BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ

PHẠM MINH TÂN

CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA

HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM

ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH

Chuyên ngành: Vật lý chất rắn Mã số: 62 44 01 04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ

HÀ NỘI, NĂM 2015

Công trình được hoàn thành tại: Trung tâm Điện tử Lượng tử, Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Hồng Nhung 2. PGS.TS. Tống Kim Thuần Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Hội, Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Lê Anh Tuấn, Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS. Mai Anh Tuấn, Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 10, Đào Tấn, Ba Đình, Hà Nội vào hồi ..... giờ ..... phút, ngày ..... tháng ..... năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc Gia - Thư viện Viện Vật lý

1

MỞ ĐẦU

Hạt nano silica chứa tâm màu là các hạt SiO2 xốp kích thước nano chứa được một số lượng lớn phân tử màu hữu cơ trong một hạt silica đơn. Nền silica lại ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương thích sinh học cao. Sử dụng các phương pháp và quy trình thích hợp, một số lượng lớn chất màu có thể đưa vào trong một hạt nano silica đơn (từ hàng chục tới hàng nghìn phân tử màu). Do đó, các hạt nano silica chứa chất màu có độ chói và khuếch đại tín hiệu quang cao gấp nhiều lần so với phân tử màu đơn lẻ. Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của các hạt nano silica có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang. Nếu lựa chọn các ứng dụng phân tích sinh học thích hợp, các hạt nano silica có thể tạo ra những cải thiện đáng kể trong độ nhạy phân tích. Hơn nữa, do bị cầm giữ trong nền silica, các chất màu được bảo vệ khỏi các ảnh hưởng của môi trường. Mặt khác, do nền silica chứa rất ít oxy tự do nên phân hủy quang cũng được giảm thiểu. Độ bền quang cao cho phép các hạt nano silica được sử dụng trong các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài. Hơn nữa, các hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá học để tạo các nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử sinh học như là amin (-NH2), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH). Bằng cách điều chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước hạt; số lượng tâm màu trong hạt cũng như loại tâm màu đưa vào, do đó người ta có thể tạo ra một nhóm lớn các hạt phát quang với các tính chất quang đa dạng dùng trong đánh dấu. Bản thân silica là chất thân thiện với môi trường sinh học, do đó chúng có thể là các hạt đa chức năng: vừa phát hiện và vừa mang thuốc trị bệnh. Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các chất đánh dấu sinh học mới, hứa hẹn được sử dụng rộng rãi trong các phân tích và đánh dấu sinh học. Do vậy, đề tài của luận án đã được chọn là: Chế

2

tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y - sinh.

Mục tiêu nội dung nghiên cứu của luận án: (i) Chế tạo và nghiên cứu các tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ định hướng ứng dụng làm chất đánh dấu sinh học. (ii) Ứng dụng các hạt nano silica chế tạo được làm chất đánh dấu để phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 và tế bào ung thư vú bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang.

Nội dung nghiên cứu chính của luận án: Luận án được tiến hành bằng phương pháp thực nghiệm với các nội dung sau: (i) Nghiên cứu chế tạo hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ với các nhóm chức năng trên bề mặt hạt bằng phương pháp sol-gel. (ii) Khảo sát cấu trúc hóa học trên cơ sở phân tích phổ hấp thụ hồng ngoại. (iii) Thực hiện các phép đo khảo sát các đặc trưng quang học của vật liệu nhằm nghiên cứu, đánh giá các ưu điểm của vật liệu chế tạo được các các phân tử màu tự do. (iii) Ứng dụng các hạt nano trong y - sinh học: Đánh dấu vi khuẩn E. coli O157:H7, tế bào ung thư vú KPL4 và BT-474; xây dựng các phương pháp quang học để định lượng tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 và tế bào ung thư vú KPL4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: Luận án là một công trình nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng. . Đối tượng nghiên cứu của luận án là loại vật liệu nano quang ứng dụng trong phân tích y -sinh. Các kết quả của luận án hứa hẹn bổ sung nhiều thông tin lý thú trong nghiên cứu các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ. Các phương pháp quang phổ sử dụng hạt nano trong việc xác định định lượng vi khuẩn và tế bào ung thư mà luận án đã đưa ra là kết quả đầu tiên ở nước ta. Các kết quả này làm tiền đề cho các nghiên cứu về phát hiện và điều trị ung thư.

Bố cục luận án: Luận án gồm 147 trang, các kết quả chính của luận án đã được công bố trong 5 công trình khoa học trên các tạp chí chuyên ngành và Hội nghị trong nước và quốc tế.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN

1.1. Chất màu hữu cơ 1.1.1. Cấu trúc hóa học

Các chất màu hữu cơ (các chất hữu cơ phát huỳnh quang) từ lâu đã được sử dụng trong các thí nghiệm hóa sinh và lý sinh, trong các nghiên cứu sinh học và y học bằng các phương pháp huỳnh quang do độ nhạy của bản thân các kỹ thuật huỳnh quang. Các chất màu dùng trong đánh dấu sinh học là các chất màu hữu cơ chứa các liên kết đôi liên hợp, hấp thụ mạnh ánh sáng kích thích từ vùng tử ngoại đến gần hồng ngoại gần. Cấu trúc hóa học của chúng được đặc trưng bởi tổ hợp các vòng benzen, vòng pyridin, vòng azine, vòng pyron,… nằm trong cùng một mặt phẳng 1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học

Hình 1.3. Cấu trúc mức năng lượng và chuyển dời quang học của phân tử màu

Các phân tử chất màu có rất nhiều trạng thái là các tổ hợp phức tạp các trạng thái điện tử, trạng thái dao động và trạng thái quay. Do vậy không thể xác định chính xác các mức năng lượng của phân tử chất màu. Dựa vào

ν 2 1 0

ν 2 1 0

Hấp thụ Huỳnh quang

T1

τi ≈ ns

τn ≈ ps T2

S2

S1

Lân quang τF ≈ µs

S0

4

mẫu điện tử của Bohr, Jablonski đã đưa ra giản đồ các mức năng lượng đơn giản hóa phản ánh những đặc điểm quan trọng chủ yếu của các chuyển dời lượng tử trong phân tử màu (Hình 1.3). Trong đó S0, S1, S2, ... là các trạng thái đơn điện tử (singlet) và các trạng thái điện tử bội ba (triplet) là T1, T2, ... tương ứng với số lượng tử spin toàn phần S = 0 và S = 1. Ở trạng thái singlet, hai điện tử ở cùng một mức năng lượng sẽ có spin đối song. Ngược lại khi một điện tử nằm ở trạng thái triplet, spin của nó song song với spin còn lại.

1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ 1.2.1. Các hạt nano silica và latex

Hạt nano silica và latex (hạt nano polymer) là các hạt nano chứa tâm màu. (i) Chất màu có thể được gắn trên bề mặt hoặc đưa vào bên trong hạt nano. (ii) So với các chất màu hữu cơ thì các hạt nano này có độ bền quang cao hơn. (iii) Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của của các hạt nano silica và latex có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang. Vì vậy, hạt nano silica và latex có độ bền quang tương đối tốt và không nhấp nháy. 1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil

Các hạt nano silica bên cạnh có các ưu điểm như đã nêu ở trên, còn tồn tại một số nhược điểm đó là : (i) có nhiều lỗ xốp nên tính đồng nhất quang học không cao, (ii) phân tử màu dễ bị thoát ra ngoài. Để khắc phục nhược điểm này, người ta dùng nền ormosil (organically modified silicate) là nền thủy tinh sol-gel có chứa thành phần hữu cơ liên kết với nguyên tử Si bằng liên kết bền vững – liên kết cộng hóa trị. Nền loại này được điều chế bằng phương pháp sol-gel từ các alkoxysilic có chứa một nhóm hữu cơ liên kết với Si bằng liên kết bền (Si-C) không bị phân li trong quá trình thủy phân.

Các hạt nano silica sử dụng trong các ứng dụng y - sinh học thường được

5

tạo các nhóm chức năng amine, carboxyl hay thiol bằng cách sử dụng các precursor có các nhóm hữu cơ NH2, COOH hay SH, đây là các nhóm chức năng tương hợp sinh học.

1.2.3. Các phương pháp chế tạo Các hạt nano silica chứa màu hữu cơ thường được tạo ra theo ba phương

pháp sau: phương pháp Stober, phương pháp micelle thuận và micelle đảo.

1.2.4. Các đặc trưng hóa lý

1.2.4.1. Vật liệu nền Nền hạt nano silica có hai vai trò: thứ nhất là phân tán tâm màu trong các

lỗ xốp, thứ hai là bảo vệ tâm màu khỏi sự xâm nhập của môi trường bên ngoài và khỏi sự phân hủy quang khi có ánh sáng kích thích do nền này có nồng độ oxy tự do thấp hơn 3 bậc so với dung môi. Vì vậy, chất lượng nền là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng hạt nano silica trong vai trò là chất đánh dấu huỳnh quang.

1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang (i) Các hạt nano silica có độ chói rất cao do chúng có thể chứa một lượng

lớn các phân tử màu bên trong nền silica, vì vậy cường độ huỳnh quang của một hạt nano silica nói chung có thể lớn gấp tới hàng nghìn lần cường độ huỳnh quang của một phân tử màu cùng chất trong dung môi. Có thể điều khiển độ chói bằng việc thay đổi số phân tử chất màu trong mỗi hạt nano silica, với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang.

(ii) Độ bền quang là một chỉ số đặc biệt quan trọng đối với việc sử dụng các hạt nano vào ứng dụng trong sinh học. Các phép đo và quan sát trong sinh học thường diễn ra trong khoảng thời gian dài để có thể theo dõi sự thay đổi của tế bào. Nền silica có vai trò như một lớp vỏ bảo vệ chất màu khỏi tác dụng trực tiếp của ánh sáng kích thích, do đó các tâm màu chứa trong các hạt silica có độ bền quang lớn hơn nhiều so với những chất màu truyền thống tương ứng

6

trong cùng một điều kiện. Điều này làm cho các hạt nano silica chứa tâm màu rất phù hợp cho các

ứng dụng mà yêu cầu phép phân tích với độ nhạy cao và được kích thích với cường độ cao hoặc kéo dài.

1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh

1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh Để các hạt nano nói chung và hạt nano silica có thể ứng dụng trong sinh

học thì chúng phải thỏa mãn một số yêu cầu cơ bản sau: (i) phân tán được trong nước; (ii) có các nhóm chức năng và hóa học bề mặt thích hợp; (iii) có lớp bảo vệ; (iv) không làm ảnh hưởng tới chức năng nhận biết của phân tử sinh học và không làm ảnh hưởng tới khả năng gắn kết với phân tử thụ cảm; (v) không làm ảnh hưởng tới hình thái và cấu trúc phân tử sinh học nên kích thước của các hạt nano phải nhỏ hơn một giá trị giới hạn nào đó.

1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học Các hạt nano silica được gắn kết với các phân tử sinh học theo hai cách

chính: trực tiếp và không trực tiếp Gắn kết trực tiếp: các phân tử sinh học hút bám lên bề mặt hạt nano qua

liên kết không cộng hóa trị, cách gắn kết này là không đặc hiệu. Gắn kết không trực tiếp: sử dụng một chất khác (protein, kháng thể,

peptide…) để làm cầu nối nối phân tử sinh học và hạt nano. Chất này gồm hai đầu tích cực: một đầu gắn với hạt nano và một đầu gắn với phân tử sinh học.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Phương pháp sol-gel được sử dụng để chế tạo các mẫu hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ (RB và FITC). Các hạt được chức năng hóa bề mặt với các nhóm chức tương thích sinh học như: amine, carboxyl hay thiol bằng cách sử dụng các precursor có các nhóm hữu cơ NH2, COOH hay SH liên kết với Si

7

trong phản ứng đồng trùng hợp với TEOS hoặc MTEOS. Bên cạnh đó, các hạt nano silica cũng được chức năng hóa bằng cách bọc lên hạt một lớp vỏ polyethylene glycol (PEG), protein như bovine serum albumin (BSA) hay streptavidin (SA) vừa có tác dụng bảo vệ hạt, vừa có các nhóm chức năng tương thích sinh học. Cấu trúc hóa học được khảo sát thông qua phép đo phổ hấp thụ hồng ngoại. Hình thái, kích thước của hạt được khảo sát qua ảnh SEM, TEM, phép đo DLS và FCS. Các tính chất quang của vật liệu được nghiên cứu thông qua phổ hấp thụ (UV-Vis), phổ huỳnh quang, phép đo thời gian sống phát quang. Các phương pháp ứng dụng trong y – sinh học được khảo sát thông qua các thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy và kính hiển vi quang học.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ

3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề mặt theo phương pháp micelle thuận

Các hạt nano silica chế tạo theo phương pháp micelle thuận được chức năng hóa với các nhóm chức năng OH, NH2, SH thông qua phản ứng đồng trùng hợp với MTEOS, đồng thời hạt cũng được bọc lớp vỏ PEG và protein BSA, SA để vừa tạo các nhóm chức năng, vừa bảo vệ hạt trong môi trường sinh học.

3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt: Các hạt nano silica chế tạo được có dạng tựa cầu, kích thước từ 20 – 110 nm.

3.1.2. Cấu trúc hóa học: Cấu trúc hóa học của hạt được xác định bởi các vạch đặc trưng cho các liên kết trong mạng nền: O-Si-O, Si-CH3, Si-C… và các nhóm vạch đặc trưng cho dao động của các nhóm chức trên bề mặt hạt.

8

3.1.2 Các đặc trưng quang học 3.1.2.1. Hấp thụ và huỳnh quang

400 450 500 550 600 6500.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

65432

§é

hÊp

thô

chuÈ

n hã

a

B­íc sãng (nm)

1:4SBA30 2:4SBA30DT 3:4SBT30 4:4SBA30PEG 5:4SBO30 6:RB/H2O

1

550 600 650 700

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4

5

3

62

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g ch

uÈn

hãa

B­íc sãng (nm)

1: 4SBA30 2: 4SBA30DT 3: 4SBT30 4: 4SBA30PEG 5: 4SBO30 6: RB/H2O

1

Hình 3.8 và 3.9. Phổ hấp thụ và huỳnh quang chuẩn hóa của mẫu hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau

Phổ hấp thụ và huỳnh quang của các mẫu hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề mặt hạt có dạng giống phổ hấp thụ và huỳnh quang của chất màu RB tự do trong nước, tuy nhiên có sự dịch nhẹ của đỉnh phổ về phía sóng dài. Chứng tỏ có sự tương tác giữa tâm màu và mạng nền, tuy nhiên tương tác này là yếu, không làm ảnh hưởng đến tính chất quang của chất màu.

Từ phổ hấp thụ và huỳnh quang, các thông số và các đặc trưng quang học của tâm màu RB trong các hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau được tính toán : Hiệu suất lượng tử, thời gian sống phát quang, tốc độ hồi phục bức xạ và không bức xạ,… 3.1.2.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang

Hiệu suất lượng tử (HSLT) Q và thời gian sống phát quang (TGSPQ) τ của dãy mẫu này đều tăng so với phân tử RB tự do trong nước. Các số liệu cũng cho thấy HSLT tăng chủ yếu do tốc độ HPBX Γr tăng và TGSPQ τ tăng chủ yếu do tốc độ HPKBX Γnr giảm (Hình 3.10). Các kết quả này phù hợp với quy luật của phân tử màu trong các môi trường lỏng, chứng tỏ các nhóm chức không ảnh hưởng mạnh tới tính chất quang của các phân tử màu trong hạt.

9

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

Thêi

gia

n sè

ng p

ht q

uang

VËn tèc håi phôc kh«ng bøc x¹

0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50

0.22

0.24

0.26

0.28

0.30

0.32

0.34

HiÖ

u su

Êt l­

îng

tö Q

Q Fit line

Hình 3.10. Mối liên hệ giữa TGSPQ và tốc độ HPKBX; HSLT và Γr/Γnr

3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương pháp micelle thuận

Phổ hấp thụ và huỳnh quang của các mẫu hạt nano silica chứa chất màu RB có dạng giống với phổ hấp thụ và huỳnh quang của chất màu RB tự do trong nước nhưng đỉnh phổ hấp thụ dịch từ 1 nm đến 6 nm và đỉnh phổ huỳnh quang dịch từ 4 nm đến 10 nm về phía sóng dài. Sự dịch đỉnh này chứng tỏ sự tương tác của chất màu RB với nền silica là yếu, không ảnh hưởng nhiều đến tính chất quang của chất màu RB trong hạt nano.

Từ các thông số của mẫu như phổ hấp thụ, huỳnh quang, số phân tử màu trong một hạt nano, độ chói... đã được khảo sát Các kết quả cho thấy: (i) Với cùng một độ hấp thụ, nghĩa là số phân tử tâm màu được kích thích là như nhau trong tất cả các mẫu được khảo sát thì cường độ huỳnh quang của các mẫu hạt nano đều cao hơn cường độ huỳnh quang của phân tử RB tự do trong nước. Có nghĩa là hiệu suất phát quang của các phân tử màu trong hạt nano cao hơn hiệu suất phát quang của các phân tử màu RB tự do trong nước. Hiện tượng tăng cường cường độ huỳnh quang này được giải thích là do trong nền silica, các phân tử màu được phân bố trong các lỗ xốp do đó giảm thiểu được hiện tượng dập tắt huỳnh quang do va chạm và phân hủy quang do tương tác với oxy. Cần nói thêm là độ hấp thụ và cường độ huỳnh

Γr/Γnr

10

quang được đo ở nồng độ 5.10-5 mol/l đối với phân tử RB tự do trong nước, và nồng độ ~10-2 mol/l đối với các phân tử RB trong các hạt nano. Đối với chất màu RB tự do trong dung môi thì hiện tượng dập tắt huỳnh quang do nồng độ bắt đầu xuất hiện khi nồng độ ~ 10-4 mol/l và huỳnh quang bị dập tắt gần như hoàn toàn ở khoảng nồng độ ~ 10-2 mol/l. (ii) Từ các giá trị của HSLT Q và TGSPQ τ của các hạt nano silica với các kích thước khác nhau, tốc độ hồi phục bức xạ (HPBX) Γr và không bức xạ (HPKBX) Γnr đã được tính toán cho các mẫu. Các kết quả cũng cho thấy HSLT và TGSPQ của phân tử RB trong các hạt nano đều cao hơn của RB trong nước. HSLT tăng do sự tăng của thời gian sống τ và tốc độ HPBX Γr.

400 450 500 550 600 650 7000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

§é

hÊp

thô

chuÈ

n hã

a

B­íc sãng (nm)

1:2SBO20 2:4SBO30 3:5SBO40 4:6SBO60 5:Rb/H2O

550 600 650 700

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g ch

uÈn

hãa

B­íc sãng (nm)

1:2SBO20 2:4SBO30 3:5SBO40 4:6SBO60 5:RB/H2O

Hình 3.13 và 3.14. Phổ hấp thụ và huỳnh quang chuẩn hóa của mẫu hạt nano silica với các kích thước khác nhau

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

Thêi

gia

n sè

ng p

ht q

uang

(ns)

VËn tèc HPKBX (x108s-1) 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0.28

0.32

0.36

0.40

0.44

HiÖ

u su

Êt l­

îng

tö

HSLT Q Fit line

Hình 3.16. Mối liên hệ giữa TGSPQ và tốc độ HPKBX; HSLT và Γr/Γnr

Có thể kể ra các nguyên nhân gây ra HPKBX của các phân tử RB:

Γr/Γnr

11

- Do va chạm giữa các phân tử màu. Kênh này được giảm thiểu khi phân tử màu được nằm trong lỗ xốp của nền silica.

- Do tương tác với môi trường xung quanh. Nếu môi trường xung quanh là nước thì huỳnh quang sẽ bị mất do phân tử màu tương tác với oxy tự do trong nước trên trạng thái triplet. Nền silica chứa rất ít oxy tự do, ít hơn 3 bậc so với trong nước, do đó hồi phục không bức xạ qua kênh này sẽ giảm hẳn khi đưa phân tử màu vào nền silica. Mặt khác, trên bề mặt các lỗ xốp có các nhóm -OH, nếu phân tử RB tương tác mạnh với nền silica thì hồi phục không bức xạ cũng có thể tăng do phản ứng với nhóm -OH. Phân tích trên cho thấy, tính chất quang (HSLT và TGSPQ) của các mẫu càng cao nếu tương tác giữa chất màu RB và nền là yếu, và ngược lại.

3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) và streptavidin (SA)

Để bảo vệ hạt cũng như tạo các nhóm chức năng tương thích sinh học, hạt nano silica chứa tâm màu đã được bọc protein BSA và SA, các kết quả khảo sát tính chất quang cho thấy, lớp bọc protein không ảnh hưởng đến tính chất quang của tâm màu trong hạt. Đồng thời luận án cũng đã trình bày kết quả khảo sát lượng BSA và SA đủ để bọc lên hạt.

Với hạt có kích thước 100–110 nm, nồng độ 7.1012 hạt/ml thì lượng BSA đủ để bọc lên hạt là 1,0–1,2 mg/ml. Lượng BSA > 1,2 mg/ml sẽ gây ra sự dư thừa BSA ảnh hưởng tới độ đồng nhất quang học của dung dịch. Số liệu BSA này chỉ đúng với một loại hạt với kích thước và nồng độ cụ thể.

3.4. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo

3.4.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với APTES.

Kết quả đo phổ hấp thụ của dung dịch FITC@APTES với lượng

12

ethanol khác nhau cho thấy, khi tăng lượng ethanol thì độ hấp thụ tăng. Phổ hấp thụ chuẩn hóa cho thấy, dạng phổ của FITC@APTES không thay đổi khi lượng ethanol tăng. Có thể thấy rằng, số phân tử hợp chất FITC@APTES tăng tỷ lệ thuận với lượng ethanol khi lượng này còn thấp và tiến tới bão hòa khi lượng ethanol đạt 7 thể tích. Các dung dịch FITC@APTES của thí nghiệm trên được đánh số theo thể tích ethanol lần lượt là: FITC@APTES1, FITC@APTES3, FITC@APTES5, FITC@APTES7 và FITC@APTES10.

400 450 500 550 600 650 7000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

§é

hÊp

thô

(®vt

y)

B­íc sãng (nm)

FITC@APTES1 FITC@APTES3 FITC@APTES5 FITC@APTES7 FITC@APTES10 FITC/Ethanol

0 2 4 6 8 10

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

§é

hÊp

thô

cña

FITC

@A

PTES

L­îng ethanol

Hình 3.27. Phổ hấp thụ của chất màu FITC tự do và FITC@APTES. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ của FITC@APTES vào lượng ethanol

Khi lượng ethanol tăng, chỉ số PdI của dung dịch hạt nano silica tăng. Khi lượng ethanol tăng lên bằng 7 thì bắt đầu có hiện tượng kết đám, với lượng ethanol bằng 10 thì không tạo được các hạt riêng rẽ mà thành các đám. Hiện tượng này được giải thích là khi lượng ethanol tăng lên thì lượng nước còn dư trong dung dịch chứa hợp chất FITC@APTES cũng tăng lên, tốc độ phản ứng thủy phân và ngưng tụ tăng dẫn đến kích thước hạt lớn, đồng thời làm tăng các phản ứng giữa các phân tử precursor của một loại để hình thành các hạt nhỏ, các hạt này sẽ dính vào nhau tạo thành các đám mà không được phân tán riêng rẽ. Do đó, để chế tạo được các hạt nano với kích thước mong muốn với chất lượng tốt thì phải hạn chế lượng nước trong dung dịch FITC@APTES. Chính vì thế, chúng tôi lựa chọn mẫu dung dịch

13

FITC@APTES với lượng ethanol thấp nhất (FITC pha bão hòa trong ethanol) để chế tạo hạt nano silica chứa FITC.

3.4.2. Tính chất quang

Phổ hấp thụ và huỳnh quang chuẩn hóa của phân tử FITC tự do, hợp chất FITC@APTES trong ethanol và trong các hạt nano silica được trình bày trên Hình 3.29 và 3.30.

400 450 500 550 600 650 700

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

§é

hÊp

thô

chuÈ

n hã

a

B­íc sãng (nm)

FITC_ethanol FITC@APTES SiO2@FITC

500 550 600 650 7000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g ch

uÈn

hãa

B­íc sãng (nm)

FITC-ethanol SiO2 @FITC

Hình 3.29 và 3.30. Phổ hấp thụ và huỳnh quang chuẩn hóa của phân tử FITC tự do, hợp chất FITC@APTES trong ethanol và FITC trong các hạt nano silica

Hình 3.29 cho thấy dạng phổ hấp thụ của phân tử FITC trong hạt silica khác với trong liên kết FITC@APTES và càng khác với phân tử FITC tự do trong ethanol. Điều này là do liên kết FITC@APTES làm biến đổi phân tử FITC. Hơn nữa, liên kết FITC@APTES được đưa vào hạt silica dưới vai trò một precursor tham gia vào quá trình đồng trùng hợp để tạo mạng nền Si-O-Si-FITC. Phân tử FITC trở thành một thành phần của mạng nền SiO2. Vì vậy, tương tác giữa phân tử FITC và nền trong trường hợp này là tương tác mạnh, làm biến đổi cấu trúc hóa học cũng như cấu trúc không gian của phân tử FITC, dẫn tới làm thay đổi dạng phổ hấp thụ.

Phổ huỳnh quang của phân tử FITC trong hạt silica và trong ethanol được trình bày trong Hình 3.30 Có thể thấy ngay rằng dạng của hai phổ là giống nhau với sự mở rộng và dịch đỉnh nhẹ về phía sóng dài của phổ trong

14

nền silica. Điều này cho thấy rằng, tương tác mạnh giữa phân tử FITC và nền silica đã không ảnh hưởng tới tính chất phát quang của phân tử này, chứng tỏ tính hiệu quả của phương pháp chế tạo.

Khảo sát lượng ethanol tối ưu để phản ứng với FITC cho thấy mẫu FITC@APTES7 có cường độ phát quang cao nhất, sau đó là mẫu FITC@APTES1, rồi tới các thành phần khác. Tuy nhiên, như đã trình bày ở trên, mẫu FITC@APTES7 kích thước lớn và không đơn phân tán. Như vậy, việc sử dụng hợp chất FITC@APTES1 cho hạt vừa có chất lượng quang tốt, vừa có hình thái học tốt.

3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober

Cùng với việc chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC theo phương pháp micelle đảo, chúng tôi cũng tiến hành chế tạo và khảo sát hình thái, các tính chất quang của các hạt nano silica chứa tâm màu FITC theo phương pháp Stober

3.5.1. Tính chất quang

Phổ hấp thụ và hấp thụ chuẩn hóa của phân tử màu FITC trong các hạt nano silica được chế tạo theo phương pháp Stober cho thấy phổ hấp thụ có dạng giống như trong hạt silica chế tạo bằng phương pháp micelle đảo, chứng tỏ sự giống nhau của mạng nền SiO2 của hai phương pháp chế tạo.

400 420 440 460 480 500 520 540 5600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

§é

hÊp

thô

(®vt

y)

B­íc sãng (nm)

ST900 ST1000 ST1100 ST1200 FITC@APTES

400 450 500 550

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

§é

hÊp

thô

chuÈ

n hã

a

B­íc sãng (nm)

ST900 ST1000 ST1100 ST1200 FITC@APTES

Hình 3.33. Phổ hấp thụ và hấp thụ chuẩn hóa của hợp chất FITC@APTES trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau

15

Phổ huỳnh quang chuẩn hóa (Hình 3.34) cho thấy, dạng phổ huỳnh quang của các phân tử màu FITC trong các hạt nano giống của phân tử màu FITC tự do trong ethanol, tuy nhiên đỉnh phổ dịch từ 6 – 11 nm về phía sóng ngắn so với của các phân tử FITC tự do trong ethanol.

500 520 540 560 580 600 620 6400

200

400

600

800

1000

ST900 ST1000 ST1100 ST1200 FITC@APTES

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g (®

vty)

B­íc sãng (nm) 500 520 540 560 580 600 620 640

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g ch

uÈn

hãa

B­íc sãng (nm)

ST900 ST1000 ST1100 ST1200 FITC-Ethanol

Hình 3.34. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau

Từ các kết quả trên có thể khẳng định rằng sử dụng phương pháp Stober để chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC đã cho kết quả tốt.

3.5.2. Chức năng hóa

Trong khuôn khổ luận án, chúng tôi chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng các nhóm chức amine NH2 và carboxyl COOH là hai nhóm chức rất thông dụng trong các cấu trúc của phân tử sinh học.

3.5.2.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH2

Các mẫu sau khi chức năng hóa được phân tán trong môi trường Tris và nước.

Các kết quả đo DLS và thế Zeta cho thấy các hạt trước và sau khi chức năng hóa đều có chỉ số PdI rất thấp, chứng tỏ các hạt rất đơn phân tán. Hạt nano silica trước và sau khi chức năng hóa với nhóm chức NH2 có đường kính thủy động học là 83 nm và 109 nm chứng tỏ đã có một lớp APTES được phủ lên hạt. Đồng thời thế Zeta tăng từ -11,2 mV lên -0,8 mV. Chứng tỏ một phần OH đã được thay thế bằng nhóm chức NH2 (tồn tại dưới dạng

16

ion NH3+) làm cho thế Zeta dương lên. Các kết quả này cho thấy trên bề mặt hạt đã có các nhóm chức NH2.

Bảng 3.10: Kết quả đo DLS và thế Zeta của các hạt nano silica có nhóm chức NH2 được chế tạo bằng phương pháp Stober

Mẫu Kích thước TEM (nm)

Các thông số DLS Thế Zeta

(mV) Đường kính

thủy động học (nm)

PdI

ST1000 70 83 0,003 -11,2

ST1000NH2 - 109 0,044 -0,8

Một trong các tiêu chí để hạt có thể sử dụng trong thực tế là tính ổn định theo thời gian. Vì vậy, sau 3 tháng chúng tôi đã kiểm tra lại các mẫu trên và thấy mẫu hạt bảo quản trong môi trường nước bị kết tụ thành đám lớn, mắt thường nhìn thấy nên không đo DLS. Mẫu bảo quản trong môi trường Tris được đo DLS để kiểm tra xem có bị kết đám hay không. Kết quả được đưa trên Bảng 3.10.

Bảng 3.11: Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm chức NH2

Mẫu Các thông số DLS

Ghi chú Đường kính thủy

động học (nm) PdI

ST1000NH2 (Tris) 133 0,056 Sau 03 tháng

Các kết quả cho thấy, chỉ số PdI của mẫu sau 3 tháng chế tạo vẫn giữ ở mức rất thấp (0,056) chứng tỏ các mẫu vẫn rất đơn phân tán, có nghĩa là các

17

hạt được bảo quản tốt trong môi trường Tris. Có thể giải thích việc này như sau: Tris là một loại amine bậc một, cấu tạo phân tử gồm một nhóm NH3

+ và 3 nhóm OH trong nước. Các nhóm này đã giúp cân bằng điện tích trên bề mặt hạt silica cũng gồm các nhóm OH- và NH3

+, làm cho các hạt ổn định không bị kết tụ.

3.5.2.2. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH

Luận án cũng đã trình bày các kết quả chức năng hóa hạt nano silica với nhóm chức COOH trên bề mặt hạt. Khi lượng precursor C3H6Na2O5Si (DDOS) được sử dụng để trùng hợp liên tiếp lên bề mặt hạt tăng thì thế Zeta của mẫu hạt cũng tăng lên, hạt được chức năng hóa đến khi thế Zeta của hạt đạt đến giá trị làm cho mẫu hạt ổn định và đơn phân tán trong môi trường (ς > 30 mV).

CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH

DẤU SINH HỌC

4.1. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

4.1.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy các vi khuẩn E. coli

O157:H7 sau khi gắn kết với phức hệ SiO2RB@KT phát quang mạnh (những điểm sáng đỏ - vàng, Hình 4.1.b). Hình 4.1.c cho thấy các hạt nano silica bám đều trên bề mặt vi khuẩn Từ những ảnh cắt lớp tế bào vi khuẩn (Hình 4.1.d) cho ta thấy hạt silica chỉ bám trên bề mặt vi khuẩn đích mà không ở trong vi khuẩn, ảnh lớn cho thấy trên các thành vi khuẩn tín hiệu huỳnh quang phát rất mạnh, bên trong vi khuẩn, hầu như không thấy tín hiệu huỳnh quang, trong khi ảnh chụp trên bề mặt vi khuẩn (ảnh nhỏ) thì tín

18

hiệu phát rất mạnh. Như vậy phức hệ SiO2RB@KT chỉ gắn trên bề mặt thành tế bào theo nguyên lý miễn dịch (kháng nguyên – kháng thể) với tỷ lệ khá cao.

Hình 4.1. Hình ảnh các tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7

4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi khuẩn E. coli O157:H7

Để xác định định lượng vi khuẩn E. coli O157:H7, vi khuẩn đã được gắn kết với phức hệ hạt nano silica – kháng thể, sau đó được khảo sát phổ huỳnh quang. Từ phổ huỳnh quang của các vi khuẩn với nồng độ khác nhau được đánh dấu bằng phức hệ SiO2RB@KT (Hình 4.3a) ta dựng được đường

a

b)

c

__

d

19

chuẩn sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của hạt nano vào nồng độ vi khuẩn có trong mẫu. Kết quả cho thấy cường độ huỳnh quang tỷ lệ tuyến tính với số lượng vi khuẩn (Hình 4.3b), phương trình của đường fit có dạng: Y = 0,008.X.

550 600 650 700 7500

20

40

60

80

100

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g (®

vty)

B­íc sãng (nm)

1.0x104CFU 7.5x103CFU 5.0x103CFU 2.5x103CFU 1.0x103CFU 7.5x102CFU 5.0x102CFU 2.5x102CFU

0.00 2.50x103 5.00x103 7.50x103 1.00x1040

20

40

60

80

100

C­ê

ng ®

é hu

únh

quan

g (®

vty)

Sè l­îng vi khuÈn (CFU)

Hình 4.3. a) Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 với nồng độ khác nhau đánh dấu bằng phức hệ SiO2RB@KT. b) Cường độ huỳnh quang theo số lượng vi khuẩn (đường màu đỏ) và đường fit (màu xanh, Y = 0,008.X)

Kết quả này được so sánh với phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, kết quả cho thấy mối tương quan cao giữa hai phương pháp (Hình 4.4). Như vậy có thể sử dụng phương pháp phổ huỳnh quang để phát hiện và định lượng vi khuẩn.

20

0.0

3.0x104

6.0x104

9.0x104

Sè l­

îng

vi k

huÈn

(CFU

)

Ph­¬ng ph¸p ®Õm Ph­¬ng ph¸p phæ huúnh quang

Hình 4.4. So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp

đếm khuẩn lạc (trái) và phương pháp phổ huỳnh quang (phải)

4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú 4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang

Ảnh huỳnh quang của tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiO2RB@HER2 (Hình 4.5.A) và với SiO2RB@BSA (Hình 4.5.B). Trên ảnh hiển vi huỳnh quang (Hình 4.5.A) chúng ta có thể thấy các hạt silica (màu đỏ) tập trung trên cả màng và vùng xung quanh nhân của tế bào KPL4. Kiểm tra khả năng bám không đặc hiệu lên bề mặt màng tế bào hay không, mẫu đối chứng là hạt SiO2RB@BSA (chỉ có nano silica bọc BSA, không có kháng thể) được ủ với tế bào KPL4, kết quả cho thấy (Hình 4.5.B) gần như không có silica bám trên tế bào KPL4, nghĩa là các hạt SiO2RB@BSA tự do không có khả năng gắn lên màng tế bào.

21

Hình 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiO2RB@HER2 (A) và với SiO2RB@BSA (B)

4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào Sau khi tiến hành nhuộm với kháng thể phù hợp theo bố trí thí nghiệm,

chúng tôi tiến hành đếm tế bào trên máy flow cytometer FACS Canto (BD). Đầu tiên, tiến hành chạy mẫu đối chứng chứa hai loại tế bào HeLa và

KPL4 với tỷ lệ 1:1 không ủ hoặc ủ với hạt nano silica SiO2RB@BSA, không có kháng thể. Kết quả cho thấy hình dạng hai đồ thị giống nhau và có đỉnh phổ huỳnh quang ở khoảng 2,5.103, đây được coi là đường nền. Tiếp theo, các kết quả thí nghiệm đếm tế bào với mẫu chứa hai loại tế bào HeLa và KPL4 với tỷ lệ 1:1 và 5:1 Kết quả cho thấy: với mẫu khảo sát với tỷ lệ Hela:KPL4 là 1:1, kết quả trên hình cho hai quần thể, quần thể thứ nhất là các tế bào không phát huỳnh quang (HeLa) được thể hiện bằng đỉnh có cường độ ở khoảng 3,0.103, quần thể thứ 2 gồm các tế bào phát huỳnh quang (KPL4) thể hiện qua đỉnh có cường độ ở khoảng 2,0.104. Kết quả khảo sát với tỷ lệ Hela:KPL4 là 5:1, kết quả trên hình cho thấy quần thể thứ nhất là các tế bào không phát huỳnh quang (HeLa) được thể hiện bằng đỉnh có cường độ ở khoảng 2,5.103, quần thể thứ 2 gồm các tế bào phát huỳnh quang (KPL4) thể

22

hiện qua đỉnh có cường độ ở khoảng 6,0.103.Từ những kết quả thu được, chúng ta có thể khẳng định phức hệ SiO2RB@HER2 có khả năng nhận biết đặc hiệu tế bào KPL4 trong hỗn hợp với tế bào HeLa dù với tỉ lệ tế bào KPL4 thấp.

Hình 4.11 và 4.12. Đếm tế bào KPL4 trong hỗn hợp tế bào Hela và KPL4 với tỷ lệ HeLa:KPL4= 1:1 và 5:1

KẾT LUẬN Luận án đã trình bày các phương pháp chế tạo và chức năng hóa hạt

nano silica chứa tâm màu hữu cơ. Khảo sát các tính chất quang của tâm màu trong các hạt nano. Ứng dụng các hạt nano trong nhận biết các phần tử sinh học. Các kết quả nghiên cứu đã đạt được và những đóng góp mới của luận án được tóm tắt như sau:

A. Chế tạo 1. Chế tạo các hạt nano silica với kích thước từ 20 – 80 nm phân tán

trong nước bằng phương pháp micelle thuận với các nhóm chức năng tương thích sinh học: NH2, SH, COOH và lớp bọc protein BSA và Streptavidin.

2. Chế tạo các hạt nano silica đơn phân tán có kích thước 40 – 100 nm chứa tâm màu FITC bằng phương pháp micelle đảo và Stober. Các hạt này đã được chức năng hóa với các nhóm NH2 và COOH bằng phương pháp

23

đồng trùng hợp với các precursor thích hợp. Các khảo sát cho thấy hạt nano được chức năng hóa bằng nhóm amine NH2 ổn định rất tốt trong Tris (PdI < 0,1) trong thời gian 3 tháng.

B. Tính chất quang 1. Tương tác giữa các phân tử RB với nền silica là tương tác yếu.

Tương tác giữa phân tử FITC với nền silica là tương tác mạnh làm biến đổi dạng phổ hấp thụ của phân tử này. Tuy nhiên, khảo sát dạng phổ huỳnh quang cho thấy cả hai tương tác đó đều không ảnh hưởng đến tính chất quang của các phân tử màu nghiên cứu. Các nhóm chức năng và lớp bọc protein BSA và SA không ảnh hưởng tới tính chất quang của các phân tử RB và FITC trong hạt.

2. Nghiên cứu các tính chất quang lý của phân tử RB trong nền silica cho thấy: Các phân tử RB trong hạt silica đều có hiệu suất lượng tử Q lớn hơn và thời gian sống phát quang τ dài hơn khi tự do trong nước do giảm thiểu dập tắt huỳnh quang do va chạm và tương tác với môi trường xung quanh. Hiệu suất lượng tử phụ thuộc vào tương tác của tâm màu với nền silica và tương tác giữa các hạt nano. Hiệu suất lượng tử tăng chủ yếu do sự tăng của vận tốc hồi phục bức xạ Γr và thời gian sống phát quang τ tăng chủ yếu do sự giảm của vận tốc hồi phục không bức xạ Γnr.

C. Ứng dụng 1. Đã chế tạo thành công các phức hệ hạt nano silica chứa tâm màu RB

và FITC - kháng thể đơn dòng đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 và tế bào ung thư vú HER2 (SiO2RB@KT, SiO2RB@HER2, SiO2FITC@HER2).

2. Sử dụng các phức hệ SiO2RB@KT, SiO2RB@HER2, SiO2FITC@HER2 để nhận biết đặc hiệu tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 và tế bào ung thư vú KPL4 và BT-474 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang.

24

3. Sử dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang để xây dựng phương pháp xác định số lượng vi khuẩn đích E. coli O157:H7.

4. Nghiên cứu mối tương quan giữa số lượng tế bào với cường độ huỳnh quang để rút ra khả năng phát hiện tế bào đích ung thư vú của phức hệ SiO2RB@HER2 bằng phương pháp đếm tế bào trong dòng chảy.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 1. Tống Kim Thuần, Trần Hồng Nhung, Trần Thanh Thủy, Phạm

Công Hoạt, Phạm Minh Tân, Jean Claude Brochon, Patrick Tauc, Nguyễn Thị Thanh Ngân, “Ứng dụng các hạt nano phát quang vào việc đánh dấu tế bào để phát hiện và giám sát các loại vi sinh vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học (2009), 7(4): 513-519.

2. Phạm Minh Tân, Trần Thu Trang, Trần Thanh Thủy, Nghiêm Thị Hà Liên, Vũ Thị Thùy Dương, Tống Kim Thuần và Trần Hồng Nhung, “Chế tạo, nghiên cứu tính chất quang của hạt nano ormosil chứa tâm màu có các nhóm chức năng và ứng dụng đánh dấu sinh học”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên (2012), 96(08), 59-67.

3. Minh Tan Pham, Thi Van Nguyen, Thuy Duong Vu Thi, Ha Lien Nghiem Thi, Kim Thuan Tong, Thanh Thuy Tran, Viet Ha Chu, Jean-Claude Brochon and Hong Nhung Tran, “Synthesis, photophysical properties and application of dye doped water soluble silica-based nanoparticles to label bacteria E.coli O157:H7”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, IOP Publishing, 3 (2012) 045013.

4. Hong Nhung Tran, Thi Ha Lien Nghiem, Thi Thuy Duong Vu, Minh Tan Pham, Thi Van Nguyen, Thu Trang Tran, Viet Ha Chu, Kim Thuan Tong, Thanh Thuy Tran, Thi Thanh Xuan Le, Jean-Claude Brochon, Thi Quy Nguyen, My Nhung Hoang, Cao Nguyen Duong, Thi Thuy Nguyen, Anh Tuan Hoang and Phuong Hoa Nguyen, “Dye-doped silica-

25

based nanoparticles forbioapplications, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology”, IOP Publishing, 4 (2013) 043001.

5. Hong Nhung Tran, Thi Ha Lien Nghiem, Thi Thuy Duong Vu, Viet Ha Chu, Quang Huan Le, Thi My Nhung Hoang, Lai Thanh Nguyen, Duc Minh Pham, Kim Thuan Tong, Quang Hoa Do, Duong Vu, Trong Nghia Nguyen, Minh Tan Pham, Cao Nguyen Duong, Thanh Thuy Tran, Van Son Vu, Thi Thuy Nguyen, Thi Bich Ngoc Nguyen, Anh Duc Tran, Thi Thuong Trinh and Thi Thai An Nguyen, “Optical nanoparticles: synthesis and biomedical application”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, IOP Publishing, 6 (2015) 023002.