Untersuchungen zur Neovaskularisation und Degradation ... · Die Blutversorgung der Haut erfolgt über arterielle Äste der Subkutis, die sich meistens von den muskulären Perforansgefäßen

Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil -Universitätsklinik-

der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. H.-U. Steinau

Untersuchungen zur Neovaskularisation und Degradation

synthetischer PEGT/PBT- Block-Kopolymermatrizen nach Implantation in die transparente Rückenhautkammer

von Balb/c-Mäusen.

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Andrej Ring

aus Pawlowka 2004

Dekan: Referent: Korreferent:

Prof. Dr. med. G. Muhr Prof. Dr. med. H.-U. Steinau PD Dr. med. P. M. Faustmann

Tag der Mündlichen Prüfung: 12.04.2005

MEINEN ELTERN IN DANKBARKEIT GEWIDMET

Inhaltsverzeichnis

I

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINFÜHRUNG ...........................................................................................................3 1.1. Einleitung ................................................................................................................3

1.2.1. Verbrennungstrauma ...........................................................................................4

1.2.2. Aufbau und Funktionen des Hautorgans .............................................................5

1.2.3. Pathophysiologie des Verbrennungstraumas ......................................................7

1.2.4. Tiefengrade der Hautverbrennung.......................................................................9

1.2.5. Therapiestrategien .............................................................................................11

1.3.1. Hautersatzmaterialien ........................................................................................12

1.3.2. Komposit-Hautersatz..........................................................................................14

1.4.1. Synthetische Biomaterialien und ihre klinische Anwendung..............................16

1.4.2. Struktur und Eigenschaften von synthetischen Polymeren................................17

1.4.3. Chemische Struktur des PEGT/PBT(Polyester-Polyether)-Kopolymers............19

1.5. Biokompatibilität und Biodegradation synthetischer Polymer-Implantate .............20

1.6. Fremdkörperreaktion.............................................................................................21

1.7. Neovaskularisation................................................................................................22

1.7.1. Vaskulogenese...................................................................................................22

1.7.2. Angiogenese ......................................................................................................23

1.7.3. Grundschritte der Angiogenese .........................................................................24

1.8. Vaskularisation von synthetischen Polymer-Materialien.......................................28

1.9. Ziele der Untersuchungen.....................................................................................29

Inhaltsverzeichnis

II

2. METHODEN.............................................................................................................30

2.1. Das Modell der transparenten Rückenhautkammer .............................................31

2.2. Versuchstiere ........................................................................................................32

2.3. Implantationstechnik der transparenten Rückenhautkammer...............................33

2.4. PEGT/PBT-Kopolymermatrizen (Scaffold-Implantate)..........................................37

2.5. Implantation der Scaffold-Implantate ....................................................................39

2.6. Makroskopische Untersuchung und Photodokumentation....................................41

2.7. Einschlusskriterien für die Kammerpräparationen ................................................41

2.8. Explantation der Implantate ..................................................................................42

2.9. Lichtmikroskopische Untersuchung ......................................................................43

2.10. Einschlusskriterien für die mikroskopische Blutgefäß- und Zellzählung………...44

2.11. Testung der Reproduzierbarkeit und der Präzision der Zähltechnik...................45

2.12. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung (REM) .....................................45

2.13. Digitale Bildanalyse der REM-Aufnahmen..........................................................46

2.14. Statistik................................................................................................................47

Inhaltsverzeichnis

III

3. ERGEBNISSE..........................................................................................................48

3.1. Makroskopische Untersuchungen.........................................................................48

3.2. Reproduzierbarkeit und Präzision der Zähltechnik ...............................................50

3.3. Zelluläre Entzündungsantwort...............................................................................52

3.3.1. Untersuchungstag 7 post implantationem..........................................................53

3.3.2. Untersuchungstag 14 post implantationem........................................................54


3.3.4. Kapselgewebe....................................................................................................58

3.4. Neovaskularisation................................................................................................61




3.5. Degradation und Matrixflächenanalyse.................................................................68




3.5.5. Implantatdickenänderung...................................................................................74

Inhaltsverzeichnis

IV

4. DISKUSSION ...........................................................................................................76

4.1. Diskussion zum Rückenhautkammer-Modell ........................................................76

4.2. Diskussion zur Analyse der postimplantativen Matrixflächenänderung................77

4.3. Diskussion zur Neovaskularisation der PEGT/PBT-Kopolymermatrizen .............79

4.4. Diskussion zu Entzündungsantwort und Fremdkörperreaktion.............................82

4.5. Diskussion zum Degradationsverhalten der PEGT/PBT-Kopolymermatrizen ......86

5. ZUSAMMENFASSUNG ...........................................................................................89

6. LITERATURVERZEICHNIS .....................................................................................93

7. DANKSAGUNGEN.................................................................................................100

8. LEBENSLAUF........................................................................................................101

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

V

VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN AUF Apikales Untersuchungsfeld

BUF Basales Untersuchungsfeld

bzw. beziehungsweise

ca. circa

d Tag/Tage

d.h. das heißt

etc. et cetera

FITC-Dextran Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran

h Stunde/Stunden

HE Hämatoxylin/Eosin-Färbung

i.p. intraperitoneal

i.v. intravenös

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

KOF Körperoberfläche

LM Lichtmikroskopie

mg Milligramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µM n n

Mikromol Stichprobenumfang bzw. Gruppengröße Polymerisierungsgrad

PBT Polybutylenterephtalat

PD Porendiameter

PEGT Polyethylenglykolterephtalat

p.impl. post implantationem

REM Rasterelektronenmikroskopie

s.c. subkutan

sog. sogenannt

u.a. und andere, unter anderem

usw. und so weiter

vs. versus

z.B. zum Beispiel

Einführung

3

1. EINFÜHRUNG 1.1. Einleitung Die offene Wundfläche nach einem Verbrennungstrauma verursacht einen Verlust von Flüssigkeit, Elektrolyten, Eiweiß und bietet eine ungeschützte Eindringpforte für pathogene Mikroorganismen. Durch Verbrennung verursachtes tiefes Hautgewebstrauma, welches mit komplettem Verlust von Epidermis und Dermis einhergeht, impliziert zugleich den Verlust der autoregenerativen Kapazität des Hautorgans. Insbesondere wenn sich das tiefe Verbrennungstrauma auf größere Areale der Körperoberfläche ausdehnt, sind die Möglichkeiten einer Eigen-Spalthaut-Verpflanzung limitiert. Eine frühzeitige Wiederherstellung des Wundverschlusses und Schaffung eines suffizienten Hautersatzes nach einer radikalen operativen Entfernung von ausgedehnten zerstörten Gewebearealen sind die zentralen Probleme in der Verbrennungsbehandlung [1]. Fortdauernd werden Versuche zur Entwicklung neuartiger Hautersatzprodukte unternommen. Ein Hautersatzmaterial für die chirurgische Behandlung von Verbrennungswunden würde nicht nur die Überlebenschancen von Verbrennungspatienten substantiell verbessern, sondern auch zu besseren Wiederherstellung der Organfunktion und damit erhöhten Lebensqualität der Patienten führen.

Einführung

4

1.2.1. Verbrennungstrauma Die Inzidenz thermischer Verletzungen in westlichen Industrieländern wird mit 5-10% angegeben. Jährlich erleiden in der Bundesrepublik Deutschland fast 20.000 Kinder und Erwachsene thermische Verletzungen unterschiedlicher Schweregrade. Nach Angaben der Deutschsprachigen Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungsmedizin (DAV) waren im Jahr 1996 aus den Intensivstationen der 14 größten Zentren für Behandlung Schwerbrandverletzter in Deutschland, 893 Patienten mit einer verbrannten Körperoberfläche von durchschnittlich 27,4% gemeldet. 19,9% dieser Patienten verstarben trotz einer Intensivbehandlung. Eine schwere, d.h. tiefe und ausgedehnte Verbrennung bedeutet ein maximales Trauma für den Patienten und stellt ein großes medizinisches als auch sozioökonomisches Problem dar [2]. Die Pathophysiologie der Verbrennung geht weit über die lokalen Wundvorgänge hinaus. Die systemischen Auswirkungen der Verbrennung durch die lokal entstandenen Endotoxine und Entzündungsmediatoren können zur Entstehung der Verbrennungskrankheit mit häufig letalem Ausgang führen [3].

Einführung

5

1.2.2. Aufbau und Funktionen des Hautorgans Die Haut ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Stabilität des Innenlebens. Sie ist das größte Organ des Menschen, ein ausgedehnter Hautverlust ist nicht mit dem Leben vereinbar. Die Haut besteht aus einer dünneren epithelialen Schicht aus verhorntem mehrschichtigen Plattenepithel, der Epidermis, und einer dickeren bindegewebigen Schicht, der Dermis. Die beiden Schichten sind voneinander durch eine Basalmembran getrennt (Abb. 1). Das Unterhautfettgewebe, die Subkutis, in welche die Dermis übergeht, verbindet die Haut mit ihrer Unterlage. Die Haut besitzt verschiedene Anhangsstrukturen wie Haare, Nägel und Drüsen, welche sich von der Epidermis ableiten. Die Epidermis besteht aus mehreren Schichten von Hautzellen, den Keratinozyten. Andere Zelltypen wie Melanozyten und Langerhans-Zellen sind in der Epidermis verstreut. Sie produzieren das schützende Hautpigment bzw. spielen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr. Bei der Epidermis unterscheidet man die basalen und suprabasalen Schichten. Die Keratinozyten der basalen Schicht, des Stratum basale, stehen im Kontakt zur Basalmembran. Im Stratum basale sind teilungsfähige Zellen angesiedelt. Die Zellen der suprabasalen Schicht bestehen aus mehreren Zelllagen und besitzen keine Teilungsfähigkeit. Sie erfüllen im Wesentlichen eine Schutzfunktion. In der Dermis werden zwei Schichten unterschieden. Die obere zellreichere Dermisschicht, das Stratum papillare und das untere Stratum reticulare. Die Zellen der Dermis sind zum größten Teil die Fibroblasten. Sie bilden die Grundsubstanz der Dermis, die extrazelluläre Matrix. Diese besteht aus Kollagen, retikulären Fasern, Elastin und Glykosaminoglykanen. In der Dermis findet man auch Nervenfasern. Die Blutversorgung der Haut erfolgt über arterielle Äste der Subkutis, die sich meistens von den muskulären Perforansgefäßen abzweigen. Sie bilden in der Dermis das oberflächliche und das tiefe Kapillarnetz aus. Die Epidermis selbst besitzt keine Blutgefäße und wird durch die Diffusion aus der Dermisschicht mit Nährstoffen versorgt. Dem Hautorgan kommen wichtige physiologische Funktionen zu. Die Haut erfüllt eine Schutzfunktion u.a. gegen mechanische, chemische, thermische und bakterielle Einwirkungen. Sie spielt eine wichtige Rolle bei der Thermoregulation des

Einführung

6

Körpers und reguliert den Flüssigkeits-, Eiweiß- und Elektrolythaushalt. Die Haut besitzt weiterhin immunologische, endokrinologische sowie sensorische Funktionen.[4]

Epid

erm

isDe

rmis

Subk

utis

BasalmembranStratum basale

Kapillarnetz

Keratinozyten

Nervenfasern

Hautdrüse

Extrazelluläre Matrix

FettgewebeHaarwurzel

Abbildung 1: Schematische Darstellung der epithelialen sowie der bindegewebigen

Hautschichten. Epidermis und Dermis sind durch die Basalmembran, mit der die

teilungsfähigen Keratinozyten des Stratum basale in Kontakt stehen, getrennt.

[modifiziert nach G.H. von Donnersmarck: Verbrennungen, Zuckschwerdt, 1998]

Einführung

7

1.2.3. Pathophysiologie des Verbrennungstraumas Ein massives thermisches Trauma wie die Verbrennung, welches zur Störung der Hautfunktionen führt, ist nicht nur durch lokale pathologische Vorgänge in der Brandwunde gekennzeichnet, sondern hat darüber hinaus tiefgreifende systemische Auswirkungen auf den gesamten Organismus zufolge (Abb. 2). Bei Einwirkung großer Mengen an thermischer Energie auf die Haut kommt es zur Denaturierung der Proteine mit Verlust der Enzymfunktion und Zerstörung der Zellen. Dabei entstehen Proteine bzw. Lipoproteine, die toxisch und antigen wirken können [5]. Bei einem thermischen Trauma werden drei Zonen der Verbrennungswunde unterschieden [6]. Nekrotische Hautareale und der Verbrennungsschorf, die durch Proteindenaturierung gekennzeichnet sind, werden der Koagulationszone zugerechnet. Umgeben wird diese Zone von der sog. Stasezone mit eingeschränkter Mikrozirkulation, bedingt durch Vasokonstriktion, Schwellung der Endothelzellen und Mikrothrombosierung der Gefäße. Die Stasezone wird von der Hyperämiezone umgeben, die durch Vasodilatation mit erhöhter Durchblutung gekennzeichnet ist. Eine zunehmende Einschränkung der Mikrozirkulation in den schwergeschädigten Arealen der Stasezone kann zu einer Konversion dieser in eine Koagulationszone führen. Die Faktoren, welche zu einer Verschlechterung der Mikrozirkulation führen können sind u.a. Dehydrierung, Hypovolämie, Druck, vasokonstriktorische Medikamente und Infektionen. Auch der Ischämie-Reperfusionsschaden, in dessen Folge es zu Endothelzellveränderungen und Adhärenz der Leukozyten an der Gefäßwand kommt, kann zu einer weiteren Perfusionseinschränkung des Gewebes führen [7, 8]. Bei einer tiefen Verbrennung gehen alle Funktionen der Haut in diesem Bereich verloren. Das Zusammenbrechen der Isolierfunktion der Haut führt zu einem hohen Wasserverlust durch Verdunstung, der mit Elektrolyt- und Eiweißverlusten einhergeht. Auch fehlt der Schutz gegen eine bakterielle Invasion und die Gewebsnekrose bietet zugleich einen idealen Nährboden für Bakterien. Die aus dem nekrotischen Gewebe freigesetzten Toxine und Mediatoren wie z.B. Zytokine und Proteinasen bedingen durch ihre systemischen Wirkungen einen generalisierten Kapillarschaden

Einführung

8

(sog. capillary leak) mit erhöhter Kapillarpermeabilität und Austritt von Plasmaproteinen in das Interstitium. Ein interstitielles Ödem mit intravasalem Flüssigkeitsmangel ist die Folge. Die Wirkung der verschiedenen Mediatoren führt weiterhin zur Aktivierung von Thrombozyten, Granulozyten, des Gerinnungs- und Komplementsystems. Eine schwere verbrennungsinduzierte Immunsuppression in Verbindung mit einer systemischen Entzündungsreaktion (SIRS, systemic inflammatory response syndrome) können zu einer Multiorgandysfunktion mit Herz-, Lungen-, Nieren- und Leberversagen, führen [3, 9, 10].

BRANDVERLETZUNGBRANDVERLETZUNG

KAPILLARSCHKAPILLARSCHÄÄDIGUNGDIGUNGCAPILLARY LEAKCAPILLARY LEAK

SCHOCKSCHOCKSIRS / SEPSISSIRS / SEPSIS

VERBRENNUNGSKRANKHEITVERBRENNUNGSKRANKHEITMULTIORGANVERSAGENMULTIORGANVERSAGEN

AKTIVIERUNG DES GERINNUNGSAKTIVIERUNG DES GERINNUNGS--UND KOMPLEMENSYSTEMSUND KOMPLEMENSYSTEMS

FREISETZUNG VONFREISETZUNG VONENTZENTZÜÜNDUNGSMEDIATORENNDUNGSMEDIATOREN

VOLUMENVERLUSTVOLUMENVERLUSTÖÖDEMDEM

STSTÖÖRUNG DERRUNG DERMIKROZIRKULATIONMIKROZIRKULATION

ENDOTOXINEENDOTOXINEINFEKTIONINFEKTION

Abbildung 2: Schematische Darstellung pathophysiologischer Reaktionen und

komplexer systemischer Effekte eines schweren Verbrennungstraumas.

[in Anlehnung an Germann, G. und H.U. Steinau, Zentralbl Chir 118 (1993), 293]

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1.2.4. Tiefengrade der Hautverbrennung Die Tiefenausdehnung der Hautverbrennung wird in vier Grade (Abb. 3) eingeteilt [11, 12]. Verbrennungen ersten Grades (I°) betreffen ausschließlich die epidermale Hautschicht. Sie führen zu Gefäßerweiterung mit vermehrtem Blutzustrom in den kleinen Hautgefäßen. Charakteristisch ist ein schmerzhaftes Erythem und Ödem der Haut. Diese Verletzungen heilen ohne Narben ab. Bei zweitgradigen Verbrennungen reicht die Koagulationszone bis in die Dermis. Hier besteht eine stärkere Störung der Mikrozirkulation. Die Läsion der Gefäßwand führt zu Exudation und subepidermalen Brandblasenbildung. Abhängig von der Tiefe werden oberflächlich-zweitgradige (II a°) und tief-zweitgradige (II b°) Verbrennungen unterschieden. Bei der oberflächlich-zweitgradigen Verbrennung ist die Epidermis komplett zerstört und die Dermis nur in ihrer papillären Schicht betroffen. Die Heilung erfolgt durch Migration und Proliferation von Keratinozyten, die in den Anhangsstrukturen der tieferen Dermis überleben. Bei tief-zweitgradigen Verbrennung ist die Haut bis in die retikuläre Dermisschicht zerstört. Erfolgt keine operative Intervention, heilt eine solche Verletzung unter Bildung von Granulationsgewebe mit starker Narbenbildung aus. Die Verbrennungen dritten Grades (III°) sind durch tiefgreifende Nekrosen und Zerstörung aller Hautschichten gekennzeichnet. Sie bedürfen einer chirurgischen Exzision und nachfolgender Hautersatztransplantation. Bei Verbrennungen vierten Grades (IV°) kommt es zur Verkohlung der Haut und der tiefen Strukturen wie Muskel, Sehnen oder Knochen. Diese Verletzungen erfordern eine ausgedehnte chirurgische Therapie.

Einführung

10

III°/ IV°

Epidermis

DermisSubkutis

Muskel

I°

II°a / II°b

Brandschorf

Brandblasen

Epidermis

Dermis

Subkutis

Muskel

Epidermis

Dermis

Subkutis

Muskel

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Schweregrade der Hautverbrennung. Abgebildet ist eine zunehmende Zerstörung der Hautschichten entsprechend der Tiefenausdehnung der Verbrennung. [modifiziert nach G.H. von Donnersmarck: Verbrennungen, Zuckschwerdt, 1998]

Einführung

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1.2.5. Therapiestrategien Die modernen Therapiekonzepte zur Versorgung schwerer Verbrennungs-verletzungen haben in den vergangenen Jahren zu einer deutlichen Senkung der Letalität beigetragen. Entscheidende Verbesserungen in der Therapie schwerbrandverletzter Patienten konnten auf den Gebieten der initialen Schock -und Flüssigkeitsersatztherapie erzielt werden. Das Ziel dieser Behandlung ist die Vermeidung eines Multiorganversagens durch Kreislaufstabilisierung und ausreichende Organperfusion [2, 13, 14]. Des Weiteren ist die Beherrschung der respiratorischen Insuffizienz, des Inhalationstraumas und der Katabolie wichtige Ziele in der Therapie Schwerbrandverletzter [15-17]. Auch durch systemische und lokale antibiotische Behandlung sowie optimierte chirurgische Therapie von Verbrennungswunden wurden große Erfolge erzielt. Insbesondere durch eine frühzeitige radikale Entfernung von nekrotischem Gewebe, dem Hauptauslöser vieler pathologischer Vorgänge, werden Schocksymptomatik, Infektion und weitere Dauerschäden reduziert bzw. ganz vermieden [18-22]. Die Wunde stellt den zentralen Angriffspunkt in der Verbrennungstherapie dar. Viele schwerwiegende pathologische Vorgänge als Folge der Verbrennung können zum Teil vermieden werden, wenn die Gewebsnekrosen frühzeitig abgetragen werden. Erfolgt jedoch kein Wundverschluss, gehen die Vorteile einer solchen Frühexzision verloren. Wenn die Wiederherstellung einer suffizienten Barriere zur Umgebung nicht gewährleistet wird, droht erneut durch eine bakterielle Wundbesiedelung die Sepsis mit weiteren lebensbedrohlichen Komplikationen.

Einführung

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1.3.1. Hautersatzmaterialien Die Deckung großflächiger Wunden in der Verbrennungschirurgie erfolgt heutzutage zunehmend mittels eines Hautersatzes. Die dabei verwendeten Materialien lassen sich ihrer Funktion nach in drei Kategorien einteilen [23, 24]. Es werden zum einen unterschieden der temporäre Hautersatz zum vorübergehenden Wundverschluss durch z.B. Schweinehaut, Humanamnion, allogene Keratinozyten u.a. (Abb. 4). Zum anderen eine weitere Kategorie, der sog. semipermanente Hautersatz. Bei diesem wird das Hautersatzmaterial in die Kollagenmatrix des Empfängergewebes teils eingebaut. Beispiele dafür sind die glyzerolkonservierte Fremdhaut sowie die biosynthetische Membran Integra® [25]. Die dritte Kategorie ist der permanente Hautersatz, wie autologe Spalthaut und azelluläre allogene Dermispräparate. Diese Art von Hautersatz kann für eine dauerhafte Deckung der Brandwunde verwendet werden. Ein ideales permanentes Hauersatzmaterial sollte die Eigenschaften der Haut ausreichend imitieren können, insbesondere die Fähigkeit zum Schutz vor Infektionen, Flüssigkeits- und Wärmeverlust besitzen und langfristig akzeptable funktionelle wie kosmetische Ergebnisse liefern, schnell verfügbar und preiswert sein. Derartigen Minimalanforderungen kann gegenwärtig allerdings keines der klinisch verwendeten Hautersatzmaterialien entsprechen.

Einführung

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Abbildung 4: Überblick über einige derzeitig vorhandenen Hautersatzmaterilaien.

Erste Spalte: Produktname und Hersteller. Zweite Spalte: Schematische Darstellung

der Komponenten. Dritte Spalte: Komponentenbeschreibung. Vierte und Fünfte

Spalte: Preise. [aus Jones, I., L. Currie, and R. Martin, Br J Plast Surg 55 (2002), 187]

Einführung

14

1.3.2. Komposit-Hautersatz Derzeit weisen die experimentellen Ziele zunehmend in Richtung der sog. „composite skin grafts“. Darunter vorzustellen sind künstliche Hautersatztransplantate, die durch Kombination des Hautepithels mit einem epitheltragenden Biomaterial, welches die ursprüngliche Dermisstruktur nachahmt, zusammengesetzt werden. Die Nachahmung der Dermisschicht wird dabei durch in-vitro bzw. in-vivo prävaskularisierte synthetische Trägergerüste („scaffolds“) erreicht, welche von der sog. neodermalen Matrix (bestehend zum größten Teil aus Fibroblasten und Kollagengewebe) im Rahmen einer durch die Struktur des Biomaterials geleitete Geweberegeneration („guided tissue regeneration“) durchsetzt werden (Abb. 5). Die Verpflanzung solcher Scaffolds könnte dann mit einer Kotransplantation von ultra-dünner Spalthaut oder kultivierten autologen Keratinozyten unter Verwendung von konfluenten Zellrasen oder anderen Zellübertragungssystemen, kombiniert werden [26-31]. Dieser neuartige Ansatz zur Behandlung von tiefen und ausgedehnten Verbrennungswunden wird als „Komposit“-Hautersatztechnologie bezeichnet. Wie bei der Spalthautverpflanzung, sind auch die Transplantate aus kultiviertem Epithel auf ein gut vorbereitetes Wundbett vor der Übertragung angewiesen. Daher kann diese Technik nur erfolgversprechend sein, wenn die Dermisregeneration mit Ausbildung von ausreichend vaskularisietem neodermalem Gewebe einhergeht, welches als Substrat für epitheliale Transplantate dienen kann.

Einführung

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EPIDERMALE TEILUNGSFÄHIGE

ZELLE

AUTOLOGE EPIDERMIS „LEERE“ MATRIX EINES SCAFFOLD-IMPLANTATS

KOMPOSIT-HAUTERSATZ

MATRIXPOREN

GENERIERUNG VON ZELLRASEN AUS AUTOLOGER KERATINOZYTEN-KULTUR

PRÄVASKULARISATION DES BIOMATERIALS

KOTRANSPLANTATION

PORENINFILTRATIONDURCH

BLUTGEFÄSSE

EPITHELIALER ZELLRASEN

Abbildung 5: Komposit-Hautersatztechnologie. Nach Isolierung von teilungsfähigen

Keratinozyten erfolgt die Kultivierung eines autologen epithelialen Zellrasens. Dieser

wird anschließend auf ein prävaskularisiertes Biomaterial übertragen.

[modifiziert nach P.Bianco and P.G. Robey, Nature 414 (2001), 119]

Einführung

16

1.4.1. Synthetische Biomaterialien und ihre klinische Anwendung Eine große Vielfalt von Biomaterialien, meistens aus der Klasse der Polymere wie z.B. Polyethylen (PE), Polylaktid (PLA), Polyglykolid (PGA), etc., werden in Form von dreidimensionalen Trägermatrizen als Dermisersatzmaterialien eingesetzt. Die Polymerstoffe sind in einer großen Varietät der Zusammensetzungen und Eigenschafen erhältlich und können zu komplexen Formen und Strukturen synthetisiert werden. Synthetische dreidimensionale Polymermatrizen spielen daher eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Materialien zur Restauration schwerer struktureller Gewebsdefekte und der biologischen Funktionen des beschädigten Gewebes. Der Einsatz von synthetischen Polymer-Biomaterialien in der Chirurgie hat in den letzten 20 Jahren ständig zugenommen. Eine Vielzahl von Implantaten unterschiedlichster Polymerzusammensetzung und Bearbeitung wird durch Verwendung zusätzlicher neuerer Materialien und Herstellungstechnologien fortwährend ergänzt. Aufgrund ihrer biologischen und mechanischen Eigenschaften werden Polymere für unterschiedliche Anwendungen in der Chirurgie wie z.B. als resorbierbares Nahtmaterial, als künstlicher Herzklappen- und Gefäßersatz, als Osteosynthesematerial in der Frakturbehandlung und bei der Weichteil- und Bandrekostruktion an Gelenken genutzt.

Einführung

17

1.4.2. Struktur und Eigenschaften von synthetischen Polymeren Bei den synthetischen Polymeren handelt es sich um organische Verbindungen, die aus Makromolekülen aufgebaut sind. Die Bildung solcher Makromoleküle erfolgt aus niedermolekularen Verbindungen, die als Monomere bezeichnet werden. Im Verlauf von Polyreaktionen werden Monomere durch unterschiedliche Reaktionsmechanismen zu Polymeren verknüpft. Polyreaktionen sind statistisch verlaufende Reaktionen, die in drei verschiedene Typen unterteilt werden. Die Polymerisation verläuft nach einem Polymerisationskettenmechanismus, bei dem die Kettenaufbaureaktion nur an einem aktivierten Ende der Verbindung abläuft (z.B. radikalische Polymerisation). Bei der Polykondensation und der Polyaddition besteht kein solcher Kettenmechanismus, die Reaktion kann gleichzeitig an verschiedenen Stellen erfolgen. Der Unterschied besteht darin, dass bei der Polykondensation ein kleineres Nebenprodukt abgespalten wird. Bei der Polyaddition entsteht kein solches Nebenprodukt. Bei jeder Polyreaktion entstehen Makromoleküle, die sich in der Anzahl ihrer Monomerbausteine, dem Polymerisationsgrad n, unterscheiden. Die Polymere sind daher keine einheitlichen Verbindungen, sondern haben eine Molekülmassen-Verteilung. Abhängig davon, ob bifunktionelle oder trifunktionelle Monomere bei der Polymersynthese verwendet werden, entstehen lineare, verzweigte oder räumlich vernetzte Polymere. Grundsätzlich können bei den Polyreaktionen gleichartige oder verschiedenartige Monomere miteinander verknüpft werden. Kopolymere bestehen im Gegensatz zu den Homopolymeren aus verschiedenen Monomer-Einheiten. Die einzelnen Struktureinheiten eines Kopolymers können dabei alternierend, statistisch oder als Blöcke entlang der Makromolekülkette angeordnet oder an sie aufgepfropft werden (Abb. 6). Bei den Kopolymeren bzw. Block-Kopolymeren handelt es sich somit um Hybridpolymerisate die aus Struktureinheiten mit unterschiedlichen Eigenschaften synthetisiert werden können [32, 33].

Einführung

18

KOPOLYMER-TYP STRUKTURSYSTEM

Alternierender Typ

Statistischer Typ

Block-Typ

Pfropf-Typ

AB

A

B

A

B AB

A BA BA B A B

AA BB AA BB

AA AA AA

B

B

B

B

B

A

AA

...... ......

B

A =Struktureinheit A

=Struktureinheit B

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Struktursysteme von Kopolymeren. [modifiziert nach Prof. Dr. M. Häberlein, KKC-Vorlesung, FH Frankfurt am Main, 2002]

Einführung

19

1.4.3. Chemische Struktur des PEGT/PBT(Polyester-Polyether)-Kopolymers Durch Polymerisation bifunktioneller Monomer-Moleküle wie der aliphatischen Diole und der aromatischen Dicarbonsäuren entsteht unter Abspaltung niedermolekularer Verbindungen ein linearer Polyester. Polybutylenterephthalat (PBT) wird durch Polykondensation von Terephthalsäure mit Butandiol-1,4 unter Verwendung von speziellen Katalysatoren hergestellt. Zur Herstellung von Polyethylenglykolterephtalat (PEGT) wird Ethylenglykol und Terephtalsäure verwendet (Abb. 7). Durch Ester- bzw. Etherverknüpfungen zwischen den PEGT- und PBT-Segmenten entsteht das alternierende segmentierte PGT/PBT-Block-Kopolymer. (Abb. 8 )

CHO C OHO

n

O

CO C OCH2 4

OH

O

+CH2 CH2 CH2 CH2HO n

n

On HO2

n OHCH2 CH2HO CHO C OHO O

CO C OCH2 2

O

+ n

n

On HO2

1,4- Butandiol Terephtalsäure

Ethylenglykol Terephtalsäure

Polyethylenglykolterephtalat (PEGT)

Polybutylenterephtalat (PBT)

Polykondensation

Polykondensation

Abbildung 7: Reaktionsgleichungen der Polykondensation von 1,4-Butandiol,

Ethylenglykol und Terephtalsäure.

CO C OCH2 2

O

n

O

PEGT/PBT- KOPOLYMER

l CO C OCH2 4

O Om

Abbildung 8: Strukturformel (Random-Sequenz) des PEGT/PBT-Kopolymers.

Einführung

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1.5. Biokompatibilität und Biodegradation synthetischer Polymer-Implantate Durch den unterschiedlichen Anteil an hydrophilen und hydrophoben Strukturen kann das Ausmaß der Wasser- und Sauerstoffdurchlässigkeit sowie das Degradations-verhalten der Polymerverbindungen beeinflusst werden. Die synthetischen Polymere lassen sich prinzipiell in zwei Klassen aufteilen, die biostabilen und die bioabbaubaren bzw. biodegradierbaren Materialien. Die Mehrzahl der biodegradierbaren Polymere, die in den letzten zwei Jahrzehnten entwickelt wurden, enthalten hydrolysierbare Verbindungen (Amide, Ester, Urethan) entlang der Polymerketten. Sie lassen sich im Kontakt mit lebendem Gewebe abbauen und besitzen verschiedenartige physikalische, biologische und chemische Eigenschaften. Die Hydrolyse ist dabei abhängig vom Molekulargewicht, der Qualität der Kontaktoberfläche, der chemischen Zusammensetzung und der chemischen Struktur des Polymers, sowie von den biologischen Umgebungsbedingungen. Der Begriff der Biokompatibilität beschreibt die biologische Verträglichkeit synthetischer Polymere im Sinne einer Implantat-Gewebe-Interaktion. Die Nachahmung einer gewebeverwandten Struktur bei den Polymeren trägt zu ihrer Biokompatibilität bei. Dadurch kann eine mechanische Irritation der umliegenden Zellen und Gewebe so gering wie möglich gehalten werden. Unter dem Begriff der Biodegradation wird die Abbaubarkeit eines Polymers durch Modifizierung der Polymeroberfläche sowie der chemischen Struktur verstanden, die durch ein biologisches System initiiert wird. Ein nicht-resorbierbares Polymer-Implantat ist keinesfalls wünschenswert. Es würde sich dabei um einen persistierenden Fremdkörper im lebenden Gewebe handeln. Vielmehr sind für den biomedizinischen Einsatz jene synthetischen Polymerstoffe gefordert, die resorbierbar, biokompatibel und immunologisch inaktiv sind. Die Anwendung von synthetischen Polymeren in der Klinik setzt die Testung der Toxizität, der Biokompatibilität und des Degradationsverhaltens der anzuwendenden Materialien voraus.

Einführung

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1.6. Fremdkörperreaktion Fremdkörper, die entweder kristallin oder metallisch sind, oder aber aus Polymerisaten bestehen, können, wenn sie zu langsam vom Organismus abgebaut werden, zur Entstehung einer Fremdkörperreaktion führen. Die Pathogenese einer Fremdkörperreaktion wird im Allgemeinen wie folgt erklärt. Die Fremdkörper im Gewebe führen zu einer lokalen Ansammlung von Makrophagen. Dabei werden die Fremdkörper phagozytiert und für längere Zeit in den sog. Heterophagievakuolen der Makrophagen gespeichert. Abhängig von der Oberflächenbeschafenheit der Fremdkörper können diese die Vakuolenwand einreißen. Infolgedessen werden gewebszerstörende Enzyme freigesetzt. Dabei wird eine Entzündungsreaktion mit Zerstörung des umliegenden Gewebes gestartet. Bei Fremdkörpern, die größer sind als die phagozytierenden Makrophagen, kommt es durch Fusionieren der Makrophagen zur Bildung von Fremdkörperriesenzellen. Diese lagern sich an die Fremdkörperpartikel an und setzen dabei lysosomale Enzyme frei. Histologisch zeigt sich das Bild eines Fremdkörpergranuloms. In direkter Umgebung zu den Riesenzellen zeigen sich eingewanderte Makrophagen, die von einem lymphozytären Infiltrat und einspriessenden Kapillaren und Fibroblasten umringt werden. Im Rahmen dieser Reaktion kann es zur Aktivierung des T-Zell-System mit Ausbildung einer stenosierenden Vaskulitis und Sklerosierung des Entzündungsgebietes kommen. Eine überschießende Gewebsreparation kann später in eine maligne Entartung des Gewebes übergehen [34].

Einführung

22

1.7. Neovaskularisation Das Überleben eines künstlichen Gewebeersatzmaterials ist nur dann sicher zu garantieren, wenn unmittelbar nach der Transplantation eine schnelle und effiziente Neovaskularisation einsetzt. Wie bereits erwähnt, ist auch bei der Komposit-Hautersatz-Technologie, wo der primären Transplantation eines Dermisersatzes die Übertragung des autologen Hautepithels folgt, das Überleben der Epithelzellen von der effizienten Vaskularisation der neodermalen Matrix abhängig. Bei der Entstehung neuer Blutgefäße werden generell zwei Vorgänge unterschieden: die Vaskulogenese und die Angiogenese. 1.7.1. Vaskulogenese Bei der Vaskulogenese erfolgt die Entstehung neuer Blutgefäße direkt aus den Vorstufen der Endothelzellen, den endothelialen Progenitorzellen (EPC) bzw. Angioblasten. Verschiedene Wachstumsfaktoren dienen dabei diesen Zellen als Stimuli für Proliferation und Migration. Die Vaskulogenese läuft in mehreren nacheinander folgenden Schritten ab: (1) Im Knochenmark bilden sich aus den Vorläuferzellen die Endothelzellen; (2) Aus Endothelzellen formen sich primordiale Zellaggregate, die zwar Zellkontakte ausbilden, aber noch kein Lumen besitzen; (3) Die Endothelzellen polarisieren sich im folgenden und bilden endotheliale Schläuche; (4) Aus einer Ansammlung der endothelialen Schläuche entsteht ein vaskuläres Netzwerk; (5) Letztendlich werden die neugebildeten Gefäße von Perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen umgeben. Diese Form der Gefäßneubildung vollzieht sich größtenteils während der frühen Stadien der Embriogenese [35, 36].

Einführung

23

1.7.2. Angiogenese Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle in der Wundheilung und bei der Gewebsreparation, wo die Neovaskularisation für den Transport von Zellen und Nährstoffen zur Wunde essentiell ist. Es wurden in der Vergangenheit viele spezifische Moleküle entdeckt, die den Entstehungsprozess von Blutgefäßen kontrollieren. Diese sog. Angiogenese-Faktoren dienen als Stimuli für Proliferation und Migration von Endothelzellen. Sie übermitteln ihre Effekte über eine Reihe von Rezeptoren, die auf der Oberfläche der Endothelzellen exprimiert werden. VEGF (vascular epithelial growth factor) ist der Hauptregulator der Neovaskularisation und spielt eine große Rolle in der frühen Entwicklung von endothelialen Progenitor-Zellen [37]. Ein anderer angiogener Faktor ist bFGF (basic fibroblast growth factor). Er ist ein potenter Induktor der Endothelzellproliferation und des Blutgefäßwachstums in vivo und in vitro. Eine große Gruppe weiterer angiogenese-induzierender Faktoren haben keinen direkten Einfluss auf die Endothelzellen. Zu diesen sog. indirekten Angiogenese-Faktoren gehören u.a. PGF (platelet-derived growth factor), TGF-β (transforming growth factor beta) und Angiopoetin [38, 39].

Einführung

24

1.7.3. Grundschritte der Angiogenese Im Gegensatz zur Vaskulogenese ist die Angiogenese ein Entstehungsprozess, welcher die Bildung von neuen Blutgefäßen aus Endothelzellen bereits vorhandener Blutgefäße beschreibt. In einem ausgereiften Blutgefäß befinden sich die Endothelzellen für gewöhnlich im Ruhestadium. Während eines Konversationsvorgangs erhalten die Endothelzellen neue Eigenschaften zur Neovaskularisation des Gewebes. Die Konversation von Endothelzellen in den angiogenen Phänotyp wird durch bestimmte Situationen wie z.B. Hypoxie angeregt. Dieser Vorgang wird von der Veränderung der Zellform (zur Erleichterung der Migration), gesteigerten Sekretion proteolytischer Enzyme (wodurch die Basalmembran und die Extrazellularmatrix abgebaut werden) und von einer erhöhten Sensitivität für angiogene Faktoren (durch Modulation der Rezeptorexpression), begleitet. Nach Beendigung der Angiogenese und Ausbildung eines Gefäßnetzes erlangen die Endothelzellen erneut den Ruhe-Phänotyp. Es werden bei der Angiogenese sechs Grundschritte (Abb. 9) unterschieden: (1) Durch Vasodilatation des Blutgefäßes werden Zellkontakte zwischen den angrenzenden Endothelzellen (EZ) reduziert; (2) Die Basalmembran (BM) des Blutgefäßes und die Extrazellularmatrix (EZM) wird durch Freisetzung proteolytischer Enzyme zerstört; (3) Durch Migration und Proliferation der Endothelzellen entsteht die Knospe eines neuen Gefäßes (Abb. 10); (4) Eine dornförmige Struktur mit einem Gefäßlumen entsteht (Abb. 11); (5) Basalmembran und Blutgefäßnetz werden ausgebildet; und (6) Perizyten und VSMC (vascular smooth-muscle cells) stabilisieren das neugebildete Blutgefäßnetz [40-43].

Einführung

25

1

2 3

4

56

Vasodilatation

Degradation von BM & EZM Migration der EZ / Gefäßknospe

LumenentstehungDornformation

GefäßnetzbildungNeubildung der Basalmembran

Stabilisierung des Gefäßnetzes durch Perizyten und VSMC

VEGFbFGF

EZ

VSMC

PERIZYT BM

LUMEN

VEGFbFGF

VEGFbFGF

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Grundschritte der Angiogenese [modifiziert nach M.A. Zimmerman et al, Surgery 125 (1999), 244]

Einführung

26

Abbildung 10: Abbildung zeigt neugebildete Gefäßknospen (Dreiecke) im Bereich der

Tumorgefäße nach Implantation von Zellen eines malignen Melanoms in die

transparente Rückenhautkammer (Vergrößerung: 355fach). Intravitalmikroskopische

Fluoreszenz-Aufnahmen nach i.v.-Aplikation von FITC-Dextran.

[Forschungslabor der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte,

Direktor: Prof. Dr. med. H.U. Steinau, Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum.

In Kooperation mit der Fakultät für Biochemie, Universität Kiel.]

Einführung

27

Abbildung 11: Neubildung von vaskulären Dornformationen (Pfeile) mit bereits

perfundierten Lumina im Randbereich eines synthetischen Dermisersatzes nach

Implantation in die transparente Rückenhautkammer (Vergrößerung: 177fach).

Intravitalmikroskopische Fluoreszenz-Aufnahmen nach i.v.-Aplikation von FITC-

Dextran.

[Forschungslabor der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte,

Direktor: Prof. Dr. med. H.U. Steinau, Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum.]

Einführung

28

1.8. Vaskularisation von synthetischen Polymer-Materialien Ziel des sog. „tissue engineering“ ist die Entwicklung eines künstlichen Ersatzmaterials für geschädigtes bzw. zerstörtes Körpergewebe. Ersatzmaterialien werden üblicherweise durch Trägergerüste aus synthetischen biokompatiblen Matrizen unterstützt. Ein kritisches Problem bei der Entwicklung von künstlichen Gewebeersatzstoffen ist die Aufrecherhaltung von Zellmassen am Leben nach ihrer Übertragung auf avitale Biomaterialien [44, 45]. Lebende Zellen, die von in-vitro Kulturbedingungen auf ein synthetisches Trägergerüst transferiert werden, können nicht überleben allein aufgrund von Diffusionsvorgängen. Frühere Studien, die von Folkman am wachsenden Tumorgewebe durchgeführt wurden, zeigten, dass Tumoren nicht mehr als wenige Kubikzentimeter an Volumen zunehmen können, außer sie entwickeln eigene Blutgefäße [46]. Analog dazu, kann nur ein optimal vaskularisiertes Polymer-Trägergerüst eine suffiziente Oxygenierung und Nährstoffversorgung von Zellen bewirken. Eine der Möglichkeiten zur Realisierung einer de-novo vaskulären Versorgung in solchen Polymer-Konstrukten ist die Neovaskularisation in vivo. Durch primäre Implantation einer „leeren“ Polymermatrix kann ihre Neovaskularisation durch Sprießen und Einwachsen von Blutgefäßen aus dem präexistenten Gefäßnetz des Wirtgewebes in das Biomaterial erreicht werden [47]. Nachfolgend können Zellen wie Keratinozyten auf derartig prävaskularisierte Biomaterialien transplantiert werden (Abb. 5).

Einführung

29

1.9. Ziele der Untersuchungen Mit der synthetischen porösen PEGT/PBT-Block-Kopolymermatrix steht ein Biomaterial zur Verfügung, das den gewünschten Ansprüchen an einen idealen Dermisersatzstoff gerecht zu werden scheint. Tierexperimentelle Langzeitstudien mit subkutan eingebrachten Implantaten aus PEGT/PBT-Block-Kopolymer indizierten dieses Material als biokompatibel und degradierbar. Untersuchungen zu physiko-chemischen Charakteristiken als auch in vitro Untersuchungen mit Zellkulturen haben ausreichende Hydrophilität, hohe molekulare Permeabilität der Kopolymermatrix für eine suffiziente Wasser-und Nährstoffverteilung demonstriert und gezeigt, dass dieses Biomaterial sich hervorragend als Substrat für das Wachstum von humanen Keratinozyten und Fibroblasten eignet. Allerdings lagen bislang keine quantitativen Daten über den Zeitverlauf und das Ausmaß der Neovaskularisation (vaskuläre Gewebsinfiltration) und der Degradation (Materialabbau-und resorption) sowie unzureichende Kenntnisse über die Intensität der Fremdkörperreaktion (Entzündungsantwort) nach Implantation von PEGT/PBT-Block-Kopolymermatrizen in Abhängigkeit von unterschiedlicher Oberflächenstruktur des Biomaterials vor. Zu diesen Zwecken wurden drei Typen von PEGT/PBT-Block-Kopolymermatrizen (Scaffold-Implantate) mit unterschiedlichen Porenparametern in die transparente Rückenhautkammer von Balb/c-Mäusen implantiert. Folgende Untersuchungsziele wurden formuliert: Quantitative histologische Analysen des Grades der Neovaskularisation, der Degradation und der Fremdkörperreaktion im Zeitverlauf sowie Demonstration eines Zusammenhanges eventueller Unterschiede mit dem implantierten Implantattyp. Die Hypothese lautete, dass Kopolymermatrizen mit unterschiedlicher Porosität und Porendiameter einen unterschiedlichen angiogenen Effekt, degradatives Verhalten sowie entzündliche Reaktion hervorrufen würden. Außerdem wurde ein optimales Intervall für den Porendiameter erwartet, durch welchen eine erhöhte Neovaskularisation der Kopolymermatrix gefördert würde.

Methoden

30

2. METHODEN Die im Folgenden vorgestellten Untersuchungen wurden in der Zeit von September 2001 bis Oktober 2003 mit Genehmigung der zuständigen Behörde der Bezirksregierung Arnsberg im Forschungslabor der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte an der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum durchgeführt. Das tierexperimentelle Protokoll folgte den Vorschriften zum Schutz von Labortieren „Principles of Laboratory Animals“ der National Society for the Medical Research (USA) sowie dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ der National Academy of Sciences und dem National Institute of Health (USA) (Publication No. NIH 86-23, revised 1985).

Methoden

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2.1. Das Modell der transparenten Rückenhautkammer Das Modell der transparenten Rückenhautkammer stellt ein etabliertes Verfahren für standardisierte in vivo Mikrozirkulationsstudien dar. Es basiert auf dem Kammermodel des Syrischen Goldhamsters, welches von Endrich und Mitarbeitern entwickelt wurde [48]. Durch Verfeinerung der Rückenhautkammer und der mikrochirurgischen Implantationstechnik konnte dieses Modell für Untersuchungen an der Maus übertragen werden. In dieser Arbeit verwendeten transparenten Rückenhautkammern (Abb. 12) wurden aus Titan konstruiert, mit dem Vorteil hoher Gewebeverträglichkeit, hoher Stabilität und geringem Gesamtgewicht von 3,2 Gramm [49, 50].

BASISPLATTEBASISPLATTEDECKPLATTEDECKPLATTE

NAHTNAHTÖÖFFNUNGENFFNUNGEN BEOBACHTUNGSFENSTERBEOBACHTUNGSFENSTER

BLOCKIERUNGSRINGBLOCKIERUNGSRING

DECKGLASDECKGLAS

ÖÖFFNUNGEN ZUR FFNUNGEN ZUR GEWICHTSREDUKTIONGEWICHTSREDUKTION

ABSTANDSMUTTERABSTANDSMUTTERFIXIERUNGSMUTTERFIXIERUNGSMUTTER

11,8 mm

Abbildung 12: Transparente Rückenhautkammer (Übersicht).

Methoden

32

2.2. Versuchstiere Die transparenten Rückenhautkammern wurden 12 bis 14 Wochen alten weiblichen Labormäusen (n=36) des Stammes Balb/c (Charles River, Sulzfeld), mit einem Körpergewicht von 18 bis 22 Gramm implantiert (Abb. 13). Die Haltung der Versuchstiere erfolgte in mausgerechten Käfigen bei einer Raumtemperatur von 21°C mit einem Tag-Nacht-Zyklus von jeweils 12 Stunden. Zur Fütterung der Labormäuse wurden Standard-Futterpillen mit einem Gehalt von 120 mg/kg des Vitamin E und 18.000 IU/kg des Vitamins A (Spezialdiäten, Soest), sowie sauberes Trinkwasser ad libitum, verwendet.

Abbildung 13: Vierzehn Wochen alte weibliche Balb/c-Maus.

Methoden

33

2.3. Implantationstechnik der transparenten Rückenhautkammer Den Versuchstieren wurde eine s.c. Injektion der Narkoselösung (20-25 µl) im Bereich der hinteren Extremität verabreicht. Die Injektionslösung wurde auf der Basis einer physiologischen Kochsalzlösung gemischt und enthielt zu gleichen Volumenanteilen Ketaminhydrochlorid (Ketavet 100mg/ml, Pharmacija & Upjohn, Erlangen) sowie Xylazinhydrochlorid (Rompun 2%, Bayer Vital, Leverkusen). Das Implantationfeld auf dem Rücken des Versuchstieres wurde rasiert, chemisch depiliert (Pilca Med, Olivia, Hamburg) und mit einer 70% Alkohollösung gereinigt. Die gut dehnbare Rückenhautfalte der Maus wurde mittels zweier Nahtfäden ausgespannt (Abb. 14) und mit der Basisplatte der Rückenhautkammer vernäht (Abb.15). Es wurden zwei transkutane Inzisionen für die beiden Schrauben der Kammerbasisplatte im basalen Bereich der Hautfalte mit einem Skalpell geschaffen. Die Labormaus wurde danach so auf dem Operationstisch positioniert, dass die fixierte und ausgespannte Hautfalte über der Kammerbasisplatte zu liegen kam. Unter dem Operationsmikroskop (Leica Microsystems, Bensheim) wurde dann mittels mikrochirurgischer Instrumente (FST, Heidelberg) die obere Schicht der Hautfalte in Form eines kreisrunden Areals von ca. 15mm im Diameter komplett exzidiert und die darunterliegende Faszienschicht bis auf die dünne Hautmuskelschicht (panniculus carnosus) abgetragen (Abb. 16). Die verbliebene Schicht, bestehend aus dem dünnen quergestreiften Hautmuskel, dem Subkutangewebe, der Dermis und der Epidermis, wurde durch die Deckplatte der Rückenhautkammer mit einem integrierten Beobachtungsfenster nach Spülung des Wundgrundes mit 0,5 ml einer isotonischen Kochsalzlösung abgedeckt. Die Rückenhautfalte des Versuchstieres kam dabei zwischen den beiden Rahmenplatten der Titankammer in Form eines Sandwichs zu liegen. Die beiden Platten der Kammer wurden anschließend miteinander verschraubt und mit zwei nichtresorbierbaren Sicherungsfäden am oberen Kammerpol mit der Hautfalte vernäht (Abb. 17). Um eine Kompression der kutanen Blutgefässe zu vermeiden dienten drei Schraubenmuttern als Plattenabstandshalter innerhalb der Kammerkonstruktion, die einen Sicherheitsabstand von ca. 400µm garantierten.

Methoden

34

Die implantierte Kammer wurde zum Ausschluss einer späteren Verunreinigung im Käfig mittels eines Pflasters (Mikropore, 3M Health Care, Borken) abgeklebt und mit einer Identifikationsnummer versehen. Die Implantation der transparenten Rückenhautkammer erfolgte unter sterilen Bedingungen. Die Titankammern wurden vor der Implantation 5 Minuten lang bei 134°C dampfsterilisiert. Desweiteren wurden die mikrochirurgischen Implantationsinstrumente nach jeder Implantation gereinigt, desinfiziert und bei 250 Grad Celsius 15 Sekunden lang in einem Glass-bead-Sterilizer (FST, Heidelberg) vorbereitet. Die Gesamtdauer der Kammerimplantation betrug pro Tier ca. 30 Minuten, die Wirkungsdauer der Narkose ca. 40 Minuten. Nach Abklingen der Narkosewirkung sowie während des gesamten Experiments wurden die Kammern von den Tieren gut toleriert. Es ließen sich keine Anzeichen von Schmerzen oder Störungen des Fress- und Schlafverhaltens beobachten. Postoperativ wurden keine Analgetika benötigt. Die Versuchstiere wurden nach dem Eingriff artgerecht in separaten Einzelkäfigen untergebracht und im Tierstall bei freiem Zugang zu Wasser und Futter gehalten.

Methoden

35

Abbildung 14: Ausspannen der enthaarten Rückenhautfalte mittels zweier Fäden.

Abbildung 15: Fixierung der Basisplatte der Rückenhautkammer durch Nähte am

oberen Pol des Titanrahmens.

Methoden

36

Abbildung 16: Exzision eines kreisrunden Hautareals aus der oberen Schicht der

Hautfalte und Präparation bis auf die Hautmuskelschicht.

D

Abbildung 17: Wache weibliche Balb/c-Maus mit implantierter Rückenhautkammer.

Methoden

37

2.4. PEGT/PBT-Kopolymermatrizen (Scaffold-Implantate) Die in diesem Experiment als Scaffold-Implantate verwendeten PEGT/PBT-Kopolymermatrizen (Polyactive™) wurden von Isotis NV in Bilthoven, Niederlande, bereitgestellt. Das Biomaterial ist ein segmentiertes Block-Kopolymer, das aus alternierenden weichen, hydrophoben PEGT-Segmenten (polyethylene glycol terephtalate) und harten, hydrophilen PBT-Segmenten (polybutylene terephtalate) besteht. Die Zusammensetzung des segmentierten Polyether/Polyester-Kopolymers wurde als aPEGTbPBTc beschrieben, wo a das Molekulargewicht des PEGT, b den prozentuellen Gewichtsanteil des PEGT-Segments und c den prozentuellen Gewichtsanteil des PBT-Segments, bezeichnen [51]. In dieser Arbeit wurde ein Kopolymer mit dem Gewichtsverhältnis von 55/45 und dem PEGT-Molekulargewicht von 300 Da (300PEGT55PBT45) verwendet. Kopolymermatrizen mit drei unterschiedlichen Porendiametern (1: <75µm, 2: 75-212µm, 3: 250-300µm) wurden untersucht. Hierzu wurden Scheiben mit einem Diameter von ca. 5 mm und der Scheibendicke von ca. 300 µm aus dem porösen Kopolymer-Film (Abb. 18 A, B) mittels einer Gewebestanze (Biopsy-Punch) ausgestanzt und als Scaffold-Implantate benutzt. Die Implantate wurden einer Gassterilisation unterzogen und bis zur Implantation bei -20°C steril gelagert.

Methoden

38

A

B

Abbildung 18: REM-Aufnahme der Oberflächenstruktur des Scaffold-Implantates

(Porendiameter: 75-212µm). A Implantatscheibe (Vergrößerung: 20fach).

B Poröse Struktur der PEGT/PBT-Kopolymermatrix (Vergrößerung: 400fach).

Methoden

39

2.5. Implantation der Scaffold-Implantate Zur Eliminierung möglicher Effekte des unmittelbaren Präparationstraumas auf das Kammerhautgewebe wurde eine Erholungsphase bis zur Implantation der Scaffold-Implantate von ca. 48h gewählt. Für die Implantation der Implantatscheiben in die Rückenhautkammer wurde die Labormaus in einen Plexiglas-Tubus mit Ventilationsöffnung eingebracht. Das Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer kam dabei durch einen engen Längsschlitz außerhalb des Tubus zu liegen. Der Tubus mit der Maus wurde dann auf einer speziellen Plattform fixiert. Der Kammerverband wurde entfernt und die Oberfläche des Beobachtungsfensters mit einem in 70%ger Alkohollösung getränkten sterilen Wattestäbchen vorsichtig gereinigt. Danach wurde das Beobachtungsfenster durch Entfernen von Blockierungsring und Deckglas eröffnet sowie die Kammergrundperipherie von Fibrinfäden gereinigt. Die sterilen Implantatscheiben wurden im Zentrum des Kammergrundes positioniert und gegen das Hautmuskelgewebe leicht angedrückt (Abb. 19 A, B). Es wurden ca. 60 µl einer 0,9%gen NaCl-Lösung in das Beobachtungsfenster eingebracht, die Durchtränkung des Implantates abgewartet und das Fenster mit einem sterilen Deckglas unter Luftausschluss abgedeckt. Die überschüssige Flüssigkeit wurde mit einem sterilen Saugtupfer (FST, Heidelberg) entfernt, bis der Hautmuskel peripher des eingebrachten Implantates am Deckglas haftete. Zusätzlich wurde ein steriler Blockierungsring in das Beobachtungsfenster eingesetzt, um eine Verschiebung von Deckglas und Implantat zu vermeiden. Anschließend wurde die Kammer mit einem Micropore™-Pflaster erneut abgeklebt und das Versuchstier in seinen Käfig zurückgesetzt.

Methoden

40

Scaffold-Implantat

Hautmuskel

Implantat-Poren

A

B

Hautmuskel

HautblutgefäßeImplantatrand

Abbildung 19: Implantation der Scaffold-Implantate. A Positionierung der

Implantatscheibe im Zentrum des Beobachtungsfensters auf der blutgefäßtragenden

Hautmuskelschicht. B Deutlich erkennbare poröse Struktur des 75-212µm-Scaffold-

Implantats.

Methoden

41

2.6. Makroskopische Untersuchung und Photodokumentation Die Versuchstiere wurden regelmäßig einer Untersuchung untergezogen. Insbesondere wurde auf Verhaltensmerkmale der Tiere wie Rastlosigkeit und Ängstlichkeit geachtet. Das Beobachtungsfenster der Rückenhautkammer sowie das angrenzende Hautgewebe wurden auf markante Veränderung hin, wie Zeichen einer Verletzung und lokaler Entzündung untersucht und photodokumentiert. Die Bilder wurden mittels einer auf dem Operationsmikroskop angebrachten Digitalkamera (EOS D60, Canon) aufgenommen. 2.7. Einschlusskriterien für die Kammerpräparationen Nach Implantation der Scaffold-Implantate wurden über 3 Tage alle 24 h im Bereich des Beobachtungsfensters der Kammerpräparation liegende Implantate photomakroskopisch überprüft und beurteilt. Nur Kammerpräparationen ohne Anzeichen einer Einblutung oder Entzündung wurden für die Versuche ausgewählt. Als Ausschlusskriterien einer Präparation wurden gewertet: Zeichen einer Entzündung, einer Einblutung, Stase der Mikrozirkulation sowie Ödembildung im Bereich des Präparationsareals. Versuchstiere, die eine intakte Mikrozirkulation im Bereich des Beobachtungsfensters der Kammer aufwiesen, wurden am 3. Tag nach Einbringen der Implantate den Versuchsgruppen randomisiert zugewiesen.

Methoden

42

2.8. Explantation der Implantate Am 7 (n=9), bzw. 14 (n=9), bzw. 21 (n=18) Tag p.impl. wurden die Versuchstiere durch intravenöse Gabe einer Pentobarbital-Überdosis (Narcoren Merial, Halbermoos,) eingeschläfert. Die Implantate sowie das angrenzende Hautgewebe wurden für die histologischen Untersuchungen aus dem Beobachtugsfenster der Kammer en bloc reseziert. Die Proben wurden auf einer Korkenplatte befestigt und in 5,0%ger Formaldehyd-Lösung fixiert. Die fixierten Proben wurden dann sagital geteilt, orientiert und in einer Paraffin-Kassette aufgestellt. Die Proben wurden in der aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und in Paraffin für eine komplette Querschnitt-Ansicht der Implantatscheiben eingebettet. Mittels eines Mikrotoms wurden semidünne (≈ 5µm) Gewebeschnitte samt dem Kopolymerfilm angefertigt. Danach wurden die histologischen Schnitte entparaffiniert und einer Standardfärbung mit Hämatoxylin-Eosin unterzogen.

Methoden

43

2.9. Lichtmikroskopische Untersuchung Als Einschlusskriterien für die histologische Auswertung der Gewebeschnitte wurden definiert: sagitale Rand-zu-Rand-Querschnitte aus dem zentralen Bereich der Implantatscheibe, Gewebeschnitte ohne stärkere Einrisse des Implantatgerüstes sowie Implantatschnitte mit adhärentem Hautgewebe. Die histologischen Schnitte wurden auf das Vorhandensein von Entzündungsreaktion, Nekrosen, Bindegewebsinfiltration und Vaskularisation untersucht. Die Kopolymermatrix der Scaffold-Implantate wurde vom umgebenden Gewebe im polarisierten Licht differenziert und am Tag 7, 14 und 21 p.impl. analysiert. In quantitativer Untersuchung wurde die Dichte der Blutgefäßprofile und der mehrkernigen Fremdkörper-Riesenzellen in jeweils zwei HE-Schnitten von jedem der 36 Implantate durch denselben Untersucher (A.R.) bestimmt. Der Untersucher wusste zum Zeitpunkt der Auswertung nicht, welcher Gruppe und welchem Explantationszeitpunkt die jeweiligen histologischen Schnitte angehörten. Aus 4 histologischen Untersuchungsfeldern (UF≈ 0.047mm2) innerhalb eines jeden Gewebeschnittes (n=72) wurden digitale Aufnahmen (n=288) mit Hilfe eines konfokalen Lichtmikroskops (Axiostar, Zeiss) und einer digitalen Mikroskopkamera (HV-C20M, Hitachi) bei 400facher Vergrößerung aufgenommen. Die Untersuchungsfelder wurden zufällig entlang der ganzen Länge des Implantatanschnittes ausgewählt. Zwei basale UF in der Nähe des Hautmuskel-Implantat-Übergangs und zwei apikale UF an der Grenze zum ursprünglichen Deckglas der Kammer wurden analysiert. Quer- und längsgeschnittene Profile der Blutgefäße jeden Diameters sowie mehrkernige Fremdkörper-Riesenzellen wurden identifiziert und computer-assistiert (AnalySIS™, Münster) gezählt (Abb. 20). Da in der vorliegenden Arbeit keine immunhistochemischen Untersuchungsverfahren angewandt wurden, ist auf die Quantifizierung der übrigen Zelltypen, wie Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen usw., verzichtet worden.

Methoden

44

2.10. Einschlusskriterien für die mikroskopische Blutgefäß- und Zellzählung Die Kriterien für ein Blutgefäß bzw. eine mehrkernige Fremdkörper-Riesenzelle wurden wie folgt definiert: a) positive HE-Reaktion, b) nachweisbares Gefäßlumen bzw. Riesenzelle mit mehr als einem Zellkern, c) Lokalisation innerhalb des bezeichneten Untersuchungsfeldes.

IMPLANTATPORENAPIKALES UNTERSUCHUNGSFELD (AUF)

BASALES UNTERSUCHUNGSFELD (BUF)

IMPLANTAT / HAUTMUSKEL-GRENZE

PORÖSEKOPOLYMER-MATRIX

HAUTMUSKEL

SUBKUTANES FETTGEWEBE

DERMISSCHICHT

EPITHELSCHICHT

BLUTGEFÄSSPROFILE/MEHRKERNIGE RIESENZELLEN

Abbildung 20: Schematische Darstellung eines histologischen Sagitalschnittes durch

das implantattragende Hautgewebe. Rechtecke repräsentieren Untersuchungsfelder

in den apikalen und basalen Bereichen des Implantates.

Methoden

45

2.11. Testung der Reproduzierbarkeit und der Präzision der Zähltechnik Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Zähltechnik wurde eine wiederholte Zählung durch denselben Untersucher in 10 zufällig ausgewählten Untersuchungsfeldern anhand der digitalen Aufnahmen zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt. Danach wurden die Werte der ersten und zweiten Zählungsreihen miteinander verglichen. Bei der Bestimmung der Präzision der Zähltechnik wurden in denselben 10 zufällig ausgewählten Feldbildern die absolute Zahl der Blutgefäßprofile sowie der Fremdkörper-Riesenzellen durch einen zweiten unabhängigen Untersucher (Facharzt für Pathologie) erneut bestimmt und mit den Werten der ersten Zählungsreihe des ersten Untersuchers verglichen. 2.12. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung (REM) Von den in Paraffin eingebetteten Implantat-Haut-Gewebeproben wurden zunächst 5 µm dünne Gewebeschnitte angefertigt. Die Präparate wurden auf Thermanox- Objektträger aufgezogen, entparaffiniert, im kritischen CO2-Punkttrockner (Balzers CPD 030) getrocknet und mit einer leitenden Gold-Schicht (Edwards S 150B) bedampft. Mit Hilfe eines Raster-Elektronen-Mikroskops (REM, Siemens) wurde bei 20kV zunächst die Oberflächenmorphologie und Matrixintegrität des Kopolymers, Porenstruktur des Implantatgerüstes sowie die Struktur des neugebildeten Bindegewebes innerhalb der Implantatporen beurteilt. Weiterhin wurden zufällig jeweils 4 Digitalbilder pro Sagitalschnitt im Bereich der basalen sowie der apikalen Untersuchungsfelder von den insgesamt 72 Implantat-Schnitten (2 Schnitte pro Implantat) bei 400facher Vergrößerung angefertigt.

Methoden

46

2.13. Digitale Bildanalyse der REM-Aufnahmen Die rasterelektronenmikroskopisch gewonnen Digitalaufnahmen wurden an ein Computerprogramm zur digitalen Bildanalyse (AnalySIS™, Münster) transferiert. Zur Quantifizierung der degradationsbedingten Veränderung der Oberfläche von Implantatgerüsten wurde die Fläche des Kopolymermatrix, die Fläche der fibrovaskulären Gewebsformation als auch die optisch leer erscheinende Porenfläche aufgrund der unterschiedlichen Grauwertverteilung semi-automatisch in mehrere Phasen aufgetrennt. Die zugehörigen Grauwert-Phasen wurden dann durch Farbkodierung zusammengefasst. Anschließend wurde die farbkodierte Fläche der soliden Struktur des Kopolymermatrix sowie der Matrixfragmente innerhalb des Untersuchungsfeldes berechnet und als relativer Prozentanteil zur gesamten analysierten Bildfläche (≈0.047mm2) des Untersuchungsfeldes ausgedrückt. Bei der Flächenberechnung wurden Bildelemente bis zu einer Größe von 1/1000 der Gesamtfläche des Feldbildes mitkalkuliert. Ein Fehlerwert für die Phasenüberlagerung der Grauwertskala von maximal 1% wurde zugelassen. Zusätzlich wurden die Implantatdicke sowie die Dicke der fibrovaskulären Implantatkapsel berechnet.

Methoden

47

2.14. Statistik Die statistische Auswertung der Daten erfolgte unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Statistikprogramms (Sigma Stat™, Jandel Scientific, Jandel Corp., USA). Statistische Vergleiche zwischen den Stichproben wurden mit Hilfe des non-parametrischen ANOVA-on-Ranks-Tests (nach Kruskal-Wallis) durchgeführt. Dem Test folgte eine paarweise-multiple Vergleichsprozedur (Dunn’Method), wenn signifikante Unterschiede gefunden wurden. Unterschiede wurden als statistisch signifikant festgelegt, wenn die Nullhypothese mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als 5% (p<0,05) verworfen werden konnte.

Ergebnisse

48

3. ERGEBNISSE 3.1. Makroskopische Untersuchungen Makroskopische Untersuchungen wurden mehrmals in der Woche durchgeführt. Die Versuchstiere tolerierten die Kammerpräparation und es wurden keine Änderungen des Schlaf- und Fressverhalten beobachtet. Die Hautregion um die Kammerpräparation zeigte normale Charakteristika während der gesamten Dauer des Experiments. Mit Ausnahme initialer Hyperämie mit leichten Ödemzeichen in wenigen Kammerpräparationen wurden keine schweren Entzündungszeichen, insbesondere keine Infektionszeichen beobachtet. Ab dem 14. Tag nach Implantation der Kopolymermatrizen erschien die Implantatoberfläche unter dem Auflicht-Mikroskop wegen der zunehmenden Blutgefäßinfiltration rötlich verändert (Abb. 21). Während der Explantation zeigten die Implantatscheiben am 7. Tag p.impl. bereits eine merkliche Adhärenz zum Hautmuskel, die am 14. und 21. Tag deutlich stärker ausgeprägt war.

Ergebnisse

49

Abbildung 21: Vaskularisation eines 75-212µm-Scaffold-Implantates am 14. Tag

post implantationem mit Ausbildung eines Blutgefäßnetzes (Dreiecke).

Vereinzelt sind Einblutungen innerhalb des Implantates sichtbar (Pfeile).

Ergebnisse

50

3.2. Reproduzierbarkeit und Präzision der Zähltechnik Die Ergebnisse der wiederholten Auszählungen wurden den ursprünglichen Werten der Auszählung des ersten Untersuchers (Untersucher A) in einem Punktwolke-Diagramm mit Regressionsgeraden gegenübergestellt. (Abb. 22 A, B) Zur besseren Abschätzung der Unterschiede zwischen zwei Zählungsreihen wurde zusätzlich das Bland-Altman-Diagramm angewandt. (Abb. 23 A, B) Zum Nachweis eines Zusammenhangs zwischen den Zählreihen wurde der Korrelationskoeffizient nach Spearman bestimmt. Die wiederholte Auszählung der Blutgefäßprofile durch einen zweiten Untersucher (Untersucher B) zeigte einen Korrelationskoeffizienten 0,95. Die Differenzen der beiden Zählungsreihen zeigten keine Normalverteilung mit einem Median von 0,5. Die wiederholte Auszählung der Fremdkörper-Riesenzellen durch den zweiten Untersucher zeigte einen Spearman-Korrelationskoeffizienten von 0,83. Die Differenzen der Werte beider Zählungsreihen waren normalverteilt mit einem Mittelwert von 0,1 und Standardabweichung von 0,99. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch bei der Testung zur Reproduzierbarkeit der Zähltechnik gefunden. Die wiederholte Auszählung der Blutgefäßprofile durch den ersten Untersucher zeigte einen Spearman-Korrelationskoeffizienten von 0,95. Die Differenzen der beiden Zählungsreihen zeigten keine Normalverteilung mit einem Median von 0,0. Die wiederholte Auszählung der Riesenzellen durch den ersten Untersucher zeigte einen Spearman-Korrelationskoeffizienten von 0,88. Die Differenzen der Werte beider Zählungsreihen waren normalverteilt mit einem Mittelwert von 0,1 und Standardabweichung von 0,74.

Ergebnisse

51

Auszählung der Blutgefäßprofile durch Untersucher B

0 2 4 6 8 10 12

Aus

zähl

ung

der B

lutg

efäß

prof

ile d

urch

U

nter

such

er A

0

2

4

6

8

10

12

Auszählung der Fremdkörper-Riesenzellen durch Untersucher B

0 2 4 6 8 10 12

Aus

zähl

ung

der F

rem

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per-R

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nzel

len

durc

h U

nter

such

er A

0

2

4

6

8

10

12

A B

Regressionsgerade Regressionsgerade

Abbildung 22: Punktwolke-Diagramme demonstrieren eine enge Korrelation

zwischen zwei unabhängigen Zählungsreihen (Untersucher A vs. Untersucher B) für

Blutgefäßprofile (Diagramm A) sowie für Fremdkörper-Riesenzellen (Diagramm B).

Mittelwert der Auszählungen (Blutgefäßprofile)beider Untersucher [ (A+B)/2 ]

0 2 4 6 8 10 12

Diff

eren

z de

r Aus

zähl

unge

n (B

lutg

efäß

prof

ile)

beid

er U

nter

such

er [

A-B

]

-6

-4

-2

0

2

4

6

Mittelwert der Auszählungen (Fremdkörper-Riesenellen)beider Untersucher [ (A+B)/2 ]

0 2 4 6 8 10 12Diff

eren

z de

r Aus

zähl

unge

n (F

rem

dkör

per-R

iese

nzel

len)

beid

er U

nter

such

er [

A-B

]

-6

-4

-2

0

2

4

6

A B

Abbildung 23: Bland-Altman-Diagramme zeigen die Beziehung zwischen den

Differenzen und den Mittelwerten beider Zählungsreihen für Blutgefäßprofile

(Diagramm A) sowie für Fremdkörper-Riesenzellen (Diagramm B).

Ergebnisse

52

3.3. Zelluläre Entzündungsantwort Während der gesamten histologischen Untersuchung wurde besonders auf Unterschiede in der Gewebsreaktion zwischen den basalen hautmuskelnahen Untersuchungsfeldern (BUF) und apikalen deckglasnahen Untersuchungsfeldern (AUF) innerhalb der gleichen Implantat-Typen geachtet. Keine der untersuchten Gewebeschnitte der Untersuchungstage 7, 14 und 21 zeigten eine Nekrose innerhalb des porösen Implantatgerüstes sowie im angrenzenden Hautgewebe. Die Struktur des implantattragenden Hautgewebes war zusammengesetzt aus charakteristischen Schichten des quergestreiften Hautmuskels, der Dermis und der Epidermis (Abb. 24). Innerhalb der Kollagenmatrix der Dermis fanden sich zahlreiche subkutane Drüsen und Haarfollikel eingebetet.

Dermis

Implantatmatrix

Abbildung 24: Übersichtsbild der implantattragenden Hautmuskelschicht (breite

Pfeile) mit darunterliegender Dermis und Epithelschicht (schmale Pfeile).

Vergrößerung: 100fach.

Ergebnisse

53

3.3.1. Untersuchungstag 7 post implantationem Am 7. Tag p.impl. fanden sich die Implantatporen von einem spärlichen Stroma durchsetzt, welches sich aus wenigen Fibroblasten, Leukozyten und Makrophagen zusammensetzte und in allen Poren des Implantat-Querschnittes zu finden war mit einer höheren zellulären Konzentration innerhalb der basalen Untersuchungsfelder. Die Makrophagen schienen an den Porenwänden zu haften und sich an der Oberfläche der Kopolymermatrix zunehmend auszubreiten. Bezüglich der Zählung mehrkerniger Fremdkörper-Riesenzellen innerhalb der BUF bestand ein signifikanter Unterschied (Abb. 25 A, B). Höchste Dichte dieser Zellen wurde in BUF der <75µm-Scaffold-Implantate beobachtet.

Fremdkörper-Riesenzellen (AUF)

7. Tag post implantationem

<75 µm 75-212 µm 250-300 µm

Abs

olut

e Ze

llzah

l pro

Unt

ersu

chun

gsfe

ld

0

5

10

15

20

nicht signifikant

Fremdkörper-Riesenzellen (BUF)


<75 µm 75-212 µm 250-300 µm

Abs

olut

e Ze

llzah

l pro

Unt

ersu

chun

gsfe

ld

0

5

10

15

20

*

* <75µm-Scaffolds vs. 250-300µm-Scaffolds, ANOVA on Ranks, p<0,05

BA

Abbildung 25: Graphische Darstellung der Ergebnisse der mikroskopischen

Auszählungen von Fremdkörper-Riesenzellen mittels Box-Plots. Dargestellt ist die

Dichte der Fremdkörper-Riesenzellen am 7. Tag post implantationem in AUF (A) und

BUF (B) der Scaffold-Implantate. Strich innerhalb der Box: Median. Gestrichelte Linie:

Mittelwert. Die von der Box ausgehenden Striche: 10%- und 90%-Perzentile. Punkte:

5%- und 95%-Perzentile. n=12 (Untersuchungsfelder pro Gruppe).

Ergebnisse

54

3.3.2. Untersuchungstag 14 post implantationem Am 14. Tag p.impl. migrierten Makrophagen weiterhin in die Kopolymermatrix und fusionierten innerhalb des Biomaterials verstärkt zu mehrkernigen Riesenzellen. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Mehrheit der mehrkernigen Riesenzellen entlang der Implantat/Hautmuskel-Grenze in den basalen Untersuchungsfeldern beobachtet (Abb. 26). Sowohl mononukleäre Makrophagen als auch mehrkernige Riesenzellen stellten die häufigsten Zelltypen innerhalb der BUF (Abb. 27). Im Gegensatz dazu fand sich in Richtung der apikalen Untersuchungsfelder weiterhin hauptsächlich fibroblastenreiches Stroma mit vereinzelten Phagozyten.



<75 µm 75-212 µm 250-300 µm

Abs

olut

e Ze

llzah

l pro

Unt

ersu

chun

gsfe

ld

0

5

10

15

20

nicht signifikant

A

<75 µm 75-212 µm 250-300 µm

Abs

olut

e Ze

llzah

l pro

Unt

ersu

chun

gsfe

ld

0

5

10

15

20

nicht signifikant

Fremdkörper-Riesenzellen (BUF)


B


Auszählungen von Fremdkörper-Riesenzellen am 14. Tag post implantationem in AUF

(A) und BUF (B) der drei Scaffold-Implantate. Strich innerhalb der Box: Median.

Gestrichelte Linie: Mittelwert. Die von der Box ausgehenden Striche: 10%- und 90%-

Perzentile. Punkte: 5%- und 95%-Perzentile. n=12 (Untersuchungsfelder pro Gruppe).

Ergebnisse

55

Matrixpore

Abbildung 27: Dichte Ansammlung von Fremdkörper-Riesenzellen (Dreiecke)

innerhalb des basalen Untersuchungsfeldes der Kopolymermatrix eines <75µm-

Scaffold-Implantates am 14. Tag post implantationem. Vergrößerung: 200fach.

Ergebnisse

56

3.3.3. Untersuchungstag 21 post implantationem Am 21. Tag p.impl. waren mehrkernige Riesenzellen, die anfangs hauptsächlich basal vorzufinden waren, in jedem der untersuchten Felder des Implantates vertreten. Die Kopolymermatrix der <75µm-Scaffold-Implantate fand sich nahezu komplett von Phagozyten umgeben und durch Fremdkörper-Riesenzellen eingehüllt (Abb. 29). Zu diesem Zeitpunkt unterschied sich die Menge gezählter mehrkerniger Riesenzellen innerhalb der AUF nicht wesentlich zwischen den verschiedenen Typen der Scaffold-Implantate. Dagegen fand sich in BUF der <75µm-Scaffold-Implantate eine immer noch hohe Dichte dieser Zellen (Abb. 28).



<75 µm 75-212 µm 250-300 µm

Abs

olut

e Ze

llzah

l pro

Unt

ersu

chun

gsfe

ld

0

5

10

15

20

nicht signifikant

AFremdkörper-Riesenzellen (BUF)


<75 µm 75-212 µm 250-300 µm

Abs

olut

e Ze

llzah

l pro

Unt

ersu

chun

gsfe

ld

0

5

10

15

20

*


B


Auszählungen von Fremdkörper-Riesenzellen am 21. Tag post implantationem in AUF

(A) und BUF (B) der drei Scaffold-Implantate. Strich innerhalb der Box: Median.

Gestrichelte Linie: Mittelwert. Die von der Box ausgehenden Striche: 10%- und 90%-

Perzentile. Punkte: 5%- und 95%-Perzentile. n=24 (Untersuchungsfelder pro Gruppe).

Ergebnisse

57

A

B

Abbildung 29: A, B Umhüllung der Kopolymermatrix durch Fremdkörper-

Riesenzellen (Dreiecke) und Infiltration der Matrixporen durch fasereiches

vaskularisiertes Bindegewebe (Sterne). Basale Untersuchungsfelder eines 75-212µm-

Scaffold-Implantates am 21. Tag post implantationem.

Ergebnisse

58

3.3.4. Kapselgewebe Die mikroskopische Untersuchung der Schnitte des 7. postimplantativen Tages ergab weiterhin, dass alle Kopolymermatrizen die Ausbildung eines umgebenden fibrozellulären Gewebes an den Rändern der Implantatscheiben induzierten. Dieses Gewebe setzte sich hauptsächlich aus Fibroblasten, Extrazellularmatrix, Leukozyten und wenigen Blutgefäßen zusammen. Ab dem 14. Tag post implantationem zeigte dieses implantatumschließende Granulationsgewebe eine zunehmende Vaskularisation. Zusätzlich fand sich eine feine Deckschicht eines ähnlich zusammengesetzten vaskularisierten Gewebes auf der Implantatoberfläche (Abb. 30). Die Dicke des Kapselgewebes wurde an den Rändern sowie an der Oberfläche der Implantatschnitte bestimmt und zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den Implantattypen. Implantate mit den Porengrößen von 75-212µm und 250-300µm waren zu allen Untersuchungszeitpunkten von einem vaskularisierten Kapselgewebe stärkerer Dicke umgeben als <75µm-Scaffold-Implantate (Tabelle 1 A, B).

Ergebnisse

59

Tabelle 1: Ergebnisse der Dickenmessung der Implantatkapsel. Tabelle zeigt die

Veränderung der Kapseldicke abhängig vom Untersuchungstag und Implantattyp.

A Kapseldicke am Rand des Implantats. B Kapseldicke auf der Oberfläche des

Implantats. Messwerte angegeben als Mittelwert in µm ± Standardabweichung.

<75µm-Scaffold-Implantate 33 µm ± 4 54 µm ± 1853 µm ± 10

75-212µm-Scaffold-Implantate


d 7 d 21d 14

69 µm ± 15 106 µm ± 1692 µm ± 18

38 µm ± 7 78 µm ± 1762 µm ± 17

15 µm ± 3 17 µm ± 318 µm ± 3

17 µm ± 4 26 µm ± 524 µm ± 8

16 µm ± 3 22 µm ± 821 µm ± 6

Untersuchungstag (post implantationem)

Implantat-Typ

Implantat-Rand

Implantat-Oberfläche

d 7 d 21d 14

Untersuchungstag (post implantationem)

A

B

<75µm-Scaffold-Implantate



Implantat-Typ

Ergebnisse

60

Hautmuskel

Hautmuskel

Implantatmatrix

Implantatmatrix

A

B

Abbildung 30: Ausbildung eines vaskularisierten Kapselgewebes (Pfeile) auf der

Oberfläche der Implantate. A 75-212µm-Scaffold-Implantat. B Poreninfiltration durch

fibrovaskuläres Gewebe ausgehend von der Implantatkapsel (250-300µm-Scaffold-

Implantat).

Ergebnisse

61

3.4. Neovaskularisation 3.4.1. Untersuchungstag 7 post implantationem Ab dem 7. Tag p.impl. begann die Neovaskularisation der porenausfüllenden Bindegewebsmatrix der basalen Untersuchungsfelder in der Nähe der Implantat/Hautmuskel-Grenze. (Abb. 36). Dabei wurde die größte Dichte des vaskulären Gewebes in Scaffold-Implantaten der Porengrößen 75-212µm und 250-300µm beobachtet. Einige wenige Blutgefäßprofile wurden auch in AUF dieser Implantate gefunden. Im Gegensatz dazu, ließen sich in AUF der <75µm-Implantate keine Blutgefäße nachweisen (Abb. 31).

Blutgefäßdichte (AUF)


<75 µm 75-212 µm 250-300 µmAnza

hl d

er B

lutg

efäß

prof

ile p

ro U

nter

such

ungs

feld

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

*


Blutgefäßdichte (BUF)


<75 µm 75-212 µm 250-300 µmAnza

hl d

er B

lutg

efäß

prof

ile p

ro U

nter

such

ungs

feld

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

*


A B


Auszählungen von Blutgefäßprofilen mittels Box-Plots. Dargestellt ist die

Blutgefäßdichte am 7. Tag post implantationem in AUF (A) und BUF (B) der Scaffold-

Implantate. Strich innerhalb der Box: Median. Gestrichelte Linie: Mittelwert. Die von

der Box ausgehenden Striche: 10%- und 90%-Perzentile. Punkte: 5%- und 95%-

Perzentile. n=12 (Untersuchungsfelder pro Gruppe).

Ergebnisse

62

3.4.2. Untersuchungstag 14 post implantationem Während der vierzehntägigen Implantationsdauer setzte sich die porengeleitete und oberflächengerichtete vaskuläre Infiltration der Kopolymermatrix mit Ausbildung eines Gefäßnetzes innerhalb der Implantate fort. Generell ließ sich eine Zunahme der neugebildeten Gefäße am 14. Tag p.impl. für alle Implantate nachweisen. Die Anzahl der gezählten Blutgefäßprofile in BUF sowie AUF der 250-300µm-Scaffold-Implantate unterschied sich von <75µm-Scaffold-Implantaten, war jedoch nur in den apikalen Untersuchungsfeldern signifikant (Abb. 32).



<75 µm 75-212 µm 250-300 µmAnz

ahl d

er B

lutg

efäß

prof

ile p

ro U

nter

such

ungs

feld

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

*




<75 µm 75-212 µm 250-300 µmAnz

ahl d

er B

lutg

efäß

prof

ile p

ro U

nter

such

ungs

feld

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

nicht signifikant

A B



Blutgefäßdichte am 14. Tag post implantationem in AUF (A) und BUF (B) der

Scaffold-Implantate. Strich innerhalb der Box: Median. Gestrichelte Linie: Mittelwert.

Die von der Box ausgehenden Striche: 10%- und 90%-Perzentile. Punkte: 5%- und

95%-Perzentile. n=12 (Untersuchungsfelder pro Gruppe).

Ergebnisse

63

3.4.3. Untersuchungstag 21 post implantationem Am 21. Tag p.impl. war die Dichte der Blutgefäßprofile in BUF der 75-212µm-und 250-300µm-Scaffold-Implantate weiterhin höher als in<75µm-Scaffold-Implantaten, der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Dagegen zeigte die Zählung der Blutgefäßprofile in den AUF signifikant höhere Dichte für 75-212µm-und 250-300µm-Scaffold-Implantate (Abb. 33). Die Präsenz des vaskulären Gewebes innerhalb der AUF sowie der BUF der <75µm-Scaffold-Implantate am 21. Tag post implantationem war insgesamt schwach ausgeprägt (Abb. 34). Diese Implantate waren durch eine intensive Kumulation von Makrophagen und Fremdkörper-Riesenzellen gekennzeichnet.



<75 µm 75-212 µm 250-300 µmAnz

ahl d

er B

lutg

efäß

prof

ile p

ro U

nter

such

ungs

feld

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

*




<75 µm 75-212 µm 250-300 µmAnz

ahl d

er B

lutg

efäß

prof

ile p

ro U

nter

such

ungs

feld

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

nicht signifikant

A B



Blutgefäßdichte am 21. Tag post implantationem in AUF (A) und BUF (B) der

Scaffold-Implantate. Strich innerhalb der Box: Median. Gestrichelte Linie: Mittelwert.

Die von der Box ausgehenden Striche: 10%- und 90%-Perzentile. Punkte: 5%- und

95%-Perzentile. n=24 (Untersuchungsfelder pro Gruppe).

Ergebnisse

64

Ein Unterschied zeigte sich weiterhin bezüglich des poreninfiltrativen Gewebewachstums. Obwohl die fibrovaskuläre Gewebsinfiltration der Matrixporen hauptsächlich von der basalen Seite der Implantate (welche direkten Kontakt zu der gut vaskularisierten Hautmuskelunterlage hatten) ausging, wurde im apikalen Bereichen der Implantate eine zusätzliche Vaskularisation der Poren beobachtet, die direkt vom Gefäßnetz des einkapselnden Granulationsgewebes ihren Ursprung nahm. Dieser Infiltrationsmodus erschien stärker ausgebildet in 75-212µm- und 250-300µm-Scaffold-Implantaten, wo die Dicke der vaskularisierten Bindegewebskapsel signifikant höher war im Vergleich zu <75µm-Scaffold-Implantaten. Einundzwanzig Tage nach Implantation des porösen Kopolymermatrix fanden sich die 75-212µm- und 250-300µm-Scaffold-Implantate in einem kräftig vaskularisierten Bindegewebe eingebettet (Abb. 36). Die histologischen Schnitte dieser Implantattypen zeigten eine intensive Vaskularisation der Matrixporen durch ein Gefäßnetz aus kleinen Blutgefäßen und Kapillaren. Nahezu alle Poren waren hier durch fibrovaskuläres Gewebe von netzartig organisierter Struktur dicht ausgefüllt (Abb. 35).

Ergebnisse

65

A

BB

Abbildung 34: A Spärliches Stroma mit Makrophagen und Fremdkörper-

Riesenzellen (Pfeile) innerhalb des apikalen Untersuchungsfeldes eines <75µm-

Scaffold-Implantates am 21. Tag post implantationem (Vergrößerung: 400fach). B

Basales Untersuchungsfeld eines <75µm-Scaffold-Implantates mit gelegentlichen

Blutgefäßen (Sterne) sowie intensiver Kumulation von Fremdkörper-Riesenzellen

(Pfeile) entlang des Implantat/Hautmuskel-Übergangs am 21. Tag post

implantationem (Vergrößerung: 400fach).

Ergebnisse

66

B

A

Abbildung 35: Vollständige Ausfüllung der Matrixporen durch Neubildung von

fibrovaskulären Gewebe (Sterne). 75-212µm-Scaffold-Implantat (A) und 250-300µm-

Scaffold-Implantat (B) am 21. Tag post implantationem (Vergrößerung: 400fach).

Ergebnisse

67

Implantatmatrix

A

B

Abbildung 36: A Beginnende Penetration der Matrixporen eines 75-212µm-Scaffold-

Implantates durch das fibrovaskuläre Gewebe (Sterne) am 7. Tag post

implantationem. B Komplette Gewebsdurchwachsung der porösen Kopolymermatrix

eines 75-212µm-Scaffold-Implantates am 21. Tag post implantationem.

Ergebnisse

68

3.5. Degradation und Matrixflächenanalyse 3.5.1. Untersuchungstag 7 post implantationem Früheste Zeichen einer sichtlichen Erosion und Delamination der Kopolymermatrix fanden sich rasterelektronenmikroskopisch bereits am 7. Tag p.impl., bevorzugt im Bereich der basalen Untersuchungsfelder. Die porenumgebende glatte Oberflächenstruktur des Kopolymermatrix erschien unterbrochen durch gelegentliche irreguläre Formationen, die sich zystenähnlich in der Porenwand darstellten (Abb. 37). 3.5.2. Untersuchungstag 14 post implantationem Am 14. Untersuchungstag nahm der Verlust der strukturellen Integrität des Implantates als das Resultat einer fortschreitenden Matrixfragmentierung zu (Abb. 38). Besonders in Scaffold-Implantaten der Porengröße von <75µm erschien die Fragmentierungsrate höher als in Implantaten mit größeren Porendiametern. Insbesondere die Fragmentierung der <75µm-Scaffold-Implantate war durch zunehmende Kumulation von Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen an der Oberfläche der Kopolymermatrix begleitet. 3.5.4. Untersuchungstag 21 post implantationem Am 21. Tag p.impl. fanden sich wenige Implantatfragmente auch intrazellulär, inkorporiert durch mehrkernige Riesenzellen. Ab dem 14. Tag post implantationem ereignete sich zunehmend die Integration der Kopolymermatrix in das fibröse Gewebe. Eine signifikante Abnahme der Kopolymerfläche innerhalb der basalen Untersuchungsfelder wurde in allen Implantat-Typen am 21. Tag p.impl., verglichen mit der Flächenberechnung des 7. und 14. Tages p.impl., festgestellt (Abb. 40 D-F). Dabei zeigte sich, dass die Flächenverlustrate der 75-212µm- und 250-300µm-Implantate geringer war als die der <75µm-Implantate. Einundzwanzig Tage p.impl.

Ergebnisse

69

hatten die <75µm-Scaffold-Implantate im Bereich der BUF einen durchschnittlichen Restflächenprozentsatz von ungefähr 15% der totalen Fläche des Untersuchungsfeldes, was ca. 68% der ursprünglichen absoluten Kopolymerfläche am Tag 7 entsprach. Die Flächenanalyse der Kopolymermatrix (Abb. 39) nach einer Implantationsdauer von drei Wochen demonstrierte einen Flächenverlust von annähernd 32% für <75µm-Scaffold-Implantate, 23% für 75-212µm-Scaffold-Implantate und 18% für die Scaffold-Implantate mit der Porengröße zwischen 250 und 300µm. Annähernd gleiche Ergebnisse konnten bei der Flächenanalyse für apikale Untersuchungsfelder gezeigt werden, wo sich kein signifikanter Unterschied zu den Werten der BUF fand (Abb. 40 A-C). Die Untersuchung zur Flächenänderung der Kopolymermatrizen suggerierte, dass im Durchschnitt 75% der gesamten „verlorenen“ Matrixfläche (vorausgesetzt, der Implantatverlust während der ersten Woche nach Implantation war vernachlässigbar gering) zwischen dem 7. und 14. Tag, sowie weitere 25% innerhalb der nächsten Woche degradiert wurden.

Ergebnisse

70

A

B

Abbildung 37: A, B Durch Degradation bedingte erosive Oberflächenveränderungen

der Matrix-Balken bzw. der Porenwände mit Resorptionsvakuolen am 14. Tag post

implantationem.

Ergebnisse

71

A

B

Abbildung 38: A, B Exzessive Fragmentierung der Kopolymermatrix von <75µm-

Scaffold-Implantaten am 21. Tag post implantationem.

Ergebnisse

72

Implantatmatrix

Neodermis

Matrixpore

Phase 1

Phase 2

Phase 3

A

B

Abbildung 39: Phasenbildung durch Grauwert-Differenzierung unter Verwendung des

AnalySIS™-Computerprogramms zur Bildverarbeitung. REM-Aufnahme (basales

Untersuchungsfeld eines 75-212µm-Scaffold-Implantats. Vergrößerung: 400fach) vor

der Phasenauftrennung (A) und nach Farbkodierung der einzelnen Phasen (B).

Ergebnisse

73

Flächenänderung der 75µm-Scaffold-Implantate (AUF)

d 7 d 14 d 21Rel

ativ

e Fl

äche

der

sol

iden

Impl

anta

tmat

rixpr

o U

nter

such

ungs

feld

[%]

-10

0

10

20

30

40

Untersuchungstag post implantationem

**

* ANOVA on Ranks, p<0,05

Flächenänderung der 75-212µm-Scaffold-Implantate (AUF)

d 7 d 14 d 21Rel

ativ

e Fl

äche

der

sol

iden

Impl

anta

tmat

rixpr

o U

nter

such

ungs

feld

[%]

-10

0

10

20

30

40


*


Flächenänderung der 250-300µm-Scaffold-Implantate (AUF)

d 7 d 14 d 21Rel

ativ

e Fl

äche

der

sol

iden

Impl

anta

tmat

rixpr

o U

nter

such

ungs

feld

[%]

-10

0

10

20

30

40


**


Flächenänderung der 75µm-Scaffold-Implantate (BUF)

d 7 d 14 d 21Rel

ativ

e Fl

äche

der

sol

iden

Impl

anta

tmat

rixpr

o U

nter

such

ungs

feld

[%]

-10

0

10

20

30

40


*


*

Flächenänderung der 75-212µm-Scaffold-Implantate (BUF)

d 7 d 14 d 21Rel

ativ

e Fl

äche

der

sol

iden

Impl

anta

tmat

rixpr

o U

nter

such

ungs

feld

[%]

-10

0

10

20

30

40


*


*

Flächenänderung der 250-300µm-Scaffold-Implantate (BUF)

d 7 d 14 d 21Rel

ativ

e Fl

äche

der

sol

iden

Impl

anta

tmat

rixpr

o U

nter

such

ungs

feld

[%]

-10

0

10

20

30

40



**

A

B

C

D

E

F

Abbildung 40: Säulendiagramme demonstrieren die Ergebnisse zur computer-

assistierten Kopolymermatrix-Flächenanalyse (als Mittelwerte ± Standardfehler des

Mittelwertes in % in Relation zur gesamten analysierten Bildfläche der REM-

Aufnahme) in Abhängigkeit vom Untersuchungszeitpunkt bzw. postimplantativen

Untersuchungstag. Gezeigt ist eine progressive Abnahme der Implantatfläche sowohl

innerhalb der basalen (D-F) als auch innerhalb der apikalen Untersuchungsfelder (A-C) für alle drei Typen der Scaffold-Implantate.

Ergebnisse

74

3.5.5. Implantatdickenänderung Bei der Dickenmessung der Implantate wurde beobachtet, dass eine Änderungen der Implantatdicke für alle Implantat-Typen bereits am 7. Tag nach Implantation festzustellen war. Die initiale Präimplantationsdicke der Implantatscheiben von annähernd 300µm änderte sich deutlich in allen Scaffold-Implantaten nach Implantation (Abb. 41). Insbesondere in <75µm-Scaffold-Implantaten betrug die durchschnittliche Implantatdicke am 7. Tag p.impl. 486±8µm und blieb annähernd konstant am 14. Tag p.impl., verminderte sich aber auf 395±3µm am 21. Untersuchungstag p.impl. Im Gegensatz dazu, war die durchschnittliche Dickenänderung in Implantaten der Porengrößen 75-212µm und 250-300µm weniger ausgeprägt. Bei diesen Implantattypen wurde die Implantatdicke am 7. Tag mit 380±4µm bzw. 371±8µm gemessen, und reduzierte sich allmählich auf 332±3µm bzw. 321±5µm am Tag 21 p.impl.

Ergebnisse

75

d 7 d 14 d 21D

icke

der

Impl

anta

tsch

eibe

(µm

)200

300

400

500

600

Postimplantative Veränderung der Implantatdicke

75µm-Scaffold-Implantate

**

Zeitpunkt der Untersuchung (post implantationem)* ANOVA on Ranks, p<0,05

d 7 d 14 d 21

Dic

ke d

er Im

plan

tats

chei

be (µ

m)

200

300

400

500

600



*

*

Zeitpunkt der Untersuchung (post implantationem)* ANOVA on Ranks, p<0,05

d 7 d 14 d 21

Dic

ke d

er Im

plan

tats

chei

be (µ

m)

200

300

400

500

600



**

Zeitpunkt der Untersuchung (post implantationem)


A

B

C

Abbildung 41: A-C Postimplantative Veränderung der Implantatdicke. Messwerte

sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes. Gestrichelte Linie

repräsentiert die präimplantative Dicke der Scafflold-Implantate.

Diskussion

76

4. DISKUSSION 4.1. Diskussion zum Rückenhautkammer-Modell Das Modell der transparenten Rückenhautkammer repräsentiert ein hervorragendes System zum Studium der Angiogenese sowie Neovaskularisation synthetischer Biomaterialien. Mit Hilfe des Rückenhautkammer-Modells ist eine sorgfältige Annäherung zu Untersuchungen vieler Strukturcharakteristiken synthetischer, degradierbarer Biomaterialien möglich. Unter Verwendung der Rückenhautkammer können nicht nur Untersuchungen zur angiogenen Antwort auf diverse Implantate durchgeführt, sondern auch Effekte vieler bioaktiver Substanzen auf die Angiogenese und Mikrozirkulation studiert werden [52-55]. In Kombination mit der intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie erlaubt das Modell der transparenten Rückenhautkammer eine direkte Visualisierung und Dokumentation der Entstehungsdynamik neuer Blutgefäße. Das Modell der Kammerpräparation an der Maus lässt außerdem durch den Einsatz monoklonaler Antikörper die Anwendung immunhistologischer Untersuchungsmethoden zu.

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4.2. Diskussion zur Analyse der postimplantativen Matrixflächenänderung Die Quantifizierung der Implantatdegradation wurde computer-assistiert unter Verwendung des Bildanalyse-Systems AnalySIS™ durchgeführt. Bei der Berechnung der Flächengröße wurde anfangs angenommen, dass aufgrund der zunehmenden Fragmentierung der Kopolymermatrix es zu einer messbaren relativen Zunahme der Implantatfläche kommen würde [56]. Jedoch wurde in der vorliegenden Arbeit keine Flächenzunahme der Kopolymermatrix beobachtet. Im Gegenteil, die Bildanalyse zeigte eine progressive Flächenabnahme der Implantatmatrix. Diese Ergebnisse wurden höchstwahrscheinlich durch Resorption sowie zelluläre Inkorporation der fragmentierten Implantatpartikel verursacht. Außerdem wurden die Identifizierung kleinerer Matrixfragmente, die Gewebsdifferenzierung sowie die nachfolgende Phasenauftrennung der REM-Aufnahmen durch die zunehmende Einbettung des Kopolymers in ein dichtes faserreiches Gewebe erschwert. Weiterhin ist es vorstellbar, dass die progressive Gewebsinfiltration der porösen Implantatmatrix zur Kontraktion des Implantatgerüstes bzw. zur Expansion der Implantatporen geführt haben könnte. Diese wahrscheinlich mit der Implantationsdauer zunehmenden Vorgänge haben sich sicherlich verfälschend auf die Berechnung der tatsächlichen Matrixfläche ausgewirkt. Dadurch würden sich die Matrixflächenänderungen nicht zwingend als degradationscharakteristisch erweisen und das tatsächliche Degradationsverhalten der Kopolymermatrix nicht widerspiegeln bzw. maskieren. Ein weiterer Nachteil der angewandten Methode war, dass die quantitative Analyse des Degradationsverhaltens der porösen PEGT/PBT-Kopolymermatrix an histologischen Schnitten erfolgte, wo die räumliche Struktur des Implantatgerüstes nicht berücksichtigt wurde. Da die untersuchten Implantate keine geometrisch strenge Raumstruktur der porösen Matrix aufwiesen, d.h. inkonstante Porendiameter, Porenzahl, Porenform, Porenverteilung und Porenverbindungen vorlagen, war auch die Präsenz der soliden Kopolymermasse in der histologischen Schnittebene ausgesprochen inkonstant. Es ist davon auszugehen, dass dadurch die Aussagekraft der AnalySIS™-gestützten Flächenberechnung in Bezug auf das

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Degradationsverhalten limitiert ist und die Ergebnisse der Flächenanalyse mit Vorbehalt zu interpretieren sind. Um den degradationsbedingten Implantatverlust dennoch präzise quantifizieren zu können wäre es theoretisch möglich, eine Bestimmung des Implantatgewichtes oder drei-dimensionale Strukturanalyse des Implantatgerüstes vor und nach der Implantation durchzuführen. Dies wird sich allerdings als schwierig wenn nicht sogar als unmöglich erweisen, da gegenwärtig keine Methode existiert, mit der sich eine exakte und reproduzierbare Trennung des Implantatmaterials von dem Infiltrationsgewebe durchführen lässt [56].

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4.3. Diskussion zur Neovaskularisation der PEGT/PBT-Kopolymermatrizen Studien zur Neovaskularisation biotechnologisch hergestellter Gewebe werden seit neuestem zunehmend durchgeführt. Da solche Gewebekonstrukte für gewöhnlich durch biokompatible polymere Matrixgerüste (Scaffolds) unterstützt werden, ist die erfolgreiche Vaskularisation dieser Kunstgewebe von vielen strukturellen Charakteristiken der unterstützenden Polymermatrix abhängig. In der Tat wurde eine positive Korrelation zwischen der Porengröße und dem Ausmaß der Vaskularisation und Akkumulation des Bindegewebes für Poly-L-Laktid-(PLLA)-Implantate bereits gezeigt [57]. Unter Verwendung einer Polymermatrix bestehend aus Polyvinylalkohol (PVA) als Gerüstmaterial konnte demonstriert werden, dass die Zunahme der Matrix-porosität mit Zunahme der Diffusionseffizienz und Vaskularisation eng korreliert [58]. In einer anderen Untersuchung wurden zwei Serien porösen Polyurethans basierend auf 50/50 Epsilon-Kaprolakton/L-Laktid mit unterschiedlicher Porosität und Porengröße subkutan in Ratten implantiert [59]. Die porösen Polyurethan-Implantate mit höherer Porosität erfuhren eine bessere Gewebsinfiltration im Vergleich zu Implantaten niedrigerer Makroporosität und Mikroporen von 10-15 µm im Diameter. Im Gegensatz dazu zeigt die vorliegende Untersuchung an PEGT/PBT-Block-Kopolymermatrizen, dass eine erhöhte Porosität (hohe Anzahl von Poren pro Fläche bzw. Volumen) der Kopolymermatrix nicht zwingend zu einer verbesserten Neovaskularisation sowie Bindegewebsneubildung führt. In Scaffold-Implantaten mit Porengröße von <75µm und höchsten Porosität (im Vergleich zu 75µm-212µm-und 250-300µm-Scaffold-Implantaten) war die Gewebsneubildung lokal eingeschränkt, so dass sich das neugebildete fibrovaskuläre Gewebe hauptsächlich auf die basalen Abschnitte der Kopolymermatrix, in der Nähe des Implantat/Hautmuskel-Übergangs, konzentrierte. Infolgedessen wurde angenommen, dass die Infiltration der Kopolymermatrix durch das fibrovaskuläre Gewebe sowie die Bindegewebs-und Blutgefäßneubildung in <75µm-Scaffold-Implantaten negativ durch einige andere Faktoren beeinflusst wurden. Einer dieser Faktoren war wahrscheinlich die relativ hohe Dichte von Makrophagen und Riesenzellen innerhalb der hochporösen Matrix

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der <75µm-Scaffold-Implantate. Hier wurde das Biomaterial bereits in der ersten Woche nach Implantation durch die Phagozyten im Bereich der basalen Untersuchungsfelder förmlich eingehüllt. Die hohe Zahl der Makrophagen und insbesondere der mehrkernigen Riesenzellen könnte auf diese Weise zu einer nahezu kompletten Besetzung des Raumes innerhalb der Matrixporen geführt haben. Es ist denkbar, dass die Proliferation anderer Zelltypen sowie die Bildung einer bindegewebigen Matrix und ihre Infiltration durch das vaskuläre Gewebe dadurch behindert wurden. Als weiteren Faktor mit potentiell negativem Einfluss auf die Neovaskularisation wurde die Akkumulation von niedermolekularen Abbauprodukten des Kopolymers innerhalb der degradierbaren Matrix vermutet. Es ist möglich, dass einige biologische Parameter für optimale Gewebsregeneration wie pH-Wert und Osmolarität durch verstärkten Anfall von Zersetzungsprodukten der <75µm-Polymermatrix verändert wurden. Die lokal hohe Konzentration an niedermolekularen Abbauprodukten könnte sich so hemmend auf die Fibroblastenproliferation und Angiogenese ausgewirkt haben. Berichte über Effekte der Abbauprodukte auf Zellkulturen von in den in-vitro durchgeführten Untersuchungen an absorbierbaren Polymeren bekräftigen diese Annahme [60-62]. Als Hauptmechanismus der Degradation des segmentierten Polyether/Polyester-Kopolymers wurde die molekulare Fragmentierung durch chemische Hydrolyse der Ether-Ester-Verbindungen beschrieben. Die Endprodukte des hydrolytischen Abbauprozesses des PEGT/PBT-Kopolymers wurden als für den Organismus empfängliche physiologische Metabolite erwartet. In der Tat wurden jedoch bis heute keine toxischen Reaktionen bzw. lokale oder systemische Komplikationen wie auch keine Akkumulation des Biomaterials in den großen Organen der Tiere beobachtet [56, 63, 64]. Jedenfalls wurde die Beeinflussung der Vaskularisation der porösen PEGT/PBT-Kopolymermatrix durch Polymerabbauprodukte bislang nicht beschrieben. Eine ausreichende Vaskularisation apikaler Bereiche des Implantats bzw. der Implantatoberfläche ist zwingend, wenn lebende Zellen auf die Oberfläche des Biomaterials transplantiert bzw. dort gesät werden sollen. Es ist außerdem bekannt, dass allein durch Diffusion die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung blutgefäßferner

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Zellen nicht sicherzustellen und auf eine Entfernung von wenigen Mikrometer von der nächsten Kapillare limitiert ist. Aus diesem Grund war die differenzierte histologische Auswertung basaler und apikaler Bereiche der Implantatschnitte sinnvoll. Dadurch ließ sich das Ausmaß der vaskulären Gewebspenetration in den apikalen Feldern, eruieren, wo aus der Sicht der Sauerstoff- und Nährstoffversorgung kritische Zustände vorliegen würden. Ein Faktor, welcher sicherlich die Neovaskularisation apikaler Implantatbereiche beeinflusst haben könnte, war die räumliche Kommunikation bzw. Verbindung (Interkonnektivität) der Matrixporen untereinander. Dieser Parameter, welcher den freien Flüssigkeitsstrom und die Zirkulation von Nährstoffen und Metaboliten innerhalb der Kopolymermatrix ermöglicht, konnte in 75-212µm- und 250-300µm-Scaffold-Implantaten durch ihre expansive Vaskularisation und Bindegewebsdurchwachsung als nahezu optimal demonstriert werden. Die bereits am 7. Tag post implantationem ubiquitär präsente Poreninvasion durch die Zellen des Granulationsgewebes, hauptsächlich Fibroblasten, Leukozyten und Makrophagen, deutete auf eine adäquate Verbindung zwischen den Matrixporen in diesen Scaffold-Implantaten. Ein anderer Faktor, welcher die Neovaskularisation der apikalen Implantatbereiche höchstwahrscheinlich mitbeeinflusste, ist vermutlich die Implantatdicke. Da die 75-212µm- und 250-300µm-Scaffold-Implantate während der gesamten Untersuchung eine niedrigere Implantatdicke aufwiesen als die <75µm-Scaffold-Implantate, ist es möglich, dass wegen der geringeren Distanz zwischen den apikalen Bereichen an der Implantatoberfläche und dem Kapillarnetz des Panniculus carnosus eine schnellere Blutgefäßdurchwachsung der Kopolymermatrix und somit ein höherer Vaskularisationsgrad der apikalen Felder beobachtet werden konnte. Wie bereits demonstriert, wurde insbesondere bei den 75-212µm -und 250-300µm-Scaffold-Implantaten die Formierung eines vaskularisierten Granulationsgewebes beobachtet, welches die Implantatscheiben an ihren Rändern und apikaler Oberfläche umgab. Es konnte gezeigt werden, dass ausgehend von diesem einkapselnden Granulationsgewebe zusätzliche Penetration der porösen Implantatmatrix durch fibrovaskuläres Gewebe der Kapsel erfolgte, wodurch die Vaskularisation apikaler Implantatbereiche verbessert bzw. beschleunigt wurde.

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4.4. Diskussion zu Entzündungsantwort und Fremdkörperreaktion Der genaue Entstehungsmechanismus von Fremdkörperreaktionen auf bio-degradierbare Polymer-Materialien ist bisher weitgehend ungeklärt. Es ist seit längerem bekannt, dass synthetische Polymere innerhalb eines Organismus zur Immunantwort bzw. chronischen Entzündungsreaktion führen können [65, 66]. Durch Verwendung von Nahtmaterialien wurden diesbezüglich die ersten Erfahrungen mit synthetischen biodegradierbaren Materialien gewonnen. In experimentellen und klinischen Untersuchungen wurden als Reaktion auf die getesteten Polymerstoffe wie Polyglykolid, Polyglatin oder Polydioxanon, das Einwandern von Fremdkörper-Riesenzellen und Infiltrate aus Rundzellen und Granulozyten beobachtet. Des Weiteren wurde in einer Arbeit von Lam und Mitarbeitern gezeigt, dass die Phagozytose von Partikeln des Poly-L-Laktids zum Zelltod der Makrophagen führen und eine entzündliche Reaktion durch die lokale Freisetzung von Entzündungsmediatoren hervorrufen kann [67]. Unterschiedliche Beobachtungen wurden bezüglich der Ausprägung von Fremdkörperreaktionen in Assoziation mit Polymerstoffen beschrieben. Als Ursache dafür wurde u.a. die stark variierende Degradationskinetik unterschiedlicher Polymerimplantate diskutiert [68]. Die Untersuchungen mit schnell biodegradierbaren Materialien wie Polyglykolid haben gezeigt, dass das Auftreten von Fremdkörperreaktionen auf die Akkumulation der in kurzer Zeit anfallenden Abbauprodukte und die Überforderung des Makrophagen-Monozyten-Systems zurückzuführen sind [69]. In tierexperimentellen Untersuchung zur Fremdkörperreaktion am Beispiel von Polyglykolid-Implantaten konnten Weiler und Mitarbeiter zeigen, dass kristalline Polymer-Abbauprodukte einer hydrolytischen Spaltung durch Makrophagen und Granulozyten schwer zugänglich sind und zu Degradationsverzögerung mit Ausbildung einer Fremdkörperreaktion führen [70]. Aus anderen experimentellen Arbeiten ist bekannt, dass allein durch Veränderung der Oberflächenstruktur die Biokompatibilitätscharakteristika von Polymerimplantaten verbessert werden können. Es konnte gezeigt werden, dass dadurch die Implantat-Gewebe-Bindung erhöht und die Ausprägung einer Fremdkörperreaktion vermindert

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werden können [71, 72]. Auch konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der prozentualen Zusammensetzung eines segmentierten Kopolymers und die Modifikation des Molekulargewichts der Polymer-Segmente, die Oberflächenbindung, die Proliferation, die Morphologie sowie die Differenzierung von Zellen beeinflusst werden kann [73, 74]. Dass bestimmte Polymereigenschaften die Kanzerogenese beeinflussen können, soll hier nur kurz erwähnt werden. So haben Kinoshita und Mitarbeiter die Formierung von Tumorgewebe an im Subkutangewebe von Ratten implantierten porösen Polyethylen studiert [75]. Es stellte sich dabei heraus, dass die poröse Struktur des Polymers die Tumorformationsrate gegenüber der von nicht-porösen Polymeren erhöhen konnte. Diese Beobachtungen wurden auf die erhöhte Kontaktoberfläche zwischen dem Tumorgewebe und dem Polymer zurückgeführt. Diese Arbeitsgruppe konnte auch feststellen, dass die Immobilisation von Kollagen durch eine kovalente Bindung an der Implantatoberfläche das Tumorwachstum reduzieren konnte [76]. In der vorliegenden Arbeit wurde eine intensive Entzündungsantwort auf alle untersuchten Typen der Scaffold-Implantate beobachtet. Einundzwanzig Tage nach Implantation war die Schnittfläche des Implantats gänzlich durch vaskularisiertes fibröses Gewebe und phagozytierende Zellen charakterisiert. Die beobachtete zelluläre Antwort auf die Implantate hatte die Charakteristika einer gewöhnlichen Fremdkörperreaktion. Diese komplexe Entzündungsantwort wird durch viele Autoren als Teil des normalen Wundheilungsprozesses auf implantierte Biomaterialien angesehen [77-80]. Prinzipiell unterschieden sich die in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen nicht von Berichten anderer Autoren zur Untersuchung der Entzündungsantwort auf polymere Biomaterialien. Die beobachtete Fremdkörperreaktion in Verbindung mit PEGT/PBT-Kopolymermatrizen zeichnete sich initial durch Emigration von Leukozyten und Makrophagen aus den Blutgefäßen des Hautmuskelgewebes aus, gefolgt von der Infiltration der Kopolymermatrix durch diese Zellen. Im weiteren Verlauf kam es zur verstärkten Formierung mehrkerniger Fremdkörper-Riesenzellen entlang der Implantat/Hautmuskel-Grenzfläche, mit einer stärkeren Ausprägung in <75µm-Scaffold-Implantaten. Obwohl das Wissen um die

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Mechanismen der Initiierung und Aufrechterhaltung einer entzündlichen Gewebeantwort auf implantierte Biomaterialien noch weitgehend limitiert ist, sind zahlreiche Faktoren bekannt, welche die Intensität und den Charakter der Fremdkörperreaktionen beeinflussen. Bereits durch den das Gewebe verletzenden chirurgischen Eingriff werden die Inflammationsmechanismen aktiviert [78]. Andere Faktoren, wie die Adhäsion des Implantats und Mikrobewegungen im Bereich der Implantat/Gewebe-Verbindungszone, die wahrscheinlich abhängig von Oberflächenstruktur der Implantate stark variieren, könnten den Entzündungsprozess beeinflussen bzw. unterhalten. Entzündungszellen setzen verschiedenartige Mediatoren frei, die chemotaktische, angiogene und anti-angiogene Wirkungen besitzen können. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass Entzündungszellen wie Makrophagen und mehrkernige Riesenzellen im Bereich des Implantat/Hautmuskel-Übergangs durch den Mikroscherstress aktiviert werden können. Dadurch können sie durch verstärkte Freisetzung von Mediatoren die Inflammation und die Fremdkörperreaktion unterhalten [81-84]. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Präsenz der Kopolymermatrix die Bildung einer dünnen Kapselschicht aus granulationsähnlichem Gewebe induzierte, welche die Implantate von außen vollständig umhüllte. Die Architektur des in Verbindung mit den PEGT/PBT-Kopolymermatrizen geformten Kapselgewebes war identisch (mit Ausnahme der Kapseldicke) für alle untersuchten Implantat-Typen. Während der drei Untersuchungswochen bestand diese Kapsel aus gut vaskularisiertem Gewebe mit Kapillaren und einigen größeren Blutgefäßen, welche die Neovaskularisation der Kopolymermatrizen in den apikalen Implantatbereichen zum Teil unterstützte. Die Ausbildung ähnlicher Kapselformation nach Implantation absorbierbarer Materialien wurde bereits in anderen Studien beschrieben [85-87]. Die jedoch dort in Assoziation mit Implantaten beobachtete Gewebsreaktion war die Ausbildung einer avaskulären, bevorzugt aus interstitiellem Kollagen bestehenden fibrösen Kapsel. Eine derartige Kapselformation kann zur Isolation des Biomaterials vom Rest des Organismus und zur verminderten angiogenen Antwort auf das Implantat führen [88-90]. Zusätzlich kann der relative Mangel an Blutgefäßen

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innerhalb der Kapsel zu Fehlfunktionen des Implantats führen, die sich durch Verlust der Fähigkeit zum Flüssigkeitsaustausch und erhöhte Anfälligkeit für Infektionen äußern können [91, 92]. Analog zu oben erwähnten Berichten ist es weiterhin vorstellbar, dass die in der vorliegenden Arbeit beobachtete Fremdkörperreaktion auf die PEGT/PBT-Kopolymermatrizen ebenfalls in eine komplette Abkapselung und Fibrosierung des Implantates übergehen kann. Ebenso ist es vorstellbar, dass im Verlauf der biologischen Degradation die vollständige Resorption der Kopolymermatrizen stattfindet. Es ist außerdem möglich, dass die Fremdkörperreaktion im Bereich des Implantat/Hautmuskel-Übergangs während der gesamten Lebenszeit des Implantates persistiert. In diesem Fall würde die begleitende Entzündungsreaktion das Risiko der Metaplasie des implantattragenden Gewebes erhöhen und eventuell sogar zur malignen Zelltransformation sowie zur Tumorenstehung führen [93-96]. Allerdings beabsichtigte die vorliegende Arbeit nicht die Demonstration von Langzeit-Ergebnissen zur inflammatorischen Antwort auf PEGT/PBT-Implantate. Es ist gegenwärtig nicht klar, in welchem Ausmaß die beobachteten Gruppenunterschiede bezüglich der inflammatorischen Antwort implantatstrukturspezifisch sind, und ob die gezeigten Ergebnisse auf höhere Säugetierspezies übertragen werden können. Jedenfalls sollte den Beobachtungen zur inflammatorischen Antwort bei Untersuchungen der biologischen Kompatibilität synthetischer Biomaterialien größte Bedeutung zugemessen werden.

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4.5. Diskussion zum Degradationsverhalten der PEGT/PBT-Kopolymermatrizen Das Wissen um das Degradationsverhalten von Kopolymer-Strukturen innerhalb eines biologischen Systems ist für die Anwendung vieler Biomaterialien in der Medizin essentiell. Der Abbau von Polymer-Verbindungen durchläuft mehrere Schritte, beginnend mit dem Verlust des Molekulargewichts und endend mit einem Massenverlust. Die Besonderheit der kopolymeren PEGT/PBT-Implantate wird bereits durch die Zwei-Komponenten-Natur des Kopolymers, bestehend aus hydrophilen schnell-resorbierbaren und hydrophoben langsam-resorbierbaren Segmenten, unterstrichen. Es wird vermutet, dass sich das PEGT/PBT-Kopolymer im lebenden Gewebe durch chemische Hydrolyse der Esterbindungen in seine Monomere zerfällt.

Für eine Reihe von aliphatischen Polyestern wurde gezeigt, dass sie zusätzlich durch eine enzymatisch katalisierte Hydrolyse abgebaut werden können [97]. Dabei wird vermutet, dass der erste Schritt während der Depolymerisation ein erosiver Prozess der Oberfläche ist, da es für die Enzyme unmöglich sein dürfte, die Polymerbalken zu penetrieren. Schließlich entstehen wasserlössliche Zwischenprodukte, die durch die phagozytierende Zellen resorbiert bzw. metabolisiert werden können [98]. Im Gegensatz zu den aliphatischen Polyestern bleibt bei aromatischen Polyestern, wie dem PEGT/PBT-Polyester, die Frage, ob sie komplett abbaubar sind und keine schädlichen Effekte auf die biologische Umgebung durch persistierende und eventuell sogar toxische Zwischenprodukte haben, zurzeit noch offen. Momentan existieren nur wenige Berichte über die Degradation von Polymeren, die aromatische Bestandteile enthalten [99]. Reine aromatische Polyester wie PBT gelten als höchst unempfindlich gegenüber einer hydrolytischen Degradation. Ein signifikanter Abbau reiner aromatischer Polyester durch Mikroorganismen oder enzymatische Prozesse konnte bislang in wenigen Arbeiten gezeigt werden. Kawai berichtete über mikrobielle Degradation von Polyestern aus Terephtalat, Phtalat oder Isophtalat, die mit Polyethylenglykol polykondensiert wurden. Die Empfindlichkeit der Polyester gegenüber einer mikrobiellen Degradation wurde in diesem Fall auf die sehr langen Dihydroxyl-Komponenten zurückgeführt [100]. Im Fall der biologisch induzierten

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Degradation von aliphatisch-aromatischen Kopolyestern gelangten einige Untersucher zu der Schlussfolgerung, dass nur in Stoffen mit relativ niedrigen Fraktionen der aromatischen Komponente eine signifikante Degradation beobachtet werden kann. Es wurde gezeigt, dass der Massenverlust der Kopolymere und die biologische Degradationsrate mit Erhöhung des Anteils an aromatischen Komponenten (Terephtalsäure) abnahmen [98, 101, 102]. Solange die aromatischen Sequenzen eines Polyester-Kopolymers als biologisch schwer attackierbar gelten, kann nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden, dass schwerdegradierbare aromatische Oligomere im Organismus nicht kumuliert werden könnten. Obwohl in Untersuchungen zum Degradationsverhalten aromatischer Oligomer-Zwischenprodukte gezeigt werden konnte, dass wahrscheinlich ein biologischer Mechanismus zum schnellen Abbau von Oligo-Estern (bestehend aus einer oder zwei Terephtalat-Einheiten) existiert, verläuft die definitive Degradation langer aromatischer Oligomere sehr viel langsamer [103, 104]. Es bleibt zurzeit ungeklärt, ob in einer biologischen Umgebung Enzyme existieren, die prinzipiell fähig sind Esterbindungen zwischen zwei Terephtalsäuren zu spalten oder der Abbaumechanismus gänzlich über die chemische Hydrolyse abläuft [99]. Unabhängig davon bleibt zu klären, ob die Depolymerisationsprodukte eines aliphatisch-aromatischen Polyester-Kopolymers im Organismus kumulieren und dadurch toxisch wirken können. In der vorliegenden Arbeit stieg die Anzahl der phagozytierenden Zellen während der dreiwöchigen Implantationsdauer der Kopolymermatrix stetig an. Makrophagen und mehrkernige Fremdkörper-Riesenzellen, einige mit intrazellulären Einsschlüssen der Kopolymerpartikel, waren allgegenwärtig entlang der Implantat/Hautmuskel-Grenze sowie innerhalb der Implantatmatrix vertreten. Diese Beobachtungen lassen die Vermutung zu, dass der Degradationsprozess des Kopolymers nicht nur durch chemische Hydrolyse sondern auch durch zelluläre Elimination unterstützt wurde. Bereits am 14. Tag p.impl. zeigten alle Implantate intensive Zeichen einer Inflammation. Die stärkste Expression einer Fremdkörperreaktion wurde in Scaffold- Implantaten mit Porengröße von <75µm beobachtet. Dieser Implantat-Typ erschien nach der Implantationsdauer von drei Wochen exzessiv fragmentiert. Dabei ist die

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höhere Fragmentierungsrate dieser Implantate vermutlich nicht zuletzt auf die relativ feinere Struktur der Implantatgerüste zurückzuführen. Die vergleichsweise schmaleren Implantatbalken bzw. dünnere Porenwände der <75µm-Scaffold-Implantate haben sicherlich zu einem schnelleren Zusammenbruch der Kopolymermatrix beigetragen. Gleichzeitig wiesen Implantate dieser Porengröße vergleichsweise niedrigere Vaskularisation sowie Bindegewebsdurchwachsung auf. Aufgrund dieser Beobachtungen lässt sich annehmen, dass eine frühzeitig einsetzende und intensive fibrovaskuläre Gewebedurchwachsung der Kopolymermatrix in den ersten Implantationswochen einen protektiven Charakter gegen eine überschießende Fragmentierung des Implantatgerüstes besitzt. In Implantaten, welche vergleichsweise nur mäßige Gewebsneubildung aufwiesen, erfolgte die Fragmentierung und Absorption der Kopolymermatrix langsamer. Die Dickenzunahme der Implantatgerüste während der Implantationsdauer von einundzwanzig Tagen, insbesondere in <75µm-Scaffold-Implantaten, kann wahrscheinlich als Resultat des Anquellens der Matrix gewertet werden. In früheren Arbeiten zur Untersuchung physiko-chemischer Charakteristiken des porösen PEGT/PBT-Kopolymers wurde die Quellungseigenschaft bereits beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die Schwellung des hydrophilen Biomaterials durch die Wasseraufnahme verursacht wird. Diese Eigenschaft des Kopolymers wird durch verschiedene Faktoren wie Molekulargewicht des PEGT, das Weichsegment/Hartsegment-Verhältnis und Matrixporosität bedingt [105, 106]. Die in der vorliegenden Arbeit beobachtete initiale Schwellung der Implantatscheiben am 7. Untersuchungstag p.impl. war jedoch von einer allmählichen Abnahme der Implantatdicke während der nächsten zwei Implantationswochen gefolgt. Diese Beobachtungen lassen sich durch die progressive Fragmentierung der Kopolymermatrix erklären, die aufgrund des zunehmenden Verlustes der strukturellen Integrität und der Materialmasse zum Zusammenbruch der Implantatgerüste geführt haben könnte. Zusätzlich wurde die Implantatdicke vermutlich durch die zunehmende Gewebsneubildung innerhalb der Matrixporen beeinflusst. Es ist denkbar, dass das poreninfiltrierende faserreiche Bindegewebe so zur Kontraktion und folglich zum Höhenverlust des Scaffold-Implantates geführt haben könnte.

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5. ZUSAMMENFASSUNG Das fundamentale Ziel des „tissue engineering“ ist die Wiederherstellung der Funktion eines zerstörten Organs durch Kombination lebenden Gewebes mit speziellen synthetischen Biomaterialien [107]. Der aktuelle Trend in der Entwicklung von Biomaterialien ist die Erschaffung einer die Geweberegeneration unterstützenden Matrix, die durch Förderung des angiogenen Prozesses zur optimalen vaskulären Integration des Biomaterials führt [45, 108]. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Neovaskularisation der kopolymeren PEGT/PBT-Implantate eng mit den Oberflächeneigenschaften wie Porendiameter, Porosität und Poren-Interkonnektivität der Implantatmatrix korrelieren. Wie oben demonstriert, ergab sich bezüglich der Neovaskularisation eine große Differenz zwischen den untersuchten Implanat-Typen. So wurde beobachtet, dass die Poreneigenschaften das Ausmaß und den Charakter der angiogenen Antwort auf die verschiedenartigen porösen Implantate zu determinieren scheinen. In Implantaten mit dicht angeordneten kleinen Poren (PD<75µm), wo nur minimaler Raum vorhanden ist, wurde hauptsächlich eine Fremdkörperreaktion mit einer starken Präsenz von Makrophagen und Riesenzellen beobachtet. Im Gegensatz dazu erwiesen sich kopolymere Scaffold-Implantate mit den Porendiametern von 75-212µm und 250-300µm als weit vorteilhafter für eine profunde vaskuläre Gewebsinfiltration. Die Porenstruktur dieser Implantate mit ausreichend kommunizierenden großen Poren schien optimal die Zellmigration und Gewebedurchwachsung zu navigieren, ohne die Proliferation von Zellen merklich zu stören. Die demonstrierten Ergebnisse stützen die initiale Annahme, dass die Porosität, Porendiameter sowie Poren-Interkonnektivität der synthetischen PEGT/PBT-Kopolymermatrizen einen Einfluss sowohl auf die Neovaskularisation als auch auf die Degradation haben. Die niedrige Vaskularisationsbereitschaft der <75µm-Scaffold-Implantate konnte in Verbindung mit dem frühzeitigen Zusammenbruch der Kopolymermatrix und intensiven Oberflächenveränderungen während des Degradationsvorganges gebracht werden. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde die Hypothese aufgestellt, dass die relativ schnelle

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Matrixdegradation der <75µm- Implantate möglicherweise durch eine intensive Freisetzung von einer Art Zell-Inhibitoren begleitet wurde, wodurch die lokale Formierung neuer Blutgefäße negativ beeinflusst wurde. Jedenfalls sollte diese potentielle Eigenschaft der PEGT/PBT- Degradationsprodukte durch weitere Untersuchungen zur Begründung der definitiven Biokompatibilität des porösen PEGT/PBT-Kopolymers bestätigt werden. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werde, dass der progressive Verlust der polymeren Implantatfläche an den mittels Bildanalyse ausgewerteten histologischen Schnitten mit einer intensiven Fremdkörperreaktion zeitlich und räumlich assoziiert wurde. Fremdkörper-Riesenzellen und Makrophagen demonstrierten eine frühe Invasion in die Kopolymermatrizen. Durch ihre zunehmende Ausbreitung an den Porenwänden der Implantatmatrix wurden sie zu den vorherrschenden Zelltypen in Kontakt mit dem Kopolymer. Durch den Nachweis intrazellulärer Implantatfragmente in den phagozytierenden Zellen kann ihre direkte Involvierung in den Degradationsvorgang des PEGT/PBT-Kopolymers angenommen werden. Mehrere Autoren haben berichtet, dass Makrophagen und Fremdkörper-Riesenzellen imstande sind, Faktoren zu produzieren, welche die Angiogenese als Antwort auf Gewebeverletzung oder implantierte Materialien induzieren können [109-111]. Jedoch konnte in der vorliegenden Arbeit trotz der zahlreichen Präsenz mehrkerniger Riesenzellen in den <75µm-Scaffold-Implantaten kein entsprechend hoher Neovaskularisationsgrad beobachtet werden. Vermutlich war durch die relativ hohe Dichte mehrkerniger Riesenzellen, welche die Implantatbalken des <75µm-Scaffold-Implantate förmlich umwickelten und den Porenraum fast vollständig ausfüllten, die Migration und Proliferation anderer Zelltypen innerhalb der Matrix erheblich limitiert. Abschließend ist festzuhalten, dass die porösen PEGT/PBT-Kopolymermatrizen generell imstande sind, als unterstützende Konstrukte die Regeneration einer dermisähnlichen Schicht zu induzieren. Jedoch sind die angiogene Reaktion, die fibrovaskuläre Infiltration, die Entzündungsantwort sowie die degradative Aktivität auf PEGT/PBT-Implantate von mehreren Faktoren abhängig. Hierunter werden einige wichtige durch die Eigenschaften der Implantatstruktur wie Porengröße, Porosität,

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Poren-Interkonnektivität, Implantatdicke sowie Oberflächentopographie, beschrieben. Eine der wichtigen Charakteristiken der porösen PEGT/PBT-Kopolymermatrizen ist ihre Degradierbarkeit in vivo. Es wäre, am Beispiel von PEGT/PBT-Implantaten, von Vorteil, wenn die körperfremde kopolymere Matrix, nachdem sie ihre Funktion als Schiene für die geleitete Regeneration der Neodermis (guided tissue regeneration) erfüllt hat, aus dem Organismus so schnell wie möglich entfernt werden könnte. Dabei müsste außerdem sichergestellt werden, dass nicht nur das ursprüngliche Material, sondern auch seine niedermolekularen Abbauprodukte nicht zur Störung der Gewebeproliferation oder zu toxischen Nebenwirkungen führen. Es ist bislang jedoch nicht gelungen, eine kontrollierte Degradation des Biomaterials, wo Resorptions- bzw. Verlustrate der Implantatmasse annähernd gleich der Geschwindigkeit der Neubildung einer körpereigenen Gewebematrix ist, zu demonstrieren. Diverse Faktoren beeinflussen das Verhalten implantierter Materialien innerhalb eines biologischen Systems. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Antwort des Wirtsgewebes auf Implantate trotz ihrer einheitlichen chemischen Zusammensetzung und identischen Implantationsortes extrem variieren kann. Die aufgezeigten Differenzen sind vermutlich in erster Linie das Resultat unterschiedlicher biologischer Kompatibilität der Oberflächenstruktur der drei untersuchten Typen der Scaffold-Implantate. Es gibt bis heute kein synthetisches Biomaterial, das die Bedingungen für einen optimalen Dermisersatz erfüllt. Die Fähigkeit der degradierbaren porösen PEGT/PBT-Kopolymermatrix, als dermale Regenerations-und Stützschiene innerhalb eines Komposit-Hautersatzes zu dienen, bleibt weiterhin zu demonstrieren. Das in der vorliegenden Arbeit vorgestellte Konzept der in-vivo Prävaskularisation von synthetischen Scaffold-Implantaten repräsentiert nur eine der möglichen Methoden zur de-novo Neovaskularisation biotechnologisch hergestellter Ersatzgewebe. Wesentliche Beiträge wurden kürzlich zum Verständnis des Prozesses der Angio- bzw. Vaskulogenese geleistet. Effektive Neovaskularisation von synthetischen Geweben könnte bereits unter Verwendung verschiedener angiogener Faktoren und ihrer Freisetzungssysteme, durch präimplantative in-vitro Kultivierung von Endothelzellen auf synthetischer Polymeroberfläche, den Einsatz genetisch-

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modifizierter Zellen und endothelialer Progenitor-Zellen, etc., erzielt werden [112-116]. Obwohl sich die Entwicklung von Komposit-Hautersatzmaterialien noch in den Anfangsstadien befindet, ist das weltweit ein Gebiet intensiver Forschung. Vielversprechende Fortschritte sind auf diesem Gebiet in den kommenden Jahren zu erwarten. Schon in naher Zukunft könnte ein Komposit-Hautersatz neben den Spalthaut-Transplantaten, dem aktuellen Goldstandard in der Behandlung von Verbrennungswunden, Anwendung finden.

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Danksagungen

100

7. DANKSAGUNGEN Hochverehrtem Herrn Prof. Dr. med. H.-U. Steinau, Direktor der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, danke ich für die Aufnahme als Doktorand im Forschungslabor seiner Klinik und Überlassung des Themas dieser Arbeit. Herr Dr. med. Stefan Langer danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe sowie die stets konstruktive Kritik und präzise Analyse meiner Arbeit. Er führte mich mit großer Hingabe und Geduld in die wissenschaftliche Arbeit ein. Unter seiner Anleitung lernte ich mikrochirurgische Operationstechniken sowie intravitale fluoreszenzmikroskopische Untersuchungsmethoden. Seine fachliche Kompetenz und sein unermüdlicher Einsatz für das Gelingen der experimentellen Arbeit werden mir stets in bester Erinnerung bleiben. Ich danke Ihm besonders für die bis heute andauernde freundschaftliche Verbundenheit. Hochverehrtem Herrn Prof. Dr. med. K.-M. Müller, Direktor des Instituts für Pathologie an der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum, danke ich für die freundliche Gestattung der Durchführung von histologischen und mikroskopischen Arbeiten an seinem Institut sowie für die hilfreichen und kreativen Anregungen bei der Realisierung elektronenmikroskopischer Untersuchungen. Herrn Priv.-Doz. Dr. med. C. Kuhnen, Institut für Pathologie, Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum, danke ich besonders für die fachkundige Unterstützung und den stets kompetenten Rat bei der Durchführung histologischer und mikroskopischer Arbeiten. Frau Dr. rer. nat. I. Schmitz sowie den Mitarbeitern des elektronenmikroskopischen Labors am Institut für Pathologie der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum, danke ich sehr für die freundliche und kompetente Unterstützung bei der Durchführung rasterelektronenmikroskopischer Untersuchungen. Frau C. Troske, Mitarbeiterin des Instituts für Pathologie, danke ich besonders für die Unterstützung bei der Durchführung digitaler Bildanalysen mittels AnalySIS® -Bildbearbeitungsprogramm. Herrn P. Schuchardt und Herrn S. Wieskämper, Mitarbeitern des Tierstalles an der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum, danke ich für die freundliche Unterstützung und Betreuung der Versuchstiere. Ein besonderer Dank gilt weiterhin meiner Familie. Meiner Schwägerin Anna Koux danke ich besonders für die kreativen Vorschläge zur graphischen Gestaltung dieser Arbeit. Ich bedanke mich von ganzem Herzen bei meinen großartigen Eltern für Ihre immerwährende und hilfsbereite Unterstützung, die mir die Ausbildung zum Arzt und die Anfertigung dieser Dissertation erst ermöglichte. Schließlich danke ich meiner wundervollen Ehefrau für die konstruktive Kritik und Ihr Durchhaltevermögen beim Korrekturlesen des Skriptes dieser Arbeit. Das Forschungslabor für Mikrozirkulation sowie die vorliegende Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Vogelsang-Stiftung und ISOTIS NV, Niederlande.

Lebenslauf

101

8. LEBENSLAUF

Name: Andrej Ring

Geboren: am 7. Oktober 1976 in Pawlowka/UdSSR

Konfession: Evangelisch

Eltern: Nelli Ring, geb. Kremer Juri Ring wohnhaft in Waltrop, Kreis Recklinghausen

Geschwister: Daniel Ring

Familienstand: verheiratet mit Olga Koux-Ring, geb. Koux

Schulausbildung: 1982-1986 Grundschule, Pawlowka 1986-1990 Mittelschule, Pawlowka 1990-1993 Städt. Realschule, Waltrop 1993-1996 Theodor-Heuss-Gymnasium, Waltrop

Fremdsprachen: Russisch, Englisch

Zivildienst: 1996-1997 Chirurgische Abteilung, St. Vincenz Krankenhaus, Datteln

Studium: 1997 Beginn des Studiums der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum

Praktisches Jahr: Medizinische Klinik und Poliklinik der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum (Prof. Dr. med. H. Schatz)

Chirurgische Klinik und Poliklinik der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum (Prof. Dr. med. G. Muhr)

Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte der Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum (Prof. Dr. med. H.-U. Steinau)

Ärztliche Prüfung: Arzt im Praktikum:

17. November 2003 seit Januar 2004 in der Chirurgischen Klinik Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum

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Untersuchungen zur Neovaskularisation und Degradation ... · Die Blutversorgung der Haut erfolgt über arterielle Äste der Subkutis, die sich meistens von den muskulären Perforansgefäßen