VPLIV EKSTRAKCIJSKEGA MEDIJA NA KVALITETO EKSTRAKTA … · Zaradi neobičajne oblike so jo poimenovali z nenavadnimi imeni: levja griva, opičja glava, opičja goba, medvedova glava,

Diplomsko delo

VPLIV EKSTRAKCIJSKEGA MEDIJA NA

KVALITETO EKSTRAKTA IZ GOBE Hericium

erinaceus

september, 2017 Eva Krajnčan

Eva Krajnčan

Vpliv ekstrakcijskega medija na kvaliteto ekstrakta

iz gobe Hericium erinaceus

Diplomsko delo

Maribor, september 2017

Vpliv ekstrakcijskega medija na kvaliteto ekstrakta

iz gobe Hericium erinaceus

Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Eva Krajnčan

Študijski program: visokošolski strokovni študijski program I. stopnje

Kemijska tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirana inženirka kemijske tehnologije (VS)

Mentor: doc. dr. Maša Knez Hrnčič

Komentor: dr. Darija Cör

Maribor, september 2017

Vpliv ekstrakcijskega medija na kvaliteto ekstrakta iz gobe Hericium erinaceus

I

Kazalo

Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava....................................................................................................................................... III

Zahvala ................................................................................................................................... IV Povzetek ................................................................................................................................... V Abstract ................................................................................................................................... VI Seznam tabel ......................................................................................................................... VII Seznam slik .......................................................................................................................... VIII

Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ IX 1 Uvod in opredelitev problema ........................................................................................... 1

2 Teoretski del ...................................................................................................................... 2 2.1 Hericium erinaceus .................................................................................................... 2

2.1.1 Učinki gobe ......................................................................................................... 3 2.2 Laboratorijske metode in materiali ............................................................................ 4

2.2.1 Organska topila ................................................................................................... 4

2.2.2 Konvencionalna (klasična) ekstrakcija ............................................................... 6

2.2.3 Ultrazvočna ekstrakcija ...................................................................................... 7 2.2.4 Filtriranje ............................................................................................................ 9 2.2.5 Uparevanje ........................................................................................................ 10

2.2.6 Kemijska analiza vzorcev s spektrofotometrijo ................................................ 10 3 Eksperimentalni del ......................................................................................................... 13

3.1 Konvencionalna klasična ekstrakcija ....................................................................... 13 3.1.1 Pribor in kemikalije .......................................................................................... 13

3.1.2 Opis dela ........................................................................................................... 13 3.1.3 Izračuni ............................................................................................................. 14

3.2 Ultrazvočna ekstrakcija ............................................................................................ 14

3.2.1 Pribor in kemikalije .......................................................................................... 14 3.2.2 Opis dela ........................................................................................................... 15

3.2.3 Izračuni ............................................................................................................. 15 3.3 Ekstrakcija polisaharidov ......................................................................................... 15

3.3.1 Izračuni ............................................................................................................. 15 3.4 Analize ekstraktov ................................................................................................... 15

3.4.1 Določanje vsebnosti totalnih fenolov ............................................................... 15 3.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo .............................. 17

4 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 19 4.1 Konvencionalna (klasična) ekstrakcija .................................................................... 19 4.2 Ultrazvočna ekstrakcija ............................................................................................ 20 4.3 Ekstrakcija polisaharidov ......................................................................................... 21 4.4 Analize ekstraktov ................................................................................................... 22

4.4.1 Določanje vsebnosti totalnih fenolov ............................................................... 22 4.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo .............................. 23

5 Zaključek ......................................................................................................................... 25 6 Literatura ......................................................................................................................... 26 7 Priloge ............................................................................................................................. 28

7.1 Priloga 1 ................................................................................................................... 28 7.2 Priloga 2 ................................................................................................................... 29

7.3 Priloga 3 ................................................................................................................... 30


II

7.4 Priloga 4 ................................................................................................................... 31

8 Življenjepis....................................................................................................................... 32 Izjava o istovetnosti tiskane in elektronske verzije ................................................................. 34


III

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: ScienceDirect (http://www.sciencedirect.com)

Gesla: Število referenc

ultrasound extraction IN phenolic content 81

Hericium erinaceus IN antioxidant activity 6

convencional extraction IN organic solvent 3

Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI)


ekstrakcija ALI glive ALI biološka aktivnost 176

konvencionalna ekstrakcija ALI antioksidanti 85

Vir: Digitalna knjižnica Univerze v Mariboru (http://dkum.uni-mb.si/Iskanje.php)


ekstrakcija ALI antioksidativna aktivnost 17

Skupno število pregledanih člankov: 11

Skupno število pregledanih knjig: 5

Maribor, september 2017 Eva Krajnčan

podpis


IV

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici, doc.dr. Maši Knez Hrnčič, za pomoč,

prijaznost, koristne nasvete in vzpodbudo pri nastajanju

diplomskega dela.

Zahvala gre tudi somentorici, dr. Dariji Cör, ki mi je potrpežljivo

stala ob strani pri izvanju eksperimentalnega dela in izdelovanju

diplomske naloge.

Iskreno se zahvaljujem staršem, ki sta mi omogočila študij, me

spodbujala in predvsem verjela vame skozi vsa leta.


V


Povzetek

Ekstrakcijski postopki so že od nekdaj učinkoviti za industrijo, predvsem živilsko, saj

omogočajo relativno hitro in učinkovito izolacijo bioaktivnih komponent. Vedno večjo

pozornost v svetu pridobivajo tudi različna prehranska dopolnila, zato smo si izbrali

atraktivno in okusno medicinsko gobo Hericium erinaceus. S pomočjo konvencionalne

oziroma klasične ekstrakcije in ultrazvočne ekstrakcije, ki smo ju izvajali pri različnih

temperaturah, smo pridobili različne ekstrakte omenjene gobe. Uporabljali smo topila etanol

in metanol ter ugotavljali, kako izbira topila in temperatura obratovanja vplivata na kvaliteto

ekstrakta. Izvedli smo tudi ekstrakcijo polisaharidov, kjer smo kot ekstrakcijski medij

uporabili vodo. Sledila je analiza vzorcev s spektrofotometrijo, kjer smo določali vsebnost

totalnih fenolov ter antioksidativno aktivnost, izraženo kot procent inhibicije.

Ugotovili smo, da na masni izkoristek in izolacijo biološko aktivnih komponent poleg gostote

topila vplivata tudi polarnost in temperatura topila, pri kateri izvajamo ekstrakcijo. Bolj

polarno je topilo, večja je vsebnost totalnih fenolov ter večji je procent inhibicije.

Ključne besede: izolacija, biološka aktivnost, organska topila, UV ekstrakcija, prosti radikali,

Hericium erinaceus.

UDK: 577.334:577.12(043.2)


VI

Effect of extraction media on the quality of extract from Hericium erinaceus

Abstract

Extraction procedures have always been effective in the industry, especially in agriculture as

they allow fast and effective isolation of bioactive components. Globally there is a lot of

attention on various food supplements, that is why we have chosen the attractive and tasty

medical mushroom Hericium erinaceus. We used conventional extraction procedures as well

as more modern methods such as ultrasound extraction. This process involves exposing the

samples to different temperatures, therefore gained various different extracts of the

aforementioned mushroom. Using ethanol and methanol we tried to asses how solvents as well

as temperatures affect the quality of the extracts. We have also carried out extraction of

polysaccharides, by using water. In the following step, the samples have been analysed using

spectrophotometric methods for determination of total phenols and the total antioxidant assay

expressed as a percentage of inhibition. . Mass yield and the isolation rate of biologically

active components is mostly affected by the polarity and density of the applied solvent and

temperature of the solvent, which also influences solvent density, used in the extraction

process. If a solvent with a higher polarity is used, greater phenol content and higher

percentage of inhibition is observed.

Key words: isolation, biological activity, organic solvent, UV extraction, free radicals,

Hericium erinaceus.

UDK: 577.334:577.12(043.2)


VII

Seznam tabel

Tabela 2-1: Fizikalno-kemijske lastnosti etanola [12].............................................................. 5

Tabela 2-2: Fizikalno-kemijske lastnosti metanola [12] .......................................................... 5

Tabela 3-1: Ekstrakti z izbranimi topili in temeraturami........................................................ 14

Tabela 4-1: Izračunani izkoristki konvencionalne ekstrakcije ............................................... 19

Tabela 4-2: Izračunani izkoristki ultrazvočne ekstrakcije ...................................................... 20

Tabela 4-3: Izračunani delež polisaharidov v ekstraktu ......................................................... 21

Tabela 7-1: Izmerjene vrednosti absorbanc galne kisline....................................................... 28

Tabela 7-2: Vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih ................................................................ 30

Tabela 7-3: Antioksidativna aktivnost ekstraktov .................................................................. 31


VIII

Seznam slik

Slika 2-1: Hericium erinaceus [6] ............................................................................................. 2

Slika 2-2: Hericium erinaceus v obliki prahu [9] ..................................................................... 3

Slika 2-3: Hericium erinaceus v kapsulah ................................................................................ 4

Slika 2-4: Shematski prikaz postopka ekstrakcije trdno tekoče [13] ........................................ 6

Slika 2-5: Potek konvencionalne ekstrakcije ............................................................................ 7

Slika 2-6: Ultrazvočna kopel ..................................................................................................... 8

Slika 2-7: Pridobljeni ekstrakt ................................................................................................... 8

Slika 2-8: Postopek filtriranja skozi filterno nučo .................................................................... 9

Slika 2-9: Uparjanje z rotavaporjem ....................................................................................... 10

Slika 2-10: Vzorci v kivetah, pripravljeni za meritve s spektrofotometrom ........................... 11

Slika 2-11: Mehanizem reakcije DPPH z antioksidantom [21] .............................................. 12

Slika 2-12: Beta glukan [26] ................................................................................................... 12

Slika 4-1: Grafični prikaz izkoristkov ekstrakcij in delež polisaharidov v ekstraktu ............. 21

Slika 4-2: Grafični prikaz vsebnosti TF v ekstraktih in v ekstraktu polisaharida ................... 23

Slika 4-3: Grafični prikaz antioksidativne aktivnosti ekstraktov ............................................ 24

Slika 7-1: Umeritvena krivulja z galno kislino ....................................................................... 29


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

a naklon premice umeritvene krivulje GA (mL/mg)

b odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance

Abs absorbanca raztopine vzorca

Ac0 absorbanca referenčne raztopine po času 0 min

Ac15 absorbanca raztopine vzorca po času 15 min

mekstrakt masa ekstrakta (g)

mmaterial masa materiala (g)

msteklenička+ekstrakt masa stekleničke z ekstraktom (g)

msteklenička masa stekleničke

M molska masa (g/mol)

Tt temperatura tališča (°C)

Tv temperatura vrelišča (°C)

Grški simboli

Ƞekstrakcija izkoristek ekstrakcije (%)

γGA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/mL)

ekstr. koncentracija ekstrakta v raztopini vzorca (mg/mL)

ρ gostota (g/cm3)

ν frekvenca (s-1)

Kratice

DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil

EtOH etanol

FC Folin - Ciocalteu

H2O voda

MeOH metanol

UV območje ultravijoličnega valovanja

TF totalni fenoli


1

1 Uvod in opredelitev problema

Gobe so od začetka ljudske civilizacije pomemben predmet človekovega zanimanja. Privlačile

so že Grke, Rimljane, Kitajce in Egipčane, ki so cenili bogastvo okusa in arome gliv, skozi

tradicionalno uporabo pa so začeli odkrivati tudi njihove zdravilne učinke. Znano je, da je na

svetu približno 1,5 milijona gliv, čeprav je poznanih le 10 %, v človeške namene pa se jih

uporablja le 5 %. [1]

Danes prihaja do porasta različnih bolezni, za katere medicina še ni odkrila pravih rešitev, zato

raste tudi potreba po odkrivanju novih bioaktivnih substanc, ki lahko imajo v prihodnosti

pomembno vlogo pri zdravljenju. [1]

V diplomskem delu smo raziskovali in spoznavali gobo Resasti bradovec (lat. Hericium

erinaceus), izredno okusno in cenjeno jedilno in medicinsko gobo. [2]

Glive iz rodu Hericium vsebujejo različne sestavine, ki delujejo protibakterijsko, protiglivično

in zavirajo delovanje prostih radikalov. Farmacevtsko aktivne snovi, najdene v omenjeni gobi,

so poleg fenolnih spojin tudi maščobne komponente, ki jih sicer tokrat nismo določevali, so

pa prisotne v gobi. Fitosteroli znižujejo vsebnost lipoproteinov in trigliceridi zmanjšujejo

presnovo maščob. Telo gobe je sestavljeno iz različnih sestavin, kot so polisaharidi, proteini,

lektini, fenoli, itd. [3]

Vse te sestavine pripomorejo k našemu boljšemu počutju, krepijo imunski sistem, lajšajo

gastritis in pomirjajo razdražen želodec zaradi stresa, zato je goba vedno bolj popularna v

obliki prehranskega dopolnila in dostopna na trgovskih policah.

Za izolacijo biološko aktivnih komponent uporabljamo postopek ekstrakcije. Izbira metode z

najboljšim donosom in največjo čistostjo produkta iz naravnih virov je odvisna predvsem od

narave spojin in surovin, ki se obdelujejo. [4]

V eksperimentalnem delu smo uporabili postopek ultrazvočne in konvencionalne ekstrakcije

ob uporabi različnih topil in pogojev, npr. temperature in mešanja, s katerimi smo želeli

pridobiti čim večje izkoristke. Izvedli pa smo tudi ekstrakcijo polisaharidov.

Po končanih ekstrakcijah je sledila analiza vzorcev. Zanimala nas je predvsem njihova

biološka aktivnost, saj glive vsebujejo veliko antioksidantov. Te snovi ščitijo telo pred

škodljivimi prostimi radikali in preprečujejo oksidacijo celic, ki je prepoznavna kot aktivator

razvoja tumornih celic in smrti celic zaradi apoptoze. Fenolne komponente spodbujajo

delovanje ledvic in jeter, pospešujejo odvajanje vode iz telesa, delujejo protivirusno in proti

raku. [5]

S pomočjo spektrofotometrije smo določili vsebnost totalnih fenolov ter antioksidativno

aktivnost z radikalsko metodo.


2

2 Teoretski del

2.1 Hericium erinaceus

Snežno belo gobo Resasti bradovec (Hericium erinaceus), prikazano na sliki 2-1, prepoznamo

po svoji tipični obliki in je v svetu znana kot redka vrsta gobe. Raste na živih in tudi mrtvih

bukvah in hrastih. [6]

Je precej široke oblike in ima viseče iglice, dolge od 3 do 6 cm, ki skupinsko izgledajo kot

brada. So mehko podvite, sprva bele, pozneje okraste in resaste. Bet je debel in kratek ter se

deli na nekaj tanjših do 15 mm debelih betov ali vejic, ki se koralasto razvejijo in imajo na

spodnji strani goste in tanke mesnate bodice oziroma iglice. Meso je bele barve, brez

posebnega vonja in okusa. Trosi so jajčaste, skoraj okrogle oblike, trosni prah pa je belkaste

barve. [7]

Zaradi neobičajne oblike so jo poimenovali z nenavadnimi imeni: levja griva, opičja glava,

opičja goba, medvedova glava, bela brada ali ježasta goba. [6]

Slika 2-1: Hericium erinaceus [6]


3

2.1.1 Učinki gobe

Goba Hericium erinaceus s svojo sestavo pripomore k zdravemu delovanju človekovega

organizma ter pozitivno vpliva na delovanje možganov. V medicini se uporablja že vrsto let,

najprej v kitajski medicini, več sto let nazaj.

Vsebuje beljakovine, ki so vključene v proizvodnjo, vzdrževanje, rast in obnovo nevronov v

možganih ter zvišujejo živčni rastni faktor. Preprečujejo poškodbe živčevja zaradi staranja in

obnavljajo ter izboljšujejo spomin. [8]

Stari zdravstveni zapisi govorijo o koristnih učinkih gobe na delovanje ledvic, jeter, srca,

vranice in želodca ter izboljšanju prebave, telesne kondicije, obnavljanju energije in zaviranju

raka. Japonski znanstveniki so odkrili, da naj bi uporaba gobe pomagala tudi pri zdravljenju

Alzheimerjeve bolezni, multiple skleroze, perifernih poškodb živčnih tkiv in drugih bolezni,

dolgotrajna uporaba pa naj bi pripomogla k izboljšanju spomina in inteligence. [8]

Uporaba naj bi pripomogla tudi k uravnavanju krvnega sladkorja in holesterola, obstajajo pa

tudi dokazi, ki govorijo o zmanjšanju občutljivosti na alergije. [8]

Do sedaj se je izvedlo malo raziskav glede omenjene gobe in še niso našli strupenih stranskih

učinkov uporabe. Opažena je bila študija o stranskih učinkih, ki govori o morebitnem

povečanju škodljivih encimov v jetrih po enomesečni uporabi, zato je v tem primeru

odsvetovana vsakodnevna uporaba omenjenega prehranskega dopolnila. Seveda pa je

potrebna previdnost pri vsaki uporabi kateregakoli novega prehranskega dopolnila. [8]

Gobe se uživajo s tremi kapsulami dvakrat dnevno po jedi z nekaj tekočine. V tem primeru

ena kapsula vsebuje 70 g, torej je priporočen dnevni vnos 420 g. Lahko jo uporabljamo tudi v

prahu, kot prikazuje slika 2-2. Dvakrat dnevno po jedi zaužijemo eno do dve žlički prahu z

nekaj tekočine. [6]

Slika 2-2: Hericium erinaceus v obliki prahu [9]


4

Slika 2-3: Hericium erinaceus v kapsulah

2.2 Laboratorijske metode in materiali

Izvedli smo konvencionalno in ultrazvočno ekstrakcijo, pri kateri smo uporabili organska

topila etanol in metanol. Prav tako smo izvedli klasično ekstrakcijo polisaharidov, kjer smo

kot topilo uporabili vodo. Po končanih ekstrakcijah je sledila kemijska analiza ekstraktov s

pomočjo spektrofotometričnih metod, s katerimi smo določevali vsebnost totalnih fenolov ter

antioksidativno aktivnost.

2.2.1 Organska topila

Potek ekstrakcije je močno odvisen od narave oziroma vrste topila. Z namenom pridobivanja

čim bolj čistih ekstraktov z boljšimi izkoristki in nižjimi stroški, so bili razviti številni različni

načini ekstrakcije. [10]

Molekule alkoholov so sestavljene iz dveh različnih delov: nepolarne verige ogljikovih

atomov, ki je hidrofobna in hidroksilne skupine, ki je hidrofilna in polarna zaradi večje

elekronegativnosti kisikovega atoma in štirih neveznih kisikovih elektronov. V alkoholih z

majhnim številom ogljikovih atomov, kot sta etanol in metanol, prevladujejo polarne lastnosti,

zato sta omenjena polarna alkohola zelo primerna za ekstrakcijo fenolnih spojin.

Na polarnost molekule vpliva tako dolžina in razvejanost verige ogljikovih atomov, kot tudi

število hidroksilnih skupin, saj večje število -OH skupin zagotavlja večjo polarnost spojine.

Kljub temu, da imata etanol in metanol samo eno hidroksilno skupino, večjo polarnost

zagotavlja kratek nepolarni rep ogljikovih atomov.


5

2.2.1.1 Etanol

Etanol, sicer tudi etilni alkohol, je primarni alkohol s kemijsko formulo C2H6O in je v

splošnem uporaben kot topilo. Kemijsko čist alkohol je brezbarvna tekočina prijetnega vonja,

ki gori s svetlo modrim plamenom. Njegovi hlapi tvorijo z zrakom eksplozivno zmes. V naravi

nastaja predvsem pri alkoholnem vrenju pod vplivom kvasovk iz ogljikovih hidratov

(sladkorja). Tehnični etanol industrijsko pridobivajo z adicijo vode na adsorbiran eten ali pa z

redukcijo etanala na katalizatorju. [11]

Tabela 2-1 prikazuje fizikalno-kemijske lastnosti etanola.

Tabela 2-1: Fizikalno-kemijske lastnosti etanola [12]

TOPILO ETANOL

VIDEZ BREZBARVNA TEKOČINA

MOLEKULSKA MASA (M) 46,07 g/mol

VRELIŠČE (Tv) 78 °C

TALIŠČE (Tt) -114 °C

GOSTOTA PRI 20 °C (ρ) 0,7900 g/cm3

FAKTOR POLARNOSTI (P) 5,2

2.2.1.2 Metanol

Metanol, oziroma metilni alkohol, je najpreprostejši alkohol, prvi v homologni vrsti alkoholov

s kemijsko formulo CH4O. Največ ga pridobivajo iz premoga in zemeljskega plina, čisti

metanol pa je pri običajnih pogojih brezbarvna, lahko vnetljiva tekočina, prijetnega vonja in

ostrega okusa. Je zelo strupen. Uporabljajo ga predvsem kot topilo, gorivo, surovino za

proizvodnjo formaldehida in anilinskih barvil in tudi kot reagent za metiliranje in za

denaturacijo etanola. [11]

Fizikalno-kemijske lastnosti metanola so zbrane v tabeli 2-2.

Tabela 2-2: Fizikalno-kemijske lastnosti metanola [12]

TOPILO METANOL

VIDEZ BREZBARVNA TEKOČINA

MOLEKULSKA MASA (M) 32,04 g/mol

VRELIŠČE (Tv) 64 °C

TALIŠČE (Tt) -97,6 °C

GOSTOTA PRI 20 °C (ρ) 0,7918 g/cm3

FAKTOR POLARNOSTI (P) 5,1


6

2.2.2 Konvencionalna (klasična) ekstrakcija

Ekstrakcija je postopek, s katerim ločujemo spojine iz trdnih ali tekočih zmesi s pomočjo topila

in temelji na različni topnosti sestavin zmesi v topilu. Poenostavljeno shemo prikazuje slika

2-4, dejanski potek ekstrakcije pa prikazuje slika 2-5. Ekstrakcija sestoji iz dveh zaporednih

operacij, v prvi spravimo zmes v intenziven stik s topilom, v drugi pa obe fazi ločimo. Produkt

ekstrakcije je ekstrakt, ki ga lahko porabimo za nadaljne analize. Postopek ekstrakcije

uporabljamo predvsem za pridobivanje olj, arom, začimb ali farmacevtskih substanc iz

različnih plodov, semen ali drugih rastlin in sadežev. [13]

Izbira opreme za ekstrakcijo ter obratovalni pogoji so odvisni tako od deleža in porazdelitve

topne komponente v materialu, kot tudi od narave trdne snovi in velikosti delcev. [13]

V primeru, ko je topljenec enakomerno dispergiran v trdni snovi, poteka najprej raztapljanje

na površini, šele nato topilo penetrira skozi zunanji sloj v notranjost delca do topljenca, zato

se hitrost ekstrakcije zmanjša. Če pa je delež topljenca v trdni snovi velik, lahko pride zaradi

velike poroznosti do zdrobitve strukture v fino nasutje netopnega preostanka, ki postane

neprepusten za topilo. [13]

Proces ekstrakcije lahko razdelimo v tri stopnje [13]

1. fazna sprememba pri raztapljanju topljenca

2. difuzija topljenca v topilu, ki se nahaja v porah trdnega materiala na površino delca

3. prenos topljenca skozi tekočinski film na površini delca v glavni tok topila

Običajno ima prvi proces zaradi svoje visoke hitrosti zanemarljiv vpliv na ekstrakcijsko

hitrost, vendar pa lahko katerakoli stopnja vpliva na ekstrakcijo. [13]

Slika 2-4: Shematski prikaz postopka ekstrakcije trdno tekoče [13]


7

2.2.2.1 Dejavniki, ki vplivajo na ekstrakcijsko hitrost [13]

• Velikost delcev: Manjši so delci, večja je medfazna površina med trdnino in tekočino

in posledično je prenos snovi hitrejši. Po drugi strani pa se lahko zelo fini delci

sprimejo v večje delce in na tak način ovirajo separacijo delcev in fluida in pretok

fluida. Zaželjeno je, da vsak delec zahteva približno enaki čas za ekstrakcijo.

• Topilo: Izbira topila je izjemno pomembna, zato je najbolša uporaba selektivnega

topila z nizko viskoznostjo.

• Temperatura: Topnost komponente, ki jo ekstrahiramo in difuzijski koeficient

naraščata s temperaturo, zato narašča tudi hitrost ekstrakcije. Zgornja meja temperature

je določena sekundarno, na primer z aktivnostjo encima ali ekonomičnostjo procesa.

• Mešanje fluida: Mešanje poveča snovni prenos s površine materiala v glavno maso

topila in preprečuje sedimentacijo delcev.

Slika 2-5: Potek konvencionalne ekstrakcije

2.2.3 Ultrazvočna ekstrakcija

Zvok s frekvenco nad 20·103 s-1 se imenuje ultrazvok in se poleg laboratorijskih namenov v

svetu uporablja tudi v napravah za odkrivanje predmetov pod morjem ali za iskanje napak v

kovinskih telesih in v drugih predmetih. [14]

Zaradi kavitacijskega učinka, ki izboljšuje masni in toplotni prenos skozi celične stene, se

ultrazvok vedno bolj uporablja kot samostojni postopek ali kot del večstopenjskega procesa

pri ekstrakciji različnih učinkovin. Ultrazvočna ekstrakcija izkorišča prednosti, kot so večja

prepustnost topila v celični material, krajši potek ekstrakcije, višja kvaliteta produkta,

obnovljivost, nižja poraba topila in emulgatorjev, nižji stroški in manj porabljene energije pri

postopku. Prednost zelene oziroma okolju prijazne ekstrakcije je tudi možnost hitrega in

enostavnega očiščenja naprave po končanem delu. [15]


8

Uporabo ultrazvoka lahko razdelimo v dve kategoriji, nizko intenzivne visoke frekvence (ν

>100 kHz in visoko intenzivne nizke frekvence (20 kHz ≤ ν ≤100 kHz) ultrazvoka. Nizko

intenzivni ultrazvok ne spreminja kemijskih in fizikalnih lastnosti materiala, medtem ko

visoko intenzivni utrazvok povzroča povišane tlake ali strig ter posledično lahko povzroči

fizikalne, kemijske ali mehanske spremembe materiala. [16]

Na sliki 2-6 vidimo ultrazvočno kopel, ki smo jo uporabili pri ultrazvočni ekstrakciji, slika 2-

7 pa prikazuje pridobljeni ekstrakt v primerjavi z predhodno zmletim materialom.

Slika 2-6: Ultrazvočna kopel

Slika 2-7: Pridobljeni ekstrakt


9

2.2.4 Filtriranje

Filtriranje, prikazano na sliki 2-8, je fizikalna operacija ločevanja v tekočinah ali v plinih

suspendiranih delcev snovi, od plinov ali tekočin, v katerih se nahajajo, s pomočjo ustreznega

ločilnega medija. Pogoj za uspešno filtracijo je ustrezni filterni sloj oziroma filterni medij, ki

prepušča samo tekočino ali pline, ki jih želimo ločiti, zadržuje pa suspenziode. [18]

Poleg filtrne nuče, katero smo tudi sami uporabili v eksperimentalnem delu, poznamo tudi

filtrni lij in filtrni lonček. Na filtrne nuče, ki so običajno iz porcelana in imajo na dnu luknjice,

se namesti filtrni papir, filtriranje pa se izvaja s podtlakom. Filtrne lije uporabljamo skupaj z

različnimi vrstami specialnih filtrnih papirjev, ki se med seboj razlikujejo predvsem po

velikosti por. [18]

V industriji poznamo različne tipe filtrnih naprav, ki se razlikujejo v diskontinuirnem in

kontinuirnem delovanju, v obratovanju pod atmosferskim tlakom ali pa pri določenem nad-

ali podtlaku. Urejene so tako, da ustrezajo predvidenim namenom filtriranja. [18]

Hitrost in uspešnost filtracije sta odvisni od vrste suspenzije, viskoznosti tekočine, v kateri je

suspenzija suspendirana, temperature, koncentracije, najbolj pa vpliva predvsem izbira

filtrnega medija. [18]

Slika 2-8: Postopek filtriranja skozi filterno nučo


10

2.2.5 Uparevanje

Uparevanje je proces, pri katerem koncentriramo praktično nehlapne topljence z odvajanjem

topila, ki je v večini primerov voda in jo po končanem postopku lahko zavržemo. Toplotno

energijo, ki je potrebna pri procesu uparjanja, dovajamo s suho nasičeno vodno paro. [13]

Pri našem eksperimentalnem delu smo uporabljali rotacijski uparjalnik (rotavapor), prikzan

na sliki 2-9, ki mu pravimo tudi odprti kotel. To je najenostavnejša oblika uparjalnika, ki ga

skozi grelni plašč ali grelno kačo grejemo s kondenzirano paro. Ti uparjalniki so sicer poceni

in enostavni za uporabo, a porabijo veliko toplote in so zato neekonomični.

Slika 2-9: Uparjanje z rotavaporjem

2.2.6 Kemijska analiza vzorcev s spektrofotometrijo

Analiza vzorcev je potekala s pomočjo spektrofotometričnih metod, saj so metode enostavne

za uporabo ter imajo visoko selektivnost in točnost.

Spektroskopske metode so optične metode, kjer lahko na osnovi posnetih spektrov

ugotavljamo kvalitativno in kvantitativno sestavo vzorca. Spektri nastanejo z vzbujevanjem

atomov oziroma molekul. [19]

Metoda temelji na merjenju absorbirane svetlobe, ki preide skozi referenčno raztopino in skozi

vzorec. Intenziteto prepuščene svetlobe skozi vzorec izmeri detektor, ki pretvori svetlobno

energijo v električni signal. Za merjenje nizke svetlobne intenzitete uporabljamo

fotopomnoževalke, drugače pa uporabljamo fotodiode. Podatke dobimo s pomočjo

računalniškega programa, ker je spektrofotometer povezan z osebnim računalnikom, rezultate

pa si interpretiramo s pomočjo Beer – Lambertovega zakona, ki podaja zvezo med intenziteto

absorbirane svetlobe in koncentracijo absorbirajoče snovi. [19] [20]


11

Uporabljali smo kivete, ki morajo biti iz materiala, ki prepušča sevanje željene valovne

dolžine in je inerten za merjenje raztopin. Morajo biti enostavne po obliki in po konstrukciji,

optično gladke s konstantno debelino in površino. Kivete, uporabne za UV območje, so

narejene iz kvarčnega stekla, za VIS območje pa so lahko iz navadnega stekla. [19]

2.2.6.1 Totalni fenoli

Ekstrakcija fenolnih spojin poteka s polarnimi topili. Fenolne skupine ali polifenoli

predstavljajo skupino sekundarnih metabolitov, ki so na splošno vključeni v obrambo pred

ultravijoličnim sevanjem, patogeni, preprečujejo oksidacijo in imajo visok antioksidativni

učinek. Večinoma imajo različne strukture, vendar v splošnem vsebujejo aromatski obroč in

eno ali več hidroksilnih skupin ter nastopajo kot preproste fenolne molekule ali visoko

polimerizirane spojine. [21] [15]

S pomočjo študijev so ugotovili, da imajo različne biološke lastnosti, so protivirusni,

antikancerogeni, protitumorni in delujejo protivnetno. [21]

Delovanje antioksidativnih fenolnih molekul temelji na sposobnosti, da postanejo radikali, ki

so bolj stabilni v primerjavi z večino prostih radikalskih vrst, zaradi stabilizacije prostega

elektrona z delokalizacijo na aromatski obroč. [21]

Vsebnost totalnih fenolov smo določili s pomočjo Folin – Ciocalteujeve metode. Kemijska

reakcija temelji na prenosu elektrona iz fenolnih spojin in merjenju absorbance modro

obarvanega kompleksa. Ena izmed glavnih pomanjkljivosti metode je ta, da se lahko reagent

reducira zaradi drugih substanc, ki niso fenoli. [21]

Slika 2-10 prikazuje pripravljene vzorce za določanje vsebnosti totalnih fenolov.

Slika 2-10: Vzorci v kivetah, pripravljeni za meritve s spektrofotometrom


12

2.2.6.2 Radikalska metoda DPPH

Oksidacija je bistvenega pomena pri proizvodnji energije pri živih organizmih. Prosti radikali

in druge reaktivne kisikove vrste povzročajo poškodbe tkiva in smrt celic. Oksidacijska škoda,

ki jo povzročajo prosti radikali, je povezana s staranjem in različnimi boleznimi. Čeprav skoraj

vsi organizmi vsebujejo obrambne antioksidativne sisteme, ti sistemi ne zadoščajo za

preprečitev škode v celoti, zato si lahko pomagamo z antioksidativnimi sredstvi oziroma z

živili z visoko antioksidativnostjo. [22]

Antioksidativna aktivnost se pogosto meri s spektroskopskimi metodami, indirektno ali

direktno. Uporabili smo indirektno metodo, prikazano na sliki 2-11, ki ugotavlja sposobnost

antioksidanta kot lovilca prostih radikalov, ki ne predstavlja direktno povezavo z

oksidacijsko razgradnjo. Določevali smo antioksidativnost s kalorimetričnim določanjem

vsebnosti standardnega radikala DPPH•. Radikal DPPH• ima absorpcijski maksimum pri

valovni dolžini 515 nm. Molekula DPPH ima stabilen prosti radikal, ki ne tvori dimer kot

večina drugih radikalov. To je posledica delokalizacije prostega elektrona okoli molekule.

Ko se radikal poveže z donirajočim elektronom antioksidanta, se absorpcija zmanjša in

nastane reducirana oblika molekule.[23]

Slika 2-11: Mehanizem reakcije DPPH z antioksidantom [21]

2.2.6.3 Polisaharidi

Polisaharidi so zanimivi za farmacevtsko industrijo zaradi številnih zdravilnih učinkov, med

katerimi sta najbolj pomembna protitumorska in imunostimulativna. Delujejo tudi

hipoglikemično, protiangiogeno, preprečujejo alegične reakcije, ščitijo pred sevanjem in

varujejo jetra. [10]

Med aktivne komponente gobe Resasti bradovec štejemo za gobe tipične beta glukane,

prikazane na sliki 2-12, ki spadajo v skupino neceluloznih naravnih polisaharidov, sestavljenih

iz molekul glukoze. Med farmakološko bolj zanimive spadajo 1-3D-beta glukani, ki jih

najdemo v celičnih stenah gob. Večinoma so vodotopni in imajo na dolgi verigi le monomerne

enote glukoze. [24] [25]

Slika 2-12: Beta glukan [26]


13

3 Eksperimentalni del

3.1 Konvencionalna klasična ekstrakcija

Izvedli smo 4 konvencionalne ekstrakcije, ki so se razlikovale v izbiri topila in v temperaturi,

pri kateri smo izvajali ekstrakcijo in tako pridobili 4 ekstrakte.

3.1.1 Pribor in kemikalije

• bučka z okroglim dnom

• merilni valj (100 mL)

• žlička

• tehtnica

• material (gobe Hericium erinaceus)

• magnetni mešalček

• povratni hladilnik

• nuča z nastavkom

• filter papir

• rotacijski uparjalnik

• etanol in metanol

3.1.2 Opis dela

V bučke z okroglim dnom smo zatehtali 5 g predhodno zmletih gobic in tako pripravili 4

različne vzorce, kot prikazuje tabela 3-1. V prvi dve bučki smo dodali 100 mL etanola, v drugi

dve bučki smo dodali 100 mL metanola ter v vsako še magnetni mešalček. Bučke smo

namestili v vodne kopeli, katerih temperature so prikazane v spodnji tabeli. Namestili smo tudi

povratni hladilnik in zmes enakomerno mešali približno 2 uri. Po končanem mešanju smo

bučko previdno sneli, jo ohladili ter vsebino prefiltrirali s pomočjo nuče in filter papirja.

Prefiltrirano ekstrakcijsko zmes smo prelili v novo bučko z okroglim dnom, ki smo jo

namestili na rotacijski uparjalnik, ostanek na filter papirju smo zavrgli. Po uparjanju na

rotavaporju smo topilo dokončno odparili do suhega preostanka še s pomočjo dušika. Tako

pripravljene ekstrakte smo shranili v hladilnik in jih kasneje uporabili za nadaljne analize. [27]


14

Tabela 3-1: Ekstrakti z izbranimi topili in temeraturami

ŠT. EKSTAKTA TOPILO

1 etanol (vroče, 80 °C)

2 etanol (hladno, 23 °C)

3 metanol (vroče, 60 °C)

4 metanol (hladno, 23 °C)

3.1.3 Izračuni

Stekleničke, kamor smo shranili ekstrakt, smo stehtali in določili maso ekstrakta ter izračunali

izkoristek ekstrakcije.

Maso ekstrakta mekstrakt smo določili kot razliko mas stekleničke z ekstraktom (msteklenička+ekstrakt)

in prazne stekleničke (msteklenička).

Z enačbo 3.1 smo izračunali izkoristek ekstrakcije ηestrakcije .

η =𝑚𝑒kstrakt

𝑚material∙ 100 (3.1)

3.2 Ultrazvočna ekstrakcija

Izvedli smo 2 ultrazvočni ekstrakciji pri temperaturi 35 °C. Pri prvem vzorcu smo uporabili

etanol in pri drugem vzorcu metanol.

3.2.1 Pribor in kemikalije

• erlenmajerica

• merilni valj (100 mL)

• žlička

• tehtnica

• material (gobe Hericium erinaceus)

• kopel z ultrazvokom

• nuča z nastavkom

• filter papir

• rotacijski uparjalnik

• etanol in metanol


15

3.2.2 Opis dela

V 2 erlenmajerici smo zatehtali po 5 g zmletih gobic in v prvo erlenmajerico dodali 100 mL

etanola in v drugo erlenmajerico 100 mL metanola. Erlenmajerici smo pustili v ultrazvočni

kopeli približno 2 uri pri konstantni temperaturi 35 °C. Ko se je čas iztekel, smo zmes vsako

posebej prefiltrirali skozi filter papir s pomočjo nuče. Prefiltrirano zmes smo namestili na

rotacijski uparjalnik in tako kot pri konvencionalni ekstrakciji dokončno odparili topilo do

suhega preostanka s pomočjo dušika. Tako pripravljene ekstrakte smo shranili za nadaljne

analize.

3.2.3 Izračuni

Za izračun mase ekstrakta in izkoristka ekstrakcije smo uporabili popolnoma enako enačbo

3.1, kot pri konvencionalni ekstrakciji.

η =𝑚ekstrakt

𝑚material∙ 100

3.3 Ekstrakcija polisaharidov

Pri ekstrakciji polisaharidov smo zatehtali 5 g glivnega materiala in dodali 100 mL vode. Tako

pripravljeno zmes smo ekstrahirali v bučki s povratnim hladilnikom 3 h pri temperaturi 85,5

°C v parafinski kopeli ter pri konstantnem mešanju. Po končani ekstrakciji je sledila filtracija.

Filtrat smo skoncentrirali s pomočjo vakuumskega uparjalnika. Nato smo filtratu dodali 3

kratno količino ohlajenega EtOH in ga za 24 h hranili pri temperaturi 4 °C. Raztopino z

oborjenimi polisaharidi smo nato centrifugirali pri 5000 rpm 10 min. [17]

3.3.1 Izračuni

Delež polisaharidov v ekstraktu smo določili po enačbi 3.1, ki smo jo uporabili tudi pri

izračunu izkoristka konvencionalne in ultrazvočne ekstrakcije.

3.4 Analize ekstraktov

Ekstraktom smo določali antioksidativno aktivnost z radikalsko metodo ter vsebnost totalnih

fenolov.

3.4.1 Določanje vsebnosti totalnih fenolov

3.4.1.1 Pribor in kemikalije

• merilne bučke

• stekleničke

• avtomatske pipete in mikropipeta

• analitska tehtnica

• spatula

• spektrofotometer

• galna kislina (GA)

• Folin – Ciocalteu reagent (FC)

• natrijev (V) karbonat (Na2CO3)

• vodna kopel


16

3.4.1.2 Umeritvena krivulja z galno kislino

Najprej smo pripravili osnovno raztopino galne kisline (GA) s koncentracijo 0,4 mg/mL tako,

da smo v 25 mL bučko zatehtali 10 mg GA in jo dopolnili do oznake z destilirano vodo.

Pripravili smo tudi Folin – Ciocalteu reagent (FC) tako, da smo osnovno raztopino FC reagenta

razredčili z destilirano vodo v razmerju 1:10. Sledila je še priprava raztopine Na2CO3,

koncentracije 75 g/L. Na2CO3 smo zatehtali v merilno bučko, dolili destilirano vodo do oznake

ter s pomočjo ultrazvočne kopeli popolnoma raztopili Na2CO3. Nato smo v 10 mL bučke

odpipetirali naslednje volumne predhodno pripravljene osnovne raztopine GA: 7,5 mL; 5,0

mL; 2,5 mL; 1,0 mL; 0,75 mL; 0,5 mL in 0,1 mL ter razredčili do oznake. Raztopine smo

dobro premešali in si pripravili vzorce. V stekleničke smo odpipetirali 0,5 mL raztopine GA

iz bučk, dodali 2,5 mL raztopine Folin – Ciocalteu reagenta ter 2 mL raztopine Na2CO3.

Raztopine smo dobro premešali in jih termostatirali na vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50

°C, jih ohladili in izmerili absorbance s pomočjo spektrofotometra pri valovni dolžini 760 nm.

Hkrati smo pripravili še slepi vzorec, kjer smo namesto raztopine GA uporabili metanol. Na

osnovi izmerjenih absorbanc smo narisali diagram odvisnosti absorbance (Abs) od

koncentracije GA (γGA) v raztopinah. [27]

3.4.1.3 Določanje vsebnosti totalnih fenolov v ekstraktih

V 10 mL bučke smo zatehtali 2 mg/mL ekstrakta in dopolnili do oznake z destilirano vodo ter

dobro premešali, da se je ekstrakt raztopil. Nato smo po 0,25 mL raztopine ekstrakta

odpipetirali v 7 stekleničk (kolikor je bilo ekstraktov), dodali 1,25 mL Folin – Ciocalteu

reagenta ter 1 mL raztopine Na2CO3. Čas za pripravo vzorca ni smel biti daljši od 2 min. Tako

pripravljene vzorce smo potem termostatirali na vodni kopeli temperature 50 °C 5 min. Vzorce

smo ohladili in izmerili absorbanco pri valovni dolžini 760 nm. Pripravili smo si tudi kontrolni

vzorec tako, da smo namesto raztopine ekstrakta odpipetirali metanol. Ta kontrolni vzorec

smo uporabili za umerjanje spektrofotometra. [27]

3.4.1.4 Izračuni

Koncentracijo totalnih fenolov v ekstraktih smo določili s pomočjo umeritvene krivulje z GA

po sledeči enačbi:

𝐴𝑏𝑠 = 𝑎 ∙ 𝛾GA + 𝑏 (3.2)

𝛾GA=𝐴𝑏𝑠−𝑏

𝑎 (3.3)

kjer je:

Abs absorbanca raztopine vzorca izmerjena pri 760 nm (/),

b odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance (/),

a naklon premice umeritvene krivulje GA (mL/mg),

γGA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/mL).


17

Vsebnost totalnih fenolov izrazimo v mg GA na g ekstrakta (wGA ekstrakt [mgGA/gekst.]) oziroma

mg GA na g materiala (wGA material [mgGA/gmat.]) po sledečih enačbah:

𝑤𝐺𝐴 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑡 =𝛾𝐺𝐴

𝛾𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑡· 1000 (3.4)

𝑤𝐺𝐴 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 = 𝑤𝐺𝐴 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑡 ·𝜂𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗𝑒

100 (3.5)

Kjer je:

γGA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/mL),

γekstrakt koncentracija ekstrakta v raztopini vzorca (mg/mL), ki se izračuna na osnovi

mase zatehte ekstrakta (mekstrakt, v mg), ki smo ga pripravili za analizo;

𝛾𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑡 = 𝑚𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑡 𝑉𝑟𝑎𝑧𝑡𝑜𝑝𝑖𝑛𝑎 (𝑉𝑟𝑎𝑧𝑡𝑜𝑝𝑖𝑛𝑎 = 10 mL)⁄ ,

ηekstrakcije izkoristek ekstrakcije (%).

3.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo

3.4.2.1 Pribor in kemikalije

• merilne bučke

• avtomatski pipeti

• stekleničke

• analitska tehtnica

• spatula

• spektrofotometer

• 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH)

• metanol

3.4.2.2 Določanje antioksidativne aktivnosti ekstraktov

Najprej smo si pripravili raztopino DPPH v metanolu (6 x 10-5 M). Zatehtali smo 2,36 mg

DPPH v 100 mL merilno bučko in razredčili do oznake ter dobro premešali, da se je ves DPPH

raztopil. Nato smo v 10 mL bučke zatehtali 10 mg ekstrakta ter razredčili z metanolom do

oznake. S pomočjo ultrazvočne kopeli smo ekstrakt popolnoma raztopili. V stekleničke smo

odpipetirali 3 mL raztopine DPPH in 77µL raztopine ekstrakta, zmešali, ter tako pripravljene

vzorce termostatirali 15 min pri sobni temperaturi v temnem prostoru. Sledilo je merjenje

absorbance vzorcev pri valovni dolžini 515 nm. Hkrati smo pripravili tudi referenčno

raztopino tako, da smo namesto raztopine vzorca odpipetirali metanol in absorbanco te

raztopine izmerili takoj. [27]


18

3.4.2.3 Izračuni

Antioksidativna aktivnost ekstrakta je podana kot % inhibicije glede na referenčno raztopino.

Izračuna se po enačbi:

% inhibicije = (𝐴𝑐

0−𝐴𝑠15

𝐴𝑐0 ) ∙ 100 (3.6)

kjer je:

Ac0 absorbanca referenčne raztopine v času 0 min,

As15 absorbanca raztopine vzorca po času 15 min.


19

4 Rezultati in diskusija

4.1 Konvencionalna (klasična) ekstrakcija

Mase ekstraktov in izkoristke konvencionalnih ekstrakcij smo izračunali po enačbi 3.1 in

rezultate zbrali v tabeli 4-1. Rezultate smo prikazali tudi grafično (slika 4-1.)

Tabela 4-1: Izračunani izkoristki konvencionalne ekstrakcije

ŠT. EKSTRAKTA 1 2 3 4

TOPILO

etanol

(vroče,

80 °C)

etanol

(hladno,

23 °C)

metanol

(vroče,

60 °C)

metanol

(hladno,

23 °C)

MASA MATERIALA (g) 5,00 4,98 5,04 4,99

MASA STEKLENIČKE (g) 10,43 10,38 10,53 10,42

MASA STEKLENIČKE Z

EKSTRAKTOM (g) 11,00 10,71 11,06 10,76

MASA EKSTRAKTA (g) 0,57 0,33 0,53 0,34

IZKORISTEK (%) 11,47 6,58 10,45 6,76

Na izkorisek ekstrakcije vpliva več dejavnikov, med katerimi so najbolj pomembni izbira

topila, polarnost topila, gostota topila ter temperatura, pri kateri izvajamo ekstrakcijo.

Relativna polarnost uporabljenih topil raste v smeri etanol (EtOH) ˂ metanol (MeOH) ˂ voda

(H2O) in izkoristki ekstrakcij naj bi rastli v smeri rasti polarnosti topil. Najnižji izkoristek

ekstrakcije smo v skladu s teorijo pridobili pri ekstraktu 2 z etanolom v vlogi topila (6,58 %),

vendar pa največji izkoristek ekstrakcije ni bil pridobljen z metanolom v vlogi topila, ampak

z etanolom pri vročih pogojih ekstrakcije (11,47 %, 80 °C). Za njim pa je sledil metanolni

ekstrakt pri vročih pogojih ekstrakcije z nekoliko manjšim izkoristkom, 10,45 %.

Sklepamo lahko, da ima v našem primeru večji vpliv na izkoristek temperatura ekstrakcije kot

pa sama polarnost topila. Možna pa je tudi večja prisotnost nepolarnih komponent oziroma

komponent, ki so bolj topne v manj polarnih topilih.

S povišanjem temperature se poveča topnost topljenca v topilu, zviša pa se tudi difuzijski

koeficient, zato lahko pričakujemo višje izkoristke pri višjih temperaturah. Kljub temu pa

lahko zaradi uporabe visoke temperature pride do degradacije določenih komponent. [27]


20

4.2 Ultrazvočna ekstrakcija

Izračunani masi ekstraktov in izkoristka ultrazvočnih ekstrakcij sta zbrani v tabeli 4-2. Najvišji

delež ultrazvočne ekstrakcije smo pridobili z etanolom (11,25 %), nekoliko manjši izkoristek

pa z metanolom (6,66 %).

Sklepamo lahko, da je manjši izkoristek ultrazvočne ekstrakcije z metanolom posledica nizke

temperature topila, ki znaša 35 °C, hkrati pa je lahko zopet večja prisotnost nepolarnih

komponent. Na izkoristek pa vpliva tudi gostota topila, čeprav sta gostoti etanola in metanola

pri 35 °C približno enaki.

Tabela 4-2: Izračunani izkoristki ultrazvočne ekstrakcije

ŠT. EKSTRAKTA 5 6

TOPILO etanol (35 °C) metanol (35 °C)

MASA MATERIALA (g) 5,00 5,00

MASA STEKLENIČKE (g) 10,47 10,37

MASA STEKLENIČKE Z EKSTRAKTOM (g) 11,03 10,71

MASA EKSTRAKTA (g) 0,56 0,33

IZKORISTEK (%) 11,25 6,66


21

4.3 Ekstrakcija polisaharidov

Pri ekstrakciji polisaharidov smo kot ekstrakcijski medij uporabili destilirano vodo. Maso

ekstrakta in delež polisaharidov v ekstraktu smo določili z enačbo 3.1 in rezultate zbrali v

tabeli 4-3. Delež polisaharidov v ekstraktu je prikazan grafično na sliki 4-1 in je zeleno

obarvan.

Ekstrakcija z destilirano vodo je najbolj pogost postopek pridobivanja polisaharidov iz gob. S

pomočjo vroče vode smo ekstrahirali vodotopne polisaharide in poskušali odstraniti čim več

v vodi netopnih polisaharidov. Pogosta je tudi uporaba soli, kislin in razredčenih alkalnih

raztopin, ki služijo za razkroj celične stene in odstranjevanje fenolnih spojin.[10]

Tabela 4-3: Izračunani delež polisaharidov v ekstraktu

ŠT. EKSTRAKTA 7

TOPILO destilirana voda (vroče, 85 °C)

MASA MATERIALA (g) 4,99

MASA STEKLENIČKE (g) 10,54

MASA STEKLENIČKE Z

EKSTRAKTOM (g)

10,91

MASA EKSTRAKTA (g) 0,37

DELEŽ POLISAHARIDOV (%) 7,51

Slika 4-1: Grafični prikaz izkoristkov ekstrakcij in delež polisaharidov v ekstraktu

11,47

6,58

10,45

6,76

11,25

6,66

7,51

0

2

4

6

8

10

12

14

etanol (vroče,80 °C)

etanol (hladno) metanol (vroče,60 °C)

metanol(hladno)

etanol (35 °C) metanol (35 °C)destilirana voda- delež

polisaharidov(vroče, 85 °C)


22

4.4 Analize ekstraktov

4.4.1 Določanje vsebnosti totalnih fenolov

4.4.1.1 Umeritvena krivulja z galno kislino

Izmerjene vrednosti absorbanc (Abs) galne kisline so zbrane v tabeli 7-1 v prilogi 1. S pomočjo

teh vrednosti smo narisali umeritveno krivuljo absorbance v odvisnosti od koncentracije galne

kisline v raztopinah (cGA). Umeritvena krivulja je prikazana na sliki 7-1 v prilogi 2.

4.4.1.2 Določanje vsebnosti totalnih fenolov v ekstraktih

Rezultati eksperimenta so podani v mg GA na g ekstrakta, izračunani po enačbi 3.5 in zbrani

v tabeli 7-2 v prilogi 3. Podatki so prikazani tudi grafično (slika 4-2).

Ugotovili smo, da najvišjo vsebnost TF vsebuje vzorec številka 3, ki smo ga pridobili z

ekstrakcijo z metanolnim medijem pri visoki tempreraturi (33,11 mg GA/g ekst.)

Vrednosti padajo v smeri MeOH > EtOH. Najvišjo vsebnost TF smo pridobili z metanolom v

vlogi topila ne glede na to, pri katerih pogojih in temperaturah smo izvajali ekstrakcijo.

Metanol je očitno zelo selektivno topilo za fenolne spojine, čeprav je masni izkoristek

ekstrakcije nižji od izkoristka ekstrakcije z etanolom. Sledijo etanolni ekstrakti, ki imajo prav

tako podobne vrednosti ne glede na to, ali smo izvajali klasično konvencionalno ekstrakcijo

ali ultrazvočno. Sklepamo, da ima večji vpliv na rezultate izbira topila, čeprav raziskav iz

področja vpliva različnih vrst topil in različnih temperatur ekstrakcije na vsebnost TF

praktično ni. Opazimo pa lahko tudi, da vsebnost totalnih fenolov pri istem topilu raste z

rastočo temperaturo. Pri metanolu dobimo najnižjo vsebnost fenolov pri ultrazvočni

ekstrakciji (35 °C).

Trdimo lahko, da ima tako pri vroči kot pri hladni ekstrakciji vpliv na vrednost TF polarnost

topila, saj je ekstrakt številka 3 z najvišjo vsebnostjo TF bolj polaren od etanola. Ekstrakta,

pridobljena z ulrazvočno ekstrakcijo, se razlikujeta v vrednosti zaradi vpliva polarnosti pri

konstantni temperaturi.

Vsebnost TF v ekstraktu polisaharida (ekstrakt številka 7) smo določili po enakem postopku

kot ostale ekstrakte. Ker gre za ekstrakt polisaharida, kjer smo kot ekstrakcijski medij uporabili

vročo vodo, s katero odstranimo fenolne spojine, je vrednost v primerjavi z drugimi ekstrakti

zanemarljiva in znaša 0,22 mg GA/g ekstr.

Rezultati so prikazani s standardnimi odmiki. Standardni odmik nam pove, za koliko dana

vrednost odstopa od povprečja in oceni našo natančnost pri delu, kar pomeni nižji standardni

odmik, večja natančnost analize. Da bi bili naši rezultati natančni in realni, smo vsak vzorec

analizirali v dveh paralelkah. Najnižji standardni odmik smo dobili pri metanolnem ekstraktu,

dobljenim z ultrazvočno ekstrakcijo in najvišjega pri metanolnem ekstraktu, dobljenim s

hladno konvencionalno ekstrakcijo.


23

Slika 4-2: Grafični prikaz vsebnosti TF v ekstraktih in v ekstraktu polisaharida

4.4.2 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo

Merili smo antioksidativno aktivnost ekstraktov in jo izrazili kot procent inhibicije DPPH

(enačba 3.6). V tabeli 7-3 v prilogi 4 so rezultati meritev v kivetah, dodan pa je tudi graf na

sliki 4-3.

Največji % inhibicije smo dobili pri metanolnem vzorcu 3 (12,37 %), pri ostalih vzorcih smo

dobili podobne rezultate. Najnižji % inhibicije smo izmerili pri etanolnem vzorcu 6 pri pogojih

ultrazvočne ekstrakcije (2,27 %). Najmanj natančni rezultat oziroma največji standardni

odmik smo dobili ravno pri vzorcu 3, pri katerem smo izmerili tudi najvišji % inhibicije,

najnižji standardni odmik pa nam je dal vzorec številka 6.

Če primerjamo rezultate celokupnih fenolov (slika 4-2), z inhibitorjem učinka, vidimo, da ima

metanolni vzorec pri visoki temperaturi najvišji procent inhibicije in tudi najvišjo vrednost

totalnih fenolov, čeprav ni nujno, da je višja vrednost totalnih fenolov posledica višje inhibicije

DPPH radikala. [27]

Zgornjo tezo lahko potrdimo s primerom ekstrakta polisaharida, ki ima visoko vrednost %

inhibicije (8,04 %), takoj za ekstraktom najvišjega % inhibicije, ampak ima nizko vsebnost

TF.

Z uporabo različnih topil torej izoliramo različne bioaktivne komponente. Na izolacijo poleg

izbranega topila vpliva tudi izbrana temperatura, saj lahko pri ekstrakciji pri visoki temperaturi

pride do razpada določenih aktivnih komponent, kar se kaže v zmanjšanem antioksidativnem

delovanju. To je lahko razlog za nizki procent inhibicije pri etanolnem vzorcu pri

visokotemperaturni ekstrakciji (80 °C).

24,0516

14,6260

33,1115

29,2502

17,6229

25,7740

0,21870

5

10

15

20

25

30

35

etanol(vroče, 80°C)

etanol(hladno)

metanol(vroče, 60°C)

metanol(hladno)

etanol (UV,35°)

metanol(UV, 35°C)

destiliranavoda

(polisaharidi,vroče, 85 °C)

TF(mgGA/gEKST.)


24

Slika 4-3: Grafični prikaz antioksidativne aktivnosti ekstraktov

5,13803,9020

12,3711

5,9306

2,2725

5,8142

8,0364

0

5

10

15

20

25

etanol(vroče, 80 °C)

etanol(hladno)

metanol(vroče, 60 °C)

metanol(hladno)

etanol (UV,35 °C)

metanol (UV,35° C)

destiliranavoda

(polisaharidi,vroče, 85 °C)

% inhb. DPPH


25

5 Zaključek

V prvem delu diplomske naloge smo raziskovali vpliv ekstrakcijslega postopka in

obratovalnih pogojev na izkoristek ekstrakcije. Ugotovili smo, da v našem primeru masni

izkoristek ekstrakcije ne narašča v smeri rasti polarnosti topil, čeprav je polarnost pomemben

vpliv, saj bi v tem primeru dobili najvišji izkoristek v primeru uporabe metanola kot topila.

Sklepamo lahko, da je na izkoristek bolj vplivala temperatura, saj so izkoristi veliko večji pri

vroči kot pa pri hladni ekstrakciji, ne glede na izbiro topila. Višja temperatura povečuje topnost

topljenca v topilu, sklepamo pa lahko tudi, da je veliko komponent v glivi nepolarne narave,

že prej omenjene maščobne komponente. Tako pri konvencionalni kot pri ultrazvočni

ekstrakciji smo najvišje izkoristke pridobili z etanolom. Če primerjamo metanolne ekstrakte,

vidimo, da je bila bolj uspešna uporaba konvencionalne kot pa ultrazvočne ekstrakcije, čeprav

je ultrazvočna ekstrakcija vedno bolj popularna v industriji, tudi v prehrambeni, morda zaradi

nizkih temperatur obratovanja.

V drugem delu naloge smo določili prisotnost skupnih fenolov in akntioksidativno aktivnost

ekstraktov.Vsebnost totalnih fenolov je bila v razponu med 14,63 mg GA/gekst. in 33,11 mg

GA/gekst. Trdimo lahko, da so bile vrednosti relativno nizke. Najvišje vrednosti smo izmerili

metanolnim ekstraktom, ne glede na izbiro temperature, kar je lahko posledica velikega vpliva

polarnosti topila na vsebnost TF. Z uporabo visoke temperature lahko fenolne spojine uničimo.

Na vsebnsot pa vpliva tudi čas izpostavitve, saj lahko pride do posledične degradacije.

Sklepamo lahko, da so fenolne spojine občutljive na temperaturo, čeprav v našem primeru

vsebnost le teh s temperaturo narašča. [16]

Ekstraktom smo izmerili % inhibicije z radikalsko metodo DPPH. Ugotovili smo, da ima

ekstrakt pridobljen s konvencionalno ekstrakcijo pri vročih pogojih najvišjo vsebnost totalnih

fenolov ter najvišji procent inhibicije. Najnižje odstotke smo dobili pri uporabi etanola, pri

vseh uporabljenih pogojih, zato lahko sklepamo, da vsebuje manj antioksidativnih komponent,

saj so le-te slabše topne v etanolu.


26

6 Literatura

[1] Novaković A. Biopotencijal autohtonih gljiva u funkciji nutraceutika: doktorska

disertacija. Novi Sad: Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno matematički fakultet, 2015.

[2] Garnweidner E. Gobe: žepni gobarski vodnik. Ljubljana: Cankarjeva založba, 1989.

[3] Gerbec B., Tavčar E., Gregori A., Kreft S., Berovic M. Solid State Cultivation of

Hericium erinaceus Biomass and Erinacine: A production. Journal of Bioprecessing &

Biotechniques, 2155-9821

[4] Dnyaneshwar Jadhav, Rekha B.N., Parag R. Gogate, Virendra K. Rathod. Extraction of

vanillin pods: A comparison study of conventional soxhlet and ultrasound assisted

extraction. Journal of Food Engineering, 93 (2009) 421-426

[5] Krajnc S. Biološka aktivnost ekstrakta jagod: diplomsko delo. Maribor: Univerza v

Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2012.

[6] http://www.goba.eu/ponudba/prehranska-dopolnila-iz-gob/hericium-erinaceus/ (dostop

10. 5. 2017).

[7] http://www.gobe.si/Gobe/HericiumErinaceum/ (dostop 11. 5. 2017).

[8] https://nootriment.com/hericium-erinaceus/ (dostop 22. 5. 2017).

[9] https://www.google.si/search?q=hericium+erinaceus+prah&client (dostop 22. 5. 2017).

[10] Turk D. Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidu ob uporabi organskih

topil in superkritičnih fluidov: magistrsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru,

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2014.

[11] Kač M. Leksikon kemije. Ljubljana: Založba Mladinska knjiga, 2001.

[12] http://webbook.nist.gov/chemistry/ (dostop 16. 6. 2017).

[13] Knez Ž., Škerget M. Termodifuzijski separacijski procesi: zbrano gradivo. Maribor:

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 1999.

[14] Strnad J. Fizika: Mehanika/toplota, prvi del. Ljubljana: Društvo matematikov, fizikov in

astronomov, Zveza organizacij za tehnično kulturo Slovenije, 1987.

[15] Francisco J. Barba, Zhenzhou Zhu, Mohamed Koubaa, Anderson S. Sant'Ana, Vibeke

Orlien. Green alternative methods for the extraction of antioxidant bioactive compounds

from winery wastes and bz-products: A review. Trends of Food Science & Technology,

49 (2016) 96-109.

[16] Boček T. Ekstrakcija antioksidativnih komponent iz Kurkume (Curcuma longa):

diplomsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko

tehnologijo, 2013.

[17] K. Skalicka-Wozniak, J. Szypowski, R. Los, M. Siwulski, K. Sobieralski, K. Glowniak,

A. Malm. Evaluation of polysaccharides content in fruit bodies and their antimicrobial

activity of four Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) P. Karst. strains cultivated on

different wood type substrates, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 81 (2012).

[18] Knez Ž., Ozim V. Mehanska tehnika: zbrano gradivo. Maribor: Univerza v Mariboru,

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 1995.


27

[19] Brodnjak Vončina D. Analizna kemija 2: zbrano gradivo. Maribor: Univerza v

Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2006.

[20] Skoog. D. A., West D. M, Hollar J. F. Fundamental of analytical chemistry. New York:

Saunders College Publishing, 1992.

[21] Gador-Indra Hidalgo, Maria Pilar Almajano. Red Fruits: Extraction of Antioxidants,

Phenolic Content, and Radical Scavenging Determination: A review. Barcelona:

Universitat Politecnica de Catalunya, Chemical Engineering Department, 2017.

[22] Hamzah Rabiat Unekwu, Jigam Ali Audu, Makun Hussaini Makun, Egwim Evans

Chidi. Phytochemical screening ana antioxidant activity of methanolic extract of

selected wild edible Nigerian mushrooms. Asian Pacific Journal of Tropical Disease,

S153-S157, 2014.

[23] Oprešnik T. Vsebnost fenolnih spojin v sadnih in zeliščnih pijačah: diplomsko delo.

Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2016.

[24] http://www.fengcha.si/index.php/superhrana/medicinske-gobe/hericium-erinaceus-

resasti-bradovec-bio-v-prahu.html?gclid=CPKfk7qVhtQCFVTgGQod12wINQ (dostop

22. 6. 2017)

[25] http://www.vir-

zdravja.com/Preglednovic/tabid/62/ArticleID/152/CBModuleId/506/Default.aspx

(dostop 23. 6 . 2017)

[26] https://en.wikipedia.org/wiki/Beta-glucan#/media/File:Beta-1,3-1,4-glucan.png/

(dostop 23. 6. 2017)

[27] Cör D. Ekstrakcije bioloških materialov s subkritičnimi in superkritičnimi fluidi:

doktorska disertacija. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko

tehnologio, 2016.


28

7 Priloge

7.1 Priloga 1

Tabela 7-1: Izmerjene vrednosti absorbanc galne kisline

V (mL) c (mg/mL) Abs (760nm)

0 0 0

0,10 0,004 0,0953

0,25 0,010 0,1692

0,50 0,020 0,2475

0,75 0,030 0,3561

1,00 0,040 0,4703

2,50 0,100 1,1650

5,00 0,200 1,9028

7,50 0,300 2,1592


29

7.2 Priloga 2

Slika 7-1: Umeritvena krivulja z galno kislino

y = 11,756xR² = 0,9942

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

A(7

60

nm

)

c (mg/mL)


30

7.3 Priloga 3

Tab

ela

7-2

: V

seb

no

st t

ota

lnih

fen

olo

v v

ekst

rakti

h

ŠT

. E

KS

TR

AK

TA

1

2

3

4

5

6

7

TO

PIL

O

etan

ol

(vro

če,

80

°C)

etan

ol

(hla

dno

) m

etan

ol

(vro

če,

60

°C)

met

ano

l (h

lad

no

) et

ano

l (U

V, 3

5°)

m

etan

ol

(UV

,

35

°C)

des

tili

ran

a vo

da

(po

lisa

har

idi,

vro

če,

85

°C

)

Ab

s 1

(76

0n

m)

0,5

843

0,3

716

0,7

819

0,7

769

0,3

011

0,6

038

0,0

084

Ab

s 2

(76

0n

m)

0,5

469

0,3

163

0,7

754

0,6

676

0,5

277

0,6

084

0,0

024

Ab

s (7

60n

m)

0,5

656

0,3

440

0,7

787

0,7

223

0,4

144

0,6

061

0,0

054

TF

(m

g/m

l)

0,0

481

0,0

293

0,0

662

0,0

614

0,0

353

0,0

516

0,0

005

TF

1 (

mg/m

l)

0,0

497

0,0

316

0,0

665

0,0

661

0,0

256

0,0

513

0,0

007

TF

2 (

mg/m

l)

0,0

465

0,0

269

0,0

660

0,0

568

0,0

449

0,0

518

0,0

002

mg

GA

/gE

KS

T.

24

,842

7

15

,799

3

33

,244

0

31

,458

5

12

,801

9

25

,671

8

0,3

401

mg

GA

/gE

KS

T.

23

,260

5

13

,452

7

32

,978

9

27

,041

9

22

,443

9

25

,876

1

0,0

972

TF

(1

,2)

(mg

GA

/gE

KS

T.)

2

4,0

51

6

14

,626

0

33

,111

5

29

,250

2

17

,622

9

25

,774

0

0,2

187

ST

DV

1

,11

88

1,6

593

0,1

875

3,1

230

6,8

179

0,1

445

0,1

718


31

7.4 Priloga 4

Tab

ela

7-3

: A

nti

oksi

dat

ivn

a ak

tivn

ost

ekst

rakto

v

ŠT

.EK

ST

RA

KT

A

TO

PIL

O

Abs

1

Abs

2

Inhb

1 (

%)

Inh

b2

(%

) In

hb

(%

) S

TD

V

1

etan

ol

(vro

če,

80 °

C)

0,8

528

0,8

587

5,4

65

0

4,8

11

0

5,1

38

0

0,4

62

5

2

etan

ol

(hla

dno)

0,8

711

0,8

627

3,4

36

4

4,3

67

6

3,9

02

0

0,6

58

4

3

met

ano

l (v

roče

, 60 °

C)

0,8

332

0,7

478

7,6

37

7

17

,10

45

12

,37

11

6,6

94

0

4

met

anol

(hla

dno)

0,8

392

0,8

580

6,9

72

6

4,8

88

6

5,9

30

6

1,4

73

6

5

etan

ol

(UV

, 35

°C

) 0,8

801

0,8

831

2,4

388

2,1

062

2,2

725

0,2

352

6

met

anol

(UV

, 35°

C)

0,8

481

0,8

512

5,9

86

0

5,6

42

4

5,8

14

2

0,2

43

0

7

des

tili

ran

a vo

da

(poli

sahar

idi,

vro

če, 85 °

C)

1,0

887

1,0

947

8,2

89

1

7,7

83

7

8,0

36

4

0,3

57

4


32

8 Življenjepis

PERSONAL INFORMATION Eva Krajnčan

Šmartno ob Paki 69, 3327 Šmartno ob Paki (Slovenia)

0038631813777

[email protected]

WORK EXPERIENCE

JOB APPLIED FOR Chemical engineering technician

Jun 2010–Jun 2010 Tool-maker and related worker

BSH hišni aparati I.D. invalidska družba, d.o.o., Nazarje (Slovenia)

▪ Summer job

▪ Packing kitchen equipment

Jul 2011–Aug 2011 Office clerk

Gorenje d.d., Velenje (Slovenia)

▪ Summer job

▪ Destroying useless papers

▪ Answering phone calls

▪ Running errands

▪ Message delivery

▪ Sorting mails

Jul 2012–Aug 2012 Chemical worker helper

Gorenje d.d., Velenje (Slovenia)

▪ Summer job

▪ Cleaning laboratory equipment

▪ pH analysis

Dec 2014–Dec 2016 Waiter

Patrick's Pub, Maribor (Slovenia)

▪ Service of tables

▪ Preparing drinks and coffee

▪ Mixing cocktails

▪ Serving food

▪ Handling money

▪ Using computer program for bars


33

EDUCATION AND TRAINING

Jul 2017–Aug 2017 Laboratory technician

Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano, Maribor (Slovenia)

▪ Helping with laboratory analysis (Ion Chromatography,

Biochemical Oxygen Demand, Total Organic Carbon, Determination of Phosphates,

Phenolic Index and Cyanides...)

Oct 2012–Sep 2017

Faculty of Chemistry and Chemical Technology, Maribor (Slovenia)

General: mathematics, physics, organic chemistry, inorganic chemistry,

analytical chemistry, physical chemistry

Mechanical subjects: fluid mechanics, heat and substance transfer,

regulation of process

2008–2012

Gimnazija Celje - Center, Celje (Slovenia)

General: mathematics, physics, biology, chemistry, Slovenian language,

English language, Spanish language, Russian language

Physical education and sports

Communication skills Good communication skills gained through working as a waitress and

practice of using English language due to foreign visitors.

Capable of working in team, following instructions and develop new ideas.

Working in laboratory with laboratory equipment made me precise and

responsible for my work.


34

Izjava o istovetnosti tiskane in elektronske verzije

Med postopkom oddaje zaključnega dela v digitalno knjižnico Univerze v Mariboru se tvori že izpolnjena izjava

o istovetnosti tiskane in elektronske verzije zaključnega dela, ki jo študent natisne in podpiše. Če delo ne sme

biti javno dostopno, izjavo o istovetnosti podpiše tudi mentor. Kopijo izjave veže v tiskan izvod zaključnega

dela, ki bo oddan v Knjižnico tehniških fakultet.

Documents

VPLIV EKSTRAKCIJSKEGA MEDIJA NA KVALITETO EKSTRAKTA … · Zaradi neobičajne oblike so jo poimenovali z nenavadnimi imeni: levja griva, opičja glava, opičja goba, medvedova glava,