LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABORATORIJA

ALINA KONDRATOVIČ

VARFARINO FARMAKOGENETIKA: CYP4F2 RS1558139

GENOTIPO SVARBA DOZUOJANT VARFARINĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

dr. Vacis Tatarūnas

KAUNAS, 2016

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas

Prof.dr. Vitalis Briedis

Data

VARFARINO FARMAKOGENETIKA: CYP4F2 RS1558139 GENOTIPO

SVARBA DOZUOJANT VARFARINĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

dr.Vacis Tatarūnas

Data

Recenzentas

Data

Darbą atliko

Magistrantė

Alina Kondratovič

Data

KAUNAS, 2016

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 6

SANTRUMPOS ....................................................................................................................................... 7

ĮVADAS ................................................................................................................................................... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ..................................................................................................... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ...................................................................................................... 10

1.2. Varfarinas .................................................................................................................................... 10

1.2.1. Varfarino veikimo mechanizmas ir metabolizmas ............................................................... 11

1.2.2. Tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) rodiklio įtaka varfarino dozei .......................... 13

1.2.3. Klinikinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui ........................................................... 14

1.2.4. Genetinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui ........................................................... 15

1.3. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo principo panaudojimas genų

polimorfizmo nustatymui ................................................................................................................... 16

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ......................................................................................... 18

2.1. Tyrimo organizavimas ............................................................................................................. 18

2.2. Tyrimo objektas ....................................................................................................................... 18

2.3. Mėginių imties parinkimas ...................................................................................................... 19

2.4. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcija .......................................................................... 20

2.4.1. Mėginio paruošimas ......................................................................................................... 20

2.5. Statistinės analizės metodai ..................................................................................................... 23

3. REZULTATAI ............................................................................................................................... 24

3.1. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amžių ir lytį .......................................................................... 24

3.2. Amiodarono vartojimo įtaka varfarino dozavimui įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu ....... 24

3.3. Genotipų įtaka varfarino dozavimui ........................................................................................ 25

3.3.1. CYP2C9 įtaka dozuojant varfariną .................................................................................. 25

3.3.2. VKORC1 įtaka varfarino dozavimui ................................................................................ 27

4

3.3.3. CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozavimui ................................................................ 28

4. REZULTATŲ APTARIMAS ........................................................................................................ 29

5. IŠVADOS ....................................................................................................................................... 31

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ............................................................................................. 31

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS .......................................................................................................... 32

8. PRIEDAI ........................................................................................................................................ 37

8.1. LSMU KI MKL taikoma DNR ekstrakcijos metodika ............................................................ 37

8.2. Magistro baigiamojo darbo rezultatų pristatymas tarptautinėje mokslinėje konferencijoje.... 40

5

SANTRAUKA

A.Kondratovič magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Vacis Tatarūnas; Lietuvos

sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorija. – Kaunas.

Pavadinimas: Varfarino farmakogenetika: CYP4F2 rs1558139 genotipo svarba dozuojant

varfariną.

Tyrimo tikslas: Išsiaiškinti, kokią įtaką daro klinikiniai ir genetiniai faktoriai varfarino

dozavimuivartojimo pradžioje ir ilgalaikio gydymo metu ligoniams po širdies vožtuvų operacijos.

Tyrimo uždaviniai: 1. Įvertinti, kokią įtaką amiodarono vartojimas daro varfarino dozavimui

po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu. 2. Ištirti CYP2C9 ir VKORC1

polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo

metu. 3. Ištirti CYP4F2 rs1558139 polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies vožtuvų

operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.

Tyrimo objektas ir metodai: Šiame tyrime dalyvavo 91 pacientas, kuriam buvo pasiekta ir

mažiausiai 2 palaikyta stabili varfarino dozė, reikalinga normaliam TNS rodikliui (2 – 3,5), iki išrašant

pacientus iš ligoninės. Iš viso 72 pacientai, vartoję varfariną mažiausiai 3 mėnesius, dalyvavo

tolesniame tyrime. 38 (52,8 %) pacientai buvo vyrai ir 34 (47,2 %) moterys. DNR ekstrakcija, DNR

kokybės įvertinimas ir tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (TL-PGR) buvo atlikta Lietuvos

sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje.

Genotipų paplitimas yra išreikštas % (procentais). Varfarino dozė yra pateikta kaip vidurkis ±SD

(standartinis nuokrypis). p<0,05 reikšmė buvo laikoma statistiškai reikšminga.

Rezultatai:Vyrai (60,7±12,8) buvo jaunesni nei moterys (67,2±9,2, p=0,01). Amiodarono

nevartojantiems pacientams (87,5%) reikėjo mažesnės varfarino dozės ilgalaikio gydymo metu

(5,2±1,9 mg), nei išrašant juos iš ligoninės(6,1±2,8 mg, p=0,05). Hospitalizavimo metu 26 (36,1%)

pacientai vartojo amiodaroną, o ilgalaikio gydymo metu – tik 9 pacientai (12,5%).Nebuvo pastebėta

ženklaus poveikio varfarino dozei pacientams, turintiems CYP2C9*2, CYP2C9*3 ir VKORC1

C1173T genotipus. Buvo pastebėtas varfarino dozės sumažėjimas pacientams, turintiems CYP4F2

rs1558139 G/G genotipą (nuo 6,3±2,9 mg iki 4,9±2,0 mg, p=0,07). Nebuvo nustatyta daugiau faktorių,

turinčių įtakos nuolatiniam varfarino vartojimui indukcijos ir ilgalaikio gydymo metu.

Išvados: 1. Ilgalaikio gydymo metu tiek amiodarono nevartojantiems pacientams, tiek ir jį

vartojusiems, varfarino dozės reikšmingai sumažėjo, palyginus su išrašymo iš ligoninės metu

vartotomis varfarino dozėmis. 2. CYP2C9 *1/*1 (*2 alelis), taip pat kaip ir VKORC1 C1173C

genotipą, turintiems pacientams reikėjo reikšmingai didesnių varfarino dozių, nei kitokį genotipą

turintiems ligoniams. 3. Mažesnių varfarino dozių reikėjo CYP4F2 rs1558139 G/G genotipą turintiems

ilgalaikio gydymo metu, nei įsotinant.

6

SUMMARY

A. Kondratovič final master‘s thesis/ research supervisor dr. Vacis Tatarūnas; Lithuanian

University of Health Sciences, Institute of Cardiology, Laboratory of Molecular Cardiology – Kaunas.

Title: Pharmacogenetics of warfarin: the impact of CYP4F2 rs1558139 genotype on warfarin

dosage.

The aim of the study: To show the influence of clinical and genetic factors on warfarin

dosage during induction and long-term treatment in patients who followed heart valve surgery.

The objectives of the study: 1. To determine the impact of amiodarone usage on warfarin

dosage after heart valve surgery during induction and long-term treatment. 2. To evaluate the influence

of CYPC9 and VKORC1 genetic polymorphism on warfarin dosage after heart valve surgery durint

induction and long-term treatment. 3. To determine the impact of CYP4F2 rs1558139 gene

polymorphism on warfarin dosage after heart valve surgery durint induction and long-term treatment.

Objects ant methods: This study involved 91 patient who reached stable warfarin dosage

(the therapeutic range of INR (from 2 to 3.5) was achieved and maintained for two days of treatment)

during discharge from the hospital. Totally 72 patients, who used warfarin for at least 3 months, were

included into the further study. Study involved 38 (52.8 %) men and 34 (47.2 %) women. DNA

extraction, DNA quality assessment and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) were

performed at the laboratory of Molecular Cardiology of LUHS.Prevalence of genotypes is presented in

% (percent). Warfarin dosage is presented as mean ±SD. A p value<0.05 was considered as significant.

Results: Men (60.7±12.8) were younger than women (67.2±9.2, p=0.01). Amiodarone non-

users (87.5%) required lower warfarin dosages during long-term treatment (LTT) – (5.2±1.9 mg) than

during discharge from the hospital - (6.1±2.8 mg, p=0.05). During hospitalization, 26 patients (36.1%)

received amiodarone therapy. During LTT it was used by only 9 patients (12.5%). No significant effect

on warfarin dosage was determined in carriers of CYP2C9*2, CYP2C9*3 and VKORC1 C1173T

genotypes. The tendency in decrease of warfarin dosage was observed in patients, carrying CYP4F2

rs1558139 G/G genotype (from 6.3±2.9 mg to 4.9±2.0 mg, p=0,07). No other factors were identified to

have an impact on daily warfarin dosage during induction and during LTT.

Conclusions: 1. Both amiodarone users and non-users required significantly lower warfarin

dosages during long-term treatment than compared to warfarin dosages during induction. 2. The

patients carrying CYP2C9 *1/*1 and VKORC1 C1173C genotypes required significantly higher

warfarin dosages than other genotypes carriers. 3. The patients carrying CYP4F2 rs1558139 G/G

genotipe required significantly lower warfarin dasages during long-term treatment than during

induction.

7

SANTRUMPOS

KH2 – vitamino K redukuota forma;

CYP2C9 – citochromo P450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 9 polipeptidas;

VKORC1 – vitamino K oksidreduktazės komplekso 1-as subvienetas;

CYP4F2 – citochromo P450 superšeimos 4 šeimos F pošeimio 2 polipeptidas;

DNR – deoksiribonukleorūgštis;

PGR – polimerazės grandininė reakcija;

TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (angl. Real-time polymerase chain reaction –

RT-PCR);

MKL – molekulinės kardiologijos laboratorija;

Ph. Eur. – Europos farmakopėja;

ŽLA – žmogaus leukocitų antigenas (anlg. Human leukocyte antigen – HLA);

TNS – tarptautinis normalizuotas santykis (angl. International normalized ratio – INR);

RM – reakcijos mišinys;

8

ĮVADAS

Kraujo krešėjimas – tai viena svarbiausių apsauginių organizmo funkcijų, mechaninio

pažeidimo atveju suformuojanti kraujo krešulį ir taip apsaugant nuo nukraujavimo. Ši funkcija pirmąjį

kartą buvo paminėta Hipokrato, apie 460-377 metus prieš Kristų [1]. Plačiau kraujo krešėjimas

pradėtas nagrinėti XX amžiaus pradžioje, o XX a. antroje pusėje buvo sukurtas „kaskadų“ modelis,

paaiškinantis kraujo krešėjimo mechanizmą [2,3].

Itin svarbią vietą tarp šių dienų susirgimų užima kraujo krešėjimo sutrikimas – padidėjusi

kraujo koaguliacija. Dėl padidėjusio kraujo krešumo atsirandus tromboembolinėms komplikacijoms ir

sutrikus normaliai tam tikro audinio, organo ar viso organizmo kraujotakai pablogėja jų aprūpinimas

deguonimi ir kitomis gyvybiškai svarbiomis medžiagomis, kas gali sukelti ląstelių žūtį [4].

Diagnozavus padidėjusio kraujo krešėjimo sutrikimą, svarbu kuo greičiau parinkti efektyvų

gydymą. Vienas dažniausiai padidėjusiai kraujo koaguliacijai skiriamų vaistų pasaulyje yra

netiesioginio veikimo antikoaguliantas varfarinas [5]. Nepaisant to, kad varfarinas yra dažnai skiriama

gana efektyvi ir nebrangi padidėjusios koaguliacijos gydymo priemonė, optimalų efektyvumą yra

sudėtinga pasiekti dėl siauro terapinio lango, tai yra, dėl komplikuoto dozavimo [6].

Pastebėjus, kadvienodos varfarino dozės vieniems pacientams sukelia hemoragines

komplikacijas, kitiems – kraujo krešėjimo padidėjimą, o trečius veikia optimaliai, buvo imta nagrinėti

įvairius faktorius, kurie gali daryti tam įtaką [6]. Siekiant išvengti kraujavimų rizikos ir pasiekti

pakankamą varfarino poveikį, labai svarbu nustatyti ir įvertinti visus galimus faktorius, jų poveikius ir

atsižvelgiant į vertinimo rezultatus sudaryti dozavimo algoritmą kiekvienam pacientui individualiai.

Šiame darbe yra aptariami ir vertinami klinikiniai ir genetiniai veiksniai, darantys įtaką

varfarino dozavimui gydymo pradžioje ir ilgalaikio vartojimo atveju. CYP4F2 rs1558139 genotipo

svarba varfarino dozavimui iki šiol nebuvo tirta, todėl šio tyrimo atlikimo metu gauti rezultatai suteikia

daugiau informacijos ir padeda paskirti tinkamesnę varfarino dozę CYP4F2 rs1558139 genotipą

turinčiam pacientui.

Tyrimo tikslas yra nustatyti kokią įtaką varfarino dozavimui vartojimo pradžioje ir ilgalaikio

gydymo metu daro CYP4F2 rs1558139 genotipo polimorfizmas bei kiti genetiniai bei klinikiniai

faktoriai.

9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – Išsiaiškinti, kokią įtaką daro klinikiniai ir genetiniai faktoriai varfarino

dozavimui vartojimo pradžioje ir ilgalaikio gydymo metu ligoniams po širdies vožtuvų operacijos.

Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti, kokią įtaką daro amiodarono vartojimas varfarino dozavimui po širdies

vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.

2. Ištirti CYP2C9 ir VKORC1 polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies

vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.

3. Ištirti CYP4F2 rs1558139 polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies vožtuvų

operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.2. Varfarinas

Varfarinas – vienas plačiausiai vartojamų netiesioginio poveikio antikoaguliantų, peroraliai

vartojamas varfarino natrio druskos pavidalu [5, 7]. Varfarino natrio druska (1 pav.), balti,

higroskopiški, amorfiniai vandenyje ir etanolyje gerai tirpūs milteliai, yra enantiemerų mišinys, kurį

sudaro (R)-varfarino ir (S)-varfarino mišinys [8, 9, 10, 11]. Varfarino (S)-enantiomeras pasižymi

stipreniu kraujo krešėjimą stabdančiu poveikiu, nei varfarino (R)-enantiomeras [11].

1 pav. Varfarino natrio druskos struktūrinė formulė [9]

Didžiausia varfarino koncentracija kraujyje yra pasiekiama praėjus 4 valandoms po vaisto

peroralinio suvartojimo, tačiau antikoaguliacinis poveikis pasireiškia tik per artimiausias 24 valandas,

stipriausias povekis - po 72 – 96 valandų, ir šis trunka nuo 2 iki 5 dienų [12]. Labai didelė absorbuoto

varfarino dalis rišasi su kraujo plazmos baltymais, todėl laisvo vaisto koncentracija kraujyje siekia vos

1 % [12].

Kadangi varfarinas neleidžia susidaryti krešuliams ir taip pagerina kraujotaką, jis yra dažnai

skiriamas pacientams kaip profilaktinė arba gydomoji priemonė, diagnozavus šiuos sutrikimus:

pasireiškus trumboembolinėms komplikacijoms, kurios atsiranda dėl prieširdžių

virpėjimo, skiriant kaip gydomąją priemonę;

tromboembolinių sutrikimų, galinčių atsirasti dėl prieširdžių virpėjimo, atvejais,

skiriant kaip profilaktinę priemonę;

esant miokardo infarkto pasikartojimo rizikai, kaip profilaktinė priemonė;

atsiradus tromboembolinėms komplikacijoms po širdies vožtuvo pakeitimo operacijos,

kaip gydomoji priemonė;

tromboembolinių komplikacijų po širdies vožtuvo pakeitimo operacijos profilaktikai;

11

plaučių embolijos gydymui arba profilaktikai;

pacientams po miokardo infarkto, kaip trombozės profilaktikos priemonė, siekiant

išvengti tromboembolinių komplikacijų ir sumažinti mirties po miokardo infarkto

riziką;

venų tromboembolijos atveju, kaip gydomoji ar profilaktinė priemonė, esant

pasikartojančioms tromboembolinėms situacijoms [12].

Pasireiškus per nelyg stipriam antikoaguliaciniam varfarino poveikiui ir atsiradus

kraujavimams ar kitiems vaisto šalutiniams poveikiams yra privalu imtis atsargumo priemonių, tokių

kaip dozės koregavimas [13]. Ūmių situacijų atvejais varfarino vartojimas nutraukiamas ir yra

skiriamas vartoti varfarino antidotas - vitaminas K, kadangi varfarinas dalyvauja vitamino K cikle,

kuris yra susijęs su kraujo krešėjimu [13, 14].

1.2.1. Varfarino veikimo mechanizmas ir metabolizmas

Normalaus vitamino K ciklo, susijusio su kraujo krešėjimu, metu vyksta du pagrindiniai

procesai:

1) γ-karboksilinimo metu nuo vitamino K priklausomi II, VI, IX, X krešėjimo faktoriai ir

krešėjime dalyvaujantys C, S ir Z baltymai iš neaktyvių formų tampa aktyviomis;

2) tuo pat metu turi dalyvauti vitamino K redukuota forma (KH2), kuri proceso metu yra

paverčiama neaktyvią oksiduotą vitamino K forma [13].

Tuomet neaktyvi vit. K forma vitamino K oksido-reduktazės yra paverčiama į vitaminą K,

kuris dėl vit. K1 reduktazės (VKORC1) vėliau virsta vitaminu KH2 [13].

Vitamino K antagonisto varfarino veikimas pasireiškia dėl VKORC1 slopinimo (2 pav.), ko

pasekoje neaktyvi oksiduota vit. K forma nevirsta redukuotu vitaminu KH2 [14]. Dėl vitamino K

oksido-reduktazės nutrūksta vitamino K ciklas, todėl nebevyksta γ-karboksilinimas ir nuo vitamino K

priklausomi II, VI, IX ir X krešėjimo faktoriai bei krešėjime dalyvaujantys C, S ir Z baltymai iš

neaktyvių formų nėra verčiami aktyviomis [13, 14].

12

2 pav. Varfarino veikimo mechanizmo ir metabolizmo schema [15]

Varfarinas yra metabolizuojamas kepenyse, dalyvaujant citochromo P450 sistemos

fermentams [12, 14]. Kadangi vartojamas varfarinas yra (R)-varfarino ir (S)-varfarino enantiomerų

raceminis mišinys, tiek (R)-varfarinas, tiek (S)-varfarinas yra metabolizuojamas atskirai [8, 10, 11,

13]. (R)-enantiomero metabolizmo metu didžioji dalis vaisto yra oksiduojama CYP1A2, CYP3A4 ir

CYP2C19 kepenų fermentų, likusi dalis virsta alkoholio derivatais, o beveik visas (S)-enantiomero

kiekis yra metabolizuojamas CYP2C9 kepenų fermento [13, 14, 15].

Metabolizuotas vaistas yra pašalinamas per inkstus, su šlapimu išsiskiria apie 92 % suvartoto

vaisto [12, 13].

13

1.2.2. Tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) rodiklio įtaka varfarino dozei

Norint pasiekti optimalų varfarino efektyvumą, dozė turi būti parenkama ir koreguojama

atsižvengiant į konkretaus paciento tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) rodiklį [14, 16].

Varfarino dozės parinkimą komplikuoja ypač siauras terapinis langas (3 pav.) [6].

3 pav. Varfarino terapinis langas [17]

Vartojamo varfarino dozė yra laikoma optimaliai efektyvia, kai TNS rodiklis yra 2,0 – 3,0

intervalo ribose [18, 19]. Kuomet TNS rodiklis yra mažesnis už 2,0, padidėja tromboembolinių

komplikacijų rizika (3 pav.). Didėjant TNS rodikliui, tromboembolinių komplikacijų rizika mažėja,

tačiau TNS rodikliui pakilus virš 3,0 smarkiai padidėja kraujavimų rizika (3pav.) [19]. Tam tikrų

būklių atvejais rekomenduojamas palaikyti TNS rodiklio intervalas gali kisti. TNS intervalas tarp 2,5 –

3,5 dažniausiai yra rekomenduojamas pacientams po širdies vožtuvo pakeitimo operacijos ar esant

papildomiems rizikos faktoriams, galintiems sekelti tromboembolines komplikacijas, tokiems kaip: 1.

prieširdžių virpėjimas; 2. pasikartojanti tromboembolija; 3. Hiperkoaguliacinė būklė ir kt. [19].

Paprastai varfarino dozė gali svyruoti nuo 5 iki 10 mg per dieną, tačiau dozės dydis yra parenkamas

kiekvienam pacientui individuliai ir įvertinant visus galimus vaisto efektyvumui įtaką darančius

veiksnius, o parinkus dozę ji yra kontroliuojama ir koreguojama pagal TNS rodiklio atitikimą

individuliai, pagal paciento būklę, nustatytai normai [13, 19].

14

1.2.3. Klinikinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui

Parenkant varfarino dozę įsotinimo fazėje ir ilgalaikio vartojimo metu reikia ne tik stebėti

TNS rodiklį, bet ir atsižvelgti į klinikinius faktorius, galinčius daryti įtaką vaisto veikimui [20].

Skiriami šie pagrindiniai faktoriai, darantys įtaką varfarino dozei: amžius, kūno masės indeksas,

mitybos įpročiai, lėtinės ligos ir kitų vaistų vartojimas, sukeliantis sąveikas [21].

Nors amžiaus, kūno masės ir mitybos įtaka bei mechanizmai nėra visiškai aiškūs, šie faktoriai

daro įtaką paciento organizmo atsakui į varfariną [20]. Jautrumas varfarinui dėl minėtų faktorių įtakos

nėra siejamas su konkrečiai vienu iš jų [21]. Pavyzdžiui, amžiaus įtaka gali būti susijusi su vitamino K

iš maisto gaunamu kiekiu, kuomet sumažėjus gaunamam vitamino K kiekiui sustiprėja varfarino

veikimas [21]. Varfarino poveikio pakitimai, taip pat, gali atsirasti dėl su amžiumi mažėjančio plazmos

baltymų kiekiu ir/arba didesnio kūno masės indekso [21]. Tačiau mitybos faktorius, o būtent –

vitamino K gavimo su maistu trūkumas ar perteklius, gali daryti itin didelę įtaką varfarino poveikiui

[21].

Dažniausiai pasitaikančias lėtines ligas, kurios turi įtakos varfarino dozės parinkimui, galima

suskirstyti į: 1.kepenų lėtines ligas, 2.inkstų lėtines ligas, 3.skydliakės lėtines ligas, 4.širdies

nepakankamumą [21]. Varfarino poveikiui įtaką, taip pat, gali daryti ūminės ligos ir kraujavimai dėl

mechaninių pažeidimų [20]. Esant kepenų lėtinei ligai, varfarino poveikis sustiprėja dėl susilpnėjusios

aktyvių krešėjime dalyvaujančių faktorių gamybos [12, 22]. Nepaisant to, kad su šlapimu išsiskiria

nedidelė dalis nemetabolizuoto varfarino, o inkstų ligos atveju šlapimo išsiskyrimas sutrinka, vaisto

dozės koreguoti nėra būtina [12, 21]. Skydliaukės ligos, hipertiroidizmo, atveju varfarino poveikis

dažniausiai silpnėja ir prireikia didesnių dozių, kurios pasiekus normalią skydliaukės būklę turi būti

mažinamos, o hipotiroidizmo atveju poveikis dažniausiai stiprėja [12, 21, 22]. Tuo tarpu, pacientams,

sergantiems širdies nepankamumu, yra rekomenduojamos mažesnės varfarino dozės, o mechaninių

pažeidimų atveju vaisto vartojimą rekomenduojama laikinai nutraukti [12, 21, 22].

Bene svarbiausias ir dažniausiai aptinkamas klinikinis faktorius, darantis įtaką varfarino dozės

parinkimui, yra vaistų tarpusavio sąveikos, kurių yra skiriama daugiau nei 200 [16, 21]. Pagal poveikį

yra išskirti du vaistų tipai, darantys įtaką varfarino dozei: 1.vaistai, mažinantys TNS rodiklį, tai yra,

silpninantys varfarino veikimą; 2.didinantys TNS rodiklį, tai yra, stiprinantys varfarino veikimą [21].

Pastarajam tipui priklausė tokie vaistai, kaip acetaminofenas, amiodaronas, acetilsalicilo rūgštis,

ciprofloksacinas, citalopramas, diltiazemas, sertralinas ir kt., o pirmajam – merkaptopurinas,

ribavirinas ir kt. [16, 23].

Klinikiniai veiksniai daro didelę įtaką varfarino poveikiui, todėl parenkant šio vaisto dozę

pacientui yra labai svarbu nustatyti visus galimus klinikinius veiksnius ir juos įvertinti. Tik aptikus ir

15

tinkamai įvertinus visus klinikinius faktorius bus galima palengvinti tinkamos varfarino dozės

nustatymą ir išvengti komplikacijų, atsirandančių dėl per silpno ar per nelyg stipraus veikimo.

1.2.4. Genetinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui

Varfarino optimalios dozės parinkimui ir koregavimui konkrečiam pacientui įtakos turi ne tik

klinikiniai faktoriai ir laboratorinė kontrolė, išreikšta TNS rodikliu. Kitas veiksnys, galintis palengvinti

tinkamos dozės parinkimą kiekvienam pacientui individualiai, yra genetinių faktorių įtaka.

CYP2C9

CYP2C9 – tai genas, kuris koduoja citochromo P450 sistemos fermentą-monooksigenazę,

metabolizuojantį tokius vaistus, kaip ksenobiotikai, ibuprofenas ir (S)-varfarinas [24]. CYP2C9

genotipą turintiems pacientams yra sunkiau stabilizuoti TNS rodiklį ir dėl pakankamai lėto (S)-

varfarino enantiomero metabolizmo bei šalinimo, vartojant įprastas varfarino dozes, yra padidėjusi

kraujavimo rizika [16, 25]. Yra skiriami šie CYP2C9 polimorfizmo variantai: CYP2C9*1*1,

CYP2C9*1*2, CYP2C9*1*3, CYP2C9*2*2, CYP2C9*2*3 ir CYP2C9*3*3 [16]. Lyginant skirtingų

CYP2C9 polimorfizmo variantų varfarino dozes, didžiausių dozių reikėjo *1*1 alelį turintiems

pacientams, o mažiausių - *1*3, *2*3 arba *3*3 alelį turintiems pacientams [16, 25]. *1*2 arba *2*2

alelį turintiems pacientams reikėjo mažesnės vidutinės varfarino dozės nei *1*1 alelį turintiems

pacientams, tačiau ne tokios mažos, kaip *1*3, *2*3 arba *3*3 alelį turintiems pacientams [16].

VKORC1

VKORC1 – genas, koduojantis vitamino K epoksido-reduktazės komplekso katalizinį

subvienetą, kuris redukuoja neaktyvų vitaminą K į aktyvią jo formą [26]. Kaip darantys įtaką varfarino

dozei, autorių minimi yra šie VKORC1 polimorfizmo variantai: VKORC1 1639 (A;G) ir VKORC1

1173 (CT;TT;CC) [16, 25, 27]. Pacientams, kuriems buvo nustatytas 1173CT ar 1173TT genotipo

polimorfizmo variantas, buvo reikalinga mažesnė vidutinė dozė nei pacientams, kuriems buvo

nustatytas 1173CC genotipo variantas [16, 27]. VKORC1 1639A variantą turintiems pacientams yra

reikalinga mažesnė vidutinė varfarino dozė, nei VKORC1 1639G variantą turintiems pacientams [28].

16

CYP4F2

CYP4F2 – tai genas, koduojantis citochromo P450 sistemos fermentą-monooksigenazę, kuris

inhibuoja vitaminą K, dalyvaujantį kraujo krešėjimo procese [29, 30]. Šiuo metu yra išskirtas vienas

CYP4F2 genotipo polimorfizmo variantas, turintis įtakos varfarino dozavimui – CYP4F2 rs2108622

(CC;CT;TT) (V433M) [31]. CYP4F2 rs2108622CC genotipo variantą turintiems pacientams reikėjo

mažesnės vidutinės varfarino dozės, nei pacientams, turintiems rs2108622CT arba rs2108622TT

genotipo variantą [31]. Rs2108622TT variantą turinčių pacientų vartota vidutinė varfarino dozė buvo

didžiausia [31].

Kitas CYP4F2 genotipo polimorfizmo variantas yra CYP4F2 rs1558139, tačiau iki šiol

nebuvo atlikta šio genotipo įtakos varfarino dozės dydžiui tyrimų. Šiuo metu yra nustatyta, kad

minėtas genotipas yra susijęs su koronarinių širdies ligų vystymusi kinų populiacijos imtyje [32].

1.3. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo principo panaudojimas

genų polimorfizmo nustatymui

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) – tai paprastas ir greitas DNR fragmentų dauginimo

metodas, kurio metu yra gaunamas neribotas kiekis DNR fragmento kopijų [33]. 1983 metais mokslų

daktaras Kary Mullis suvokė, jog polimerazės grandininės reakcijos metodas gali būti taikomas kaip

būdas kopijuoti ir sistetinti didelius DNR kiekius bei konkrečius DNR fragmentus, taiga, po dviejų

metų, 1985-ais mokslininkas su tyrėjų komanda pirmą kartą pateikė savo idėją [34, 35].

Polimerazės grandininė reakcija yra atliekama panaudojant DNR šabloną, kuris gali būti

sudarytas iš vienos arba dviejų grandinių [36]. Taip pat, yra reikalingi du olegonukleotidų pradmenys,

keturių nukleotidų trifosfatai, karščiui atspari polimerazė, magnio jonai ir buferis. Reakcija yra

atliekama vykdant temperatūrų ciklus [36]. Aukšta temperatūra (95° C) yra taikoma norint atskirti

dvigubos DNR spiralės vijas, tuomet temperatūra yra sumažinama iki 50° C tam, kad pradmenys

sukibtų su šablonu, o, galiausiai, temperatūra yra pakeliama iki 72° C, kuri yra yra optimali

polimerazei, įtraukiančiai nukleotidų trifosfatus ir taip prailginančiai pradmenis [36].

Polimerazės grandininę reakciją sudaro 3 pagrindinės stadijos:

1. Denatūracijos stadija - šios stadijos metu temperatūra turi siekti apie 95̊ C, norint

išlydyti DNR grandinę ir atskirti ją į dvi vijas, o vėliau į vijų fragmentus;

2. Hibridizacijos stadija - temperatūra sumažinama, norint gauti pradmenų sukibimą

su vijų fragmentais;

17

3. Elongacijos stadija - jos metu temperatūra pakyla iki 72̊ C, kad pradmenys būtų

prailginti polimerazės [36].

Pasibaigus polimerazės grandininei reakcijai yra atliekama gautų produktų analizė

elektroforezės metodu [33].

Tikro laiko polimerazės grandininė reakcija – tai tradicinio polimerazės grandininės reakcijos

metodo plėtinys, kuris leidžia ne tik sintetinti DNR molekulės fragmentus, bet tuo pačiu ir atlikti

nukleorūgščių kiekybinį nustatymą arbą DNR fragmentų genotipavimą [37].

4 pav. Kairėje - nekomplementarus DNR reagentas, dešinėje – komplementarus [36]

Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodui atlikti papildomai yra reikalingas

fluorescenciją sukeliantis, prie pagaminto produkto prisijungiantis komplementarus DNR reagentas (4

pav.) [36]. Pagal fluorescencijos intensyvumą galima nustatyti jau suformuotą DNR fragmentų kiekį,

taigi, kiekvieno ciklo metu daugėjant suformuoto produkto, stiprėja ir detektuojamo fluorescencijos

signalo intensyvumas [36]. Atliekant tikro laiko PGR rezultatai yra fiksuojami realiu laiku, pasibaigus

kiekvienam ciklui, taigi gelelektroforezės metodo taikyti nereikia [38].

18

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo organizavimas

Magistro baigiamojo darbo tyrimo organizavimas buvo pradėtas nuo teorinio susipažinimo su

mėginio paruošimo tvarka ir stadijomis, būtinomis tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos

metodo taikymui, tokiomis kaip:

darbo laboratorijoje taisyklės, naudojamos priemonės ir prietaisai bei higienos

reikalavimai, taikytini darbui molekulinės kardiologijos laboratorijoje;

teorinis KI MKL taikomo DNR ekstrakcijos metodo nagrinėjimas, aptariant

naudojamus reagentus ir kiekvieno iš jų paskirtį, kuomet rašytinės DNR ekstrakcijos

metodikos kopija buvo pateikta laboratorijos darbuotojų;

teorinis reakcijos mišinio su DNR paruošimas - reakcijos mišinio su DNR paruošimo

metodikos teorinis nagrinėjimas ir kilusių klausimų aptarimas;

kriterijų, pagal kuriuos bus atrenkami DNR mėginiai, pasirinkimas;

DNR mėginių kiekio, kaip visos mėginių imties, pasirinkimas;

DNR mėginių kiekio vienam tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos tyrimui

pasirinkimas.

2.2. Tyrimo objektas

Tyrimas buvo atliekamas suLietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų

(LSMUL KK) pacientų periferiniu krauju, paveiktu antikoaguliantu. Periferinio kraujo ėminiai, iki

DNR ekstrakcijos atlikimo, kambario temperatūroje buvo laikomi ne ilgiau kaip 24 val., o šaldytuve-

4oC ne ilgiau kaip vieną savaitę.

DNR išskyrimas

Paėmus pacientų periferinio kraujo su antikoaguliantu mėginius, buvo atlikta DNR

ekstrakcija, remiantis LSMU MA Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos

laboratorijojetaikoma metodika, kuri yra pateikta magistro baigiamojo darbo 8.1 priede.

Atlikus DNR ekstrakciją, iš kiekvieno paciento kraujo ėminio, buvo atliekamas DNR

koncentracijos ir kokybės vertinimas spektrofotometriniu metodu.

19

DNR koncentracijos matavimas ir kokybės vertinimas

Buvo lašinama po 2 μl DNR mėginio vandeninio tirpalo ant spektrofotometro celės.

Kompiuterinėje programoje pažymimas paciento ID ir spaudžiamas mygtukas „measure“. Prieš ir po

matavimo spektrofotometro matavimo celęreikėjo nuplauti vandeniu, o vėliau nusausinti. Atliekant

DNR koncentracijos matavimą,buvo įvertinama po ekstrakcijos gauto DNR mėginio kokybė.

Po ekstrakcijos ir išeigos kokybės vertinimo, DNR mėginiai buvo užšaldyti ir laikomi

šaldiklyje, -24 oC temperatūroje, iki tol, kol pasirinktos imties kraujo DNR mėginiai buvo pradėti

ruošti tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo tyrimui.

2.3. Mėginių imties parinkimas

Tyrimams atsitiktiniu būdu buvo atrenkami ligonių mėginiai, kurių TNS rodiklis buvo (2,0 -

3,5). Remiantis ligos istorijų duomenimis, atrinktų pacientų stabili varfarino dozė, reikalinga

pasirinktam TNS palaikyti, buvo pasiekta ir išlaikyta ne mažiau nei 2 dienas iki paciento išrašymo iš

LSMUL KK. Pagal šiuos kriterijus tyrimams atrinktas 91 mėginys.

4 pav. Tyrimo dalyvių pasiskirstymas pagal lytį

Norint įvertinti vartojamo varfarino dozės, reikalingos rekomenduojamam TNS palaikyti,

kitimus ilgalaikio gydymo metu, iš 91 paciento, į tolesnį tyrimą įtraukti 72. Tinkamais tolesniam

tyrimui buvo laikomi tie pacientai, kurie: 1. Atvyko pakartotinai duoti kraujo tyrimams, 2. vartojo

antikoaguliantą varfariną ne mažiau kaip 3 mėnesius po išrašymo iš ligoninės. Iš 72 tolesniam tyrimui

atrinktų pacientų 34 (47,2%) buvo vyrai (4 pav.) ir 38 (52,8%) moterys (4 pav.).

47,2%

52,8%

Vyrai 34

Moterys 38

20

2.4. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcija

Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos tyrimo eigą sudaro du pagrindiniai etapai:

1) Mėginio paruošimas;

2) Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos instrumentinė tyrimų dalis.

Prieš pradedant tyrimą tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu, pirmiausia buvo

nustatomas numatomų tą dieną tirti mėginių skaičius. Nuo to priklausė, kiek bus naudojama reagentų.

Pasirinkti mėginiai buvo išimami iš šaldiklio ir paliekami kambario temperatūroje atšilti. Mėginiams

atšilus buvo imamas ruošti reakcijos mišinys (RM) su DNR mėginiu TL-PGR ištyrimui.

2.4.1. Mėginio paruošimas

Reakcijos mišinys gali būti ruošiamas dviem būdais:

1) Automatine pipete į plokštelę paeiliui išpilstant kiekvieną reagentą atskirai;

2) Apskaičiavus reagentų kiekius, paruošti bendrą reakcijos mišinio tūrį mėgintuvėlyje, ir

tuomet išpilstyti jį į plokštelę.

Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo tyrimas MKL buvo pradedamas nuo

reakcijos mišiniui reikalingų reagentų kiekio apskaičiavimo. Apskaičiavus reagentų kiekius,

pradedamas ruošti reakcijos mišinys.

5 pav. Reakcijos mišinio 1 mėginiui sudėtis (μl)

4,3

5,3

0,2

1,0

Vanduo

TaqMan genotipavimofermentų mišinys

4F2 biožymuo

DNR

21

Reakcijos mišinį tikro laiko polimerazės grandininei reakcijai sudaro vanduo, TaqMan

genotipavimo fermentų mišinys, 4F2 biožymuo ir tiriamo paciento DNR (5 pav.). Reakcijos mišiniui

vienam mėginiui paruošti buvo imama 4,3 μl vandens, 5,3 μl TaqMan genotipavimo fermentų mišinio,

0,2 μl 4F2 biožymens ir 1,0 μl DNR (5 pav.).

Reagentų kiekių (μl) skaičiavimai gali būti išreikšti formule:

1) Vb.r.k..=Vp.r.k.x (nmėg.+1);

Vb.r.k..– bendras reagento (Vb.v.k..=vandens /Vb.Tq.k..= TaqMan /Vb.z.k..= 4F2 biožymens) kiekis (μl), ;

Vp.r.k.– pradinis reagento (Vp.v.k.=vandens / Vp.Tq.k.=TaqMan / Vp.z.k.= 4F2 biožymens) kiekis (μl);

nmėg.– tiriamų mėginių skaičius.

1 lentelė. Sunaudoti reagentų kiekiai

Tyrimo

eilės

numeris

Tiriamų

DNR

mėginių

skaičius

(vnt.)

Kontrolinių

mėginių

skaičius

(vnt.)

Bendras

mėginių

skaičius

(vnt.)

Vandens

kiekis

(μl)

TaqMan

genotipavimo

fermentų

mišinys

(μl)

4F2

biožymuo

(μl)

DNR

kiekis

(vienam

mėginiui,

μl)

1 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1

2 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1

3 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1

4 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1

5 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1

6 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1

Iš viso 72 - - 361,2 445,2 16,8 -

Vandens kiekio apskaičiavimo pavyzdys tyrimams Nr.1-6 (1 lentelė):

Vb.v.k..=Vp.r.k.x (nmėg.+1)= 4,3μl x (13+1) = 60,2 (μl)

TaqMan genotipavimo fermentų mišinys kiekio apskaičiavimo pavyzdys tyrimams Nr.1-6 (1

lentelė):

Vb.Tq.k..=Vp.Tq.k.x (nmėg.+1) = 5,3 μl x (13+1) = 74,2 (μl)

4F2 biožymens kiekio apskaičiavimo pavyzdys tyrimams Nr.1-6 (1 lentelė):

Vb.z.k..=Vp.z.k.x (nmėg.+1)= 0,2 μl x (13+1) = 2,8 (μl).

Visi bendri reagentų kiekiai reakcijos mišiniui buvo apskaičiuojami pagal aukščiau pateiktą

formulę, pradinį reagentų kiekį padauginant iš mėginių skaičiaus (nmėg.+1), kur nmėg.yra DNR

22

mėginiųskaičius su 1 kontroliniu mėginiu be DNR (1 lentelė). Apskaičiavus reakcijos mišinio

reagentus pagal nmėg., dėl automatinių pipečių tūrio matavimo paklaidų, kitų mechaninio darbo

veiksnių, gali atsirasti reakcijos mišinio trūkumas.Norint išvengti šio trūkumo jį pilstant į reakcijos

plokštelę, kaip mėginių skaičius buvo imamas (nmėg.+1), kas padidino reakcijos mišinio tūrį ir taip

užtikrino pakankamą jo kiekį.

Apskaičiavus reagentų kiekius, buvo pradedamas ruošti reakcijos mišinys tikro laiko

polimerazės grandininei reakcijai:

1) Laminarinėje traukos spintoje buvo išdėstomi visi reikalingi reagentai (vanduo,

TaqMan genotipavimo fermentų mišinys 4F2 biožymuo) ir priemonės, tai yra,

reikiamo tūrio automatinės pipetės ir automatinių pipečių vienkartiniai

antgaliai,plastikinis „Eppendorf“ tipo mėgintuvėlis bei PGR lizdinė plokštelė. Atšilę

kraujo DNR mėginiai užkimštuose „Eppendorf“ tipo mėgintuvėliuose buvo

centrifuguojami 5 sekundes, norint sutelkti visą mėgintuvėlio turinį. Tuomet

mėgintuvėliai buvo išimami iš centrifugos ir perkeliami į laminarą. Taip pat, buvo

paruoštas indas panaudotiems vienkartiniams automatinių pipečių antgaliams išmesti.

Visas darbo laboratorijoje procesas buvo vykdomas mūvint gumines pirštines.

2) Paruoštas „Eppendorf“ tipo mėgintuvėlis buvo atkemšamas, pagal apskaičiuotus

reagentų kiekius nustatomas tam tikro reagento automatinės pipetės paimamas skysčio

tūris ir užmautas vienkartinis antgalis. Į mėgintuvėlį buvosupilami paimti vandens

(60,2μl), TaqMan genotipavimo fermentų mišinio (74,2μl) ir 4F2 biožymens (2,8μl)

kiekiai (1 lentelė), pakeičiant vienkartinį automatinės pipetės antgalį po kiekvieno

reagento įpylimo. Pipečių antgaliai buvo keičiami po kiekvieno reagento, siekiant

išvengti reagentų originaliose talpyklėse užteršimo.

3) „Eppendorf“ mėgintuvėlis buvo užkemšamas, jo turinys buvo mechaniškai

suplakamas ir yra tokiu būdu buvo paruoštas išpilstymui į PGR plokštelę.

7 pav. PGR lizdinė plokštelė

23

4) Automatinės pipetės paimamas skysčio tūris buvo nustatomas ties 9,7 μl ir

užmaunamas vienkartinis pipetės antgalis. Į kiekvieną iš 13 (1 lentelė) pasirinktų PGR

plokštelės (7 pav.) lizdų automatine pipete buvo pilama po 9,7 μl reakcijos mišinio.

Kadangi į visus PGR plokštelės lizdus buvo pilamas pagamintas reakcijos mišinys,

pipetės antgalis nebuvo keičiamas po skysčio įpylimo į kiekvieną iš lizdų, tačiau buvo

pakeistas užpildžius visus reikiamus lizdus reakcijos mišiniu.

5) Tuomet automatinės pipetės paimamas skysčio tūris buvo nustatomas ties 1,0 μl ir

išpilstomi pasirinkti kraujo DNR mėginiai. Vienas DNR mėginys buvo pilamas į vieną

PGR plokštelės lizdą, kiekvieną kartą įpylus pakeičiant pipetės antgalį. Mėgintuvėliai,

kuriuose laikoma DNR, buvo atkemšami tik mėginiui automatine pipete paėmimui, o

iškart po paėmimo vėl užkemšami. Taip buvo supilama 12 DNR mėginių į 12 lizdų, o

1 buvo paliekamas kaip kontrolė.

6) Užpildyta PGR plokštelė (plokštelės dalis) užkemšama specialia plėvele ir

centrifuguojama 1500-1700 aps./min. 15 sekundžių.

7) Po centrifugavimo plokštelė su mėginiais patalpinama tikro laiko polimerazės

grandininės reakcijos termocikleryje ir reakcija paleidžiama.

2.5. Statistinės analizės metodai

Analizei buvo naudojama „SPSS“ duomenų statistinio apdorojimo programa.Genotipų dažnis

pateiktas % (procentais). Varfarino dozė yra pateikta kaip vidurkis ±SD (standartinis nuokrypis).

p<0,05 reikšmė buvo laikoma statistiškai reikšminga.

24

3. REZULTATAI

3.1. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amžių ir lytį

Iš viso tyrimo imtį sudarė 72 pacientai. Tyrime dalyvavo 38 vyrai ir 34 moterys, taigi

vyriškosios lyties atstovai sudarė 52,8 %, o moteriškosios - 47,2 % visos tiriamųjų imties (2 lentelė).

Vidutinis tiriamųjų vyrų amžius siekė 60,76 ± 12,80 m. Moterų amžiaus vidurkis buvo 67,20

± 9,20 m. (2 lentelė). Vyrai buvo statistiškai reikšmingai jaunesni (p=0,01) nei moterys.

2 lentelė. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal lytį ir amžių

Lytis Amžius ± SD (metais) n %

Vyras 60,76 ± 12,80 38 52,8

Moteris 67,20 ± 9,20 34 47,2

Iš viso: 63,82 ± 11,69 72 100,0

3.2. Amiodarono vartojimo įtaka varfarino dozavimui įsotinimo ir ilgalaikio

gydymo metu

Iš visų tyrimo dalyvių, išrašant varfariną vartojančius pacientus iš ligoninės, amiodarono

nevartojo 46 pacientai, o ilgalaikio gydymo varfarinu metu – 63. Trumpalaikio gydymo metu

amiodarono nevartojantys pacientai sudarė 63,9 %, o ilgalaikio gydymo metu – 87,5 % visų tyrime

dalyvavusių pacientų (3 lentelė).

Ilgalaikio gydymo metu amiodarono nevartojantiems pacientams (87,5 %) reikėjo mažesnės

varfarino dozės (5,2 ± 1,9 mg), nei pacientams, kurie išrašymo iš ligoninės metu nevartojo amiodarono

(63,9 %), p=0,05 (3 lentelė). Varfarino dozė amiodarono nevartojantiems pacientams išrašymo iš

ligoninės metu buvo siekė 6,1 ± 1,9 mg.

25

3 lentelė. Varfarino dozės pokyčiai skirtingu gydymo laikotarpiu amiodarono nevartojantiems

pacientams

Iš viso

pacientų

Trumpalaikis varfarino vartojimas Ilgalaikis varfarino vartojimas

n % Varfarino dozė ±SD n % Varfarino dozė ±SD n %

72 100,0 6,1 ± 2,8 mg 46 63,9 5,2 ± 1,9 mg 63 87,5

Trumpalaikio gydymo varfarinu metu amiodaroną vartojo 26 pacientai (36,1 %), o ilgalaikio

gydymo metu – tik 9 (12,5 %).

Varfarino dozė išrašant pacientus iš ligoninės siekė 4,7 ±2,2 mg. Pastebėjome tendenciją, kad

varfarino dozė šiems ligoniams mažėjo ilgalaikio gydymo metu - 3,3 ±1,6 mg (p=0,09).

4 lentelė. Varfarino dozės pokyčiai skirtingu gydymo laikotarpiu amiodaroną vartojantiems

pacientams

Trumpalaikis varfarino

vartojimas

Ilgalaikis varfarino vartojimas

Varfarino dozė

±SD

n % Varfarino dozė

±SD

n %

4,7± 2,2 mg 26 36,1 3,3± 1,6 mg 9 12,5

3.3. Genotipų įtaka varfarino dozavimui

3.3.1. CYP2C9 įtaka dozuojant varfariną

CYP2C9 *2 alelis

Iš 72 pacientų, CYP2C9*2 *1/*1 genotipą turinčių buvo 57 (79,2 %), turinčių CYP2C9 *1/*2

genotipą - 14 (19,4 %), o CYP2C9 *2/*2 genotipas buvo nustatytas tik 1 tiriamajam (5 lentelė).

Pacientams, turintiems *1*1 (5 lentelė), trumpalaikio vartojimo metu varfarino dozė buvo 5,8

± 2,8 mg, o ilgalaikio vartojimo metu mažėjo. Ilgalaikio vartojimo metu ji buvo 5,3 ± 1,9 mg.

26

*1*2 turintiems pacientams varfarino dozė ilgalaikio vartojimo metu mažėjo iki 4,0 ± 1,6 mg.

Šį variantą turintiems tiriamiesiems išrašymo iš ligoninės metu paskirta varfarino dozė buvo 5,0 ± 2,0

mg, p=0,17 (5 lentelė).

*2*2 turintiems paskirta varfarino dozė išrašant iš ligoninės buvo 2,5 mg. Ilgalaikio gydymo

metu dozė didėjo iki 3,2 mg varfarino, p=0,07 (5 lentelė).

5 lentelė. CYP2C9*2 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu

CYP2C9*

2

genotipo

variantas

Pacientų

skaičius

Trumpalaikis

varfarino vartojimas

Ilgalaikis varfarino

vartojimas

p*

n % Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD

*1/*1 57 79,2 5,8 ± 2,8 mg 5,3 ± 1,9 mg 0,26

*1/*2 14 19,4 5,0 ± 2,0 mg 4,0 ± 1,6 mg 0,17

*2/*2 1 1,4 2,5 ± 0,0 mg 3,2 ± 0,0 mg 0,07

Iš viso: 72 100,0 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96mg 0,12

* Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.

CYP2C9 *3 alelis

CYP2C9*1*1 turėjo 59 tiriamieji. Tai sudarė 81,9 % visų tiriamųjų. *1*3 tiriamųjų imtyje

buvo nustatyta ženkliai mažiau – tik 13 pacientų, kurie sudarė 18,1 % visos imties (6 lentelė).

Varfarino dozės pokytis, išrašant pacientus ir ilgalaikio gydymo varfarinu metu, buvo gana ženklus

*1*1 turintiems ligoniams: išrašant iš ligoninės - 5,9 ± 2,7 mg, o ilgalaikio vartojimo metu sumažėjo

iki 3,7 ± 1,7 mg, tačiau stebėta tik tendencija p=0,16 (6 lentelė).

Didesnių dozių reikėjo *1*3 ligoniams ilgalaikio varfarino vartojimo atveju. Trumpalaikio

vartojimo metu vartota dozė buvo 4,3 ± 2,3 mg, o ilgalaikio varfarino vartojimo metu padidėjo iki 5,3

± 1,8 mg, p=0,49 (6 lentelė).

27

6 lentelė. CYP2C9*3 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu

CYP2C9*3

genotipo

variantas

n

%

Trumpalaikis

varfarino

vartojimas

Ilgalaikis

varfarino

vartojimas

p*

Varfarino dozė ±

SD

Varfarino dozė ±

SD

1*1 59 81,9 5,9 ± 2,7 mg 3,7 ± 1,7 mg 0,16

1*3 13 18,1 4,3 ± 2,3 mg 5,3 ± 1,8 mg 0,49

Iš viso: 72 100 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96mg 0,12

* Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.

3.3.2. VKORC1 įtaka varfarino dozavimui

T1173T turėjo 8 tiriamieji (11,1 %), C1173T – 35 tiriamieji (40,3 %), C1173C – 29 tiriamieji,

kurie sudarė 40,3 % visos tiriamųjų imties (7 lentelė).

11,1 % tiriamųjų, kurie turėjo VKORC1 TT, išrašant iš ligoninės vartojo mažesnes varfarino

dozes, nei ilgalaikio vartojimo metu. Išrašant juos iš ligoninės, varfarino dozė buvo 3,1 ± 1,8 mg, o

ilgalaikio vartojimo metu padidėjo iki 4,3 ± 1,1 mg, p=0,16 (7 lentelė).

Pacientai, turintys TC, trumpalaikio vartojimo metu vartojo didesnes varfarino dozes, nei

vartojant varfariną ilgą laiką, tačiau dozės pokytis nebuvo ženklus. Trumpalaikio vartojimo metu

varfarino dozė buvo 5,2 ± 2,5 mg, o vartojant ilgą laiką sumažėjo iki 4,8 ± 1,8 mg, p=0,44 (7 lentelė).

VKORC1 C1173C genotipą turinčių vartota varfarino doze išleidžiant iš ligoninės buvo 5,4 ±

2,1 mg, o ilgalaikio vartojimo metu padidėjo iki 6,6 ± 2,7 mg, p=0,06 (7 lentelė).

28

7 lentelė. VKORC1 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu

VKORC1

genotipo

variantas

Pacientų

skaičius

Trumpalaikis

varfarino vartojimas

Ilgalaikis varfarino

vartojimas

p*

n % Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD

T1173T 8 11,1 3,1 ± 1,8 mg 4,3 ± 1,1 mg 0,16

C1173T 35 48,6 5,2 ± 2,5 mg 4,8 ± 1,8 mg 0,44

C1173C 29 40,3 5,4 ± 2,1 mg 6,6 ± 2,7 mg 0,06

Iš viso: 72 100,0 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96 mg 0,12

* Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.

3.3.3. CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozavimui

Buvo tirti šie CYP4F2 rs1558139 genotipo variantai: G/G, G/A ir A/A. 30,6 % tiriamųjų

imties sudarė G/G polimorfizmo variantą turintys pacientai, 50,0 % sudarė heterozigotinis (G/A)

genotipo polimorfizmo variantas. CYP4F2 rs1558139 A/A polimorfizmo variantas apėmė tik 19,4 %

visos tiriamųjų imties (8 lentelė).

CYP4F2 rs1558139 G/G variantą turinčių pacientų tarpe buvo pastebėtas varfarino dozės

sumažėjimas ilgalaikio gydymo varfarinu metu. Išrašant šiuos pacientus iš ligoninės, buvo skiriama

6,3 ± 2,9 mg varfarino dozė. Po 3 mėnesių vartojama varfarino dozė sumažėjo iki 4,9 ± 2,0 mg, p=0.07

(8 lentelė).

G/A genotipas nedarė reikšmingos įtakos varfarino dozės pokyčiams. Išrašant heterozigotinį

rs1558139 genotipo polimorfizmą turinčius pacientus iš ligoninės, varfarino dozė buvo 5,5 ± 2,7 mg, o

ilgalaikio vartojimo metu sumažėjo iki 5,1 ± 1,8 mg, p=0,46 (8 lentelė).

CYP4F2 rs1558139 AA turintiems varfarino dozė padidėjo nuo 4,8 ± 2,3 mg, iki 4,9 ± 2,3 mg

ilgalaikio vartojimo metu, p=0,90 (8 lentelė).

29

8 lentelė. CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu

CYP4F2

rs1558139

genotipo

variantas

Pacientų

skaičius

Trumpalaikis

varfarino vartojimas

Ilgalaikis varfarino

vartojimas

p*

n % Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD

G/G 22 30,56 6,3 ± 2,9 mg 4,9 ± 2,0 mg 0,07

G/A 36 50,00 5,5 ± 2,7 mg 5,1 ± 1,8 mg 0,46

A/A 14 19,44 4,8 ± 2,3 mg 4,9 ± 2,3 mg 0,90

Iš viso: 72 100 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96 mg 0,12

* Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Dėl tromboembolinių kraujotakos sutrikimų yra kreipiama vis daugiau dėmesio į

antikoaguliacinį poveikį sukeliančius vaistinius preparatus. Svarbią vietą tromboembolinių ligų

gydyme ima užimti naujieji antikoaguliantai, kurie nereikalauja nuolatinės laboratorinės kontrolės ir

todėl yra lengviau dozuojami. Tačiau dėl savo didelės kainos gali būti skiriami pakankamai retai [39].

Naujųjų antikoaguliantų skyrimo galimybes taip pat apriboja tinkamo priešnuodžio nebūvimas, kas yra

ypač svarbu vaisto perdozavimo atveju ir nežinomos ilgalaikio vartojimo pasėkmės [39].

Varfarinas ir toliau išlieka vienu dažniausiai skiriamų vaistų padidėjusios kraujo koaguliacijos

gydymui. Norint patikslinti ir palengvinti nuolatinės varfarino dozės skyrimą skirtingiems pacientams

buvo nagrinėjami klinikiniai ir genetiniai veiksniai, galintys daryti įtaką stabilios varfarino dozės

dydžiui [40].

Vienas iš veiksnių, darančių įtaką varfarino dozės dydžiui, yra kitų vaistinių preparatų

vartojimas [41]. Atlikto tyrimo metu buvo vertinama vartojama varfarino dozė amiodaroną

vartojantiems ir jo nevartojantiems pacientams. Įvertinus amiodaroną vartojančius pacientus, buvo

pastebėta, kad varfarino dozė išrašant juos iš ligoninės buvo 4,7 ± 2,2 mg, o ilgalaikio vartojimo metu

sumažėjo iki 3,3 ± 1,6 mg (p=0,09), tačiau šis rezultatas nebuvo laikomas statistiškai patikimu.

Amiodarono nevartojančių pacientų varfarino dozė trumpalaikio vartojimo metu siekė 6,1 ± 2,8 mg,

tačiau ilgalaikio vartojimo metu buvo pastebėtas dozės sumažėjimas iki 5,2 ± 1,9 mg (p=0,05). Kinijos

30

pacientų, kuriems buvo atlikta širdies vožtuvo operacija, imtyje taip pat buvo pastebėta varfarino dozės

mažėjimas pacientams, kurie vartoja amiodaroną [42]. Pacientams, vartojantiems amiodaroną,

varfarino dozė buvo mažinama 0,625 – 1,25 mg [42]. Varfarino dozės mažinimo tendencija taipogi

buvo pastebėta Brazilijos pacientų imtyje [43]. Pastebėtas varfarino dozės mažėjimas vartojant

amiodaroną yra siejamas su varfarino – amiodarono sąveikos, kurios metu amiodaronas sustiprina

varfarino poveikį, inhibuodamas citochromo P450 sistemos fermentus, metabolizuojančius

antikoaguliantą varfariną [44].

Kitas apžvelgtas veiksnys buvo genetiniai faktoriai, darantys įtaką varfarino dozei. Vertinant

CYP2C9 genotipo polimorfizmo variantus, statistiškai patikimų varfarino dozės pakitimų, galėjusių

atsirasti dėl CYP2C9*2 ir CYP2C9*3 genotipo variantų, trumpalaikio ir ilgalaikio gydymo metu

nustatyta nebuvo, tačiau buvo pastebėta, kad CYP2C9 *1/*1 variantą (halotipą) turintiems pacientams

reikėjo didesnės varfarino dozės nei 2C9*2 bei 2C9*3. Analogiški rezultatai buvo gauti tiek

europiečių, tiek kaukaziečių kilmės imtyse [45, 46, 47].

Nagrinėjant VKORC1 genotipo polimorfizmo variantų įtaką varfarino dozės pokyčiui

trumpalaikio ir ilgalaikio gydymo metu, taip pat, nebuvo nustatyta varfarino dozės kitimų, kuriuos

galima būtų laikyti statistiškai patikimais. Tačiau buvo pastebėta, kad vidutinės varfarino dozės

ilgalaikio gydymo metu ėmė didėti pacientams, kuriems nustatyti T1173T ir C1173C VKORC1

genotipo polimorfizmo variantai. Kinų populiacijos imtyje buvo nustatyta, kad VKORC1 genotipo AG

ir GG variantus turintiems pacientams reikėjo didesnės varfarino dozės nei AA variantą turintiems

pacientams [42, 48]. Mažesnės varfarino dozės poreikio tendencija VKORC1 1173C/T genotipą

turintiems pacientams buvo pastebėta ir afroamerikiečių bei europiečių kilmės amerikiečių imtyse,

tačiau afroamerikiečių imties atstovams reikėjo kiek didesnių varfarino dozių [49].

Kitas nagrinėtas genotipas, darantis įtaką varfarino dozavimui, buvo CYP4F2. Patvirtinti ir

išskirti buvo CYP4F2 rs2108622 genotipo polimorfizmo variantai, turintys įtakos varfarino dozės

dydžiui: C/T ir T/T polimorfizmo variantus turintiems pacientams reikėjo didesnių dozių nei C/C

variantui [50]. Mažesnės dozės poreikis C/C variantui buvo nustatytas ir italų pacientų imtyje [51].

Rs2108622 genotipo C/T ir T/T variantų didesnės varfarino dozės poreikis gali būti siejamas su minėto

genotipo savybe lėčiau metabolizuoti vit.K1, dėl ko kepenyse susidaro didesnė vit.K1 koncentracija ir

yra reikalinga didesnė varfarino dozė norimam poveikiui pasiekti [52]. Kitas siejamas su varfarino

dozės dydžiu genotipas buvo rs3093168, kurio C/C variantas sukėlė daugiau hemoraginių

komplikacijų nei C/T ir T/T, t.y. C/C variantą turintiems pacientams reikėjo mažesnių varfarino dozių

[53]. CYP4F2 rs1558139 genotipo polimorfizmo įtakos varfarino dozavimui tyrimai iki šiol nebuvo

aprašomi literatūroje. Tiriant CYP4F2 rs1558139 genotipo polimorfizmo svarbą varfarino dozavimui

trumpalaikio ir ilgalaikio gydymo metu buvo nustatytas rodiklis, kuris galėtų būti tiriamas toliau: G/G

variantas, sudarantis 30,56 % visos tiriamųjų imties, pasižymėji varfarino dozės mažėjimu ilgalaikio

31

vartojimo metu (4,9 ± 2,0 mg), palyginti su trumpalaikiu varfarino vartojimu (6,3 ± 2,9 mg), p=0.07.

Kadangi p>0,05, šis rodiklis nėra laikomas statistiškai patikimu. Norint patikrinti hipotezę, kad

CYP4F2 rs1558139 genotipo G/G variantas ilgalaikio vartojimo metu reikalauja varfarino dozės

mažinimo, tyrimą reikėtų pakartoti didesnėje pacientų imtyje. Didesnių varfarino dozių poreikis

rs1558139 G/G genotipui, kaip ir rs2108622 CT ir TTgenotipams,gali būti susijęs su savybe lėčiau

metabolizuoti vitaminą K1, dėl ko vitaminas K ima kauptis kepenyse.

5. IŠVADOS

1. Ilgalaikio gydymo metu tiek amiodarono nevartojantiems pacientams, tiek ir jį vartojusiems,

varfarino dozės reikšmingai sumažėjo, palyginus su išrašymo iš ligoninės metu vartotomis varfarino

dozėmis.

2. CYP2C9 *1/*1 (*2 alelis), taip pat kaip ir VKORC1 C1173C genotipą, turintiems pacientams

reikėjo reikšmingai didesnių varfarino dozių, nei kitokį genotipą turintiems ligoniams.

3. Mažesnių varfarino dozių reikėjo CYP4F2 rs1558139 G/G genotipą turintiems ilgalaikio gydymo

metu, nei įsotinant.

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Reikia atlikti daugiau tyrimų CYP4F2 rs1558139 G/G genotipo įtakos varfarino dozei

įvertinti. Tyrimams turėtų būti parenkamos didesnės tiriamųjų imtys.

Rekomenduojama dozuoti varfariną atsižvelgiant tiek į klinikinius, tiek į genetinius faktorius,

bei atkreipti dėmesį į praktikoje dar netaikomą informaciją apie CYP4F2 rs1558139 G/G genotipo

įtaką varfarino dozei.

32

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Spronk HMH, Govers-Riemslag JWP, ten Cate H. The blood coagulation system as a

molecular machine. Bioessays. 2003 Dec 1;25(12):1220–8.

2. Esnouf MP, Macfarlane RG. Enzymology and the Blood Clotting Mechanism. In: Nord FF,

editor. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology [Internet]. John

Wiley & Sons, Inc.; 1968 [cited 2016 March 3]. p. 255–315. Available from:

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470122754.ch6/summary.

3. Davie EW. A Brief Historical Review of the Waterfall/Cascade of Blood Coagulation. J Biol

Chem. 2003 Dec 19;278(51):50819–32.

4. Gurudevan SV, Malouf PJ, Auger WR, Waltman TJ, Madani M, Raisinghani AB, et al.

Abnormal Left Ventricular Diastolic Filling in Chronic Thromboembolic Pulmonary

Hypertension: True Diastolic Dysfunction or Left Ventricular Underfilling? Journal of the

American College of Cardiology. 2007 Mar 27;49(12):1334–9.

5. Kurnik D, Loebstein R, Halkin H, Gak E, Almog S. 10 years of oral anticoagulant

pharmacogenomics: what difference will it make? A critical appraisal. Pharmacogenomics.

2009 Dec 1;10(12):1955–65;

6. Verheugt FWA. Anticoagulant management in the cardiovascular setting. Fundamental &

Clinical Pharmacology. 2012 Feb 1;26(1):11–5;

7. O’Reilly RA. Vitamin K and the Oral Anticoagulant Drugs. Annual Review of Medicine.

1976;27(1):245–61;

8. Toon S, Hopkins KJ, Garstang FM, Aarons L, Sedman A, Rowland M. Enoxacin-warfarin

interaction: Pharmacokinetic and stereochemical aspects. Clinical Pharmacology &

Therapeutics. 1987 Jul 1;42(1):33–41.

9. European directorate for the quality of medicines and health care. Warfarin sodium. In:

European Pharmacopoeia. 7.0 ed. Strasbourg; 2011. p. 3217–8.

10. Kerr JS, Li H-Y, Wexler RS, Robinson AJ, Robinson CS, Boswell GA, et al. THE

CHARACTERIZATION OF POTENT NOVEL WARFARIN ANALOGS. Thrombosis

Research. 1997 Oct 15;88(2):127–36.

11. Pérez-Andreu V, Roldán V, González-Conejero R, Hernández-Romero D, Vicente V, Marín

F. Implications of pharmacogenetics for oral anticoagulants metabolism. Curr Drug Metab.

2009 Jul;10(6):632–42.

12. Drug Result Page - MICROMEDEX® [Internet]. [cited 2016 March 10]. Available from:

http://www.micromedexsolutions.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/micromedex2/librarian/

CS/71F3C5/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/962

33

445/ND_PG/evidencexpert/ND_B/evidencexpert/ND_AppProduct/evidencexpert/ND_T/evide

ncexpert/PFActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?SearchTerm=warfarin&UserSearchT

erm=warfarin&SearchFilter=filterNone&navitem=searchALL#close.

13. Nutescu EA, Burnett A, Fanikos J, Spinler S, Wittkowsky A. Pharmacology of anticoagulants

used in the treatment of venous thromboembolism. J Thromb Thrombolysis. 2016;41:15–31;

14. Harter K, Levine M, Henderson SO. Anticoagulation Drug Therapy: A Review. West J Emerg

Med. 2015 Jan;16(1):11–7.

15. Moyer TP, O’Kane DJ, Baudhuin LM, Wiley CL, Fortini A, Fisher PK, et al. Warfarin

Sensitivity Genotyping: A Review of the Literature and Summary of Patient Experience.

Mayo Clin Proc. 2009 Dec;84(12):1079–94.

16. Ageno W, Gallus AS, Wittkowsky A, Crowther M, Hylek EM, Palareti G. Oral Anticoagulant

Therapy. Chest. 2012 Feb;141(2 Suppl):e44S – e88S.

17. Blann AD, Fitzmaurice DA, Lip GYH. Anticoagulation in hospitals and general practice.

BMJ. 2003 Jan 18;326(7381):153–6.

18. Lane DA, Lip GYH. Maintaining Therapeutic Anticoagulation: The Importance of Keeping

“Within Range.” Chest. 2007 May;131(5):1277–9.

19. Nishimura RA, Otto CM, Bonow RO, Carabello BA, Erwin III JP, Guyton RA, et al. 2014

AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: A report of

the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice

Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 2014 Jul;148(1):e1–132.

20. Daba FB, Tadesse F, Engidawork E. Drug-related problems and potential contributing factors

in the management of deep vein thrombosis. BMC Hematol [Internet]. 2016 Feb 4 [cited 2016

April 2];16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4743403/.

21. White PJ. Patient Factors That Influence Warfarin Dose Response. Journal of Pharmacy

Practice. 2010 Jun 1;23(3):194–204.

22. Demirkan K, Stephens MA, Newman KP, Self TH. Response to warfarin and other oral

anticoagulants: effects of disease states. South Med J. 2000 May;93(5):448–54; quiz 455.

23. Holbrook AM, Pereira JA, Labiris R, et al. SYstematic overview of warfarin and its drug and

food interactions. Arch Intern Med. 2005 May 23;165(10):1095–106.

24. Wen S-Y, Wang H, Sun O-J, Wang S-Q. Rapid detection of the known SNPs of CYP2C9

using oligonucleotide microarray. World J Gastroenterol. 2003 Jun 15;9(6):1342–6.

25. Ta Michael Lee M, Klein TE. Pharmacogenetics of warfarin: challenges and opportunities. J

Hum Genet. 2013 Jun;58(6):334–8.

34

26. VKORC1 vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 [Homo sapiens (human)] - Gene -

NCBI [Internet]. [cited 2016 March 23]. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/79001.

27. Militaru F, Vesa S, Pop T, Buzoianu A. Pharmacogenetics aspects of oral anticoagulants

therapy. J Med Life. 2015;8(2):171–5.

28. Montes R, Ruiz de Gaona E, Martínez-González MÁ, Alberca I, Hermida J. The c.−1639G >

A polymorphism of the VKORC1 gene is a major determinant of the response to

acenocoumarol in anticoagulated patients. British Journal of Haematology. 2006 Apr

1;133(2):183–7.

29. CYP4F2 cytochrome P450 family 4 subfamily F member 2 [Homo sapiens (human)] - Gene -

NCBI [Internet]. [cited 2016 March 23]. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8529.

30. Alvarellos ML, Sangkuhl K, Daneshjou R, Whirl-Carrillo M, Altman RB, Klein TE.

PharmGKB summary: very important pharmacogene information for CYP4F2.

Pharmacogenet Genomics. 2015 Jan;25(1):41–7.

31. SUN X, YU W-Y, MA W-L, HUANG L-H, YANG G-P. Impact of the CYP4F2 gene

polymorphisms on the warfarin maintenance dose: A systematic review and meta-analysis.

Biomed Rep. 2016 Apr;4(4):498–506.

32. Yu C, Yan Q, Fu C, Shi W, Wang H, Zeng C, et al. CYP4F2 genetic polymorphisms are

associated with coronary heart disease in a Chinese population. Lipids Health Dis. 2014 May

20;13:83.

33. Powledge TM. The polymerase chain reaction. Advances in Physiology Education. 2004 Jun

1;28(2):44–50.

34. Bartlett JS, Stirling D. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Bartlett JS,

Stirling D, editors. PCR Protocols [Internet]. Humana Press; 2003 [cited 2016 January 13]. p.

3–6. (Methods in Molecular BiologyTM

). Available from: http://dx.doi.org/10.1385/1-59259-

384-4%3A3.

35. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, et al. Enzymatic

amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of

sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350–4.

36. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonák J, Lind K, et al. The real-time

polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006 Apr;27(2–3):95–125.

37. Wilhelm J, Pingoud A. Real-Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem. 2003 Nov

7;4(11):1120–8.

35

38. Fraga D, Meulia T, Fenster S. Real-Time PCR. In: Current Protocols Essential Laboratory

Techniques [Internet]. John Wiley & Sons, Inc.; 2008 [cited 2016 April 6]. Available from:

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470089941.et1003s08/.

39. Ghijben P, Lancsar E, Zavarsek S. Preferences for Oral Anticoagulants in Atrial Fibrillation: a

Best–Best Discrete Choice Experiment. PharmacoEconomics. 2014 Jul 16;32(11):1115–27.

40. Francis B, Lane S, Pirmohamed M, Jorgensen A. A Review of A Priori Regression Models for

Warfarin Maintenance Dose Prediction. PLoS One [Internet]. 2014 Dec 12 [cited 2016 March

31];9(12). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4264860/.

41. Wang Y, Bajorek B. New Oral Anticoagulants in Practice: Pharmacological and Practical

Considerations. Am J Cardiovasc Drugs. 2014 Jan 23;14(3):175–89.

42. Yu Z, Ding Y-L, Lu F, Miao L-Y, Shen Z-Y, Ye W-X. Warfarin dosage adjustment strategy in

Chinese population. Int J Clin Exp Med. 2015 Jun 15;8(6):9904–10.

43. Santos PCJL, Marcatto LR, Duarte NE, Gadi Soares RA, Cassaro Strunz CM, Scanavacca M,

et al. Development of a pharmacogenetic-based warfarin dosing algorithm and its performance

in Brazilian patients: highlighting the importance of population-specific calibration.

Pharmacogenomics. 2015 Jun 1;16(8):865–76.

44. Heimark LD, Wienkers L, Kunze K, Gibaldi M, Eddy AC, Trager WF, et al. The mechanism of

the interaction between amiodarone and warfarin in humans. Clin Pharmacol

Ther. 1992;51:398–407.

45. Wypasek E, Cieśla M, Suder B, Janik Ł, Sadowski J, Undas A. CYP2C9 Polymorphism and

Unstable Anticoagulation with Warfarin in Patients Within the First 3 Months Following Heart

Valve Replacement. Adv Clin Exp Med. 2015 Aug;24(4):607–14.

46. Rouleau-Mailloux É, Shahabi P, Dumas S, Feroz Zada Y, Provost S, Hu J, et al. Impact of

regular physical activity on weekly warfarin dose requirement. J Thromb Thrombolysis.

2016;41:328–35.

47. Limdi NA, Brown TM, Yan Q, Thigpen JL, Shendre A, Liu N, et al. Race influences warfarin

dose changes associated with genetic factors. Blood. 2015 Jul 23;126(4):539–45.

48. Yan X, Yang F, Zhou H, Zhang H, Liu J, Ma K, et al. Effects of VKORC1 Genetic

Polymorphisms on Warfarin Maintenance Dose Requirement in a Chinese Han Population.

Med Sci Monit. 2015 Nov 19;21:3577–84.

49. Limdi N, Arnett D, Goldstein J, Beasley T, McGwin G, Adler B, et al. Influence of CYP2C9

and VKORC1 on warfarin dose, anticoagulation attainment and maintenance among European

American and African Americans. Pharmacogenomics. 2008 May;9(5):511–26.

36

50. Liang R, Wang C, Zhao H, Huang J, Hu D, Sun Y. Influence of CYP4F2 genotype on warfarin

dose requirement–a systematic review and meta-analysis. Thrombosis Research. 2012 Jul

1;130(1):38–44.

51. Borgiani P, Ciccacci C, Forte V, Sirianni E, Novelli L, Bramanti P, et al. CYP4F2 genetic

variant (rs2108622) significantly contributes to warfarin dosing variability in the Italian

population. Pharmacogenomics. 2009 Feb 1;10(2):261–6.

52. McDonald MG, Rieder MJ, Nakano M, Hsia CK, Rettie AE. CYP4F2 Is a Vitamin K1

Oxidase: An Explanation for Altered Warfarin Dose in Carriers of the V433M Variant. Mol

Pharmacol. 2009 Jun 1;75(6):1337–46.

53. Wang H-J, Ma C, Yang J, Xu Q, Zhang Y, Gao L, et al. CYP4F2 polymorphism as a genetic

risk factor for major hemorrhagic complications in Chinese patients on warfarin therapy. J

Geriatr Cardiol. 2012 Jun;9(2):209–10.

37

8. PRIEDAI

8.1. LSMU KI MKL taikoma DNR ekstrakcijos metodika

38

39

40

8.2. Magistro baigiamojo darbo rezultatų pristatymas tarptautinėje

mokslinėje konferencijoje

Alina Kondratovič, Vacis Tatarūnas. Pharmacogenomics of warfarin: impact of clinical and

genetic factors on warfarin dosage after heart valve surgery. The 6th

International Pharmaceutical

Conference “SCIENCE AND PRACTICE 2015”. 2015 m. lapkričio 5-6 d. Kaunas, Lietuva. Buvo

pristatytas stendinis pranešimas bei tezių knygoje atspausdinta santrauka.