page 31: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 31

3. EKSPERIMENTALNI DEL

Vse analize so bile izvedene v Analitskem laboratoriju Službe kakovosti Cinkarne Celje,

d.d.. Eksperimentalni del zajema pripravo raztopin, pripravo fototrode, izdelavo

kompleksometričnih metod in izvedbo analiz za validacijo postopka določitve masnega

deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke ter ovrednotenje merilne negotovosti.

Pri vseh določitvah smo uporabljali kemikalije čistosti p.a. in deionizirano vodo.

3.1. MERILNA OPREMA

Analitska tehtnica Mettler® XP 205 DR, Ev. št. LM W0489

Precizna tehtnica Sartorius® LC 2200 P, Ev. št. LM W0166

Avtomatski titrator Mettler® T 70, Ev. št. LM Q0230

Sušilnik Binder® APT ED 115, Ev. št. LM T0661

Fototroda Mettler® DP5, Inv. št. 49245000

Slika 3 – 1: Avtomatski titrator Mettler® T 70

3.2. PRIPRAVA RAZTOPIN

3.2.1. Raztopina klorovodikove kisline (HCl), 1:1

V 1000 mL merilno bučko odmerimo približno 500 mL deionizirane vode.

Previdno dodamo 500 mL koncentrirane HCl.

Raztopino ohladimo, dopolnimo do oznake z deionizirano vodo in dobro

premešamo.

Page 32: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 32 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

3.2.2. Raztopina natrijevega hidroksida, c(NaOH) = 5 mol/L

V 2000 mL odprti čaši prekuhamo deionizirano vodo.

Čašo odstavimo, pokrijemo z urnim steklom in ohladimo.

V 1000 mL bučko, s pomočjo lijaka, zatehtamo 200,0 g NaOH na 0,1 g natančno.

Počasi dolijemo deionizirano vodo in previdno mešamo.

Bučko z raztopino ohladimo, dopolnimo do oznake in premešamo.

3.2.3. Raztopina etilendiamintetraocetne kisline, c(EDTA) = 0,03 mol/L

V 2000 mL merilno bučko, s pomočjo lijaka, zatehtamo 22,7 g EDTA na 0,1 g

natančno.

Dodamo deionizirano vodo in premešamo, da se raztopi.

Raztopino dopolnimo do oznake in dobro premešamo.

Raztopino EDTA hranimo v temi.

Obstojnost raztopine EDTA ni časovno omejena.

3.2.4. Referenčna raztopina kalcijevega karbonata, (CaCO3) = 1,0000 g/L

Referenčni material (RM) CaCO3 sušimo v sušilniku pri 120 °C ± 2 °C do

konstantne mase (najmanj 2 uri).

Ohladimo v eksikatorju na sobno temperaturo.

Zatehtamo približno 1 g posušenega CaCO3 na 0,1 mg natančno in ga

kvantitativno s pomočjo tehtalne ladjice in lijaka prenesemo v 300 mL

erlenmajerico.

Počasi dodamo 20 mL HCl 1:1 in premešamo, da se raztopi.

Dodamo 20 mL deionizirane vode in na električni grelni plošči pustimo vreti od 3 do

5 min.

Raztopino malo ohladimo in nato prelijemo v 1000 mL merilno bučko.

Ohladimo na sobno temperaturo, merilno bučko dopolnimo do oznake z

deionizirano vodo in raztopino dobro premešamo.

3.2.5. Mureksid, indikator v prahu

V tehtalno posodico zatehtamo 25 g NaCl na 0,1 g natančno in 0,25 g mureksida

na 0,01 g natančno.

Mešanico stremo v terilnici v fino homogeno zmes.

Pripravljeno suho zmes indikatorja hranimo v temni steklenički.

Indikator je uporaben 1 mesec.

Page 33: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 33

3.3. PRIPRAVA FOTOTRODE

Med razvijanjem metod smo ugotovili optimalne pogoje delovanja fototrode:

V času razvoja metode, zaradi objektivnih razlogov, kratko obdobje meritev nismo

izvajali in smo fototrodo hranili v originalni embalaži – vodoravna lega. Pri ponovnih

začetnih meritvah standardizacije EDTA, so se pojavile težave. Zaradi prehitrih

sprememb potenciala je imela titracijska krivulja »odsekan« izgled. Ko smo začeli

fototrodo shranjevati pokončno, omenjenih težav ni bilo več, zato fototrodo vedno

shranjujemo v navpični legi.

Titracijska glava titratorja ima omejeno število odprtin (različnega premera) za

vstavljanje cevk titranta, elektrod, temperaturnega senzorja, grelca in mešala. Cevko

titranta EDTA smo na začetku razvoja metode namestili v odprtino blizu fototrode v

smeri mešanja. Ugotovili smo, da pri takšni postavitvi cevk in fototrode pade raztopina

titranta na merilni del fototrode, kar povzroči nihanja, ki vodijo do napačnega rezultata.

Zato smo cevko titranta EDTA vstavili nasproti fototrode, s čimer smo odpravili

nezaželjena nihanja in izboljšali točnost analiznega rezultata.

Zadrževanje mehurčkov v merilnem delu fototrode povzroči netočnost rezultata.

Ugotovili smo, da je zelo pomembna višinska razlika namestitve med propelerjem

mešala in fototrode. Izkazalo se je, da morajo biti lopatice mešala čim bližje

fototrodi, ker s tem preprečimo zadrževanje mehurčkov v merilnem delu fototrode.

Priprava in umerjanje fototrode

Fototrodo umerimo dnevno pred meritvami.

Fototrodo namestimo na titracijsko glavo avtomatskega titratorja.

Fototrodo vklopimo (fototroda se mora ogrevati najmanj ½ ure pred uporabo).

Nato fototrodo potopimo v deionizirano vodo, nastavimo valovno dolžino na 620 nm in

z gumbom na fototrodi uravnamo potencial na 1000 mV.

Page 34: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 34 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

3.4. IZDELAVA METOD

3.4.1. Standardizacija raztopine EDTA, c(EDTA) = 0,03 mol/L

I. Zapis metode

Na avtomatskem titratorju smo izdelali (zapisali) metodo za standardizacijo 0,03 mol/L

raztopine EDTA s fotometrično določitvijo končne točke.

Po zapisu metode smo izvedli poskusne meritve in ustreznost metode preverili z izpisom

tabele merjenih vrednosti in izgledom titracijske krivulje.

II. Standardizacija raztopine 0,03 mol/L EDTA

Standardizacijo raztopine izvajamo v 6 paralelnih določitvah.

Pred pričetkom standardizacije umerimo fototrodo pri 620 nm in izvedemo kalibracijo

kombinirane steklene elektrode.

Na titrator namestimo 20 mL bireto z raztopino EDTA in bireto dobro speremo.

V 250 mL titracijske bučke odpipetiramo 50 mL referenčne raztopine (CaCO3) =

1,0000 g/L.

S pomočjo merilnega valja dodamo 100 mL deionizirane vode.

Titracijske bučke pokrijemo s pokrovčki.

Tik pred vsako titracijo dodamo 0,20 g mureksida na 0,01 g natančno.

Raztopino v 250 mL bučki takoj namestimo na glavo titratorja.

S 5 mol/L raztopino NaOH (s pomočjo 1 mL polnilne pipete) skozi odprtino titracijske

glave uravnamo pH na 12,5 ± 0,1.

Takoj sprožimo titracijo po metodi FDP5.

V titracijski parameter »weight« vnesemo zatehto referenčnega materiala v g.

Program titratorja izračuna in izpiše povprečno vrednost 6 paralelk in standardni odmik (s)

določitve. Vrednost titra standardne raztopine se avtomatsko shrani.

Kontrola titra raztopine se izvaja po 3 tednih določitve.

Raztopine EDTA iz 2 L steklenice nikoli ne dolivamo k ostanku standardne raztopine v

titracijski steklenici.

Morebitni ostanek ustrezno odstranimo, titracijsko steklenico dobro speremo z raztopino

EDTA iz 2 L steklenice in nato svežo raztopino nalijemo v titracijsko steklenico.

Page 35: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 35

3.4.2. Določitev masnega deleža kalcija

I. Zapis metode

Na avtomatskem titratorju smo izdelali (zapisali) metodo za določitev masnega deleža kalcija s fotometrično določitvijo končne točke. Po zapisu metode smo izvedli poskusne meritve na referenčnem materialu CaCO3 in

vzorcih apnenčeve moke ter ustreznost metode preverili z izpisom tabele merjenih

vrednosti in z izgledom titracijske krivulje.

II. Določitev masnega deleža kalcija v referenčnem materialu CaCO3

Pred pričetkom meritev umerimo fototrodo pri 620 nm in izvedemo kalibracijo

kombinirane steklene elektrode.

Na titrator namestimo 20 mL bireto z 0,03 mol/L raztopino EDTA in bireto dobro

speremo.

Pod pomožnimi funkcijami titratorja preverimo shranjeno vrednost določenega titra

standardne raztopine 0,03 mol/L EDTA.

V 250 mL titracijske bučke odpipetiramo 50 mL referenčne raztopine (CaCO3) =

1,0000 g/L.

S pomočjo merilnega valja dodamo 100 mL deionizirane vode.

Titracijske bučke pokrijemo s pokrovčki.

Tik pred vsako titracijo dodamo 0,20 g mureksida na 0,01 g natančno.

Raztopino v 250 mL bučki takoj namestimo na glavo titratorja.

S 5 mol/L raztopino NaOH (s pomočjo 1 mL polnilne pipete) skozi odprtino titracijske

glave uravnamo pH na 12,5 ± 0,1.

Takoj sprožimo titracijo po metodi CaDP5.

Program titratorja izračuna in izpiše povprečno vrednost določitve masnega deleža kalcija

in standardni odmik (s) določitve.

III. Določitev masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke

Raztapljanje vzorca

Na tehtalno ladjico zatehtamo od 0,20 g do 0,25 g vzorca apnenčeve moke.

S pomočjo lijaka zatehtani vzorec stresemo v predhodno stehtano 300 mL

erlenmajerico in zabeležimo točno zatehto vzorca na 0,1 mg natančno.

Počasi dodamo 10 mL HCl 1:1 in premešamo, da se vzorec raztopi.

Dodamo 20 mL deionizirane vode in na električni grelni plošči pustimo vreti od 3 do 5

min.

Raztopino ohladimo in nato kvantitativno prefiltriramo skozi filter papir (beli trak) v 250

mL merilno bučko.

Erlenmajerico in filter papir dobro speremo z deionizirano vodo.

Merilno bučko dopolnimo do oznake z deionizirano vodo in dobro premešamo.

Page 36: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 36 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Kompleksometrična titracija

Pred pričetkom meritev umerimo fototrodo pri 620 nm in izvedemo kalibracijo

kombinirane steklene elektrode.

Na titrator namestimo 20 mL bireto z 0,03 mol/L raztopino EDTA in bireto dobro

speremo.

Pod pomožnimi funkcijami titratorja preverimo vrednost določenega titra standardne

raztopine 0,03 mol/L EDTA.

V 250 mL titracijske bučke odpipetiramo 50 mL raztopine vzorca apnenčeve moke.

S pomočjo merilnega valja dodamo 100 mL deionizirane vode.

Titracijske bučke pokrijemo s pokrovčki.

Tik pred vsako titracijo dodamo 0,20 g mureksida na 0,01 g natančno.

Raztopino v 250 mL bučki takoj namestimo na glavo titratorja.

S 5 mol/L raztopino NaOH (s pomočjo 1 mL polnilne pipete) skozi odprtino titracijske

glave uravnamo pH na 12,5 ± 0,1.

Takoj sprožimo titracijo po metodi CaDP5.

Program titratorja izračuna in izpiše povprečno vrednost določitve masnega deleža kalcija

in standardni odmik (s) določitve.

Slika 3 – 2: Titracija kalcija pred (levo) in po določitvi končne točke (desno)

Page 37: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 37

4. REZULTATI IN DISKUSIJA

Kljub zagotavljanju predpisanih pogojev okolja v tehtalnem prostoru (temperatura,

vlažnost, čim manj tresljajev) ne moremo vedno zagotoviti optimalnega tehtanja. Pri

določenih vzorcih je zelo pomemben tudi način tehtanja. Če zatehtani referenčni material

CaCO3 ali vzorec apnenčeve moke stresemo v laboratorijsko posodo, se pogosto zgodi,

da se vzorec razprši po stenah laboratorijske posode. Zato smo se odločili, da vzorec

najprej zatehtamo na tehtalno ladjico, ga s pomočjo lijaka prenesemo v predhodno

stehtano 300 mL erlenmajerico in zabeležimo točno zatehto na 0,1 mg natančno.

Tehtanje s pomočjo lijaka prepreči oprijem vzorca na stene posode. Laboratorijsko

posodo, v katero tehtamo, termostatiramo na pogoje tehtalnega prostora tako, da posodo

postavimo v tehtalni prostor najmanj 4 ure pred tehtanjem.

Referenčni material CaCO3 in vzorce apnenčeve moke raztapljamo v razredčeni HCl. Z

vizualnim opazovanjem reakcije raztapljanja in meritvami pH raztopine po raztapljanju

smo določili optimalno količino in koncentracijo HCl, ki je potrebna za raztapljanje. Ker je

reakcija raztapljanja burna, se je 300 mL erlenmajerica izkazala kot najboljša izbira

posode za raztapljanje.

Pri začetnih titracijah smo v titracijsko bučko dodajali 0,10 g indikatorja mureksida in

alikvotno raztopino vzorca razredčili s toliko deionizirane vode, da sta bili elektrodi

potopljeni. Večkrat se je zgodilo, da po končani titraciji končna točka ni bila zaznana.

Ugotovili smo, da je potrebno določiti ustrezno količino indikatorja glede na volumen

razredčenega vzorca v titracijski bučki. S pomočjo meritev referenčnega materiala CaCO3

smo določili optimalno zatehto indikatorja mureksida, to je 0,20 g mureksida na 150 mL

razredčene raztopine vzorca (50 mL raztopine vzorca + 100 mL deionizirane vode).

Ugotovili smo, da se točnost in natančnost določitve močno izboljša, če indikator mureksid

dodamo tik pred titracijo, pH raztopine pa uravnamo hitro. Z eksperimenti smo določili

dovoljeno odstopanje uravnanega pH, ki ga moramo zagotoviti pred vsako titracijo (12,5 ±

0,1).

EDTA je stabilna raztopina, vendar mora biti standardizacija določena čim bolj natančno

(čim manjši standardni odmik, ki ga lahko dosežemo v laboratoriju). Rezultat

standardizacije (titer EDTA) ima pomemben vpliv pri izračunu masnega deleža kalcija v

vzorcih.

Page 38: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 38 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

4.1. VALIDACIJA METODE

Meritve za validacijo postopka določitve kalcija smo izvedli v obdobju od 5. 11. 2012 do

25. 1. 2013 na vzorcih apnenčeve moke treh različnih dobaviteljev (IAK Kresnice, Calcit

Stahovica in IGM Zagorje) in sekundarnem referenčnem materialu kalcijevega karbonata.

Preverili smo selektivnost, linearnost, točnost, ponovljivost ter obnovljivost preskusne

metode.

4.1.1. Selektivnost

EDTA je zelo neselektiven reagent, ker tvori komplekse s številnimi kovinskimi ioni.

Selektivnost določitve pri kompleksometričnih titracijah z EDTA dosežemo z izbiro

ustreznega indikatorja, pH raztopine in uporabo maskirnih reagentov.

Da bi ugotovili, kateri interferenti so prisotni v vzorcih apnenčeve moke, smo vzorce

analizirali z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM). Analiza je pokazala, da so v

vzorcih apnenčeve moke poleg glavne komponente CaCO3 prisotne v sledovih še spojine

magnezija, aluminija, silicija in bakra (slika 4 – 1).

Slika 4 – 1: SEM analiza vzorca apnenčeve moke

Quantitative results

Weig

ht%

0

10

20

30

40

50

60

C O Mg Al Si Ca

Page 39: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 39

Za preverjanje selektivnosti metode smo raziskali vpliv dveh interferentov – Fe in Al na

rezultate določitve Ca. Pripravili smo vzorec s tremi različnimi dodatki železa (2,2 % Fe,

4,4 % Fe in 9,1 % Fe) in aluminija (2,2 % Al, 4,4 % Al in 8,7 % Al). Vzorce smo analizirali

brez in z dodatkom maskirnega reagenta trietanolamina.

Interferenčne učinke smo določili z:

100)(

%

b

bi

c

ccI (3.1.)

ci – izmerjena vrednost Ca z dodatkom interferenta

cb – izmerjena vrednost Ca brez interferenta

Tabela 4 – 1: Vpliv Fe na določitev masnega deleža Ca

Dodatek interferenta -

Fe [%]

Določitev W(Ca) [%]

Vzorec Kresnice

Izmerjeno brez dodatka

trietanolamina % I

Izmerjeno z dodatkom

trietanolamina % I

0

38,31

38,31 0,00 38,34 0,08

2,2 38,16 -0,39 38,22 -0,23

4,4 37,85 -1,20 38,38 0,18

9,1 37,16 -3,00 38,17 -0,37

Slika 4 – 2: Interferenčni učinek (% I) Fe

Page 40: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 40 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Iz tabele 4 – 1 in slike 4 – 2 ugotovimo, da interferenčni učinek železa narašča z višanjem

vsebnosti železa. Z dodatkom trietanolamina pa interferenčni učinek železa uspešno

odpravimo.

Tabela 4 – 2: Vpliv Al na določitev masnega deleža Ca

Dodatek interferenta -

Al [%]

Določitev W(Ca) [%]

Vzorec Kresnice

Izmerjeno brez dodatka

trietanolamina % I

Izmerjeno z dodatkom

trietanolamina % I

0

38,35

38,35 0,00 38,29 -0,16

2,2 38,29 -0,16 38,36 0,03

4,4 38,36 0,03 38,34 -0,03

8,7 38,22 -0,34 38,30 -0,13

Slika 4 – 3: Interferenčni učinek (% I) Al

Iz tabele 4 – 2 in slike 4 – 3 ugotovimo, da za določitev masnega deleža kalcija v vzorcih

apnenčeve moke aluminij ni interferenčni element.

Page 41: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 41

4.1.2. Linearnost

Za oceno linearnosti smo izvedli meritve sekundarnega referenčnega materiala CaCO3 po

celotnem območju zatehte.

Tabela 4 – 3: Meritve RM CaCO3 po celotnem območju zatehte

Določitev W(Ca)

Zatehta [g] VKT [mL] * WCa [%]

0,0501 3,27 39,97

0,0969 6,25 39,42

0,1518 9,88 39,80

0,2081 13,59 39,93

0,2560 16,75 40,00

0,3033 19,78 39,87

* volumen v končni točki titracije (VKT)

Slika 4 – 4: Prikaz linearne odvisnosti volumna KT od zatehte

Izračunana linearna funkcija: y = 65,445 x - 0,043

Korelacijski koeficient: R2 = 1,000

Izračunan korelacijski koeficient potrjuje linearnost metode.

Page 42: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 42 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Slika 4 – 5: Izmerjene vrednosti WCa v odvisnosti od zatehte

Iz slike 4 – 5 ugotovimo, da je določitev masnega deleža kalcija odvisna od območja

zatehte.

Na osnovi teh rezultatov smo določili območje zatehte: med 0,20 g in 0,25 g.

4.1.3. Točnost

Točnost preskusnega postopka smo preverili z meritvami na sekundarnem referenčnem

materialu CaCO3 in realnem vzorcu apnenčeve moke z dodatkom sekundarnega

referenčnega materiala CaCO3 (izkoristek).

Tabela 4 – 4: Meritve RM CaCO3 za oceno točnosti

Ponovitev Določitev W(Ca) [%]

RM (CaCO3)

1 40,11

2 40,12

3 40,04

4 39,94

5 40,00

6 40,09

7 40,04

8 40,02

Page 43: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 43

Število meritev 8

Povprečna vrednost 40,05

Standardni odmik 0,060

RSD [%] 0,15

Teoretična vrednost 40,03

Izkoristek [%] 100,0

Tabela 4 – 5: Preskus izkoristka (vzorec apnenčeve moke z dodatkom RM CaCO3)

Ponovitev

Določitev W(Ca) [%]

Vzorec apnenčeve moke Kresnice 22797 + dodatek RM

Teoretično Izmerjeno Izkoristek [%]

1 46,46 46,44 100,0

2 46,46 46,53 100,2

3 46,89 46,91 100,0

4 49,65 49,96 100,6

5 48,54 48,56 100,0

6 47,60 47,73 100,3

Izkoristki določitev masnega deleža kalcija na sekundarnem referenčnem materialu

CaCO3 in realnem vzorcu apnenčeve moke z dodatkom sekundarnega referenčnega

materiala CaCO3 so med 100,0 % in 100,6 %, zato ocenjujemo, da je preskusni postopek

točen.

4.1.4. Natančnost

Ponovljivost

Za oceno ponovljivosti določitve smo izvedli ponovitve meritev pod pogoji ponovljivosti na

petih različnih realnih vzorcih, potencialne ubežnike smo za vsak vzorec preverjali z

Grubbsovim testom, izračunali standardni odmik ponovljivosti ter relativni standardni

odmik (RSD %), ki smo ga preverjali s Horwitzovim testom sprejemljivosti.

Page 44: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 44 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Tabela 4 – 6: Meritve in izračuni za oceno ponovljivosti na realnih vzorcih

Ponovitev

W(Ca) [%]

Vzorec - Apnenčeva moka

Kresnice 22797

Kresnice 7567

Kresnice 9538

Stahovica 9540

Zagorje 9539

Datum meritev 7.12.2012 15.11.2012 26.11.2012 27.11.2012 12.12.2012

1 38,47 38,55 38,71 39,08 39,30

2 38,54 38,50 38,79 39,14 39,22

3 38,49 38,56 38,77 39,15 39,27

4 38,51 38,59 38,71 39,14 39,18

5 38,43 38,54 38,70 39,23 39,32

6 38,59 38,57 38,65 39,14 39,22

7 38,50 38,58 38,72 39,19 39,23

8 38,57 38,68 38,73 39,08 39,27

Št. meritev (n) 8 8 8 8 8

Prostostne stopnje (n-1) 7 7 7 7 7

Povprečna vrednost 38,51 38,57 38,72 39,14 39,25

Standardni odmik 0,053 0,052 0,043 0,050 0,047

RSD [%] 0,14 0,13 0,11 0,13 0,12

Horwitzov test

RSDH [%] 1,547 1,547 1,546 1,543 1,543

HORRAT 0,09 0,09 0,07 0,08 0,08

Grubbsov test (α) 0,05

Gα (n, 0,05) 2,126

Gmax 1,474 2,094 1,569 1,711 1,471

Gmin 1,569 1,372 1,686 1,265 1,525

Sskupni 0,049

Ponovljivost (2,8 sskupni) 0,137

Testiranje z Grubbsovim testom je pokazalo, da med meritvami ni ubežnikov.

Za izračunane RSD je indeks HORRAT < 2, zato ocenjujemo, da je preskusni postopek

na realnih vzorcih apnenčeve moke dovolj ponovljiv.

Iz slike 4 – 6 je razvidno, da standardni odmiki ponovljivosti niso odvisni od območja

določanja. Oceno ponovljivosti smo izračunali kot 2,8 · sr (standardni odmik ponovljivosti –

sskupni).

Page 45: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 45

Slika 4 – 6: Standardni odmiki ponovitev meritev različnih vzorcev pod pogoji ponovljivosti

Obnovljivost

Za oceno obnovljivosti določitve smo izvedli ponovitve meritev pod pogoji obnovljivosti

(ponovitve v različnih časovnih obdobjih s tremi analitiki) na petih različnih realnih vzorcih,

potencialne ubežnike smo za vsak vzorec preverjali z Grubbsovim testom, izračunali

standardni odmik obnovljivosti ter relativni standardni odmik (RSD %), ki smo ga preverjali

s Horwitzovim testom sprejemljivosti.

Tabela 4 – 7: Meritve in izračuni za oceno obnovljivosti na realnih vzorcih

Ponovitev/Datum/Izvajalec

W(Ca) [%]

Vzorec - Apnenčeva moka

Kresnice 7567 Stahovica

9540 Zagorje 9539

1/ 26.11.2012/ Analitik I 38,62 39,20 39,15

2/ 26.11.2012/ Analitik I 38,60 39,16 39,15

3/ 5.12.2012/ Analitik II 38,65 39,07 39,21

4/ 5.12.2012/ Analitik II 38,58 39,13 39,23

5/ 18.12.2012/ Analitik III 38,53 39,07 39,25

6/ 18.12.2012/ Analitik III 38,48 39,05 39,11

Page 46: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 46 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Št. meritev - n 6 6 6

Prostostne stopnje (n-1) 5 5 5

Povprečna vrednost 38,58 39,11 39,18

Standardni odmik 0,062 0,060 0,055

RSD [%] 0,16 0,15 0,14

Horwitzov test

RSDH [%] 1,731 1,728 1,727

HORRAT 0,09 0,09 0,08

Grubbsov test (α) 0,05

Gα (n, 0,05) 1,887

Gmax 1,179 1,455 1,220

Gmin 1,555 1,063 1,342

sskupni 0,059

Obnovljivost (2,8 sskupni) 0,165

Testiranje z Grubbsovim testom je pokazalo, da med meritvami ni ubežnikov.

Za izračunane RSD je indeks HORRAT < 2, zato ocenjujemo, da je preskusni postopek

na realnih vzorcih apnenčeve moke obnovljiv.

Iz slike 4 – 7 je razvidno, da standardni odmiki obnovljivosti niso odvisni od območja

določanja. Oceno obnovljivosti smo izračunali kot 2,8 · sR (standardni odmik obnovljivosti –

sskupni).

Slika 4 – 7: Standardni odmiki ponovitev meritev različnih vzorcev pod pogoji obnovljivosti

Page 47: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 47

4.2. IZRAČUN MERILNE NEGOTOVOSTI

Po izvedbi validacije metode smo določili še merilno negotovost rezultata določitve kalcija. Merilno negotovost smo ovrednotili na osnovi ocene vseh virov negotovosti, ki smo jih opredelili z modelno enačbo.

4.2.1. Definicija merjenca

Modelna enačba:

%1001000

03,0

50

250

Vm

VMtVW

v

CaEDTAEDTACa

03,0

1000

1000

50

3

33

VMV

Vpmt

CaCO

s

EDTA

CaCOCaCO

EDTA

CaW …............... masni delež kalcija [%]

EDTAV …………. volumen EDTA pri titraciji vzorca ][mL

0,03…………… nominalna koncentracija EDTA ]/[ Lmol

EDTAt ………….. titer EDTA

CaM …………... molska masa kalcija ]/[ molg

vm …………….. masa zatehte vzorca apnenčeve moke ][g

250V …………… volumen 250 mL merilne bučke (redčenje vzorca) ][mL

50V ……………. volumen 50 mL polnilne pipete (redčenje vzorca) ][mL

1000………….. faktor pretvorbe iz mL v L

100……………. izračun rezultata v %

3CaCOm ………… masa zatehte RM CaCO3 ][g

3CaCOp ………… čistost RM CaCO3

s

EDTAV …………. volumen EDTA pri standardizaciji ][mL

3CaCOM ……….. molska masa CaCO3 ]/[ molg

50V ……………. volumen 50 mL polnilne pipete (redčenje RM) ][mL

1000V …………... volumen 1000 mL merilne bučke (redčenje RM) ][mL

4.2.2. Identifikacija izvorov negotovosti

Za predstavitev izvorov in komponent merilne negotovosti uporabimo diagram vzrokov in

učinkov:

Page 48: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 48 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Slika 4 – 8: Diagram vzrokov in učinkov za postopek določitve kalcija

4.2.3. Kvantifikacija komponent negotovosti

Negotovost določitve titra EDTA

0163,1/03,01000/087,10050,16

/1000500000,10070,1

03,0

1000

1000

50

3

33

LmolmLmolgmL

LmLmLg

VMV

Vpmt

CaCO

s

EDTA

CaCOCaCO

EDTA

a) Negotovost mase zatehte RM CaCO3 za standardizacijo:

zahtevana točnost tehtnice je 0,3 mg: mgmg

kalmu 15,02

3,0.),(

gmgmu CaCO 00015,015,0)(3

000149,00070,1

00015,0)(

3

g

gmu CaCOR

Kalib. birete

Temp.

Kalib. bučke

Temp. Kon. točka

Temp.

Kalib. birete

Kon. točka

Kalib

. Temp.

Kalib

. Temp.

WCa

Ponovljivost (P)

Kalib. pipete

Temp.

Kalib.

Kalib.

Pon. standardizacije

Page 49: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 49

b) Negotovost čistosti RM CaCO3:

0005,09998,0%05,0%98,99

00025,02

0005,0)()(

33 CaCORCaCO pupu

c) Negotovost volumna 50 mL polnilne pipete:

toleranca 50 mL polnilne pipete (kalibracijski certifikat):

mLmL

kalVumLmL 0204,06

05,0.),(05,000,50 50

vpliv temperature:

mLmL

TVumLKmLKV

VdTdV

0303,03

0525,0),(0525,0550101,2 50

14

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mLVu 0365,00303,00204,0)( 22

50

00073,050

0365,0)( 50

mL

mLVuR

d) Negotovost molske mase CaCO3:

Ca → 40,078(4) molgCau /0023,03

004,0)(

C → 12,0107(8) molgCu /00046,03

0008,0)(

O → 15,9994(3) molgOu /00017,03

0003,0)(

molgMCaCO /087,1003

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

molgMu CaCO /0024,0)00017,03()00046,01()0023,01()( 222

3

000024,0/087,100

/0024,0)(

3

molg

molgMu CaCOR

Page 50: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 50 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

e) Negotovost volumna 1000 mL merilne bučke:

kalibracija 1000 mL bučke (kalibracijski certifikat):

mLmL

kalVumLmL 163,06

40,0.),(40,000,1000 1000

vpliv temperature:

mLmL

TVumLKmLKV

VdTdV

606,03

05,1),(05,151000101,2 1000

14

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mLVu 628,0606,0163,0)( 22

1000

00063,01000

628,0)( 1000

mL

mLVuR

f) Negotovost volumna raztopine EDTA pri standardizaciji:

20 mL bireta Mettler

mLV s

EDTA 5,16

fotometrična določitev EQP

toleranca 20 mL birete (kalibracijski certifikat):

mLmL

kalVumLmL s

EDTA 0163,06

04,0.),(04,000,20

vpliv temperature:

mLmL

TVumLKmLKV

VdTdV

s

EDTA 0100,03

0173,0),(0173,055,16101,2 14

določitev končne točke (Bias):

Negotovost biasa določitve končne točke je zanemarljiva.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mLVu s

EDTA 0191,00100,00163,0)( 22

00116,05,16

0191,0)(

mL

mLVu s

EDTAR

Page 51: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 51

g) Ponovljivost standardizacije:

Povprečni standardni odmik meritev določitve titra: 0,00079

00079,0)( tR Pu

Kombinirana negotovost EDTAt :

00173,000079,000116,000063,0000024,000073,000025,0000149,0

)()()()()()()(

)()(

2222222

222

1000

22

50

22

333

tR

s

EDTARRCaCORRCaCORCaCOR

EDTA

EDTAEDTAR

PuVuVuMuVupumu

t

tutu

00176,00163,100173,0)()( EDTAEDTAREDTA ttutu

Negotovost določitve masnega deleža kalcija

%25,38%100/1000502300,0

250/078,400163,1/03,040,14

%1001000

03,0

50

250

LmLmLg

mLmolgLmolmLW

Vm

VMtVW

Ca

v

CaEDTAEDTACa

a) Negotovost določitve titra EDTA:

00173,0)( EDTAR tu

b) Negotovost molske mase Ca:

Ca → 40,078(4) molgCau /0023,03

004,0)(

molgMCa /078,40

molgMu Ca /0023,0)(

000057,0/078,40

/0023,0)(

molg

molgMu CaR

Page 52: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 52 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

c) Negotovost mase zatehte vzorca:

zahtevana točnost tehtnice je 0,3 mg: mgmg

kalmu 15,02

3,0.),(

gmgmu v 00015,015,0)(

00065,02300,0

00015,0)(

g

gmu vR

d) Negotovost volumna 250 mL merilne bučke:

kalibracija 250 mL bučke (kalibracijski certifikat):

mLmL

kalVumLmL 061,06

15,0.),(15,000,250 250

vpliv temperature:

mLmL

TVumLKmLKV

VdTdV

152,03

2625,0),(2625,05250101,2 250

14

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mLVu 164,0152,0061,0)( 22

250

00066,0250

164,0)( 250

mL

mLVuR

e) Negotovost volumna 50 mL polnilne pipete:

00073,050

0365,0)( 50

mL

mLVuR

f) Negotovost volumna raztopine EDTA pri titraciji vzorca:

20 mL bireta Mettler

mLVEDTA 15

fotometrična določitev EQP

Page 53: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 53

toleranca 20 mL birete (kalibracijski certifikat):

mLmL

kalVumLmL EDTA 0163,06

04,0.),(04,000,20

vpliv temperature:

mLmL

TVumLKmLKV

VdTdV

EDTA 0091,03

0158,0),(0158,0515101,2 14

določitev končne točke (Bias):

Negotovost biasa določitve končne točke je zanemarljiva.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mLVu EDTA 0187,00091,00163,0)( 22

00125,000,15

0187,0)(

mL

mLVu EDTAR

g) Ponovljivost določitve masnega deleža kalcija:

Ker se za različne vzorce apnenčeve moke standardni odmiki meritev bistveno ne

razlikujejo, smo laboratorijsko ponovljivost postopka ovrednotili kot sskupni:

049,0)( CaPu

00128,025,38

049,0)( CaR Pu

4.2.4. Izračun kombinirane in razširjene negotovosti

Kombinirana merilna negotovost določitve kalcija:

00275,0)(

00128,000125,000073,000066,000065,0000057,000173,0)(

)()()()()()()()(

)()(

2222222

222

50

2

250

222

CaR

CaR

CaREDTARRRvRCaREDTARCaR

Ca

CaCaR

Wu

Wu

PuVuVuVumuMutuWu

W

WuWu

Page 54: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 54 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

%11,0%25,3800275,0)( CaWu

Razširjena merilna negotovost rezultata določitve kalcija pri 95 % stopnji zaupanja:

%22,0%11,02)( CaWU

Slika 4 – 9: Prikaz deleža vpliva posameznih izvorov negotovosti na celotno negotovost

Page 55: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 55

5. ZAKLJUČEK

Namen diplomske naloge je bil razviti in validirati kompleksometrično metodo za določitev

masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke z avtomatskim titratorjem in

fotometrično določitvijo končne točke s fototrodo.

Pri postopku validacije smo preverili selektivnost, linearnost, točnost, ponovljivost ter

obnovljivost preskusne metode.

Za preverjanje selektivnosti metode določitve kalcija smo raziskali vpliv dveh motečih

elementov (interferentov): železa in aluminija. Ugotovili smo, da interferenčni učinek

železa narašča z višanjem vsebnosti železa. Z dodatkom trietanolamina smo interferenčni

učinek železa uspešno odpravili. Vsebnost aluminija pa na določitev masnega deleža

kalcija v vzorcih apnenčeve moke nima izrazitega vpliva.

Za oceno linearnosti smo izvedli meritve sekundarnega referenčnega materiala CaCO3 po

celotnem območju zatehte. Z dobljenim korelacijskim koeficientom R2 = 1,000 smo potrdili

linearnost metode. Ugotovili smo, da je določitev masnega deleža kalcija odvisna od

območja zatehte. Na osnovi rezultatov smo določili območje zatehte med 0,20 g in 0,25 g.

Točnost preskusnega postopka smo preverili z meritvami na sekundarnem referenčnem

materialu CaCO3 in z meritvami na realnem vzorcu apnenčeve moke z dodatkom

sekundarnega referenčnega materiala CaCO3. Izkoristki določitev masnega deleža kalcija

na sekundarnem referenčnem materialu CaCO3 in izkoristki določitev na realnem vzorcu

apnenčeve moke z dodatkom sekundarnega referenčnega materiala CaCO3 so med

100,0 % in 100,6 %, zato smo ocenili, da je preskusni postopek točen.

Za oceno ponovljivosti določitve smo izvedli ponovitve meritev pod pogoji ponovljivosti na

petih različnih realnih vzorcih. Potencialne ubežnike smo za vsak vzorec preverjali z

Grubbsovim testom, izračunali standardni odmik ponovljivosti ter relativni standardni

odmik (RSD %), ki smo ga preverjali s Horwitzovim testom sprejemljivosti. Testiranje z

Grubbsovim testom je pokazalo, da med meritvami ni ubežnikov. Za izračunane RSD je

indeks HORRAT < 2, zato smo ocenili, da je preskusni postopek na realnih vzorcih

apnenčeve moke dovolj ponovljiv.

Za oceno obnovljivosti določitve smo izvedli ponovitve meritev pod pogoji obnovljivosti

(ponovitve v različnih časovnih obdobjih s tremi analitiki) na petih različnih realnih vzorcih.

Potencialne ubežnike smo za vsak vzorec preverjali z Grubbsovim testom, izračunali

standardni odmik obnovljivosti ter relativni standardni odmik (RSD %), ki smo ga preverjali

s Horwitzovim testom sprejemljivosti. Testiranje z Grubbsovim testom je pokazalo, da

med meritvami ni ubežnikov. Za izračunane RSD je indeks HORRAT < 2, zato smo

ocenili, da je preskusni postopek na realnih vzorcih apnenčeve moke obnovljiv.

Z ovrednotenjem posameznih prispevkov k merilni negotovosti rezultata določitve

masnega deleža kalcija smo izračunali kombinirano in razširjeno merilno negotovost.

Razširjena merilna negotovost rezultata določitve kalcija pri 95 % stopnji zaupanja znaša

0,22 %.

Page 56: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 56 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

6. LITERATURA IN VIRI

1. Kolar, M. Osnove kvantitativne analizne kemije I, Navodila za vaje. Maribor: Univerza v Mariboru, FKKT, 2003.

2. Asif Husain. Pharmaceutical Analysis, Theoretical Basis of Analysis: Complexometric Titrations. Dept. of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi- 110062, 2007.

3. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J. Fundamentals of Analytical Chemistry, Sixth edition. Saunders College Publishing, 1992.

4. Mettler Toledo, USER COM 3, Informacije za uporabnike titracijskih in pH sistemov, merilcev gostote in refraktometrov koncerna Mettler Toledo.

5. Mettler Toledo. Operating Instructions: PhototrodeTM DP5. Mettler Toledo, 2006.

6. Miller, J. N., Miller, J. C. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, Fifth Edition. Pearson Education Limited, Edinburgh Gate, Harlow, 2005.

7. Brodnjak-Vončina, D. Industrijska analiza, zbrano gradivo. Maribor: Univerza v Mariboru, FKKT, 2007.

8. Ojsteršek, J. Industrijska analiza, seminarska naloga. Maribor: Univerza v Mariboru, FKKT, 2012.

9. Stepančič, A. Statistična orodja v Excelu, Skripta za interno uporabo, I. del: Opisna statistika in testiranje hipotez. Cinkarna Celje, 2006.

10. Stepančič, A. Navodilo za delo št. 01900070014: Navodilo za validacijo preskusnih metod. Cinkarna Celje, 2005.

11. Mettler Toledo. Titration Applications Brochure 16: Validation of Titration Methods, A Guideline for Customers of Mettler Toledo Titrators, 1996

12. EURACHEM / CITAC Guide CG4. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, Third Edition, 2012.

13. Pustinek, J. Navodilo za delo št. 01900070172: Navodilo za izračun merilne negotovosti. Cinkarna Celje, 2008.

Page 57: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 57

7. PRILOGE

7.1. Priloga A: Značilne aplikacije fototrode Mettler DP5

Page 58: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 58 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

7.2. Priloga B: Izpis metode za določitev titra EDTA

Page 59: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 59

Page 60: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 60 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Page 61: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 61

7.3. Priloga C: Izpis metode za določitev kalcija

Page 62: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 62 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Page 63: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 63

Page 64: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 64 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

7.4. Priloga D: Izpis titracijskih krivulj za določitev titra EDTA

7.5. Priloga E: Izpis titracijskih krivulj za določitev kalcija

Page 65: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija Stran 65

7.6. Priloga F: Certifikat RM CaCO3

Page 66: VALIDACIJA POSTOPKA DOLOČITVE MASNEGA DELEŽA …Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

Stran 66 Validacija postopka določitve masnega deleža kalcija v vzorcih apnenčeve moke in ovrednotenje merilne negotovosti določitve kalcija

8. ŽIVLJENJEPIS

Europass življenjepis

Osebni podatki

Ime / Priimek Janja Ojsteršek

Naslov Oblakova ulica 32, 3000 Celje, Slovenija

E-pošta [email protected]

Državljanstvo Slovensko

Datum rojstva 7. 11. 1965

Spol Ženski

Delovne izkušnje

Obdobje 10. 9. 1984 –

Glavne naloge in pristojnosti Kemijski tehnik v Analitskem laboratoriju Tehnolog v Analitskem laboratoriju (od leta 2010 dalje)

Naziv in naslov delodajalca Cinkarna Celje d.d., Kidričeva 26, 3001 Celje

Izobraževanje in usposabljanje

Obdobje 1980 – 1984

Naziv izobrazbe in / ali nacionalne poklicne kvalifikacije

Kemijski tehnik

Naziv in status ustanove, ki je podelila diplomo, spričevalo ali

certifikat

Šolski center Celje Srednja šola za kemijo, elektrotehniko in računalništvo Pot na Lavo 22, 3000 Celje

Stopnja izobrazbe po nacionalni ali mednarodni klasifikacijski

lestvici V.

Znanja in kompetence

Materni jezik(i) Slovenski jezik

Drug(i) jezik(i) Angleški jezik

Računalniška znanja in kompetence Dobro poznavanje računalniških programov Microsoft Office

Vozniško dovoljenje B kategorije