Upload
others
View
12
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
ŞCOALA DOCTORALĂ
ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
Ing SIMONA VICTORIA ILEA (ZĂVOI)
CARACTERIZAREA UNOR PLANTE MEDICINALE AUTOHTONE ŞI A UNOR BIOPRODUSE DERIVATE
CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof Dr Carmen SOCACIU
Cluj-Napoca 2011
1
2
CUPRINS
INTRODUCERE 5
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PROPRII 7
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATO-PROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ 7
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
8
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE 8
III1 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDROALCOOLICE
ŞI HIDROGLICERICE 8
III 11 Materiale şi metode 8
III12 Rezultate şi discuţii 9
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS 9
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR 12
III13 Concluzii 14
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE 15
III 21 Materiale şi metode 15
III 22 Rezultate şi discuţii 16
III221 Analiza spectrometrică UV-VIS 16
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din
extractele metanolice 17
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR 17
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice 21
III23 Concluzii 24
3
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI SPECTROMETRIE
FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ CHEMOMETRICĂ 25
OBIECTIVE 25
IV 1 ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV 25
IV11 Materiale şi metode 25
IV12 Rezultate şi discuţii 25
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei specifice
a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de plantă 26
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi
T ( target = ţintit) 26
IV13 Concluzii 29
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR 29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice
a plantelor 30
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi
T ( target = ţintit) 32
IV23 Concluzii 33
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR 33
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 33
V1 Materiale şi metode 34
V2 Rezultate şi discuţii 34
V21Analiza spectrometrica UV-Vis 35
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV 37
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR 38
V24 Concluzii 39
4
CONCLUZII GENERALE 41
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43
5
INTRODUCERE
Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia
şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză
Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici
influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar
şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga
2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană
arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea
testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)
Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie
poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor
medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de
recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite
tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col
1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn
acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)
Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică
poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă
performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu
detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică
(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR
NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor
technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi
col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col
2010)
Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă
pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre
compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi
Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o
investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta
6
extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode
fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col
2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători
rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi
cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)
Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn
polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie
Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză
celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)
Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o
importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol
deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)
Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale
autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut
ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn
vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma
acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două
părţi
Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)
Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi
compoziţie chimică generală
Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)
Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice
hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin
cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
2
CUPRINS
INTRODUCERE 5
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PROPRII 7
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATO-PROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ 7
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
8
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE 8
III1 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDROALCOOLICE
ŞI HIDROGLICERICE 8
III 11 Materiale şi metode 8
III12 Rezultate şi discuţii 9
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS 9
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR 12
III13 Concluzii 14
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE 15
III 21 Materiale şi metode 15
III 22 Rezultate şi discuţii 16
III221 Analiza spectrometrică UV-VIS 16
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din
extractele metanolice 17
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR 17
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice 21
III23 Concluzii 24
3
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI SPECTROMETRIE
FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ CHEMOMETRICĂ 25
OBIECTIVE 25
IV 1 ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV 25
IV11 Materiale şi metode 25
IV12 Rezultate şi discuţii 25
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei specifice
a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de plantă 26
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi
T ( target = ţintit) 26
IV13 Concluzii 29
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR 29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice
a plantelor 30
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi
T ( target = ţintit) 32
IV23 Concluzii 33
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR 33
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 33
V1 Materiale şi metode 34
V2 Rezultate şi discuţii 34
V21Analiza spectrometrica UV-Vis 35
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV 37
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR 38
V24 Concluzii 39
4
CONCLUZII GENERALE 41
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43
5
INTRODUCERE
Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia
şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză
Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici
influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar
şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga
2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană
arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea
testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)
Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie
poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor
medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de
recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite
tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col
1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn
acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)
Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică
poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă
performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu
detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică
(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR
NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor
technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi
col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col
2010)
Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă
pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre
compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi
Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o
investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta
6
extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode
fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col
2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători
rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi
cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)
Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn
polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie
Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză
celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)
Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o
importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol
deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)
Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale
autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut
ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn
vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma
acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două
părţi
Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)
Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi
compoziţie chimică generală
Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)
Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice
hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin
cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
3
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI SPECTROMETRIE
FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ CHEMOMETRICĂ 25
OBIECTIVE 25
IV 1 ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV 25
IV11 Materiale şi metode 25
IV12 Rezultate şi discuţii 25
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei specifice
a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de plantă 26
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi
T ( target = ţintit) 26
IV13 Concluzii 29
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR 29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice
a plantelor 30
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi
T ( target = ţintit) 32
IV23 Concluzii 33
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR 33
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 33
V1 Materiale şi metode 34
V2 Rezultate şi discuţii 34
V21Analiza spectrometrica UV-Vis 35
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV 37
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR 38
V24 Concluzii 39
4
CONCLUZII GENERALE 41
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43
5
INTRODUCERE
Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia
şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză
Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici
influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar
şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga
2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană
arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea
testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)
Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie
poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor
medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de
recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite
tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col
1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn
acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)
Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică
poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă
performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu
detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică
(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR
NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor
technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi
col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col
2010)
Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă
pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre
compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi
Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o
investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta
6
extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode
fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col
2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători
rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi
cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)
Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn
polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie
Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză
celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)
Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o
importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol
deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)
Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale
autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut
ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn
vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma
acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două
părţi
Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)
Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi
compoziţie chimică generală
Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)
Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice
hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin
cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
4
CONCLUZII GENERALE 41
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 43
5
INTRODUCERE
Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia
şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză
Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici
influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar
şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga
2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană
arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea
testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)
Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie
poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor
medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de
recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite
tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col
1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn
acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)
Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică
poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă
performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu
detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică
(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR
NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor
technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi
col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col
2010)
Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă
pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre
compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi
Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o
investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta
6
extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode
fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col
2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători
rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi
cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)
Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn
polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie
Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză
celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)
Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o
importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol
deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)
Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale
autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut
ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn
vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma
acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două
părţi
Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)
Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi
compoziţie chimică generală
Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)
Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice
hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin
cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
5
INTRODUCERE
Plantele medicinale au demonstrat de secole efectele lor benefice icircn profilaxia
şi terapia unor boli fără efecte secundare comparativ cu medicamentele de sinteză
Compoziţia acestora este dependentă de mulţi factori ontogenici şi fenotipici
influenţaţi de mediu vacircrstă perioada recoltării modalitatea de uscare şi păstrare dar
şi de tipul solventului utilizat la extracţie (Tămaş M 1999 Tămaş M şi I Oniga
2000) Datorită heterogenităţii lor naturale calitatea acestor plante din flora spontană
arată fluctuaţii astfel icircncacirct este nevoie de standardizarea extractelor autentificarea
testarea purităţii şi a acţiunii (Yadav NP şi Dixit 2008 Hussain Kşi col 2009)
Identificarea amprentei compuşilor fitochimici prin cromatografie şi spectroscopie
poate oferi informaţii utile despre compoziţia calitativă şi cantitativă a plantelor
medicinale cu recunoaşterea prin metode chemometrice a markerilor de
recunoaştere (Maloney V 2004 Bender DA 2005) şi discriminarea icircntre diferite
tipuri de plante sau extracte sau a formulelor standardizate (McGuffin Mşi col
1997 Liang YZ şi col 2004 Yadav NP şi Dixit 2008 Giri L şi col 2010) icircn
acord cu cerinţele WHO (WHO 2003)
Evaluarea produselor de plante medicinale prin amprenta lor metabolomică
poate fi realizată prin metode avansate ce includ cromatografia lichidă de icircnaltă
performanţă (HPLC cu detecţie UV(DAD) ELSD MS) sau gaz cromatografie cu
detecţie MS (GC-MS) cromatografie pe strat subţire cu cuantificare densitometrică
(HPTLC-densitometrie) spectrometrie vibraţională icircn icircnfraroşu sau Raman (FT-MIR
NIR Raman) spectrometrie de rezonanţă magnetică NMR sau o combinaţie a acestor
technici (Fan XH şi col 2006 Mattoli L şi col 2006 Gong F şi col 2005 Li S şi
col 2008 Hashimoto A şi T Kameoka 2008 Gong F şi col 2009 Giri L şi col
2010)
Spectroscopia UV-Vis este o tehnică simplă ieftină şi uşor de utilizat utilă
pentru a identifica şi cuantifica principalii compuşi fitochimici discriminacircnd icircntre
compuşii lipofilici şi hidrofilici icircn corelaţie cu polaritatea solvenţilor utilizaţi
Tehnica spectrometriei icircn Infraroşu cu transformantă Fourier (FTIR) e o
investigaţie rapidă şi ne-distructivă uşor de utilizat pentru a determina amprenta
6
extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode
fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col
2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători
rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi
cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)
Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn
polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie
Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză
celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)
Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o
importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol
deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)
Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale
autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut
ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn
vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma
acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două
părţi
Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)
Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi
compoziţie chimică generală
Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)
Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice
hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin
cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
6
extractelor de plante sau pudre mai puţin cunoscută faţă de cromatografie sau metode
fizico-chimice clasice (Li Y şi col 2004b Hussain K şi col 2009 Liu H şi col
2006) Utilizarea sistemului de reflectanţă totală atenuată (ATR) permite măsurători
rapide prin FTIR icircn lichide (uleiuri şi extracte) permiţacircnd identificarea şi
cuantificarea biomarkerilor din plante (Schultz H şi M Baranska 2007)
Icircn general plantele medicinale cu acţiune hepatoprotectoare sunt bogate icircn
polifenoli cu potenţial antioxidant (de exemplu Armurariu Anghinare Păpădie
Rostopască Sunătoare) cunoscacircndu-se faptul că bolile hepatice presupun necroză
celulară şi stres oxidativ (Utrilla MP 1996 Negi AS şi col 2008)
Tinacircnd seama de potenţialul lor intens antioxidant compuşii polifenolici au o
importanţă aparte Icircn cadrul compuşilor polifenolici familia flavonoidelor are un rol
deosebit prin impactul direct asupra sănătăţii (Harbone JBşi CA Williams 2000)
Icircn teza mea de doctorat intitulată ldquo Caracterizarea unor plante medicinale
autohtone şi a unor bioproduse derivate cu acţiune hepatoprotectoare rdquo am avut
ca scop cercetarea şi studierea unor plante cunoscute ca plante hepatoprotectoare icircn
vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector efect rezultat icircn urma
acţiunii sinergice a principiilor active din aceste plante Teza este icircmpărţită icircn două
părţi
Prima parte este de studiu bibliografic şi include două capitole (1-2)
Capitolul I Plante medicinale cu acţiune hepatoprotectoare caracteristici botanice şi
compoziţie chimică generală
Capitolul II Compuşi bioactivi care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Partea a doua este partea de cercetări proprii şi cuprinde trei capitole (3-5)
Capitolul III Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor hidroalcoolice
hidroglicerice şi metanolice Capitolul IV Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin
cromatografie HPLC-UV ŞI spectrometrie FT-MIR cuplate cu analiză chemometrică Capitolul V Obţinerea şi caracterizarea unor biopreparate cu efect hepatoprotector
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
7
SCOP SI OBIECTIVE
Scopul cercetărilor intreprinse a fost studiul componentelor bioactive a unor
plante autohtone cunoscute ca avacircnd potenţial hepatoprotector caracterizarea
compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii unor biopreparate cu efect hepatoprotector
prin acţiunea sinergică a principiilor active din aceste plante
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
Obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii au urmărit
1 Caracterizarea comparativă a compoziţiei extractelor de tip hidroalcoolic
hidrogliceric si metanolic din cele 8 plante investigate utilizacircnd metode
analitice avansate (spectrometrie de tip UV-Vis spectrometrie in Infraroşu
Mediu (FT-MIR) şi HPLC cu detecţie icircn UV (HPLC-UV)
2 Analiza variabilităţii de compoziţie a plantelor investigate prin cromatografie
HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
3 Aplicarea analizei chemometrice si a analizei statistice de tip ANOVA pentru
interpretarea rezultatelor
4 Obţinerea şi caracterizarea a două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
CAPITOLUL I
PLANTE MEDICINALE CU ACŢIUNE HEPATOPROTECTOARE
CARACTERISTICI BOTANICE ŞI COMPOZIŢIE CHIMICĂ GENERALĂ
Plantele investigate icircn prezentul studiu sunt următoarele Păpădia Anghinarea
Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi Cătina-fructe Detalii
privind caracteristicile lor botanice şi de compoziţie chimică sunt detaliate icircn lucrare
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
8
CAPITOLUL II
COMPUŞI BIOACTIVI CARE CONFERĂ PROPRIETĂŢI
HEPATOPROTECTOARE
Compuşii bioactivi care intră icircn compoziţia acestor plante sunt prezentaţi detaliat
subliniindu-se acele tipuri de molecule care conferă proprietăţi hepatoprotectoare
Ambele capitole (capitolul I şi capitolul II) includ date obţinute pe baza studiului de
literatură
CAPITOLUL III
CARACTERIZAREA COMPARATIVĂ A COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR
HIDROALCOOLICE HIDROGLICERICE ŞI METANOLICE
OBIECTIVE ŞI EXPERIMENTE Pentru a caracteriza capacitatea de extracţie a componentelor active din cele 8
tipuri de plante studiate conferită de diferiţi solvenţi şi compoziţia specifică a acestor
extracte dependentă de tipul şi polaritatea solventului am urmărit două obiective şi
anume
I stabilirea importanţei şi a rolului solventului utilizat privind eficacitatea de
extracţie a compuşilor bioactivi din plantele investigate
II stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-Vis FTIR şi
cromatografie de lichide de icircnaltă performanţă) pentru evaluarea corectă a
bdquoamprenteirdquo de recunoaştere a plantelor şi a tipului de extract de cuantificare a
concentraţiilor de compuşi bioactivi şi de evaluare a autenticităţii acestor
extracte
Pentru a icircndeplini aceste obiective am efectuat două module experimentale fiecare cu
obiective bine stabilite
III1CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR HIDRO-
ALCOOLICE ŞI HIDROGLICERICE
III 11 Materiale şi metode
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
9
S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 menţionate la capitolele
anterioare cacircte două probe icircn paralel care au fost extrase cu solvenţi de tip
hidrogliceric (G) şi hidroalcoolic (E)
Metodele utilizate pentru identificare şi analiză cantitativă au fost spectrometria UV-
VIS şi spectrometria icircn IR cu transformantă Fourier pe domeniul 400-700 cm-1
( Middle Infrared = MIR) notat FTMIR
III12 Rezultate şi discuţii
III121 Analiza spectrometrică UV-VIS
S-au identificat absorbţiile specifice la lungimile de undă cu maxim şi s-au măsurat
intensităţile de absorbţie (A)
Icircn funcţie de absorbţiile specifice s-au făcut identificări ale grupurilor de molecule pe
domenii
Domeniul 212-214 nm este atribuit compuşilor lipidici (fitosteroli lipide
polare) unor vitamine (vitamina C E) şi terpenoide
Domeniul 275-290 nm este atribuit compuşilor fenolici (acizi fenolici liberi sau
derivaţi ai acizilor fenolici)
Domeniul 320-330 nm este atribuit compuşilor flavonoidici icircn forma liberă sau
glicozilaţi
Domeniul 390-420 nm este atribuit compuşilor flavonoidici şi chinonelor
derivate prin oxidarea polifenolilor
Analiza chemometrică de tip PCA şi CA
Pe baza datelor obţinute s-a făcut analiza chemometrică de tip PCA şi CA ale
extractelor icircn etanol (E) şi glicerină (G) a celor 8 plante investigate
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
A Analiza PCA de diferenţiere a plantelor utilizate conform datelor din analiza spectrometrică UV-Vis
B Analiza PCA de diferenţiere pa baza maximelor de absorbţie a spectrului icircn extracte de tip gliceric (G) şi etanolic (E) pe domeniile 212-214 nm 275-290 nm 320-330 nm şi 390-420 nm
10
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
C Analiza CA de diferenţiere pe 6 nivele a plantelor utilizate la obţinerea extractelor glicerice şi etanolice
Fig III1 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru analiza
spectrometrică UV-Vis ale extractelor celor 8 plante investigate efectuate icircn etanol
(E) şi glicerină (G)
Analiza chemometrică subliniază că
1 Păpădia se diferenţiază semnificativ faţă de Rostopască-Anghinare şi
Armurariu-Pedicuţă şi se asociază prin compoziţie cu Cătină fructe şi
Sunătoare mai ales datorită unui conţinut mai mare de compuşi ce absorb la
lungimi de undă mai mari decacirct 320 nm adică flavonoide
2 Anghinarea este mai bogată icircn compuşi fenolici (derivaţi de acid cinamic) şi
se aseamănă cu Rostopasca prin derivaţii terpenoidici
3 Seminţele de Armurariu sunt sunt mai bogate icircn lipide ( esteri de acizi
fenolici) ce absorb la lungimi de undă mai mici ( sub 278 nm) Armurariul
se asociază cu Pedicuţa datorită conţinutului mai mare de compuşi lipidici
4 Cătina frunze se diferenţiază prin conţinutul mare de lipide ( şi esteri de
acizi fenolici asemănacircndu-se cu grupul Armurariu-Pedicuţă) dar are
similitudini cu Cătina fructe 11
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
12
5 Prin integrarea datelor putem concluziona că grupul Sunătoare - fruct şi
frunze Cătină este dominant flavonoidic grupul Anghinare-Rostopască este
caracterizat preponderent de derivaţi de acizi fenolici şi derivaţi taninoşi iar
grupul Armurariu-Pedicuţă dar şi frunze Cătină are preponderent compuşi
lipidici şi terpenoide Păpădia este delimitată de aceste grupuri fiind foarte
bogată icircn compuşi polari de tip acid fenolic icircndeosebi acid cumaric şi
cumarine Pentru primele categorii extracţia icircn glicerină este benefică icircn
timp ce pentru ultima categorie extracţia icircn etanol este superioară
III122 Analiza spectrometrică FT-MIR
Din analiza comparativă a aspectului spectrelor FTIR se constată că
Icircn zona 8 (3000-3350 cm-1 ) apar diferenţe care identifică conţinutul de apă al
probelor respectiv se pot recunoaşte probele evaporate printr-o intensitate şi
arie mai mică a semnalelor semnificativ icircn cazul extractului etanolic La
extractul gliceric diferenţele sunt mici
Icircn zona 7 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice extractului gliceric
ce pot fi atribuite gruparilor metil din compuşii metoxilaţi sau lanţuri alchil din
compuşi lipidici precum şi prezenţei unor aldehide
Icircn zona 6 (2800-3000 cm-1) apare un semnal proeminent icircn cazul ambelor tipuri
de extracte ( E sau G) foarte intens icircn cazul extractului de Anghinare şi separat
icircn două semnale icircn cazul extractului evaporat E şi G din fructe de Cătină Acest
semnal poate fi atribuit legăturilor esterice dar şi legăturilor C=O din aldehide
şi cetone şi a legăturilor N-O din aminoacizi sau peptide
Zonele 4 (1300-1440 cm-1) 3 (1170-1230 cm-1) şi 2 (1000-1100 cm-1)
diferenţiază cel mai mult aceste extracte atacirct icircn formă evaporată cacirct şi
neevaporate Ele constituie regiunea de fingerprint a extractelor din aceste
plante Ele corespund vibraţiilor de alungire a legăturilor C-C C-O a
legăturilor esterice şi respectiv a compuşilor glucidici simpli sau complecşi
care sunt solubili icircn solvenţii utilizaţi Icircn general aceste zone sunt mai bine
reprezentate şi mai intense la extractele icircn glicerină (G) Icircn cazul Anghinarei
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
zona 2-4 este mai intensă ( atacirct extract E cacirct şi G) de asemenea la Sunătoare-G
Armurariu-G Pedicută-G Rostopască-G Icircn cazul Cătinei fructele au extract E
evaporat foarte bogat icircn zonele 2-4 mai bogat decacirct la frunze icircn schimb icircn
extractul G amprenta zonelor 2-4 este similară
Analiza chemometrică de diferenţiere icircntre zonele de absorbţie FTIR
FigIII2 include reprezentarea analizei chemometrice de diferenţiere icircntre zonele de
absorbţie FTIR ale extractelor neevaporate de tip E şi G ale celor 8 plante analizate
A Analiza PCA de diferenţiere icircn funcţie de solvent şi zona de absorbţie FTIR
B Analiza PCA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
13
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
C Analiza CA de diferenţiere icircntre plante pe baza amprentei FTIR
Fig III2 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru absorbţiile FTIR ale extractelor neevaporate din cele 8 plante investigate efectuate icircn etanol (E) şi
glicerină (G)
S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
III13 Concluzii
Spectrometria FTIR a permis evidenţierea bdquoamprenteirdquo specifice a extractelor
etanolice şi glicerice ale plantelor investigate evidenţiind zonele care sunt specifice şi
cu intensităţi care să permită evaluarea comparativă a grupelor funcţionale specifice
din fiecare plantă
Icircn general plantele care au fost mai bogate icircn compuşi lipidici şi mai solubile
icircn etanol fructele de Cătină Armurariu au avut absorbţii FTIR mai mari icircn zonele 7
6 4 3 (zone de fingerprint asemănătoare uleiurilor) icircn timp ce plantele bogate icircn
flavonoide au avut zona 2 mai intensă
Analiza chemometrică de tip PCA a fost utilă pentru a diferenţia tipurile de
extracte (G şi E) extractul gliceric determinacircnd extracţii mai bune a compuşilor ce
14
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
15
absorb icircn zonele 2-3cedil icircn timp ce etanolul a facilitat extracţia compuşilor ce absorb icircn
zonele 3 şi 6Nesemnificativ diferenţiate icircn funcţie de solvent au fost zonele 7 8 şi 4
Analiza chemometrică efectuată pe baza datelor obţinute ( prin testul PCA) din
probele extractelor evaporate ne arată că solventul şi zonele care diferenţiază
semnificativ probele sunt glicerina ( zona 2 si zona 3) etanolul zona 3 şi 6
Nesemnificativ diferenţiate sunt zonele 7-8 şi 4
Analiza comparativă de tip cluster (CA) icircn funcţie de aspectul spectrului FTIR
al plantelor evidenţiază că Pedicuţa şi Anghinarea formează un grup (I) delimitat de
Cătina (frunze-fruct) si Sunătoare (II) si delimitat de Rostopască-Armurariu (III) Şi
icircn acest caz Păpădia este diferenţiată de celelalte plante asemănător cu cele constatate
la analiza spectrometrică UV-Vis Această analiză a fost repetată pe un număr mai
mare de probe de fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile
( cap IV) S-a stabilit o corelaţie bună icircntre analiza PCA şi CA
Cătina (frunze şi fructe) şi Sunătoarea se pot grupa fiind bine corelate prin
proprietăţi Rostopasca şi Păpădia sunt un al treilea grup caracterizate prin compuşi
lipidici polari
Analiza spectrometrică FTIR a fost repetată pe un număr mai mare de probe de
fiecare tip pentru a se stabili dacă aceste concluzii sunt valabile Rezultatele sunt
prezentate icircn Cap IV
III2 CARACTERIZAREA COMPOZIŢIEI EXTRACTELOR METANOLICE
III 21 Materiale şi metode S-au utilizat plante uscate ( su gt 90) din categoriile 1-8 cacircte două probe de 15 g icircn
paralel care au fost extrase cu 85 metanol acidulat (metanol 90 acidulat cu 1
acid clorhidric)
Analiza spectrometrică UV-Vis
Pe baza măsurătorilor efectuate s-a calculat factorul de extracţie icircn metanol (M) şi s-a
comparat cu valorile icircnregistrate icircn ceilalţi solvenţi ( E si G)
Determinarea conţinutului de polifenoli totali
Determinarea conţinutului de polifenoli totali a fost efectuată prin metoda Metoda
FOLIN-CIOCAcircLTEU
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
Analiza cromatografică HPLC-UV
Separarea cromatografică HPLC a compuşilor fenolici din extractele metanolice de
plante medicinale s-a efectuat icircntr-un sistem HPLC Agilent 1200 cu detector UV-Vis
utilizacircnd un sistem de gradient cu două faze mobile ( Tabel III5) cu debit de1mlmin
Analiza spectrometrică FT-MIR
Măsurătorile s-au efectuat numai pe extracte neevaporate
III 22 Rezultate şi discuţii
III221 Analiza spectrometrică UV-Vis
Pentru a avea o imagine comparativă privind factorii de extracţie a diferitelor
plante medicinale (plantele 1-6) icircn funcţie de solvent şi de concentraţia substanţelor
extrase icircn FigIII3 s-au reprezentat valorile medii EF pe intervalul de max = 270-
290 nm (specific pentru derivaţi fenolici) extraşi icircn E G M (EFE1 EFG1 EFM1) şi
pe intervalul de max = 317-340 nm (pentru derivaţi flavonoidici) (EFE2 EFG2
EFM2)
Fig III3 Valori medii comparative ale factorilor de extracţie (EF) icircn diferiţi solvenţi
( E G M) la 270-290 nm (corespunzacircnd compuşilor fenolici ) (EFE1 EFG1 EFM1)
şi 317-340 nm (corespunzacircnd derivaţilor flavonoidici) (EFE2 EFG2 EFM2) pentru
plantele 1-6
Conform datelor prezentate se constată că valorile EF ale extractelor metanolice (M)
sunt superioare faţă de valorile EF pentru G şi E icircndeosebi icircn domeniul specific
16
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
absorbţiei acizilor fenolici (( 278 nm) (EFE1 EFG1 EFM1) comparative cu valorile
EF specific compuşilor flavonoidici (EFE2 EFG2 EFM2)
III222 Determinarea prin spectrometrie a conţinutului de fenoli totali din extractele metanolice Cele mai bogate surse de polifenoli sunt Sunătoarea şi frunzele de Cătină urmate de
Păpădie fructe de Cătină şi Rostopască
III223 Analiza spectrometrica FT-MIR
Calibrarea metodei cu acid galic şi amestec de acid galic cu extracte de Păpădie şi
respectiv Sunătoare
Pentru a evidenţia icircn spectrele FT-MIR absorbţiile specifice compuşilor
fenolici s-au efectuat măsurători pe un set de 5 concentraţii de acid galic
Figura III4 reprezintă aspectul spectrelor FT-MIR pe domeniul de fingerprint
750-2000 cm-1
2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 00 0
0 1
0 2
0 3
0 4
0 5
0 6
0 7
0 8
Abso
rban
ce a
u
W a v e n u m b e r ( c m -1 )
0 0 6 2 5 m g m l 0 1 2 5 m g m l 0 2 5 m g m l 0 5 0 m g m l 1 m g m l
FigIII4 Curba de calibrare a acidului galic prin icircnregistrarea spectrului FTMIR (750-2000 cm-1)
Se constată că apar 4 seturi de semnale semnificative dintre care cele de la 1614 şi 1743 cm-1 s-a constatat că au o bună corelaţie concentraţie-intensitate semnal (FigIII5)
17
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
A
0005
01015
02025
03035
04045
00625 0125 025 05 1
intensitate
conc acgalic (mgml)
1614
1743
B
02468
1012141618
00625 0125 025 05 1
aria
concacgalic (mgml)
16141743
Fig III5 Corelaţii icircntre concentraţia de acid galic şi intensitatea ( A) sau aria ( B) semnalelor de absorbţie IR de la 1614 şi 1740 cm-1
Pentru semnalul de la 1743 cm-1 de pe curba prezentată icircn Fig III24 s-a calculat
coeficientul de corelaţie R2 acesta avacircnd valoarea de 09972
18
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
y = 00805x + 00186R2 = 09972
0
002
004
006
008
01
012
0 02 04 06 08 1 12
concentratia acgalic (mgml)
inte
nsita
tea
la 1
743
1cm
FigIII6 Curba de etalonare obţinută pentru acidul galic (5 concentraţii) in funcţie de intensitatea semnalului de la 1743 cm-1
Pentru a evidenţia aceste semnale icircn probe s-au utilizat extracte de Sunătoare
şi Păpădie la care s-a adăugat icircn mod controlat acid galic 1 mgml (Fig III7)
Spectrele FTMIR au fost astfel comparate
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Sunatoare cu
acgalic 1 m gm l
W avenum ber (cm -1)
Acgalic 05m gm l
EM Sunatoare
EM Sunatoare cu
acgalic 05m gm l
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
EM Papadie cu
acgalic 1mgml
EM Papadie cu
acgalic 05mgml
Wavenumber (cm-1)
AcGalic 05 mgml
EM Papadie dil 110
Fig III7 Spectrele comparative ale extractelor metanolice de Păpădie şi Sunătoare cu adaus controlat de acid galic ( 1mgml)
Se observă că apar diferenţe la semnalele de la 1743 la 1614 1310 şi la 1035 cm-1
Se constată astfel că icircn extractul metanolic de frunze de Cătină s-a identificat cea mai
mare concentraţie de compuşi fenolici prin ambele metode şi de asemenea icircn
Armurariu şi Pedicuţă cele mai mici concentraţii
19
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
Icircn acest fel se demonstrează că metoda FTIR poate fi utilă icircn evaluarea concentraţiei
de compuşi fenolici cu condiţia să fie considerat un factor de ajustare prin icircmpărţire
care are valoarea 8
Analiza spectrometrică FT-MIR a extractelor metanolice (EM) de la cele 8 plante
investigate
FigIII8 prezintă compatativ spectrul FTMIR al celor 8 extracte de plante şi al unui
amestec de compuşi fenolici ( utilizat pentru analiza cromatografică HPLC-UV)
3 4 0 0 3 2 0 0 3 0 0 0 2 8 0 0 2 6 0 0 2 4 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0- 1
0
1
2
3
4
5
6
E M F r u n z e c a t i n a
E M P e d i c u t aE M A r m u r a r i u
E M R o s t o p a s c a
E M A n g h i n a r e
Abs
orba
nce
au
W a v e n u m b e r c m - 1
E M P a p a d i e
E M C a t i n a f r u c t e
E M A m e s t e c a c f e n o l i c i
E M S u n a t o a r e
1236
7
8 5 4
FigIII8 Imaginea generală a spectrelor FTIR icircnregistrate icircn extractele metanolice (amprenta FT-MIR) ale celor 8 plante investigate comparativ cu amestecul de
compuşi fenolici utilizaţi ca standard la analiza HPLC-UV
Se evidenţiază cele 8 zone specifice unui spectru FTIR şi deosebiri ale amprentei icircn
regiunea de fingerprint (zonele 2-6) Identificarea grupărilor funcţionale a fost bazată
pe atribuirea semnelelor de intindere şi deformare din spectrul FTIR S-au identificat
8 regiuni (marcate 1 - 8) icircn domeniul MIR ( 4000-600 cm-1) iar zona de ldquofingerprintrdquo a
fost localizată icircntre 900 şi 1500 cm-1 (regiunile 1-4)
Icircn Fig III9 este prezentată o imagine sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7
specifice icircn care cele trei tipuri de extracte (E G şi M) prezintă semnale caracteristice
pentru plantele 1-6
20
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
Fig III9 Reprezentarea sintetică a zonelor FTMIR 1 2 4 6 7 specifice icircn care cele
trei tipuri de extracte (E G şi M) cu semnale caracteristice pentru plantele 1-6
Cacircnd s-au comparat concentraţiile de compuşi fenolici din ariile semnelelor
FTIR semnalul de la numărul de undă 1743 cm-1 (I1743) şi concentraţia de compuşi
fenolici totali calculaţi prin metoda FC ( Folin-Ciocacirclteu) au fost semnificativ
corelate (plt005) aşa cum se vede icircn Fig III10
x
FigIII10 Reprezentarea comparativă a valorilor concentraţiei de compuşi fenolici
totali exprimaţi icircn mg acid galic ml extract metanolic calculat prin datele de
spectrometrie Vis ( metoda Folin ciocacirclteu) din intensitatea semnalului FTIR la 1743
cm-1 şi din aria semnalelor FTIR din domeniul 1000-1700 cm-1
III224 Analiza cromatografică HPLC-UV a extractelor metanolice
Amprenta specifică extractelor prin cromatogramele HPLC ne indică icircn general un
raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici ( acizi fenolici şi derivaţi care au
timpi de retenţie pacircnă la 25 min) şi compuşi complecşi ( glicozizi flavonoidici sau alte
molecule mari) care au timpi de retenţie mai mari de 25 min pacircnă la 40 min 21
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
Determinarea cantitativă a concentraţiilor compuşilor polifenolici din extractele
metanolice
S-a făcut calculul concentaţiilor de compuşilor polifenolici pe baza ariilor din
cromatogramele HPLC utilizacircnd formula
mg compus fenolic100 g plantă = Aexpx10 Astd x 015
Analiza chemometrică cu ajutorul testelor PCA şi CA
Fig III11 include prezentarea grafică a analizei chemometrice efectuate prin testele
PCA şi CA
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul compuşilor fenolici care pot diferenţia
plantele investigate
Analiza PCA a scorurilor icircn funcţie de tipul plantei investigate şi diferenţierea liţia
icircn compuşi fenolici
22
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
23
Analiza CA a nivelelor de diferenţiere şi respectiv grupare a plantelor icircn funcţie de
compoziţia lor icircn compuşi fenolici
Fig III11 Analiza chemometrică de tip PCA şi CA efectuate pentru valorile
concentraţiilor de compuşi fenolici separaţi prin HPLC ale extractelor metanolice din
cele 8 plante investigate
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
24
Analiza chemometrică efectuată pentru valorile concentraţiilor de compuşi
fenolici separaţi din extractul metanolic ne arată că acidul elagic catechina acidul
protocatecuic şi para-hidroxi benzoic sunt cei care pot diferenţia aceste plante
Analiza PCA ce diferenţiază plantele evidenţiază o netă separare a Cătinei
frunze (7) de celelalte plante a Păpădiei (1) avacircnd o compoziţie semnificativ diferită
urmată de asocierea probei 2 3 6 şi 8 (Anghinare şi Pedicuţă Cătină fructe) şi
separat Păpădie (1) Armurariu (5) şi 4 (Sunătoare)
Analiza clusterelor (CA) ne arată diferenţierea netă a probelor 7 (Cătina frunze)
şi 1 ( Păpădie) asocierea bună icircntre probele 2 ( Anghinare) 3 ( Rostopasca) 6
( Pedicuţă) şi 8 ( Cătina fructe) icircn acord cu cele din analiza PCA Nu se pot grupa
probele de Armurariu (5) şi Sunătoare (4) dar sunt corelate prin compoziţie cu
probele 1 ( Păpădie) şi respectiv 2 ( Anghinare)
III23 Concluzii
Ca şi concluzii la datele prezentate icircn acest capitol putem constata că
1 Metodele spectrometrice UV-Vis şi FT-MIR sunt adecvate pentru a face
amprenta specifică şi comparativă a plantelor investigate Aceste metode au
valoare
2 Valorile factorilor de extracţie EF icircn cei trei solvenţi (metanol faţă de etanol şi
glicerină) au permis identificarea adecvată a tipurilor de compuşi bioactivi din
aceste plante şi polaritatea lor
3 S-au evidenţiat corelaţii pozitive şi semnificative din punct de vedere statistic
icircntre concentraţiile de compuşi fenolici calculaţi prin metode spectrometrice de
tip UV-Vis şi metodele bazate pe FTIR Chiar dacă icircn valoare absolută aceste
valori nu sunt superpozabile acestea sunt statistic proporţionale cu un factor
de reducere 8 ce trebuie aplicat pentru metodele bazate pe spectrometria FTIR
Valoarea intensităţii semnalului MIR de la 1743 cm-1 poate fi considerat un
bun indicator al concentraţiilor de compuşi fenolici din aceste extracte
4 Datele FTIR au fost corelate cu rezultatele analizelor cromatografice HPLC-
UV Astfel s-a estimat mai exact care sunt compuşii fenolici care conferă
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
25
caracter antioxidant şi hepatotoxic şi cum putem să icirci evaluăm prin metode
rapide ( FTIR si spectrometrie UG-Vis) prin validare icircn raport cu metode de
acurateţe cum este HPLC Aceste date sunt extrem de utile pentru evaluarea
biomarkerilor de autenticitate a acestor plante
CAPITOLUL IV
ANALIZA VARIABILITĂŢII DE COMPOZIŢIE A PLANTELOR
INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC-UV ŞI
SPECTROMETRIE FT-MIR CUPLATE CU ANALIZĂ
CHEMOMETRICĂ
Pe baza datelor obţinute pe plante individuale utilizacircnd diferiţi solvenţi şi metode de
investigaţie am selectat metoda extracţiei icircn metanol ca avacircnd cel mai mare
randament de extracţie al compuşilor bioactivi din clasa polifenolilor şi al unor
glucozizi flavonoidici sau alte grupe responsabile de acţiunea hepatoprotectoare
OBIECTIVE ŞI MĂSURĂTORI
Pentru a caracteriza şi verifica validitatea datelor şi variabilitatea compoziţiei
plantelor din cele 8 clase investigate s-a urmărit
I Stabilirea amprentei cromatografice HPLC şi caracterizarea variabilităţii
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
II Stabilirea amprentei spectrometrice FT-MIR şi variabilitatea
compoziţiei extractelor prin analiza chemometrică ţintită şi neţintită
ANALIZA CROMATOGRAFICĂ HPLC-UV
IV11 Materiale şi metode
S-au utilizat pentru analiză probe paralele de la cele 8 tipuri de plante investigate (cacircte
4 probe din fiecare tip de plantă)
Ca metode s-au folosit analiza cromatografică HPLC analiza spectrometrică FT-
MIR analiza chemometrică
IV12 Rezultate şi discuţii
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
26
IV121 Separarea cromatografică HPLC-UV şi identificarea amprentei
specifice a extractelor metanolice de la 4 variante de probe din fiecare tip de
plantă
Amprenta HPLC specifică extractelor metanolice ale celor 4 varianteplantă ne indică
icircn general un raport diferit icircntre compuşii polari cu molecule mici (acizi fenolici şi
derivaţi care au timpi de retenţie pacircnă la 25 min) (zona 1) şi compuşi complecşi
( glicozizi flavonoidici sau alte molecule mari) care au timpi de retenṭie mai mari de
25 min pacircnă la 40 min ( zona 2)
Pentru a putea interpreta adecvat variabilitatea şi asemănările respectiv deosebirile
care autentifică aceste plante am aplicat chemometria pe baza datelor obţinute prin
cromatografia HPLC
IV122 Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target =
ţintit)
Pe baza datelor colectate din analiza HPLC s-a aplicat sistemul NT şi T pentru a
evalua variabilitatea şi a putea autentifica şi diferenţia extractele obţinute
Analiza de tip neţintit (NT)
Pentru a caracteriza variabilitatea compoziţiei icircn polifenoli a celor 8 plante
investigate icircn sistem NT-neţintit s-au utilizat datele colectate din cromatogramele
HPLC icircn care nu s-au identificat compuşii individuali ci s-au considerat toate
semnalele de pe toată durata separării ( 0-55 min) Acestea au fost exprimate icircn arii
ale semnalelor care au fost introduse icircn softul specific al analizei PCA
Aplicarea metodei PCA ( Principal Component Analysis)
In sistem NT ldquoinfluencerdquo care evidenţiază variabilitatea s-au considerat primele 7
componente separate din amestec s-a obţinut graficul din FigIV 1
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
27
Fig IV1 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie a probelor icircn funcţie de
principalele 7 componente separate din cromatograma HPLC ( pe intervalul
0-55 min) icircn system NT
Se constată că icircn cazul probelor de frunzele de Cătină apar cele mai semnificative
deosebiri de compoziţie dar şi icircn cazul Armurariului Restul extractelor mai ales cele
de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă Sunătoare au fost grupate compact
In FigIV2 sunt reprezentate scorurile aferente acestei analize PCA sistem NT
Fig IV2 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea scorurilor
aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2 componente (pe
intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem NT
Leverage (PC-7)0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1
R es idual X- v ar ian c e
( PC - 7)
Influence
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600Armurariu
Anghinare
Armurariu Armurariu
Anghinare Anghinare Armurariu Catina fru
Catina fruCatina fru
PedicutaRostopa
Sunatoare
Sunatoare
Anghinare Catina fruedicuta 1 Catina fru
Catina fru
Catina fru
Catina fruPapadie 1
Papadie 2 Sunatoare
Papadie 3 Papadie 4PPedicuta 2Rostopasca
3 sca
Pedicuta 4RostopascaRostopasca
Sunatoare
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
Aplicarea metodei CA (Cluster Analysis)
Analiza corelaṭiilor de tip cluster (CA) bazate pe analiza HPLC-NT
FigIV3 include reprezentarea grafică a grupărilor de tip cluster pe mai multe nivele
de corelare
FigIV3 Corelaţii de tip cluster (CA)- average clustering folosind distanţe
Bray-Curtis şi 8 domenii-de clusterizare Aceste date sunt bazate pe analiza
HPLC-NT consideracircnd icircntregul interval ( 0-55 min)
Din analiza acestui grafic se evidenţiază următoarele
bull Cu excepţia Anghinarei şi a Păpăpădiei unde cele patru probe nu sunt omogene ca şi
compoziţie (apar icircn 2 clusteri diferit poziţionaţi) celelalte plante au compoziţie
omogenă ( ex Sunătoare Armurariu Rostopasca Cătina frunze)
bull Similitudini icircntre amprentele acestora bazate pe opoziţia celor patru tipuri de plante
din grupa ldquofrunze Cătinărdquo compoziţia frunzelor de Cătină e cel mai puţin corelată cu
compoziţia plantelor medicinale
Analiza PCA de tip ţintit (T)
Pentru a stabili dacă anumiţi compuşi fenolici sunt responsabili pentru variabilitate şi
a diferenţia plantele icircntre ele s-au considerat aprioric şase derivaţi fenolici separaţi
prin cromatografie HPLC şi icircn funcţie de valorile ariilor semnalelor s-au comparat
probele de extracteFig IV4reprezintă grafic rezultatele obţinute prin analiza PCA-T
28
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
IV4 Reprezentarea variabilităţii de compoziţie prin reprezentarea
scorurilor aferente probelor prin analiza PCA icircn funcţie de principalele 2
componente (pe intervalul de separare HPLC 0-55 min) icircn sistem T
consideracircnd 6 acizi fenolici majori acid galic protocatecuic clorogenic
para-cumaric trans cinamic şi elagic
Icircn cazul extractelor de Sunătoare s-a identificat un singur acid fenolic acidul para
cumaric prin urmare icircn analiza PCA nu au putut fi considerate două componente
Şi icircn acest caz extractele de frunze de Cătină apar semnificativ deosebite de celelalte
extracte sunt asociate cacircte două reproductibile icircntre ele restul extractelor mai ales
cele de Rostopască Cătină fructe Pedicuţă au fost grupate compact
IV13 Concluzii
Dintre extractele metanolice ale plantelor studiate extractul din frunze de Cătină se
diferenţiază semnificativ din punct de vedere al compoziţiei de celelalte plante fapt
rezultat din aplicarea metodei PCA icircn sistem NT pentru a evidenţia variabilitatea
principalelor şapte componente separate icircn cromatogramele HPLC pe intervalul 0-55
min acelaşi lucru reiese şi din reprezentarea scorurilor aferente analizei PCA icircn
sistem T Prin aplicarea metodei CA s-au obţinut rezultate similare
IV 2 ANALIZA SPECTROMETRICA FT-MIR
29
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
IV21Analiza spectrometrică FT-MIR şi identificarea amprentei specifice a plantelor
Rezultate şi discuţii
Pentru a identifica diferenţele calitative şi cantitative dintre plante s-au suprapus
spectrele FTIR prin combinaţiile prezentate icircn FigIV5
1Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Pedicuţă-Rostopască
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Păpădie-Anghinare
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm)-1
EM Rostopasca EM Pedicuta
1
2
3
4
5
67
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM papadie EM Anginare
1
3
4
5
678
2
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Armurariu-Sunătoare
2Spectre FTIR suprapuse pentru
extractele de Cătină frunze-fructe
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
30
Abs
orba
nce
au
Wavenumber (cm-1)
EM Sunatoare EM Armurariu
1
2
3
5
467
8
3500 3000 2500 2000 1500 100000
02
04
06
08
10
12
14
16
18 EM catina fruct
Abso
rban
ce a
u
Wavenumber (cm)-1
EM catina frunze2
6
5
3
417
8
FigIV5 Aspectul spectrelor FTIR suprapuse pentru extractele plantelor utilizate
luacircnd cacircte două plante aparent asemănătoare
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
Analiza variabilităţii prin analiză statistică bazată pe ariile semnalelor din
spectrul FTIR
Pentru a caracteriza variabilitatea de compoziţie a plantelor investigate pe baza
spectrului FTIR s-au considerat domeniile 700-1800 cm-1 şi 1800-4000 cm-1
calculacircndu-se ariile şi deviaţiile standard corespunzătoare pentru fiecare variantă de
plantă Reprezentarea grafică a acestei variabilităţi este vizibilă icircn FigIV6 şi IV7
Fig IV 6 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 700-1800 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopască (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1)
Fig IV 7 Analiza comparativă a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor
din spectrul FTIR domeniul 1800-4000 cm-1 cu reprezentarea valorilor medii
şi a deviaţiilor standard (SD) Abrevieri utilizate CF- frunze de Cătină (7)
Ped- Pedicuţa (6) Arm- Armurariu (5) S- Sunătoare (4) Ro-Rostopasca (3)
Ang- Anghinare (2) Cfr = fructe de Cătină (8) P- Păpădie (1) 31
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
IV22Analiza chemometrică icircn sistem NT ( neţintit=nontarget) şi T ( target = ţintit)
Bazată pe analiza spectrometrică FTIR
FigIV8 Analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 spectrele fiind normalizate
icircn vederea analizei PCA
FigIV9 Analiza PCA pentru zona 700-3200 cm-1 A Spectre nenormalizate B
Spectre Normalizate la 2200 cm-1
32
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
33
IV23 Concluzii
1 Icircn cazul analizei statistice a variabilităţii compoziţiei pe baza calculului ariilor din
spectrul FTIR pentru domeniul 700-1800 cm-1 din reprezentarea valorilor medii şi
a deviaţiilor standard se observă diferenţe semnificative icircn cadrul aceleiaşi plante
luată din loturi diferite
2 Analiza FTIR pentru domeniul 1800-4000 cm-1 are rezultate diferite faţă de
domeniul 700-1800 diferenţele icircntre variantele aceleiaşi plante fiind mai puţin
semnificative De aici rezultă faptul că dependent de lot icircn cazul aceleaşi plante
avem semnale diferite icircn zonelor FTIR corespunzătoare vibraţiilor de icircntindere
aparţinacircnd diferitelor legături chimice de tip C-H C-O C-C N-H şi C=O
3 Din analiza PCA pe domeniul 700-900 cm-1 se observă diferenţe semnificative
icircntre semnalele fructelor de Cătină şi celelalte plante la fel şi pentru Armurariu
4 Icircn cazul analizei PCA de tip scores pentru zona 700-3200 cm-1 se diferenţiază
semnificativ din punct de vedere a semnalelor FTIR Fructele de Cătină şi
Armurariul nu prezinta diferenţieri nesemnificative statistic fiind grupate
compact
5 Din analiza PCA pe domeniile 700-3200 cm-1 şi respectiv 700-900 cm-1 se observă
gruparea probelor de la aceeaşi plantă icircn mod semnificativ şi se remarcă deosebiri
icircntre grupările aferente diferitelor plante ( 8 grupări distincte) Nu sunt deosebiri
semnificative prin analiza spectrelor normalizate faţă de cele nenormalizate
Analiza FTIR s-a dovedit foarte utilă pentru a grupa plantele analizate icircn funcţie de
grupările funcţionale caracteristice fiind o metodă rapidă şi economică
CAPITOLUL V
OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR BIOPREPARATE CU EFECT
HEPATOPROTECTOR
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Scopul prezentului capitol este obţinerea şi caracterizarea a două biopreparate cu
potenţial hepatoprotector obţinute din plantele studiate anterior
Obiectivele cercetărilor din această etapă au inclus
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
34
1 Obţinerea a două biopreparate A1 si A2 sub formă de pudre care se pot administra
icircn formă de capsule de 03-05 g
2 Caracterizarea spectrometrică UV-Vis a produselor A1 si A2 determinarea
conţinutului de fenoli totali
3 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza cromatografică HPLC-UV
4 Caracterizarea biopreparatelor A1 si A2 prin analiza spectrometrică FT-MIR
V1 Materiale şi metode
S-au realizat amestecurile menţionate folosind proporţii egale Astfel
Biopreparatul A1 este format din următoarele Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111
Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare
amestecate icircn raport de masa 111
S-au preparat trei tipuri de extracte din biopreparatele A1 şi A2
O cantitate de 15 g fiecare amestec de plante A1 si A2 s-a dizolvat icircn volum de 100
ml din fiecare din cele trei tipuri de solvenţi
a soluţie 5 acid ascorbic icircn apă distilată icircncălzită la 45degC
b apă distilată icircncălzită la temperatura de 45degC
c metanol cu 1 HCl concentrat
Extracţiile s-au efectuat icircntr-un interval de 48 de ore la temperatura camerei după
care s-au filtrat si păstrat la temperatură de 4 ordmC pacircnă la momentul analizei
Metodele utilizate la analiza extractelor au fost
Analiza spectrometrică UV-Vis cu identificarea principalelor tipuri de compuşi
bioactivi (cap II)
Separarea identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor fenolici prin
cromatografie lichidă de icircnaltă performanţă HPLC-PDA ( capIII) şi
Stabilirea amprentei spectrometrice icircn Infraroşu prin tehnica cu transformantă Fourier
(FTIR)(cap IV)
V2 Rezultate şi discuţii
Fig V2 a si V2b prezintă imaginea biopreparatelor icircnainte şi după icircncapsulare
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
a
b
Fig V2 Imaginea pudrelor de plante utilizate la obţinerea biopreparatelor A1 şi A2
icircnainte (a) şi aspectul biopreparatelor după icircncapsulare (b)
V21Analiza spectrometrica UV-Vis
Din analiza UV-Vis au rezultat spectrele UV-Vis icircnregistrate pe extractele de tip
1a-1c şi 2a-2c obţinute din biopreparatele A1 şi A2
Valorile concentraţiilor de polifenoli totali
Prin analiza spectrometrică Folin Ciocacirclteu s-au obţinut următoarele valori de
compuşi polifenolici
Biopreparat A1 = 1850 mg polifenoli 100 g su
Biopreparat A2 = 1260 mg polifenoli 100 g su
Astfel se remarcă o concentraţie mai mare de polifenoli icircn biopreparatul A1 ce
conţine Anghinare Păpădie şi Armurariu date care sunt confirmate şi din
determinările individuale de polifenoli efectuate pe fiecare plantă icircn parte
35
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
36
Valorile obţinute sunt icircn concordanţă cu cele raportate de alţi autori (Socaciu C şi
col 2002 Socaciu C 2008a)
Pe baza spectrelor UV utilizacircnd absorbţiile DO270nm şi DO320nm şi diluţiile efectuate la
citirea absorbţiei s-a calculat factorul de extracţie (FE) pentru fiecare biopreparat
( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţi utilizaţi ( a-c) prezentat icircn tabelul V1
Tabel V1
Valorile absorbţiilor ale diluţiilor şi ale factorilor de extracţie (FE) calculaţi pentru
fiecare biopreparat ( A1 si A2) icircn fiecare din solvenţii utilizaţi ( a-c)
Biopreparat Solvent DO270 nm DO320nm Diluţia Factorul de
extracţie(FE)
A1
B 0768 0423 100 1191
C 0936 0457 200 2786
A2 B 0330 0157 100 487
C 0556 0398 200 1908
Se constată că factorii de extracţie sunt de aproximativ 25 - 4 ori mai mari icircn metanol
( c) acidulat decacirct icircn apă (b)
Comparativ biopreparatul A1 are FE mai mari decacirct A2 icircn concordanţă cu valorile
mari mari de polifenoli totali icircn acest biopreparat
In concluzie putem aprecia că
1 Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie icircn raport de masă
echivalent are o concentraţie mai mare de polifenoli 1850 mg 100g faţă de
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare şi a
cărei concentraţie icircn polifenoli este de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi la
categoria acizilor fenolici care absorb la 280 nm
2 Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23)
urmat de apa distilată (b)
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
37
V22 Analiza cromatografică HPLC-UV
Concluzii Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o dependenţă a compuşilor
din extracte dependent de solventul utilizat Astfel
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilata (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1 dar mai
mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage acidul
vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare varietate şi
cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din biopreparatul
A1 la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina silibinina
taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi icircn
biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
Rezultatele cantitative pentru compuşii identificaţi icircn cele două biopreparate arată
următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce icircn
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
38
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic şi protocatecuic icircn cantităţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare -hipericina şi
pseudohipericina )
bull De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este mai bogat icircn
flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac icircn compuşi
polifenolici
V23 Analiza spectrometrică FT-MIR
Icircn cazul extractelor din biopreparatele A1 si A2 s-au făcut corelaţii icircntre tipul şi
domeniul de frecvenţe de absorbţie IR şi atribuirea lor la grupările funcţionale
specifice Icircn cazul biopreparatelor analizate se delimitează 8 zone de frecvenţe
marcate de la 1 la 8 De regulă zonele 2-6 sunt considerate ca aparţinacircnd domeniului
de fingerprintDomeniile utilizate pentru calculul ariilor sunt de obicei din domeniul
de fingerprint (900-1500 cm-1 )Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică
FT-MIR (ATR) cele două biopreparate A1 şi A2 S-a constatat că amprentele acestora
sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Biopreparatul A1 are ca zonă
specifică de recunoaştere zona (6) a cărei frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1 icircn
timp ce A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100 cm-1
Zona 6 e specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona (2)
indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o concentraţie mai
mare de compuşi peptidici lipidepolare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri
de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-colagog icircn timp ce
biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici (flavonoide) icircn formă
glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi explică efectul de
protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
39
V24 Concluzii
Icircn raport cu obiectivele propuse putem concluziona următoarele
1 S-au obţinut două biopreparate A1 şi A2 sub formă de pudre icircncapsulate
avacircnd fiecare compoziţii specifice Pudrele obţinute au fost introduse icircn capsule
avacircnd masele 020 g ( A1 ) şi 027 g (A2 )
Compoziţia acestora este diferită şi are acţiune specifică Astfel
bull A1 Anghinare Armurariu şi Păpădie ( raport de masa 111) Acest biopreparat
are preponderent efect coleretic si colagog
bull A2 Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare ( raport de masă
1111) Acest biopreparat are preponderent efect de protecţie antioxidantă a celulei
hepatice
2 Compoziţia acestor biopreparate este reprezentată printr-un conţinut mare de
compuşi polifenolici care explică acţiunea hepatoprotectoare Astfel
Biopreparatul A1 care conţine Anghinare Armurariu şi Păpădie are o
concentraţie mai mare de polifenoli icircndeosebi derivaţi de acizi fenolici icircn
concentraţie medie de 1850 mg 100g
biopreparatul A2 care conţine Cătină-frunze Pedicuţă Rostopască şi
Sunătoare are o concentraţie icircn polifenoli de 1260 mg 100 g care aparţin icircndeosebi
la categoria flavonoide şi acizifenolici
3 Pentru analiza spectrometrică UV-VIS s-au folosit 3 solvenţi diferiţi ( apă
acidulată cu acid ascorbic - a apă distilată ndash b şi metanol acidulat ndash c ) şi s-a calculat
factorul de extracţie specific fiecărui tip de solvent
Solventul de tip a conţinacircnd apă acidulată cu vitamina C nu a extras eficient
produşii fenolici
Cel mai eficient solvent a fost metanolul acidulat ( conform II23) urmat de
apa distilată (b)
4 Datele obţinute prin analiza HPLC-UV indică o compoziţie a extractelor ( de
tip ab sau c) dependent de solventul utilizat Astfel
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
40
Solventul de tip a (apă acidulată cu acid ascorbic) extrage preferenţial compuşii
fenolici polari icircn principal acidul galic protocatecuic şi clorogenic la ambele
biopreparate A1 şi A2
Solventul apă distilată (b) extrage acelaşi tip de compuşi la biopreparatul A1
dar mai mulţi compuşi fenolici icircn cazul biopreparatului A2 şi anume mai extrage
acidul vanilic para-benzoic para-cumaric şi siringic
Solventul metanol acidulat ( c ) extrage calitativ şi cantitativ cea mai mare
varietate şi cantitate de compuşi fenolici majori 6 compuşi fiind identificaţi din
biopreparatul A1 ( la care se adaugă 3 compuşi neidentificaţi posibil a fi silibina
silibinina taxifolina ( nu au fost disponibile standard pure) şi 11 compuşi identificaţi
icircn biopreparatul A2 alături de 2 compuşi majori neidentificaţi (posibil hipericina şi
pseudohipericina)
5 Rezultatele cantitative din analiza HPLC-UV pentru compuşii identificaţi icircn
cele două biopreparate arată următoarele
bull Biopreparatul A1 este mai bogat icircn acizi fenolici icircndeosebi acidul galic
protocatecuic şi clorogenic
bull Acidul clorogenic are valori de 952-1124 mg 100 g produs A1 icircn timp ce
valorile sale sunt mai reduse de la 377 la 499 mg 100 g produs A2 Icircn general
extractul icircn apă cu acid ascorbic e mai bogat icircn aceşti acizi valorile mai scăzute fiind
icircn varianta de extract apos (b)
bull Biopreparatul A1 are ca şi compus major acidul elagic icircn concentraţie de
33095 mg 100 g produs şi acesta numai icircn extract metanolic (c) Icircl putem considera
marker de recunoaştere pentru acest biopreparat alături de acidul transcinamic De
asemenea prezenţa silimarinei şi a silibinei ( din Armurariu- ingredient icircn
biopreparatul A1) este un marker de recunoaştere Acidul cafeic şi para-cumaric sunt
de asemenea markeri de recunoaştere
bull Biopreparatul A2 are alături de acizii galic si protocatecuic icircn cantitaţi
echivalente icircn extractele apoase ( 2a şi 2b) quercetina ca şi compus major icircn extractul
metanolic ( 7485 mg 100 g produs) alături de kempherol De remarcat că şi icircn acest
preparat la timpul de retenţie specific acidului elagic apare un semnal ( evaluat ca
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
41
avacircnd o concentraţie de 3155 mg 100 g) care a fost marcat NI icircnsoţit de un alt
semnal care ar putea fi atribuit componentelor din Sunătoare hipericina şi
pseudohipericina) De remarcat că extractul metanolic al biopreparatului A2 (2c) este
mai bogat icircn flavonoide ( quercetină şi kaemferol) chiar dacă per total este mai sărac
icircn compuşi polifenolici
6 Au fost caracterizate prin amprenta spectrometrică FTIR (ATR) cele două
biopreparate A1 şi A2 prin extractele lor de tip a b şi c S-a constatat că amprentele
acestora sunt dependente de tipul şi aciditatea solventului Astfel
bull Biopreparatul A1 are ca zonă specifică de recunoaştere zona (6) a cărei
frecvenţă este icircntre 1600 ndash 1700 cm-1
bull Biopreparatul A2 are ca zonă specifică zona (2) cu frecvenţe icircntre 1000 ndash 1100
cm-1
bull Zona 6 specifică dominanţei esterilor şi a compuşilor peptidici icircn timp ce zona
(2) indică preponderenţa glucidelor şi a glicozidelor
Icircn concluzie se poate constata că biopreparatul A1 poate fi autentificat printr-o
concentraţie mai mare de compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai
acizilor fenolici (esteri de acizi fenolici si fitosteroli) care explică efectul coleretic-
colagog icircn timp ce biopreparatul A2 este preponderent bogat icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată Aceste forme sunt mai polare mai biodisponibile şi
explică efectul de protecţie antioxidantă a celulei hepatice şi de stimulare metabolică
CONCLUZII GENERALE
Conform scopului lucrării activitatea experimentală inclusă prezentei teze a
fost studiul componentelor bioactive a unor plante autohtone cunoscute ca avacircnd
potenţial hepatoprotector caracterizarea compoziţiei acestora icircn vederea obţinerii
unor biopreparate cu efect hepatoprotector
Plantele investigate au fost Păpădia Anghinarea Rostopasca Armurariul
Sunătoarea Pedicuţa şi Cătina (frunze şi fructe) icircn total 8 tipuri din care au fost
investigate diferite probe recoltate din locaţii diferite
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
42
Icircn raport cu obiectivele punctuale ale cercetărilor proprii putem menţiona următoarele
concluzii
1 Au fost caracterizate comparativ extracte de tip hidroalcoolic hidrogliceric şi
metanolic din cele 8 tipuri de probe din cele 7 plante investigate (Păpădia
Anghinarea Rostopasca Sunătoarea Armurariul Pedicuţa Cătina-frunze şi
Cătina-fructe) Eficienţa extracţiei a fost maximă icircn metanol recomandat
pentru studiul compozitiei chimice dar nu pentru terapie datorită efectului său
toxic Pentru terapie este de preferat extractul apos proaspăt sau utilizarea de
acsule cu produs solid micronizat
2 A fost stabilit profilul specific fiecărui extract utilizănd metode de analiză
complementare şi anume metode spectrometrice de tip UV-Vis spectrometrie
icircn Infraroşu Mediu (FT-MIR) şi metode cromatogrtafice HPLC cu detecţie icircn
UV (HPLC-UV) Ele au fost interpretate statistic prin testul ANOVA şi prin
analiză chemometrică de tip PCA şi CA
5 A fost efectuată analiza variabilităţii de compoziţie a diferitelor variante din
fiecare tip de plantă şi a fost identificată reproductibilitatea compoziţiei prin
cromatografie HPLC-UV şi spectrometrie FT-MIR cuplată cu chemometrie
porin analiza PCA si CA Analiza chemometrică confirmă o reproductibilitate
semnificativă a prtobelor investigate cu oscilaticirci minime ale compoziţiei
6 S-au obţinut şi caracterizat două tipuri de biopreparate cu potenţial
hepatoprotector care au ca ingrediente plantele studiate anterior (1-8)
Biopreparatul A1 a inclus ca şi ingrediente Anghinare Armurariu şi Păpădie
amestecate icircn raport de masa 111 Biopreparatul A2 conţine Cătină-frunze
Pedicuţă Rostopască şi Sunătoare amestecate icircn raport de masa 1111
Biopreparatul A1 are un efect coleretic-colagog datorat concentraţiei mari de
compuşi peptidici lipide polare şi derivaţi esterici ai acizilor fenolici (esteri de acizi
fenolici icircndeosebi acidul galic protocatecuic şi clorogenic)
Biopreparatul A2 prin compoziţia sa crescută icircn compuşi fenolici
(flavonoide) icircn formă glicozilată are efect de stimulare a funcţiei celulei hepatice
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
43
Atacirct Biopreparatul A1 cacirct şi Biopreparatul A2 prin compozioţia lor
complementară conferă protecţie antioxidantă celulei hepatice şi aru acţiune de
stimulare a proceselor metabolice icircn segmental hepato-biliar
Cercetările efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sau in vivo a acţiunii acestor biopreparate
Originalitatea studiilor este conferită de
Analiza detaliată prin metode analitice performante a compoziţiei acestor plante icircn trei tipuri de solvenţi
Studiul variabilităţii compoziţiei la probe prelevate din locaţii diferite
Realizarea unor biopreparate originale cu funcţionalitate dirijată şi acţiune sinergică
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1 Bender DA 2005 The promise of metabolomics J Sci Food Agric 85 7ndash9
2 Fan XH YY Cheng ZL Ye RC Lin ZZ Qian 2006 Multiple chromatographic
fingerprinting and its application to the quality control of herbal medicine Analytica Chim Acta 555
217-224
3 Giri L HC Andola VK Purohit MSM Rawat RS Rawal ID Bhatt2010
Chromatographic and spectral fingerprinting standardization of traditional medicines an overview as
modern tools Res J Phytochem 4 234-241
4 Gong F Q Zhang J Zhang 2009 Quality Assessment of Herbal Medicine with
Chromatographic Fingerprint Journal of Drug Addition Education and Eradication 4 257-302
5 Gong F BT Wang FT Chau and YZ Liang 2005 Data preprocessing for
chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches Anal Lett 38 2475-
2492
6 Harbone JB CA Williams2000 Advances in flavonoid research since 1992
Phytochemistry 55 481-504
7 Hashimoto A amp T Kameoka 2008 Applications of Infrared Spectroscopy to Biochemical
Food and Agricultural Processes App Spectrosc Rev 43 416-451
8 Hussain K MT Majeed Z Ismail A Sadikun P Ibrahim 2009 Complementary and
alternative medicine quality assessment strategies and safe usage Southern Med Rev 1(2) 19-23
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203
44
9 Li S Q Han C Qiao J Song CL Cheng H Xu 2008 Chemical markers for the
quality control of herbal medicines an overview Chinese Med 3(7) 18
10 Li Y S Sun Q Zhou Z Qin J Tao J Wang X Fang 2004 b Identification of
American ginseng from different region using FT-IR and two-dimensional correlation IR
spectroscopy Vibrational Spectroscopy 36 227-232
11 Liang YZ P Xie and K Chan 2004 Review Quality control of herbal medicines J
Chromatography B 812 53-70
12 Liu H S Sun G Lv KKC Chan 2006 Study on Angelica and its different extracts by
Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy
Spectrochim Acta part A 64 321-326
13 Maloney V 2004 Plant metabolomics BioTeach J 4 92-99
14 Mattoli L F Cangi A Maidecchi C Ghiara E Ragazzi M Tubaro L Stella F
Tisato P Traldi 2006 Metabolomic fingerprinting of plant extracts J Mass Spectrometry 41(12)
1534-1545
15 McGuffin M C Hobbs R Upton A Goldberg 1997 American Herbal Products
Associationrsquos Botanical Safety Handbook CRC Press Boca Raton FL
16 Negi AS JK Kumar S Luqman K Shanker MM Gupta SP Khanuja
2008 Recent advances in plant hepatoprotectives a chemical and biological profile of some
important leads Med Res Rev 28(5) 746-72
17 Schultz H amp M Baranska 2007 Identification and quantification of valuable substances
by IR and Raman spectroscopy Vibrational Spectroscopy 43 13-25
18 Socaciu C 2008a Agrifood metabolomics - a link between analytical biochemistry and
green biotechnologies Bul USAMV-CN 65(1-2) 410-415
19 Socaciu C A Pintea A Varga F Ranga H Diehl 2002 Sea Buckthorn new ways to
use its bioactive components in food and pharmaceutical industry Buletinul USAMV-A 57 271-
278
20 Tămaş M 1999 Botanică farmaceutică vol III ndash Sistematica-Cormobionta EdMedicală
Universitară rdquo Iuliu Haţieganu rdquo Cluj Napoca 21 Tămaş M I Oniga 2000 Produse fitoterapeutice romacircneşti Litografia UMF rdquo Iuliu
Haţieganu rdquo Cluj Napoca 22 Utrilla MP 1996 Natural products with hepatoprotective action Methods Find Exp Clin
Pharmacol 18 (B) 11-2
23 WHO 2003 WHO guidelines on Good Agriculture and Collection Practices (GACP) for
medicinal plants Geneva
24 Yadav NP amp VK Dixit 2008 Recent approaches in herbal drug standardization Int J
Integr Biol 2 195ndash203