Wykorzystanie HPLC do izolacji i badania czysto›ci antybiotyk³w

  • View
    217

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Wykorzystanie HPLC do izolacji i badania czysto›ci antybiotyk³w

  • 1

    Wykorzystanie HPLC do izolacji i badania czystoci

    antybiotykw

    Przedmiot: Instrumentalne metody badania struktury i aktywnoci

    biomoleku

    Kierunek studiw: Biotechnologia Lekw

    Opracowali : Sprawdzi i zatwierdzi : prof. dr hab. in. Marian Kamiski mgr in. Mariusz Jaszczot prof. dr hab. in. Marian Kamiski dr in. Agnieszka Sagajdakow

    Gdask, 2012

  • 2

    PODSTAWY TEORETYCZNE

    Antybiotyki peptydowe

    Sposoby definiowania antybiotykw zmieniay si wraz z rozwojem

    antybiotykoterapii. Wedug pierwszej definicji zaproponowanej w roku 1942 przez

    Waksmana terminem antybiotyki (sowo pochodzi przez poczenie dwch wyrazw

    greckich: anti przeciw oraz biotikos zwizany z yciem) okrelane byy wszystkie

    substancje chemiczne wytwarzane przez drobnoustroje, ktre w duych rozcieczeniach maj

    zdolno zabijania lub hamowania (inhibicji) wzrostu innych drobnoustrojw. Aktualna

    definicja zaproponowana przez Chmiela (1998) okrela antybiotyki, jako substancje

    naturalne, najczciej pochodzenia mikrobiologicznego oraz ich syntetyczne i psyntetyczne

    analogi, ktre w maym steniu wybirczo dziaaj na struktury i procesy biologiczne,

    hamuj wzrost lub procesy rozmnaania.

    Z powodu bardzo duej liczby antybiotykw pochodzenia naturalnego oraz jeszcze

    wikszej liczby ich chemicznych modyfikacji oraz antybiotykw syntetycznych, brak jest

    jednorodnej i przejrzystej klasyfikacji. Z tego wzgldu obecnie stosuje si kilka kryteriw

    grupowania antybiotykw. Gwnym i najczciej stosowanym sposobem klasyfikacji

    substancji chemicznych o aktywnoci antybiotycznej, jest ich budowa chemiczna [1].

    Antybiotyki s uszeregowane w piciu grupach:

    pochodne aminokwasw (penicyliny, cyklosporyna itp.),

    pochodne cukrw (streptomycyna, teikoplanina, itp.),

    antybiotyki makrocykliczne (erytromycyna, amfoterycyna B),

    chinony (tetracyklina, naftochinony, itp.),

    inne antybiotyki (chloramfenikol, polioksyna, itp.).

    Do grupy pochodnych aminokwasowych, oprcz niektrych modyfikowanych

    aminokwasw, zalicza si rwnie antybiotyki peptydowe (nizyna) oraz ich pochodne:

    glikopeptydy (wankomycyna), lipopeptydy (daptomycyna) oraz chromopeptydy

    (aktynomycyna). Zwizki chemiczne bdce pochodnymi aminokwasw, w tym naturalne

    peptydy antydrobnoustrojowe (PAD) stanowi du grup zrnicowanych pod wzgldem

    budowy chemicznej i struktury przestrzennej zwizkw chemicznych o masie czsteczkowej

    od kilkuset Da (Dalton) do kilkuset kDa. Cz z nich, jak np. gramicydyna s syntetyzowane

    klasycznie, metod rybosomaln, a cz, jak wankomycyna, (bdca glikopeptydem) s

    otrzymywane na drodze syntezy nierybosomalnej.

  • 3

    Do dzisiaj powyej 40 000 antybiotykw zostao odkrytych ze rde naturalnych,

    z tego, co najmniej 3 700, to peptydy wykazujce aktywno przeciwdrobnoustrojow

    (antybiotyki peptydowe), ktre wyizolowano z szerokiej grupy organizmw ywych, do

    ktrej zaliczy mona: bakterie, grzyby, bezkrgowce (owady, pajczaki), krgowce (pazy,

    ryby, ssaki, w tym czowiek), ale rwnie wirusy (np. wirus HIV) [2,3].

    Organizmy bakteryjne wytwarzaj bardzo szerok gam zwizkw chemicznych

    o dziaaniu bakteriobjczym lub bakteriostatycznym, do ktrych nale: toksyny, enzymy

    proteolityczne oraz peptydy antydrobnoustrojowe (PDA) tym przypadku nazywane

    bakteriocynami.

    Wedug Klaenhammera (1993) 99% bakterii produkuje, co najmniej jedn

    bakteriocyn [4]. Bakteriocyny stanowi liczn grup peptydw antydrobnoustrojowych

    syntetyzowanych rybosomalnie przez bakterie zarwno gram dodatnie, jak i gram ujemne.

    Najbardziej znan grup bakteriocyn s kolicyny, produkowane przez gram ujemne

    paeczki E. coli. Sekwencja peptydu, sekwencja biaka ochronnego oraz sekwencja biaka

    odpowiadajcego za uwolnienie peptydu z komrki s kodowane, jako klaster genw

    i przechowywane w plazmidzie Col. Kolicyny wykazuj dziaanie nukleolityczne w stosunku

    do kwasw nukleinowych (DNA, rRNA i tRNA), powoduj depolaryzacj bony komrkowej

    (na zasadzie tworzenia kanaw jonowych), a take s inhibitorami syntetazy mureinowej.

    Peptyd wykazuje dziaanie toksyczne w stosunku zarwno do szczepu produkcyjnego,

    szczepw pokrewnych, ale rwnie innych rodzajw bakterii gram ujemnych [5].

    Bakterie gram (+) rwnie zdolne s do produkcji PAD, jednak ciar czsteczkowy

    tych peptydw jest mniejszy, ni 6kDa. W wielu przypadkach s to kationowe, amfifilowe

    peptydy transbonowe, ktre w duym stopniu przypominaj peptydy

    przeciwdrobnoustrojowe produkowane przez komrki eukariotyczne. Jednake peptydy

    wykazuj znacznie wysz aktywno w stosunku do specyficznych mikroorganizmw (na

    poziomie stenia pikomolarnego oraz nanomolarnego).

    Bakteriocyny bakterii gram dodatnich ze wzgldu na zrnicowanych charakter

    fizykochemiczny zostay podzielone na cztery klasy:

    lantybiotyki (klasa I),

    niemodyfikowane / nielantybiotykowe bakteriocyny (klasa II),

    wysokoczsteczkowe, termolabilne bakteriocyny (klasa III),

    bakteriocyny modyfikowane podstawnikiem lipidowym lub wglowodanowym

    (klasa IV).

  • Lantybiotyki (z ang.

    w swojej sekwencji lantioni

    strukturalnych zostay podzielone na dwie podgrupy: typ A oraz typ B

    wyduone, amfifilowe acuchy peptydowe o ci

    biwarstw fosfolipidow. Do tej grupy zalicza si

    peptydy o ciarze czsteczkowym ok. 2kDa, o ksztacie globularnym,

    powierzchniowego. Peptydy z tej klasy (np. mersacydyna i aktagardyna) s

    reakcji enzymatycznych zachodz

    komrkowej [7].

    Rys. 1. Wzr strukturalny aminokwasu niebiakowego, lantioniny.

    Niemodyfikowane bakteriocyny (k

    mlekowego (LAB) to w wi

    aminokwasowe (< 5kDa), ktre zostay podzielone na dwie podklasy: pochodne pediocyny

    (A) oraz bakteriocyny dipeptydowe (B).

    Trzecia podklasa bakteriocyn

    z dwch komplementarnych peptydw i najwy

    uzyskuj, kiedy oba peptydy s

    tej podgrupy to wysokoczsteczkowe, ulegaj

    10-15min.): laktocyny (G, M i F), termpofiliny (A i B) i wiele innych.

    Bakteriocyny z grupy

    lipidowy, bd wglowodanowy

    jest

    w wielu przypadkach pomijana.

    Antybiotyki peptydowe pochodzenia bakteryjnego

    dziaanie toksyczne rwnie w stosunku do szczepw bakterii wytwarzaj

    Z tego powodu mikroorganizmy opracoway sposoby ochrony przed toksycznym dziaaniem

    produkowanych przez siebie bakteriocyn. Pierwszym sposobem jest synteza peptydu

    ochronnego, ktrego sekwencja jest kodowana w klasterze genowym. Innym sposobem jest

    (z ang. lanthionine containing antibiotics), czyli PAD zawiera

    w swojej sekwencji lantioni (rys. 1) lub 3 metylolantioni, na podstawie r

    strukturalnych zostay podzielone na dwie podgrupy: typ A oraz typ B

    cuchy peptydowe o ciarze 2 5kDa, zdolne do przenikania

    . Do tej grupy zalicza si nizyn, epidermin oraz Pep5

    steczkowym ok. 2kDa, o ksztacie globularnym, pozbawione

    powierzchniowego. Peptydy z tej klasy (np. mersacydyna i aktagardyna) s

    reakcji enzymatycznych zachodzcych w komrce, np. synteza bakteryjnej

    Wzr strukturalny aminokwasu niebiakowego, lantioniny.

    Niemodyfikowane bakteriocyny (klasa II) produkowane przez szczepy bakterii kwasu

    mlekowego (LAB) to w wikszoci krtkie (30 70 AA), niskoczsteczkowe a

    aminokwasowe (< 5kDa), ktre zostay podzielone na dwie podklasy: pochodne pediocyny

    (A) oraz bakteriocyny dipeptydowe (B).

    podklasa bakteriocyn jest unikalna, ze wzgldu na to,

    z dwch komplementarnych peptydw i najwysz aktywno przeciwdrobnoustrojow

    , kiedy oba peptydy s obecne w porwnywalnej iloci. Peptydy wchodz

    wysokoczsteczkowe, ulegajce termicznej inaktywacji (60

    : laktocyny (G, M i F), termpofiliny (A i B) i wiele innych.

    z grupy IV do due polipeptydy zawierajce w strukturze pods

    owy (np. laktocyna S). Ze wzgldu na niskie znaczenie

    w wielu przypadkach pomijana.

    Antybiotyki peptydowe pochodzenia bakteryjnego, jak ju wspomniano wykazuj

    w stosunku do szczepw bakterii wytwarzaj

    Z tego powodu mikroorganizmy opracoway sposoby ochrony przed toksycznym dziaaniem

    produkowanych przez siebie bakteriocyn. Pierwszym sposobem jest synteza peptydu

    ochronnego, ktrego sekwencja jest kodowana w klasterze genowym. Innym sposobem jest

    4

    ), czyli PAD zawierajce

    a podstawie rnic

    strukturalnych zostay podzielone na dwie podgrupy: typ A oraz typ B [6]. Typ A to

    5kDa, zdolne do przenikania przez

    oraz Pep5. Typ B to

    pozbawione adunku

    powierzchniowego. Peptydy z tej klasy (np. mersacydyna i aktagardyna) s inhibitorami wielu

    ynteza bakteryjnej ciany

    Wzr strukturalny aminokwasu niebiakowego, lantioniny.

    lasa II) produkowane przez szczepy bakterii kwasu

    steczkowe acuchy

    aminokwasowe (< 5kDa), ktre zostay podzielone na dwie podklasy: pochodne pediocyny

    du na to, e s zbudowane

    przeciwdrobnoustrojow

    ci. Peptydy wchodzce w skad

    ce termicznej inaktywacji (60 100C,

    ce w strukturze podstawnik

    du na niskie znaczenie grupa ta

    wspomniano wykazuj

    w stosunku do szczepw bakterii wytwarzajcych dany peptyd.

    Z tego powodu mikroorganizmy opracoway sposoby ochrony przed toksycznym dziaaniem

    produkowanych przez siebie bakteriocyn. Pierwszym sposobem jest synteza peptydu

    ochronnego, ktrego sekwencja jest kodowana w klasterze genowym. Innym sposobem jest

  • zastosowanie biaek transportowych ABC

    bakteryjnej.

    Nizyna (antybiotyk typu A) bezapelacyjnie jest najlepiej poznan