Click here to load reader

Úvod do studia cytologie a histologie

  • View
    93

  • Download
    7

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Úvod do studia cytologie a histologie. Základní pojmy. Metody studia buněk a tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace, značení a zpracování vzorků. Základy mikroskopování. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241. - PowerPoint PPT Presentation

Text of Úvod do studia cytologie a histologie

  • vod do studia cytologie a histologieZkladn pojmy. Metody studia bunk a tkn. Histologick prepart. Odbr, fixace, znaen a zpracovn vzork. Zklady mikroskopovn.stav histologie a embryologieMUDr. Blanka ZajcovObecn histologie a obecn embryologie, kd B02241

  • Histologick vyeten:soust klinickch vyetovacch metodumouje stanovit diagnzu, rozpoznn nemoci je pedpokladem sprvn lby pacientametoda vdeck prceHistologick technikasoubor postup, metod a pstup, kter vedou ke zhotoven prepartuPrepart: tenk ez tkn (pro svtelnou mikroskopii 6-8m)zpracovn histologickou metodouzamontovn pod kryc sklopipraven ke studiu pod svtelnm mikroskopem

  • Odbr materiluZpsoby odbru: 1. Nekropsie z mrtvho organismu, max. 12-24 h po smrti 2. Biopsie ze ivho organismu (peroperan biopsie)Odbr mus bt rychl, etrn a bezpen pro pacienta.

    Excize vyznut skalpelem, iletkou, nesm se pli pokodit tkPunkce ir jehla se stkakou, nap. kostn de, jtra, ledvinyMikroabraze kyreta, vyeten endometriaStr, ntr tamponem nebo ttekem se oloupou buky, nap. poevn cytologieEndoskopick odbr, laparoskopie

    Odebran vzorky mus bt okamit fixovny, oznaeny.Prvodn list k zsilce histologickho materilu.

  • Odbr materiluSmrt peruen koordinan a obrann innosti organismu, zsoben ivinami a kyslkem, odvodu metabolitAutolza samovoln rozklad tkn zpsoben nekoordinovanou innost vlastnch endogennch enzymatickch systmHniloba rozklad tkn vnjmi initeli (exogenn enzymy nap. z bakteri, plsn)Autolza i hniloba poruuj strukturu a barvitelnost vzorku, takov vzorek nelze hodnotit. Zabrnit znehodnocen lze rychlou fixac vzorku. Zsady odbru materilu:Odebrat erstv materiletrnm zpsobemdn oznaitOkamit fixovatVyplnit prvodku

  • FixaceFixace - rychl a etrn konzervace tkn fixanmi prostedky

    Fyzikln fixan prostedky: ovlivuj transportn funkci vody a tm naru enzymaticky katalyzovan reakce v bukch - fixace psobenm nzk teploty: rychl zmrazen, such led, zkapalnn plyny (tekut dusk) - fixace vysuenm tkn za nzk teploty (freezing-drying): mrazov sublimace, histochemie prkaz aktivity enzym - fixace mikrovlnnm zenmChemick fixan prostedkyZaloeny na psoben par nebo roztok innch ltek fixanch tekutin,kter ve vhodn koncentraci vyvolvaj jemnou a etrnou denaturacienzymovch protein.Fyzikln chemick metody - kombinace pedchozch, nap. chlazen fixan tekutina

  • Poadavky na fixacimus rychle psobit v celm vzorkumus dobe uchovat strukturu bunk a tknmus umoovat dal poadovan zpracovn, vyeten

    Z toho dvodu mus bt vzorky pimen velk: pro svtelnou mikroskopii max. 1cm3, spe plotnky.Fixan tekutiny mus bt nadbytek 20 a 50x vt objem.Vzorek se nesm pilepit ke dnu ani plavat neponoen.Dostaten velk hrdlo ndobky, dn uzaven.Sprvn oznaen materilu: nalepovac ttek + oznaen pmo ke vzorku. Nesm dojt k zmn materilu!danka na histologick vyeten.

  • Fixan prostedkyFormol: 100% formol je 40% vodn roztok formaldehyduNejpouvanj, dostupn, relativn levn. Neutrln formol: neutralizovan uhliitanem vpenatm (asi lhve), bn pouvan koncentrace je 10%Rychle pronik do tkn, je etrn, zachovv strukturu, dobe se po nm barv. Fixujeme asi 24h, men kousky i mn, nememe pefixovat.slan formol (edn fyziologickm roztokem)pufrovan formol

    Bakerova tekutina:10% formol, chlorid vpenat, vodaVhodn pro prkaz lipid, enzym vzanch na membrny.

  • Fixan prostedky

    Bromformol: 15% formol, bromid amonn Pouit u impregnanch metod, prkaz gliovch bunk v nervov tkni.

    Bouinova tekutina: 25% formol, kys. pikrov, ledov kyselina octov - 5ml tsn ped pouitmPo fixaci se dv do 80% etanolu. Neme pefixovat. Nevhody: nehod se pro fixaci krevnatch orgn, nen vhodn pro prkaz lipid

  • Fixan prostedkyFixan tekutiny se sublimtem:SUSA:sublimt (chlorid rtunat), chlorid sodn, formol, destilovan voda, kyselina trichloroctov, ped pouitm ledov kyselina octovVborn pro cytologii, kosti, zuby, chrupavky.Pen se rovnou do 90% etanolu, v nm se provd jdovn. Jdovn odstrann sublimtovch sraenin (vznikaj pi fixaci) nap. v Lugolov roztoku i jdov tinktue.

    Zenkerova tekutina: sublimt, dvojchroman draseln, sran sodn, destilovan voda, ledov kyselina octov, NEN FORMOL!Fixace 24h, pak vyprn bloku v tekouc vod (24h), pak 70% etanol a jdovn.

  • Fixan prostedkyEtanol: pouit zejmna v neurohistologii Nisslova metoda. Tk se znandehydratuje a extrahuj se tuky zvraznn komplex granulrnhoendoplazmatickho retikula (Nisslova substance), ta se pak barv nap.thioninem.

    Aceton: 0-40C, enzymov histochemie

    Osmiumtetroxid: zkladn prostedek fixace v technice elektronov mikroskopie. Pro svtelnoumikroskopii se nehod pronik pomalu do tkn.

  • ZalvnPro bn histologick vyeten je poteba odebran a fixovan materil nakrjetna ezy 4-8m siln. Po prosycen tkn tekutm zalvacm mdiem mdiumztuhne a zv konzistenci (tvrdost, pevnost) vzorku, co umon krjet tenk ezy.

    1. Mdia rozpustn ve vod: celodal, elatina, metakryltov uml pryskyiceVhodn proto, e po fixaci a vyprn ve vod meme pmo prosycovat, zalvat a tvrdit. 2. Mdia nerozpustn ve vod: parafin, celoidin, uml epoxidov pryskyiceZalvn do tchto mdi vyaduje nejprve dkladn odvodnn vzorku a prosycen intermdiem (ltka, kter se ms s odvodujcm i zalvacm mdiem). Teprve pak prosycujeme zalvacm mdiem.

  • Zalvn do parafnuNejpouvanj metoda, nevhodn ale k zalvn tuhch tkn, prkazu lipid.Nevhoda: smrtn tkn pi odvodnn, prosycovn pi vysok teplot

    Etapy:A/ odvodnn tkn dehydrataceVzestupn ada alkohol - etanolu (30-50-70-80-90-96-100%)- mus bt etrn, prvn pouit koncentrace zvis na obsahu vody ve tkni (nap. embryonln tkn zanaj 30%, lacha i zub i 90%, po fixaci Bouinovou tekutinou 80%, SUSA 90%)- kad lze nkolik hodin, 2x se vymuje, celkem 1-2 dny

    B/ prosycen tkn intermdiem, projasnnbenzen, xylen, toluen, metylsalicylt, metylbenzotIntermdium mus rozpoutt parafn a msit se se 100% alkoholem. Vysok index lomu, provd se ve 3 lznch po 15 minutch.

  • C/ prosycen tekutm parafnemparafn 560C 3 lzn parafnu pi 560C, 1. lze asi 2-4h, 2. lze 4-6h, 3. lze 8-12h, celkem cca 24 hodin. Teplota nesm pekroit 580C.

    D/ vlastn zalitV zalvac komrce, pouv se vhradn zkvalitnn parafn (zaht na 800C, pid se 3-5% velho vosku a pefiltruje).Bloek se penese pinzetou, nahtou preparan jehlou se zorientuje, nech ztuhnout. Stle u vzorku mus zstat znaen.

    E/ tvrzen mdiaRovnomrn tuhnut pi pokojov teplot, prava bloku, pitmelen na podloku. Pro rutinn zpracovn histologickch vzork se pouvaj zalvac automaty.

  • Zalvn do celoidinuPouit: tuh tkn, lachy, chrupavky, zuby, odvpnn kostiVhoda: pokojov teplota Nevhody: trv dlouho, nelze pout pro lipidy, ndobky mus bt dobe uzavenPostup: - odvodnn vzestupnou adou alkohol - prosycen alkoholterem - vzestupn ada celoidinu (2%,4%,8%,10%) - vlastn zalit do 10% celoidinu a tuhnut - tvrzen bloku v 70-80% alkoholuZalvn do elatinyPouit: dk struktury placenta, sliznice steva, prkaz lipid ad.

    Postup: - vyprn ve vod - prosycen elatinou ve stoupajcch koncentracch (10% a 15% vodn roztok) - vlastn zalit do 15% nebo 20% roztoku elatiny v komrce - tvrzen v 10-20% formolu Krjen na kryostatu!

  • Krjen ezKrj ezy cca 6-10 mSkov mikrotom: krj parafn, celoidin, celodalRotan mikrotom: parafnov bloky zhotoven sriovch ez, nap. embryologieZmrazovac mikrotom krjen tkn nezalitch, zalitch do elatiny

  • Napnn a lepen parafnovch ezezy se napnaj na vodn hladin (povrchov napt) a lep na podlon sklo nap:sms blku a glycerinu 1:1 Nelze pout nap. pro imunohistochemii, impregnaci. Na sklko se rozete blek s glycerinem, penese se ez a podlije destilovanou vodou. Nataen na napnac plotnce. Oznaen podlonho skla! Surna.roztokem elatiny 0,5 a 1%ezy se podlvaj elatinou, surna, koagulace elatiny.

  • Svteln mikroskopMechanick st: stativ, stolek, roubyOptick st: objektiv, okulrOsvtlovac zazen: svtlo, kondenzor, clony

    Druhy objektiv: such, imerznRozliovac schopnost mikroskopu dna jeho stavbou a optickmi vlastnostmi objektivu je vyjdena numerickou aperturou.NA = n*sin n je index lomu media, je polovina otvorovho hlu objektivuRozliovac schopnost je minimln vzdlenost 2 bod, kter memerozliit, mezn hodnota u svtelnho mikroskopu pi pouit ikmhoosvtlen je asi 0,2m.Pednkov prezentace je urena vhradn pro osobn studium student 1. LF UK.

    **

Search related