Pathologist Perspective: Positioning RT PCR, Antibody and Other Test to

Support COVID-19 Patient Management

Prof. Dr. Aryati, dr., MS, SpPK(K) Ketua Umum Pengurus Pusat

Perhimpunan Dokter Spesialis Patologi Klinik (PDS PatKLIn)

Minggu, 26 April 2020

Memperingati 34th Anniversary PATELKI

Topik Bahasan

1. Mengenal Virus SARS-CoV-2

2. Mekanisme Penularan dan Patogenesis

3. RT-PCR

4. Tes Serologi

5. Parameter Laboratorium Untuk Manajemen Covid-19

6. Penanganan Spesimen

2

1. Mengenal Virus SARS-CoV-2

3

Virus SARS-CoV-2

6 jenis Coronavirus yang menginfeksi manusia:

• HKU1 (Beta Coronavirus)

• OC43 (Beta Coronavirus)

• 229E (Alpha Coronavirus)

• NL63 (Alpha Coronavirus)

• SARS-CoV

• MERS-CoV

• SARS-CoV-2

4

Ordo : Nidovirales

Family : Coronaviridae

Genus : Beta coronavirus

Subgenus: Sarbecovirus

Sumber gambar: Peiris & Yuan, 2003. Severe acute respiratory syndrome. doi:10.1038/nm1143

Penyebab penyakit Coronavirus

Disease 2019 (COVID-19)

2. Mekanisme Penularan dan Patogenesis

5

1. Droplet Transmission Terkena percikan droplet (5 – 10 µm) yang terinfeksi

dalam jarak 1 meter dari batuk / bersin Resiko mukosa (mulut/hidung) atau konjungtiva

(mata) terpapar droplet

2. Contact Transmission Kontak langsung dengan pasien yang terinfeksi Kontak tidak langsung dengan permukaan / benda

yang digunakan pada pasien yang terinfeksi (stetoskop / termometer)

6

PENULARAN VIRUS SARS-CoV-2

WHO Scientific Brief 29 March 2020. Modes of transmission of virus causing COVID-19: Implications for IPC precaution recommendations

Belum ada laporan penularan airborne dapat terjadi pada kondisi/tindakan yang menghasilkan aerosol

Ilustrasi Transmisi Penyebab COVID-19

7

Kemungkinan Penularan Lewat Cairan Tubuh Lain?

8

• Wang et al, 2020 RNA virus terdeteksi di darah (1%), dan feses (29%). Terdeteksi virus hidup pada feses 2 pasien

• Zhang et al, 2020 RNA Virus terdeteksi di darah pada 6 dari 15 pasien (40%)

• Tan et al, 2020 RNA virus terdeteksi pada 5,7% plasma sampel

• Lescure et al, 2020 terdeteksi RNA virus di serum pada 1 dari 5 pasien dengan jumlah rendah

Mendeteksi RNA virus, bukan deteksi virus hidup (infektivitas?)

9 Dr. Joao Toledo. February 19, 2020. Infection Prevention and Control and novel coronavirus (COVID-19): standard precautions and use of personal protective equipment.Pan American Health Organization

Belum ada data

Skema Replikasi dan Patogenesis Virus

10

1 Susilo, et al. 2020. Coronavirus Disease 2019: Tinjauan Literatur Terkini. Jurnal Penyakit Dalam Indonesia |

Vol. 7,

No. 1 | Maret 2020 2 Riordan, 2003. Angiotensin-I-converting enzyme and its relatives. Genome Biology 2003, 4:225

PENTING RESEPTOR ACE2

EKSPRESI RESEPTOR ACE2

• Type II alveolar cells (AT2) of lung • Esophagus upper and stratified epithelial cells • enterocytes from ileum and colon

• Myocardial cells • Kidney proximal tubule cells • Bladder urothelial cells

Mehra & Siddiqi, 2020. COVID-19 Illness in Native and Immunosuppressed States: A

Clinical-Therapeutic Staging Proposal. https://doi.org/10.1016/j.healun.2020.03.012.

Diakses 22 April 2020 11

BADAI SITOKIN

Posisi RT-PCR, Antibodi dan Laboratorium Lain Pada Manajemen

COVID-19

12 https://www.ifcc.org/ifcc-news/2020-03-26-ifcc-information-guide-on-covid-19/

3. RT-PCR SARS-CoV-2

13

14 Torres, 2008

Target Gen RT-PCR SARS-CoV-2

Nama Alat Target Gene

CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel 1

N1, N2

Xpert® Xpress SARS-CoV-22 E dan N2

Abbott RealTime SARS-CoV-23 RdRP dan N

STANDARD M nCoV Real-Time Detection kit4 Orf1ab (RdRp) dan E

QIAstat-Dx® Respiratory SARS-CoV25 Orf1b poly gen (RdRp) dan E

Cobas SARS-CoV-26 Orf1a/b dan E 15

Pemilihan Jenis Sampel

16

1 Tan et al, 2020. Viral Kinetics and Antibody Responses in Patients with COVID-19.

https://doi.org/10.1101/2020.03.24.20042382

2 Wang et al, 2020. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.

https://jamanetwork.com/

on 04/01/2020

SkemaTahapan real time RT-PCR

17 1 http://www.differencebetween.net/science/difference-between-rt-pcr-and-qpcr/ 2 Gachon et al, 2020. DOI: 10.1093/jxb/erh181

Pengambilan Sampel Nasofaring / Orofaring

18 Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbangkes. Workshop Case Management COVID-19. Jakarta, 21 Februari 2020

Sampel Swab Nasofaring Sampel Swab Orofaring

Sampel Sputum

Pengambilan Sampel Swab Anak

Virus Transpor Media

19 Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbangkes. Workshop Case Management COVID-19. Jakarta, 21 Februari 2020

Kemungkinan Penyebab False Negative KARAKTERISTIK PENYAKIT KETERBATASAN PENGAMBILAN SAMPEL

1. Kadar muatan virus berbeda di tahap infeksi yang berbeda

2. Ada perbedaan spesifik terhadap organ tubuh yang diserang virus

1. Pelaksanaan pengambilan sampel, lokasi, volume

2. Penggunaan polyester atau kapas sintetis (swab) untuk deteksi virus dan PCR

3. Tenaga medis pengambilan sampel yang tidak berstandar

TRANSPORTASI, PENYIMPANAN, MASALAH LAINNYA

KELEMAHAN REAGEN PCR

1. Pemilihan wadah penyimpanan cairan virus (VTM)

2. Faktor eksternal (suhu/ waktu penyimpanan/ transportasi)

3. Virus RNA mudah terdegradasi

1. Siklus R&D yang singkat dan stabilitas produk yang buruk

2. Belum melalui verifikasi berulang kali dan verifikasi klinis

3. Kekurangan situs gen spesifik yang tidak mencukupi saat merancang

4. Kualitas qPCR bervariasi dari produsen berbeda

20 Liu Min, Dept. Laboratorium Medis RS Pertama Afiliasi Universitas Sun Yat-Sen. Mindray Webinar. 14 April

2020

FAKTOR YANG PERLU DIPERHATIKAN PADA PCR COVID-19

1.Jenis spesimen (nasofaring /orofaring swab, sputum, BAL) tingkat positivitas berbeda

2.Persyaratan laboratorium yang dapat mengerjakan PCR (sesuai SE HK.02.01/MENKES/234/2020)

3.Ketersediaan APD, Swab & VTM, Reagen Ekstraksi dan PCR

4.Kompetensi SDM dalam (1). Pengambilan sampel; (2) Ekstraksi; (3) PCR

5.Perbedaan proses ekstraksi: manual/semi otomatis/otomatis

6.Perbedaan alat PCR: open/closed system

7.Perbedaan target gen Interpretasi dan keseragaman pelaporan hasil

21

4. Tes Serologi

22

Prinsip Tes Serologi (Rapid Test / Immunochromatography)

• Deteksi antibodi yang dihasilkan tubuh terhadap antigen (IgM, IgG, antibodi total, dll)

• Berbagai metode:

ELISA

CLIA

IFA

Immunochromatography (Rapid Test)

23 Sumber gambar: https://www.clinisciences.com/lire/newsletter-26/sars-cov-2-covid-19-test-rapide-2264.html

Dynamic Titers of IgM Antibodies to SARS-CoV-2

24 Tan et al, 2020. Viral Kinetics and Antibody Responses in Patients with COVID-19.

https://doi.org/10.1101/2020.03.24.20042382.

Dynamic Titers of IgG Antibodies to SARS-CoV-2

25 Tan et al, 2020. Viral Kinetics and Antibody Responses in Patients with COVID-19.

https://doi.org/10.1101/2020.03.24.20042382.

Tingkat Positivitas PCR, IgM, IgG Terhadap Perjalanan Penyakit

26 Guo et al, 2020. Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19). Clin Infect Dis. 2020 Mar 21. pii: ciaa310. doi: 10.1093/cid/ciaa310

Kemungkinan Penyebab False Positive

FAKTOR INTERNAL FAKTOR EKSTERNAL

1. Rheumatoid Factor 2. Antibodi heterofilik 3. Sistem komplemen: reaksi imunitas

cross-linking dengan antibodi 4. Anti-mouse antibody Ig 5. Lisozim: dapat membentuk

jembatan antara IgG fase padat dan IgG marker

1. Hemolisis: Selama inkubasi, kadar Hb yang meningkat teradsorpsi pada fase padat, lalu bereaksi dengan substrat HRP menyebabkan hasil “false positive”.

2. Waktu penyimpanan terlalu lama: IgG dapat berpolimerisasi, di imunoasai tidak langsung akan menyebabkan reaksi background yang dalam, sehingga hasil“false positive”

3. Spesimen tidak membeku sempurna: Pada ELISA, terbentuk blok fibrin sering false positive

4. Pengaturan cut-off hasil positif: area abu-abu

27 Liu Min, Dept. Laboratorium Medis RS Pertama Afiliasi Universitas Sun Yat-Sen. Mindray

Webinar.

14 April 2020

Kemungkinan Penyebab False Negative

KLINIS LABORATORIUM

1. Masa awal infeksi, antibodi belum terbentuk atau belum terdeteksi

2. Fungsi kekebalan tubuh terganggu tidak dapat menghasilkan antibodi yang cukup untuk terdeteksi

1. Reagen yang dipilih (Antigen dan kualitasnya)

2. Kondisi laboratorium (temperatur dan kelembaban)

3. Cara pengerjaan tes

28 Liu Min, Dept. Laboratorium Medis RS Pertama Afiliasi Universitas Sun Yat-Sen. Mindray

Webinar.

14 April 2020

HATI-HATI HASIL RAPID TEST ANTIBODI FALSE POSITIVE/NEGATIVE (PDS PatKLIn)

Kemungkinan false positive:

Kemungkinan cross reactive antibody dengan berbagai virus lain (Coronavirus lain dan yang mirip)

Kemungkinan false negative:

1. Belum terbentuk antibodi saat pengambilan sampel (masa inkubasi)

2. Pasien immunocompromised (gangguan pembentukan antibodi)

3. Kadar antibodi di bawah deteksi alat

29

30 Revisi-4 Tanggal 27 Maret 2020 Tanggal 23 Maret 2020

5. Paramater Laboratorium Untuk Manajemen Covid

31

Protokol Laboratorium Pada COVID-19

32

1. SKRINING

2. DIAGNOSIS

3. PEMANTAUAN

4. SURVEILANS

USULAN PANDUAN PEMERIKSAAN LABORATORIUM COVID-19 PDS PATKLIN

33

34

Progres Perubahan Parameter Laboratorium

Awal MRS • DL dan LDH normal

• Limfopenia (<1000/µL) pada 29% kasus

Perjalanan Penyakit

• ALC menurun (<1000/µL), AMC

• CRP

• LDH

Klinis kembali

membaik

• WBC (bila sebelumnya rendah

• Limfosit absolut,

• NLR

35 Fan et al, 2020. Hematologic parameters in patients with COVID-19 infection. DOI: 10.1002/ajh.25774

Susilo, et al, 2020. Coronavirus Disease 2019: Tinjauan Literatur Terkini. Jurnal Penyakit Dalam Indonesia | Vol. 7, No. 1 | Maret 2020

36

Neutrophil – Lymphocyte Ratio (NLR)

• Cut-off 3,13

• Limfopenia absolut terjadi pada kasus berat

• NLR ≥ 3,13 dan usia ≥ 50 tahun risiko meningkat 50% untuk terjadi keparahan penyakit

• Saran penanganan berdasarkan NLR dan usia:

37

NLR USIA SARAN

< 3,13 < 50 tahun Tidak ada risiko, isolasi rumah

≥ 3,13 < 50 tahun Risiko rendah, rawat inap

< 3,13 ≥ 50 tahun Risiko sedang, rawat inap dengan monitoring respirasi

≥ 3,13 ≥ 50 tahun Risiko tinggi, ICU

Liu et al, 2020. Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio Predicts Severe Illness Patients with 2019 Novel Coronavirus in the Early Stage. DOI: 10.1101/2020.02.10.20021584

Berbagai Cut-Off Nilai NLR

38

Sysmex Haematology Updates – Investigasi COVID-19 dengan Pemeriksaan Hematologi Sysmex. HEM/EM/010/III/2020

Pemantauan Laboratorium pada Protokol Tatalaksana Pasien Terkonfirmasi COVID-19

1. OTG 2. Gejala Ringan 3. Gejala Sedang

• Pemantauan laboratorium Darah Perifer Lengkap berikut dengan hitung jenis, bila memungkinkan ditambahkan dengan CRP, fungsi ginjal, fungsi hati dan ronsen dada secara berkala

4. Gejala Berat • Pemantauan laboratorium Darah Perifer Lengkap berikut dengan

hitung jenis, bila memungkinkan ditambahkan dengan CRP, fungsi ginjal, fungsi hati, Hemostasis, LDH, D-dimer.

• Monitor tanda-tanda sebagai berikut; - Takipnea, frekuensi napas ≥ 30x/min, - Saturasi Oksigen dengan pulse oximetry ≤93% (di jari), - PaO2/FiO2 ≤ 300 mmHg, - Peningkatan sebanyak >50% di keterlibatan area paru-paru pada pencitraan thoraks dalam 24-48 jam, - Limfopenia progresif, - Peningkatan CRP progresif, - Asidosis laktat progresif.

39 Protokol Tatalaksana COVID-19 PDPI, PERKI, PAPDI, PERDATIN, IDAI, 2020.

Pemantauan Laboratorium pada Protokol Tatalaksana Pasien BELUM Terkonfirmasi

COVID-19

1. OTG

2. Gejala Ringan

• Hematologi rutin, hitung jenis leukosit, dan laju endap darah

3. Gejala Sedang & Berat

• Pemeriksaan RDT/PCR Swab Nasofaring hari 1 dan 2 sesuai Pedoman Covid Kemenkes Hal 110

• Pemantauan laboratorium Darah Perifer Lengkap berikut dengan hitung jenis, bila memungkinkan ditambahkan dengan CRP, fungsi ginjal, fungsi hati, Hemostasis, LDH, D-dimer

40 Protokol Tatalaksana COVID-19 PDPI, PERKI, PAPDI, PERDATIN, IDAI

Usulan Alur Pemantauan Parameter Koagulasi Pada Pasien Dengan Infeksi Covid-19

41

42 Song et al, 2020. COVID-19 early warning score: a multi-parameter screening tool to identify highly suspected patients. https://doi.org/10.1101/2020.03.05.20031906.

6. Penanganan Spesimen

43

Prinsip Umum Penanganan Spesimen Rutin (Darah, Urin, Feses)

di Era Pandemi Covid-19

Semua spesimen yang diterima harus diperlakukan sebagai spesimen resiko tinggi

Wajib menerapkan Universal Precaution untuk semua spesimen (pelindung wajah, sarung tangan, gaun disposable)

Belum ada laporan keberadaan virus SARS-CoV-2 yang masih infeksius pada darah dan urin

Hati-hati terhadap berbagai prosedur yang menghasilkan aeorosol/droplet/tumpahan

44 Odega et al, 2020. Safe Laboratory Practices In The Light Of Covid-19 Pandemic: Way

Forward In A Resource Limited Setting. doi:10.20944/preprints202004.0103.v1

45 Dirjen Yankes, 6 April 2020. Petunjuk Teknis Penggunaan Alat Perlindungan Diri (APD) Dalam Menghadapi Wabah Covid-19

46

APD Sesuai Transmisi

TRANSMISI DROPLET DAN KONTAK TRANSMISI AEROSOL

• Gaun/gown • Sarung tangan • Masker N95 atau bedah • Pelindung kepala • Pelindung mata (goggles) • Sepatu pelindung Catatan: APD di atas dapat ditambahkan pelindung wajah (face shield)

• Gaun/gown • Sarung tangan • Masker N95 • Pelindung kepala • Pelindung mata (goggles) • Pelindung wajah (face shields) • Sepatu pelindung Catatan: APD di atas bisa ditambah dengan penggunaan apron

47

Pengerjaan Spesimen Rutin

48

49

http://2017.igem.org/Safety/What_is_Safety

Prosedur Laboratorium Yang Beresiko Menimbulkan Aerosol

50 https://wp.stolaf.edu/chemical-hygiene/preventing-aerosol-production

51

http://2017.igem.org/Safety/What_is_Safety

Tambahan: • Pengambilan swab nasofaring/

orofaring • Ekstraksi RNA

Kewaspadaan Penggunaan Sentrifugasi

52

TANGGAL PANDUAN

7 Maret 2020 Manajemen Spesimen Dan Diagnosis Laboratorium Kasus Suspek 2019-ncov

7 Maret 2020 2. Pencegahan Dan Pengendalian Infeksi Pada Suspek Infeksi 2019-ncov

19 Maret 2020 Press Release Kewaspadaan Tes Cepat (Rapid Test) COVID-19 Igm/Igg Berbasis Serologi

21 Maret 2020 Alur Pemeriksaan Rapid Test Sars-Cov-2 (COVID-19) Usulan PDS Patklin

25 Maret 2020 Panduan Tatalaksana Pemeriksaan Rapid Test Antibody Sars-cov-2 Metode Imunokromatografi

20 April 2020 Daftar Rapid Test Serologi COVID-19 Yang Sudah Terdaftar di FDA Negara

21 April 2020 Revisi Panduan Pemeriksaan Rapid Test Antibodi Metode Imunokromatografi

22 April 2020 Panduan Tatalaksana Pemeriksaan Tes Cepat Molekuler (TCM) dan Polymerase Chain Reaction (PCR) SARS-CoV-2 53

Berbagai Panduan COVID-19 oleh PDS PatKLIn

54

1. Email : infokompdspatklin2019@gmail.com

2. Facebook : infokompdspatklin2019@gmail.com

3. Website : www.pdspatklin.or.id

4. Youtube : PDS PatKLIn Dokter Patologi Klinik

5. Instagram : DOKTER PATOLOGI KLINIK

6. Twitter : www.twitter.com/patologi_klinik

Take Home Message

1. Di era pandemi, semua spesimen harus diperlakukan sebagai spesimen beresiko tinggi

2. Hati2 terhadap semua tindakan yg menimbulkan aerosol, perhatian pada APD yang digunakan

55

56

TERIMA KASIH