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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
VIVIANE COPPI BUDAL ARINS
OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE CHALCONAS E DERIVADOS
PIRIMIDÍNICOS SOBRE A ATIVIDADE INIBIDORA NA COX-1 E
COX-2 IN VITRO E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA IN VIVO
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
VIVIANE COPPI BUDAL ARINS
OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE CHALCONAS E DERIVADOS
PIRIMIDÍNICOS SOBRE A ATIVIDADE INIBIDORA NA COX-1 E
COX-2 IN VITRO E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA IN VIVO
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof
a. Dr
a. Fátima de Campos Buzzi
Co-orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa
Itajaí, Novembro de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
A43
Arins, Viviane Coppi Budal, 1975- Obtenção e avaliação de chalconas e derivados pirimidínicos sobre a atividade inibidora na cox-1 e cox2 in vitro e atividade antinociceptiva in vivo / Viviane Coppi Budal Arins. 2015. 185f. ; il., tab. ; fig. Anexos Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Profª. Drª. Fátima de Campos Buzzi” “Co-orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa” Bibliografia : p. 137-146 1. Chalconas. 2. Inibidores de Ciclo-Oxigenase. 3. Pirimidinas. 4. Atividade Antinociceptiva. I. Título. CDU: 615.32
CDU: 612.78
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE CHALCONAS E DERIVADOS
PIRIMIDÍNICOS SOBRE A ATIVIDADE INIBIDORA NA COX-1 E
COX-2 IN VITRO E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA IN VIVO
Viviane Coppi Budal Arins „Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. ‟
____________________________________ Fátima de Campos Buzzi, Doutora
Orientadora
__________________________________________________________ Clóvis Antônio Rodrigues, Doutor
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Doutora Fátima de Campos Buzzi (UNIVALI)
Presidente
_______________________________________
Doutor Rogério Corrêa (UNIVALI) Co-orientador
______________________________________ Doutor José Roberto Santin (UNIVALI)
Membro Banca Interna
______________________________________ Doutor Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI)
Membro Banca Interna
____________________________________ Doutora Patrícia de Aguiar Amaral (UNESC)
Membro Banca Externa
Itajaí (SC), 27, Novembro de 2015
Ao meu esposo Luciano, aos meus filhos Gustavo,
Benícia e José.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser a fonte de tudo que é bom... Por me amar tanto apesar de mim... Obrigada Senhor! Ao meu esposo Luciano, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos... Só nós sabemos quão alto foi o preço... Te amo! Aos meus filhos Gustavo, Benícia e José, por me mostrarem o que é o amor incondicional... Os abraços que recarregam as baterias... Aos meus pais José e Vilma e minha irmã Vanessa, por todo o incentivo e apoio desde sempre... Pai... Acho que agora acabou... As minhas fiéis escudeiras Locenir e Laíde... Sem o compromisso e a dedicação de vocês eu não teria chego até aqui. Muito Obrigada! A minha orientadora Fátima de Campos Buzzi... Tenho muito que te agradecer Fá... Não só por todo o conhecimento adquirido... Mas principalmente pelo privilégio de conviver com alguém que busca a excêlencia em tudo que faz, sem esquecer os valores... É uma honra fazer parte deste grupo... Ao querido Rogério Corrêa, meu co-orientador... Obrigada por todo incentivo, carinho e atenção... Te admiro muito! A Karina Elisa Machado, por “colocar a mão na massa” e realizar os experimentos da COX... Por ter sempre uma palavra de apoio nos momentos de desespero... Muito Obrigada! Ao professor Niero por estar sempre disponível para ajudar... Ao professor José Roberto Santin pela realização dos ensaios in vitro e pelas valiosas sugestões. Ao professor Sérgio Faloni de Andrade por contribuir com a correção e avaliação deste trabalho. Ao professor Clóvis por todo apoio e compreensão... Ao aluno Cassiano por ser imprescindível na primeira etapa deste trabalho. Muito Obrigada! A Karen, técnica do laboratório de síntese, por toda ajuda... A Juliana Nunes pelo carinho e amizade... sentirei saudades das nossas conversas... As alunas Ivana, Aline, Bianca e Anie, por tornar minhas tardes mais animadas... Obrigada meninas! A todos os irmãos em Cristo que lembraram de mim em suas orações... Muito pode a oração do justo em seus efeitos... Agradeço a todos que participaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho... Deus abençoe!!
“Ele verá o fruto do penoso trabalho de sua alma e ficará satisfeito, o meu Servo, o Justo, com o seu
conhecimento, justificará a muitos, porque as iniquidades deles levará
sobre si.” (Isaías, 53:11)
OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE CHALCONAS E DERIVADOS
PIRIMIDÍNICOS SOBRE A ATIVIDADE INIBIDORA NA COX-1 E
COX-2 IN VITRO E ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA IN VIVO
Viviane Coppi Budal Arins
Novembro/2015 Orientadora: Fátima de Campos Buzzi, Doutora. Co-Orientador: Rogério Corrêa, Doutor Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 183
Uma série de chalconas foi obtida por meio de uma derivação do método de condensação aldólica de Claisen-Schmit e utilizada como precursora para a obtenção de derivados pirimidínicos. Estas moléculas foram obtidas por meio da reação das chalconas com cloridrato de guanidina em meio básico por três diferentes condições reacionais: temperatura ambiente, refluxo convencional e refluxo por microondas. Foram obtidas 7 chalconas e 7 derivados pirimidínicos. Os rendimentos variaram entre 60,80% a 97,06% para as chalconas e para as aminopirimidinas de 12,69% a 37,12%; 18,41% a 43,94% e 36,70% a 64,38% nas condições em temperatura ambiente, refluxo convencional e refluxo por microondas, respectivamente. As séries foram avaliadas quanto aos efeitos sobre a inibição das ciclooxigenases COX-1 e COX-2 por meio de ensaio imunoenzimático in vitro. Obteve-se bons resultados de inibição, sendo o melhor resultado para as chalconas a CHX (66,79%), para COX-1 e CHDCl (86,43%) para COX-2. Para as aminopirimidinas os melhores resultados foram AMNM (84,25%) e AMH (46,73%) para COX-1 e AMH (57,27%) para COX-2. Em relação ao CI50, a chalcona mais
efetiva para COX-1 foi a CHNM (0,08101 µM/ml) e para COX-2 a CHH (0,02915 µM/ml) entre as aminopirimidinas a mais efetiva foi a AMH (0,02511 µM/ml). Com os
resultados de CI50 obteve-se o índice de seletividade COX-2. Dentre as chalconas mais seletivas está a chalcona CHH (5,0785591). As aminopirimidinas apresentaram índice de seletividade superior ao controle e às chalconas correspondentes, com exceção da AMNM que apresentou valores inferiores. As aminopirimidinas foram avaliadas quanto à atividade antinociceptiva in vivo utilizando o modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Todas as moléculas apresentaram-se mais efetivas que o controle AAS, com resultados de DI50 de 15 a
29 µM/kg. Os ensaios de citotoxicidade e atividade sobre a produção de NO não
apresentaram alterações. As análises in silico para verificar a biodisponibilidade por via oral, permeabilidade e absorção apresentaram-se dentro dos valores aceitáveis para candidatos a fármacos. Ao analisarmos a ordem de potência da série pirimidínica em relação às atividades anti-inflamatória e antinociceptiva podemos observar que não segue os parâmetros hidrofóbicos ou eletrônicos propostos por Topliss, porém os parâmetros estéreos estão envolvidos na atividade biológica. Obtiveram-se moléculas promissoras para futuros fármacos, em relação à atividade antinociceptiva e anti-inflamatória com seletividade COX-2, com perspectivas de aperfeiçoamento das rotas sintéticas, continuidade dos estudos no intuito de avaliar os mecanismos de ação farmacológica e modelagem molecular.
Palavras-chave: Inibidores da ciclooxigenase. aminopirimidinas. chalconas
OBTAINING AND EVALUATING CHALCONES AND PYRIMIDINE
DERIVATES FOR THEIR INHIBITORY ACTIVITY IN COX-1 AND
COX-2 ACTIVITY IN VITRO, AND ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY IN
VIVO
Viviane Coppi Budal Arins November/2015
Supervisor: Fátima de Campos Buzzi, Doctor Co-Supervisor: Rogério Corrêa, Doctor Area of Concentration: Natural Bioactive Substances and Products Number of Pages: 183 A series of chalcones was obtained through the Claisen-Schmit aldol condensation derivation method, and used as a precursor for obtaining pyrimidine derivatives. These molecules were obtained by reaction of chalcones with guanidine hydrochloride in basic medium for three different reaction conditions: room temperature, conventional reflux, and microwave reflux. Seven chalcones and seven pyrimidine derivatives were obtained. The yields ranged from 60.80% to 97.06% for the chalcones, and 12.69% to 37.12%; 18.41% to 43.94% and 36.70% to 64.38% for the aminopyrimidines, under the conditions of room temperature, conventional reflux and microwave reflux respectively. The series were evaluated for effects on the inhibition of COX-1 and COX-2 cyclooxygenase by the enzyme-linked immunosorbent assay in vitro. Good results were obtained for inhibition; the best resultsfor thechalcones wereCHX (66.79%), for COX-1, and CHDCl (86.43%) for COX-2. For the aminopyrimidines, the best results were AMNM (84.25%) and AMH (46.73%) for COX-1, and AMH (57.27%) for COX-2. In relation to IC50, the most effective chalcone for COX-1 was CHNM (0.08101 µM/ml) and for COX-2, CHH (0.02915 µM/ml). For the aminopyrimidines, the most effective was AMH (0,02511 µM/ml). From the results of COX-2, the gave IC50 selectivity index was obtained. Among the most selective chalcones was chalcone CHH (5.0785591). The aminopyrimidines showed a selectivity index greater than the control and the corresponding chalcones, except for AMNM, which showed lower values. The aminopyrimidines were evaluated for antinociceptive activity in vivo through the acetic acid-induced writhing model.All the molecules were more effective that the Control AAS, with ID50 results of between 15 and 29 µM/kg. Cytotoxicity assays and activity on the production of NO showed no changes. The in silico analysis to determine the oral bioavailability, permeability and absorption were within the acceptable limits for drug candidates.Analyzing the order of potency of the pyrimidine series in relation to anti-inflammatory and antinociceptive activities, we found that it does not follow the hydrophobic or electronic parameters proposed by Topliss, but the stereo parameters are involved in biological activity.Promising molecules were obtained for future drugs, in terms of the antinociceptive and anti-inflammatory activity with COX-2 selectivity, with prospects for improvement of the synthetic routes and furthering studies to assess the mechanisms of pharmacological action and molecular modeling. Keywords: Cyclooxygenase inhibitors. aminopyrimidines. chalcones
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ilustração da síntese de eicosanóides via COX................................. 35
Figura 2 Ilustração dos sítios de reconhecimento molecular da COX-1 e COX-2.............................................................................................
37
Figura 3 Estruturas dos fármacos: AAS (1); antipirina (2); fenacetina (3);
acetaminofeno (4); fenilbutazona (5), ibuprofeno (6) e naproxeno (7)........................................................................................................
39
Figura 4 Estrutura dos fármacos: etoricoxib (1); valdecoxibe (2) e celecoxibe (3).........................................................................................................
40
Figura 5 Núcleo fundamental das chalconas..................................................... 48
Figura 6 Estrutura do núcleo pirimidínico........................................................... 50
Figura 7 Estrutura do Aloxana (1) e Ácido barbitúrico (2).................................. 51
Figura 8 Imagem Ilustrativa da composição da placa utilizada no ensaio......... 73
Figura 9 Imagem Ilustrativa da reação de EIA................................................... 74
Figura 10 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da
aminopirimidina AMH para comparação visual entre as técnicas de obtenção...............................................................................................
92
Figura 11 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMM para comparação visual entre as técnicas de obtenção...............................................................................................
93
Figura 12 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMX para comparação visual entre as técnicas de obtenção ..............................................................................................
94
Figura 13 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMCl para comparação visual entre as técnicas de obtenção.........................................................................................
95
Figura 14 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMDCl para comparação visual entre as técnicas de obtenção.........................................................................................
96
Figura 15 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMNM para comparação visual entre as técnicas de obtenção.............................................................................................
97
Figura 16 Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMOH para comparação visual entre as técnicas de obtenção..............................................................................................
98
Figura 17 Espectro de IV da 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM), (DRS/ KBr, cm-1).............................................................................
99
Figura 18 Espectro de RMN1H da 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina
(AMM), (300 MHz, CDCl3)....................................................................
100
Figura 19 Espectros de RMN13C da 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM), (300 MHz, CDCl3)....................................................................
101
Figura 20 Fragmento mutagênico presente na estrutura da chalcona CHH...... 114
Figura 21 Fragmentos irritante e efeitos sobre o sistema reprodutor presente
na estrutura da chalcona CHX.............................................................
115
Figura 22 Fragmentos mutagênico e tumorigênico presentes na estrutura da chalcona CHNM...................................................................................
116
Figura 23 Fragmento tumorigênico referente ao substituinte presente na
estrutura da aminopirimidina AMNM...................................................
117
Figura 24 Percentual de inibição das enzimas COX-1 e COX-2, frente às moléculas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl, CHNM, CHOH, AMH, AMM, AMX, AMCl, AMDCl, AMNM, AMOH) e controles (Indometacina e Celecoxibe) na concentração de 100 µM..................
118
Figura 25 Derivados Pirimidínicos utilizados nos estudos de Armelin (2010)...... 123 Figura 26 Efeito das aminopirimidinas AMM, AMX, AMOH e AMNM, na
viabilidade celular de neutrófilos peritoneais através do Azul de Trypan..................................................................................................
124
Figura 27 Efeito das aminopirimidinas AMM, AMX, AMOH e AMNM, na secreção de Óxido Nítrico (NO) por neutrófilos de peritônio estimulados ou não por LPS................................................................
125
Figura 28 Efeito da aminopirimidina AMM administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético............................................................................
127
Figura 29 Efeito da aminopirimidina AMCl administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético.................................................................................
128
Figura 30 Efeito da aminopirimidina AMH administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético.................................................................................
128
Figura 31 Efeito da aminopirimidina AMX administrada em 3 concentrações
3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético.................................................................................
129
Figura 32 Efeito da aminopirimidina AMDCl administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético.................................................................................
129
Figura 33 Efeito da aminopirimidina AMNM administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético.................................................................................
130
Figura 34 Efeito da aminopirimidina AMOH administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético.................................................................................
131
Figura 35 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMX.....................................................................................................
148
Figura 36 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMX.................. 149
Figura 37 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina
AMCl....................................................................................................
150
Figura 38 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMCl................ 151
Figura 39 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMM....................................................................................................
152
Figura 40 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMM................ 153
Figura 41 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina
AMDCl..................................................................................................
154
Figura 42 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMDCl.............. 155
Figura 43 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMH.....................................................................................................
156
Figura 44 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMH................ 157
Figura 45 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina
AMNM..................................................................................................
158
Figura 46 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMNM.............. 159
Figura 47 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CD3CO) da aminopirimidina AMOH..................................................................................................
160
Figura 48 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMOH.............. 161
Figura 49 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da chalcona CHNM..................................................................................................
164
Figura 50 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHNM......................... 165
Figura 51 Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CD3CO) da chalcona
CHOH...................................................................................................
166
Figura 52 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHOH.......................... 167
Figura 53 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHH............................. 171
Figura 54 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHM............................ 173
Figura 55 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHX............................. 175
Figura 56 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHCl............................ 177
Figura 57 Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHDCl......................... 179
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Ordem de potência para parâmetros físico-químicos proposta por Topliss...................................................................................................
70
Tabela 2 Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos......................................
70
Tabela 3 Reagentes utilizados para a reação de EIA.......................................... 73
Tabela 4 Dados de obtenção da série de chalconas........................................... 81
Tabela 5 Dados de obtenção da série de aminopirimidinas................................ 89
Tabela 6 Dados de rendimento e tempo reacional das aminopirimidinas obtidas por temperatura ambiente, refluxo convencional e refluxo por reator de microondas............................................................................
91
Tabela 7 Propriedades "in silico" de solubilidade e permeabilidade das aminopirimidinas...................................................................................
111
Tabela 8 Propriedades "in silico" de solubilidade e permeabilidade das
chalconas .............................................................................................
112
Tabela 9 Resultados do estudo "in silico" para a presença de fragmentos tóxicos da série de chalconas e aminopirimidinas................................
113
Tabela 10 Valores das CI50 e SI para as moléculas (CHH; CHM; CHX; CHCl; CHDCl; CHNM, CHOH, AMH; AMM; AMX; AMCl; AMDCl, AMNM e AMOH)..................................................................................................
121
Tabela 11 Dados comparativos do efeito antinociceptivo da série de aminopirimidinas administradas em 3 concentrações 3, 6 e 10 mg/kg pela via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo ácido acético..
131
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1 Esquema geral de reação de síntese para obtenção de chalconas......................................................................................
56
Esquema 2 Esquema geral de obtenção de aminopirimidinas derivadas de
chalconas..........................................................................................
60
Esquema 3 Mecanismo de Reação de Condensação Aldólica............................. 79
Esquema 4 Proposta para o mecanismo de reação de formação do núcleo pirimidínico através da reação de Michael.........................................
87
Esquema 5 Proposta para a formação do núcleo pirimidínico através do ataque
a carbonila acílica..............................................................................
88
LISTA DE ABREVIATURAS
A – Acidez para ligações de Hidrogênio
AA – Ácido Araquidônico
AAS – Ácido Acetil Salicílico
AChE – Enzima Acetilcolinesterase
ADMET – Absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade
AINEs – Anti-inflamatórios Não-Esteroides
B – Basicidade
BC1 – Branco COX-1
BC2 – Branco COX-2
Blk – Branco
B0 – Ligação Máxima
CC – Cromatografia de Coluna
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CDCl3 – Clorofórmio deuterado
CD3CO – Cetona deuterada
CO2 – Gás Carbônico
COX – Ciclooxigenase
COX -1 – Enzima Ciclooxigenase isoforma 1
COX -2 – Enzima Ciclooxigenase isoforma 2
COX -3 – Enzima Ciclooxigenase isoforma 3
DMEM – Meio de Cultura Eagle, modificado por Dubelco
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido Desoxiribonucléico
DRIFTS – Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy
DRS – Diffuse Reflectance Spectroscopy
E – Refração Molar
EDTA – Ácido Etileno Diamino Tetracético
EIA – Enzimaimunoensaio
Es – Efeitos estéreos
HCl – Ácido Clorídrico
IA1 - Atividade Inicial 1
IA2 - Atividade Inicial 2
IA2 – Atividade Inicial 3
IL-1β – Interleucina 1-β
IL-6 – Interleucina 6
i.p - Intraperitoneal
IV – Infravermelho
KBr – Brometo de Potássio
Log P – Lipofilicidade
Log S – Solubilidade
LOX – Lipoxigenase
LPS – lipopolissacarídeo
mRNA – RNA mensageiro
MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetil-2,5-difenil-2H-tetrazólio)
NaCl – Cloreto de Sódio
NaOH – Hidróxido de Sódio
NH+OH – Grupos doadores de ligação Hidrogênio
N + O – Grupos aceptores de ligação Hidrogênio
NO – Óxido Nítrico
NO2- - Nitrito
NO3- - Nitrato
NOS – Enzima Óxido Nítrico Sintase
NOS II / iNOS – Enzima Óxido Nítrico Sintase Induzível
NOS III / eNOS – Enzima Óxido Nítrico Sintase Endotelial
NSB – Ligações Não-Específicas
PBS – Solução Tampão Fosfato-Salina
PF – Ponto de Fusão
PG - Prostaglandina
PGD2 – Prostaglandina D2
PGE2 – Prostaglandina E2
PGF2α – Prostaglandina F2α
PGG2 – Prostaglandina G2
PGH2 - Prostaglandina H2
PGI2 – Prostaciclina
PLA2 – Fosfolipase A2
QSAR – Quantitative Structure-Activity Relationship (Relação Quantitativa entre
Estrutura Química e Atividade Biológica)
RAW 264-7 – Linhagem celular de macrófagos murinos
REA – Relação Estrutura Atividade
Rf - Ratio of front
RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RNA – Ácido Ribonucleico
S – Polarizabilidade
TA – Atividade Total
TPSA –Total Polar Surface Area (Área de Superfície Polar Total)
TMS – Tetrametilsilano
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
TXA2 – Tromboxano A2
V- Volume de McGowan
σ – Parâmetros eletrônicos
π – Parâmetros hidrofóbicos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 29
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 31
2.1 Objetivo Geral: ................................................................................................... 31
2.2 Objetivos Específicos: ...................................................................................... 31
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 33
3.1 O Processo Inflamatório ................................................................................... 33
3.2 Anti-inflamatórios Não-esteroidais (AINEs) .................................................... 38
3.3 Química Medicinal ............................................................................................. 41
3.4 Chalconas .......................................................................................................... 48
3.5 Pirimidinas ......................................................................................................... 50
3.6 Atividades biológicas, relacionadas à chalconas e derivados ..................... 53
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 57
4.1 Purificação e Caracterização estrutural dos derivados ................................. 57
4.2 Síntese de chalconas ........................................................................................ 58
4.3 Síntese dos derivados pirimidínicos ............................................................... 61
4.3.1 Síntese dos derivados pirimidínicos em temperatura ambiente ................ 62
4.3.2 Síntese dos derivados pirimidínicos em refluxo convencional ................. 64
4.3.3 Síntese dos derivados pirimidínicos em refluxo por reator de microondas
.................................................................................................................................. 67
4.4 Relação Estrutura -Atividade - Método de Topliss ......................................... 69
4.5 Análise "In silico": Cálculos teóricos computacionais .................................. 71
4.6 Porcentagem de absorção ................................................................................ 71
4.7 Avaliação da atividade inibitória para COX-1 e COX-2 ................................... 71
4.7.1 Preparo das amostras (inibidores e controles) ........................................... 71
4.7.2 Avaliação da atividade inibitória "in vitro" da COX-1 e COX-2 ................... 72
4.8.1 Obtenção de Neutrófilos Migrados para o Peritônio ................................... 75
4.8.2 Viabilidade Celular ......................................................................................... 75
4.8.3 Determinação do Óxido Nítrico (NO) ............................................................ 76
4.9. Avaliação da Atividade Antinociceptiva ......................................................... 76
4.9.1 Animais ........................................................................................................... 76
4.9.2 Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético ............. 77
4.10. Análise estatística .......................................................................................... 77
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 79
5.1 Síntese das chalconas ...................................................................................... 79
5.2 Síntese das pirimidinas .................................................................................... 85
5.3 Análise computacional ................................................................................... 106
5.4. Ensaio de Inibição da ciclooxigenase (COX) in vitro .................................. 117
5.5 Avaliação in vitro da citotoxicidade e dos efeitos das aminopirimidinas
AMM, AMX, AMOH e AMNM na produção de óxido nítrico em neutrófilos
estimulados com LPS in vitro. ............................................................................. 123
5.6 Avaliação da atividade antinociceptiva ......................................................... 126
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ................................................. 133
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 137
ANEXO A ................................................................................................................ 147
ANEXO B ................................................................................................................ 163
ANEXO C ................................................................................................................ 169
ANEXO D ................................................................................................................ 181
29
1 INTRODUÇÃO
Inflamação é uma resposta biológica complexa de tecidos circunjacentes ao
dano celular, induzido por agentes biológicos, químicos ou mecânicos irritantes. Esta
lesão desencadeia a ativação de fatores de transcrição que controlam a expressão
de diversos mediadores inflamatórios (GLAROS; LARSEN; LI, 2009; RICCIOTTI;
FITZGERALD, 2011).
Entre os mediadores da inflamação de maior importância destacam-se os
eicosanóides, os oxidantes biológicos e as citocinas, que constituem alvos
terapêuticos para agentes anti-inflamatórios (RICCIOTTI; FITZGERALD, 2011).
Fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) exercem os seus efeitos
a partir da inibição da produção de prostaglandinas. O alvo farmacológico dos AINEs
é a ciclooxigenase (COX), que cataliza o primeiro passo no metabolismo do ácido
araquidônico (AA). Duas isoformas de COXs são conhecidas: COX-1, expressa
constitutivamente na maioria dos tecidos, e responsável pela produção fisiológica de
prostaglandinas e COX-2, induzida por citocinas, mitógenos e endotoxinas em
células inflamatórias, é responsável por elevar a produção de prostaglandinas
durante a inflamação (CAPONE et al, 2007).
Em virtude da não seletividade da maioria dos AINEs, ou seja, por atuarem
inibindo tanto COX-1 quanto COX-2, estes medicamentos apresentam efeitos
indesejáveis, principalmente relacionados ao trato gastrointestinal. Estes efeitos
estão relacionados diretamente com a inibição da isoforma COX-1, que
fisiologicamente é responsável pela produção de prostaglandinas citoprotetoras
(ZARGUI et al, 2007).
Quando é feita uma comparação estrutural entre os AINEs seletivos para
COX-2 e AINEs não seletivos, pode-se observar que a composição estrutural que
confere a seletividade para COX-2 é caracterizada por moléculas tricíclicas, como é
o caso dos coxibes que apresentam um anel central hetero ou carbocíclico diaril
substituído (ZARGHI; ARFAEI, 2011).
A obtenção de derivados tricíclicos pode ser realizada utilizando-se o núcleo
pirimidínico como ponto de partida, sendo um heterociclo de grande importância
químico medicinal, e estudado extensivamente devido a sua ocorrência nos sistemas
vivos, porém são escassas as pesquisas relacionadas ao estudo quantitativo da
30
relação estrutura química-atividade biológica (CHANDASEKARAN; NAGARAJAN,
2005; EL-SAYED et al, 2012).
A partir das chalconas, derivados pirimidínicos podem ser sintetizados de
forma a obter-se estruturas tricíclicas que possam atuar de forma mais seletiva no
sítio COX-2, buscando menores efeitos adversos, a nível gastrointestinal, renal,
vascular, entre outros, visando principalmente uma melhor ação anti-inflamatória
(ZARGHI; ARFAEI, 2011). Neste sentido, os estudos de relação estrutura atividade
(REA) podem ajudar a sintetizar chalconas farmacologicamente ativas, menos
tóxicas e mais eficazes (DIMMOCK et al, 1999; NOWAKOWSKA, 2007).
Neste aspecto, considerando que as chalconas podem ser derivatizadas em
diferentes grupos, o objetivo do presente trabalho foi sintetizar uma série de
pirimidinas a partir de chalconas, avaliar a atividade analgésica e anti-inflamatória,
bem como o índice de seletividade COX-2 das moléculas.
31
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Obter e avaliar a ação de chalconas e derivados aminopirimidínicos na
inibição da atividade da COX-1 e COX-2 e atividade antinociceptiva utilizando
metodologias in silico, in vitro e in vivo.
2.2 Objetivos Específicos:
Obter derivados pirimidínicos a partir de chalconas que apresentem afinidade
e seletividade com as enzimas ciclooxigenases;
Avaliar "in silico" as propriedades moleculares das moléculas sintetizadas
quanto as suas características de permeabilidade segundo as regras de Lipinski e
quanto as suas características de fármacos e sua toxicidade;
Determinar a atividade inibitória de chalconas e derivados mais promissores
sobre as enzimas COX-1 e COX-2 utilizando ensaio imunoenzimático (EIA);
Constatar a seletividade das chalconas e derivados mais promissores sobre a
atividade da COX-1 e/ou a COX-2, por meio de reações de competição;
Determinar a atividade dos compostos mais seletivos sobre a produção de
óxido nítrico em neutrófilos estimulados com LPS;
Avaliar a atividade antinociceptiva dos derivados pirimidínicos sintetizados
utilizando o modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético in vivo;
Relacionar os dados obtidos para estabelecer indícios de relação estrutura-
atividade biológica dos compostos avaliados.
32
33
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 O Processo Inflamatório
A inflamação é um processo que envolve múltiplos fatores que atuam em uma
rede complexa, quando um estímulo como, por exemplo, uma infecção, estresse
físico ou estresse químico, provoca lesão celular. Esta lesão desencadeia a ativação
de fatores de transcrição que controlam a expressão de diversos mediadores
inflamatórios. A migração de leucócitos para o local da inflamação é crucial para a
patogênese de doenças inflamatórias. O recrutamento de neutrófilos para o foco
inflamatório é um processo complexo, altamente orquestrado por uma enorme
variedade de mediadores inflamatórios. Alguns destes mediadores são responsáveis
pela locomoção orientada de leucócitos para a área inflamada, na qualidade de
agentes quimiotáticos. As interações dos neutrófilos circulantes para as células
endoteliais são a fase inicial do processo e mediada por uma expressão contínua da
molécula de adesão em ambos os tipos de células (HEBEDA et al, 2011).
Neutrófilos e macrófagos têm um papel central na inflamação aguda e
crônica, respectivamente. No sítio inflamado, as células recrutadas são ativadas e
liberam mediadores inflamatórios que induzem a iniciação e manutenção da
resposta inflamatória, causando uma mudança da fase aguda para a fase crônica da
inflamação (GLAROS; LARSEN; LI , 2009; RICCIOTTI; FITZGERALD, 2011; BASILE
et al, 2012).
No foco da inflamação, os neutrófilos desempenham um papel central na
imunidade inata por englobar microrganismos invasores por fagocitose destruindo-
as. Neste contexto, eles produzem espécies reativas de oxigênio, liberam enzimas
proteolíticas, e secretam mediadores químicos, tais como os metabolitos do ácido
araquidônico, citocinas e óxido nítrico (NO). NO é produzido fisiologicamente pela
óxido nítrico sintase constitutiva (NOS), enzimas Ca2+- dependente, chamadas NOS
I ou NOS neuronal (nNOS) e NOS III ou NOS endotelial (eNOS). Uma isoforma
induzível (iNOS/NOSII), cuja atividade é Ca2+-independente, fornece maiores
quantidades de NO do que eNOS em várias circunstâncias patológicas, incluindo a
inflamação. A reação de NO e superóxidos gerados durante a inflamação resulta na
formação de peroxinitrito, que é um dos agentes oxidantes mais poderosos,
34
conduzindo a acontecimentos vasculares e celulares de reações inflamatórias.
Portanto, a inibição de derivados NO-iNOS parece ser uma estratégia promissora
para o tratamento de doenças inflamatórias (STEFANI et al, 2012).
Em consequência da resposta inflamatória, lesões colaterais nos tecidos do
hospedeiro podem ocorrer, visto que muitos mediadores inflamatórios não são
específicos de determinado tecido-alvo. Na maioria dos casos, a resposta
inflamatória acaba regredindo; todavia, se essa regulação não ocorrer, a resposta
inflamatória irá exigir uma intervenção farmacológica. Entre os mediadores da
inflamação de maior importância destacam-se os eicosanóides, oxidantes biológicos,
citocinas, fatores de adesão e enzimas digestivas (proteases, hialuronidase,
colagenase e elastase). Apenas os três primeiros constituem alvos terapêuticos para
agentes anti-inflamatórios (DINARELLO, 2010; BUKHARI et al, 2014).
Desde a década de 1930 iniciou-se o interesse pelos eicosanóides,
principalmente devido aos relatos de que o sêmen continha uma substância que
causava a contração do músculo liso uterino. Acreditou-se que a substância fosse
originária da próstata e, por isso recebeu a designação incorreta de prostaglandina.
Com a evolução dos estudos, constatou-se que a prostaglandina não era apenas
uma substância, mas toda uma família de compostos, que eram produzidos em
muitos tecidos, sendo a maioria derivada do AA (ZARGHI; ARFAEI, 2011).
Os eicosanóides estão implicados no controle de muitos processos
fisiológicos, incluindo-se entre os mediadores moduladores mais importantes da
reação inflamatória. Em razão da potência biológica desses compostos, o ácido
araquidônico é mantido em níveis muito baixos na célula através da sua forma
esterificada. Desta forma, a disponibilidade de ácido araquidônico livre é descrita
como etapa limitante na produção de eicosanóides (ZARGHI ARFAEI, 2011).
A síntese de eicosanóides pode ser desencadeada por diversos estímulos
que ativam receptores de membrana, acoplados a uma proteína regulatória ligada a
um nucleotídio guanínico (proteína G), resultando na ativação da fosfolipase A2 ou
elevação da concentração intracelular de Cálcio (Ca2+). A fosfolipase A2 hidrolisa
fosfolipídios da membrana, particularmente fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina,
liberando o AA. Uma vez liberado, o AA servirá como substrato para duas vias
enzimáticas distintas: a via das ciclooxigenases (Figura 1), que desencadeia a
biossíntese das prostaglandinas e dos tromboxanos (prostanóides), e a via das
35
lipoxigenases, responsável pela síntese de leucotrienos, lipoxinas e outros
compostos (CARVALHO; LEMÖNICA, 1998; BUKHARI et al, 2014).
Raz e colaboradores (1989) descreveram a existência de uma isoforma
induzível da ciclooxigenase (COX), os quais demonstraram a sua indução por
estímulos inflamatórios e citocinas em culturas de fibroblastos. Passou-se então a
admitir, devido as diferentes características de expressão, a existência das
isoformas denominadas COX-1 e COX-2 (RAZ; WYCHE; NEEDLEMANN, 1989;
NEEDLEMAN et al, 1990; MITCHELL et al, 1994).
Figura 1 – Ilustração da síntese de eicosanóides via COX
Fonte: Adaptado de http://biocolesterol.blogspot.pt/2011/01/omega-3-e-o-cancer.html
A COX-1 foi a primeira a ser caracterizada e ocorre na maioria das células
como enzima constitutiva, ou seja, está sempre presente nas células em condições
fisiológicas, principalmente nos vasos sanguíneos, plaquetas, estômago e rins
36
(KUJUBU et al, 1991; BAZAN; FLOWER, 2002; CARVALHO; CARVALHO; RIOS-
SANTOS, 2004; ZARGHI; ARFAEI, 2011).
A COX-2 pode ser induzida principalmente durante a inflamação, sendo
expressa caracteristicamente por células envolvidas no processo inflamatório, como
macrófagos, monócitos e sinoviócitos e tende a facilitar a resposta inflamatória.
Entretanto, no cérebro, rins e alguns outros tecidos, a COX-2 é expressa
constitutivamente (BAZAN; FLOWER, 2002; CARVALHO; CARVALHO; RIOS-
SANTOS, 2004; COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009).
A COX-1 e COX-2 são proteínas integrais que se localizam dentro do folheto
interno da bicamada lipídica de fosfolipídios de membrana. A localização do gene da
COX-1 é no cromossomo 9 enquanto o da COX-2 é no cromossomo 1. O número de
aminoácidos que compõe as duas enzimas é bastante semelhante, variando de 576
aminoácidos para a COX-1 e de 581 aminoácidos para a COX-2 (CARVALHO;
CARVALHO; RIOS-SANTOS, 2004; PATRIGNANI, PATRONO, 2014).
Estudos com as duas isoformas de COX indicaram a mesma afinidade pelo
ácido araquidônico. A diferença observada no sítio ciclooxigenase reside na
presença de um resíduo de valina na posição 523 da COX-2, enquanto que a COX-1
apresenta um resíduo de isoleucina na mesma posição (Figura 2). A valina e a
isoleucina são aminoácidos homólogos lineares. Em virtude da cadeia lateral da
valina ser menor, facilita o acesso, aumentando em muitas vezes o volume do sítio
ativo ligante da COX-2, o que influencia o volume molecular do inibidor sobre a
seletividade à isoforma da enzima (GARG et al, 2003;. SCIULLI et al, 2005).
Outra diferença importante entre COX-1 e COX-2 parece estar na sua
capacidade de utilizar diferentes substratos. Por exemplo, em ambos fibroblastos e
células imunitárias, a COX-2 é capaz de utilizar ácido araquidônico endógeno
enquanto que a COX-1 não. Nestes sistemas, a COX-1 requer substrato exógeno.
Os genes da COX-1 e COX-2 são regulados através de dois sistemas
independentes e bastante diferentes, porém a reação enzimática que catalisam é
idêntica (DUBOIS et al, 1998; SCIULLI et al, 2005).
37
Figura 2 – Ilustração dos sítios de reconhecimento molecular da COX-1 e COX-2
Fonte: http://ejb-eliezer.blogspot.com.br/2012_05_01_archive.html
As COXs possuem duas atividades distintas. Uma atividade de endoperóxido
redutase a qual catalisa a incorporação do oxigênio ao ácido araquidônico, formando
o endoperóxido cíclico intermediário a prostaglandina G2 (PGG), e outra atividade
peroxidase que converte o PGG em prostaglandina H2 (PGH2). A PGH2 é
transformada por várias enzimas e também por mecanismos não enzimáticos em
tromboxano e nas séries de prostaglandinas D, E, F e I. A COX é, portanto
responsável pelos dois primeiros passos na síntese de prostanóides, sendo as
etapas posteriores dependentes de enzimas específicas de cada tecido. Assim, por
exemplo, as plaquetas produzem tromboxano A2 (TXA2); as células endoteliais
vasculares produzem prostaciclina (PGI2); os mastócitos produzem prostaglandina
D2 (PGD2); a vasculatura, trato gastrintestinal, pulmões e outros tecidos produzem
prostaglandina E2 (PGE2) (AULOCK; HERMANN; HARTUNG, 2003; CARVALHO;
CARVALHO; RIOS-SANTOS, 2004; ZARGHI; ARFAEI, 2011).
As prostaglandinas formadas a partir da ação das COXs ligam-se a
receptores prostanóides que se encontram localizados na membrana celular,
38
acoplados à proteína G. A ativação da proteína G resulta na estimulação de
sistemas efetores responsáveis pela liberação de segundos mensageiros em
diversos tecidos. Existem cinco classes de receptores prostanóides denominados
receptores DP, FP, IP, TP e EP, respectivamente, com base nas cinco classes de
prostanóides naturais: PGD2, PGF2, PGI2, PGE2 e tromboxano A2 (DINARELLO,
2010; PATRIGNANI; PATRONO, 2014).
Simmons e colaboradores (2002), estudando linhagens celulares,
descobriram uma nova isoforma da ciclooxigenase, a COX-3. Esta isoforma é uma
variante do gene da COX-1, através de um splicing alternativo do mRNA. Esses
pesquisadores encontraram grande quantidade de COX-3 no coração e no córtex
cerebral em humanos (SIMMONS et al, 2002; BOTTING, 2006).
3.2 Anti-inflamatórios Não-esteroidais (AINEs)
O ácido salicílico foi sintetizado quimicamente, em 1860, na Alemanha, e foi
utilizado como antisséptico, antipirético, antirreumático e, quase 40 anos mais tarde,
Felix Hoffman, um jovem químico que trabalhava para a Bayer, foi instigado por seu
pai para fazer uma forma mais palatável de salicilato para tratar seu reumatismo
grave. Assim Felix obteve o acetilsalicilato, ou ácido acetilsalicílico (AAS) (VANE;
BOTTING, 1998; PRAVEEN RAO; SAAD; TAREK, 2010).
Devido à acetilação do grupo hidroxila a molécula apresentou um menor
caráter ácido, reduzindo os efeitos adversos, como problemas estomacais, e não
alterou suas propriedades analgésica, antitérmica e anti-inflamatória. Obteve-se
assim o primeiro fármaco sintético, oriundo da otimização de um produto natural,
através de uma correlação de estrutura e propriedade química, com possibilidade de
ser usado de forma maciça, devido à sua facilidade de síntese e baixo custo, sendo
denominado comercialmente como Aspirina ® (VANE; BOTTING, 1998; PRAVEEN
RAO; SAAD; TAREK, 2010).
O AAS (Figura 3) foi introduzido no mercado em 1899, sendo reconhecido
como antipirético, anti-inflamatório e analgésico. Logo depois, outros fármacos com
ações semelhantes à Aspirina® foram descobertos, incluindo a antipirina, fenacetina,
acetaminofeno, fenilbutazona, também, os fenamatos, Ibuprofeno e naproxeno. Este
grupo foi denominado “aspirin-like” (medicamentos como a Aspirina®), além disso,
39
por apresentarem-se distintos dos glicocorticóides foram denominados também
como drogas anti-inflamatórias não-esteroidais (AINEs). Antes de 1971, pouco se
sabia sobre o mecanismo de ação dos AINEs, exceto que eles produziam um efeito
anti-inflamatório diferente dos glicocorticóides mais potentes (BOTTING, 2006;
LIMONGELLI et al, 2010).
Figura 3- Estruturas dos fármacos: AAS (1); antipirina (2); fenacetina (3); acetaminofeno (4); fenilbutazona (5); ibuprofeno(6) e naproxeno (7).
Em 1971, Vane, publicou na revista Nature, os resultados da experiência que
demonstrou a inibição da formação de prostaglandinas de modo dose-dependente
pela indometacina, salicilato de sódio e a morfina. Sendo a indometacina com ação
mais potente, o salicilato de sódio menos potente e a morfina, inativa. Desde então,
o conceito de que os AINEs funcionam pela inibição da COX, foi aceito (VANE,
1971; VANE; BOTTING, 1998; LIMONGELLI et al, 2010).
A COX-1 tem funções fisiológicas claras. A sua ativação conduz, por exemplo,
para a produção de prostaciclina, a qual, quando liberada pelo endotélio é
O CH3
O OH
O
N
N
O
CH3
CH3NH
OCH3
O
CH3
NH
OH
CH3
ON
N
O
O
CH3
CH3
CH3
OH
O
CH3 OH
OCH3
CH3
O
(1) (2)(3)
(4)
(5)
(6)(7)
40
antitrombogênica e quando liberada pela mucosa gástrica é citoprotetora (VANE;
BOTTING, 1998; JANTAN et al, 2014).
A COX-2 é induzida por estímulos inflamatórios e citocinas em outras células
migratórias, o que sugere que a ação anti-inflamatória dos AINEs seja devido à
inibição da COX-2, enquanto que os efeitos secundários indesejados, tais como
irritação da mucosa do estômago e efeitos tóxicos sobre os rins, seja devido à
inibição da COX-1 (VANE; BOTTING, 1998; JANTAN et al, 2014).
Desde a elucidação do mecanismo de ação do ácido acetilsalicílico, muitos
AINEs foram desenvolvidos por empresas farmacêuticas. Estes incluem o
naproxeno, ibuprofeno, piroxicam, diclofenaco e muitos outros. A inibição da síntese
das prostaglandinas explica todas as ações dos AINEs. O AAS, a indometacina e o
Ibuprofeno são muito menos ativos contra a COX-2 do que contra a COX-1. A gama
de atividades dos AINEs contra a COX-1 em comparação com a COX-2 explica as
variações nos efeitos adversos destes medicamentos em suas doses terapêuticas.
(VANE; BOTTING, 1998; BOTTING, 2006; LIMONGELLI et al, 2010).
Os inibidores seletivos da COX-2 foram introduzidos no mercado em 1999. Os
primeiros AINEs a serem comercializados como inibidores da COX-2 foram o
celecoxibe (Celebrex®) e o rofecoxib (Vioxx®). Foram realizadas alterações na
estrutura molecular destes compostos. O celecoxibe, em vez do grupo carboxila
comum à estrutura dos AINEs, contém um grupo sulfonamida e na estrutura do
rofecoxib foi realizada a substituição por uma metilsulfona (Figura 4). Os enxofres
contidos nos anéis fenila destes compostos ligam-se a bolsa lateral do canal
catalítico-COX da COX-2, porém a interação é fraca (BOTTING, 2006; SHI; KLOTZ,
2008).
Figura 4- Estruturas dos fármacos: etoricoxibe (1), valdecoxibe (2) e celecoxibe (3).
N
N
Cl
CH3
SO2CH3
O
N
SO2CH3
CH3
N N
SO2NH2
CH3
F3C
(1) (2) (3)
41
O AAS ainda é utilizado principalmente para a profilaxia antitrombótica. Em
doses baixas (30 mg/dia a 160 mg/dia) é capaz de acetilar irreversívelmente a COX-
1, eliminando a sua atividade enzimática. A COX-1 é a principal isoforma da enzima
na plaqueta que, por ser anucleada não pode mais sintetizá-la após ser inibida
irreversivelmente. A consequente cessação da síntese de TXA2 persiste durante
toda a vida das plaquetas afetadas (8 a 10 dias), representando o efeito
antitrombótico e constituindo a base molecular para os seus efeitos de profilaxia
contra a doença cardiovascular. Também em doses baixas, o AAS tem um efeito
mínimo sobre a síntese de COX-2, mediada por PGI2 nas células endoteliais, que
são nucleadas, tendo a capacidade de reposição (PATRIGNANI; FILABOZZI;
PATRONO, 1982; CRYER; DUBOIS, 1998; MARNETT, 2002; CAIRNS, 2007).
Este fármaco continua a ser associado a efeitos farmacológicos benéficos.
Vários estudos epidemiológicos sugerem que a ingestão de AAS está associada à
redução da mortalidade por câncer de cólon. O seguimento clínico e experimental
desta observação levou à descoberta de que a forma induzível da COX, ou seja, a
COX-2 é supra-regulada no câncer de cólon e outros canceres, o que pode
proporcionar uma base molecular para a atividade quimiopreventiva do AAS e outros
AINEs (MARNETT, 2002; CAIRNS, 2007).
Apesar da eficácia dos AINEs estar bem estabelecida, ainda há necessidade
de alternativas terapêuticas. Os compostos isolados de plantas medicinais poderão
assim constituir a base para a produção de novos fármacos para o tratamento da dor
e inflamação, com efeitos secundários reduzidos (RIJO et al, 2012).
Entre as diversas estratégias utilizadas para a introdução de novos fármacos
na terapêutica, as modificações moleculares mostram-se promissoras. Estas
consistem na transformação química de moléculas conhecidas, com o objetivo de
aumentar a potência e a segurança, garantindo assim um melhor perfil
farmacocinético e farmacodinâmico (WERMUTH, 2004).
3.3 Química Medicinal
A química medicinal engloba todas as etapas que levam ao desenvolvimento
de novos fármacos, desde a descoberta, planejamento, identificação e a preparação
de substâncias biologicamente ativas. Estes estudos também englobam o
42
mecanismo de ação, metabolismo e as relações estrutura-atividade biológica,
buscando o desenvolvimento de novos fármacos mais eficientes e com menos
efeitos adversos (CAMPOS-BUZZI, CECHINEL-FILHO, CORRÊA, 2010).
A química dos compostos heterocíclicos é a mais importante na descoberta
de novos fármacos. O estudo destas substâncias é de grande interesse tanto em
aspectos teóricos quanto práticos. Vários compostos, tais como alcalóides,
aminoácidos essenciais, vitaminas, hormônios, hemoglobina, grande número de
fármacos sintéticos e corantes contêm sistemas de anéis heterocíclicos. Há grande
número de substâncias heterocíclicas sintéticas, como pirrol, pirrolidina, furano,
tiofeno, piperidina, piridina e tiazol e possuem aplicações importantes e muitos são
intermediários importantes nas reações de síntese (PRATYUSHA et al, 2013).
A descoberta de novos fármacos baseada na modificação da estrutura de
moléculas conhecidas, geram novos protótipos com mecanismo farmacológico
idêntico a molécula original. A indústria farmacêutica emprega esta técnica na
pesquisa de novos fármacos, porém, a inovação farmacêutica só é caracterizada
quando ocorre a descoberta de novas substâncias bioativas autênticas e com
possibilidade de aplicação terapêutica (BARREIRO; FRAGA, 2008).
A substituição de um átomo de hidrogênio por um determinado substituinte
(como um halogênio ou grupos alquila, nitro, ciano, carboxilato, entre outros) pode
ocasionar modificações na potência, duração e ainda a natureza do efeito
farmacológico de uma molécula. São comuns em química medicinal os estudos de
correlação estrutura-atividade, fundamentados no efeito do substituinte em um
determinado anel aromático, uma vez que mais de 50% dos fármacos ou compostos
bioativos possuem este tipo de anel. As modificações produzidas pela introdução de
um substituinte podem atingir várias propriedades físico-químicas da molécula, tais
como a hidrofobicidade, a densidade eletrônica e a conformação estrutural, cuja
análise pode orientar novas sínteses (CECHINEL-FILHO, YUNES, 2001).
Um dos pilares da química orgânica moderna está relacionado ao conceito de
substituintes orgânicos e sua influência nas propriedades moleculares, servindo de
base para as análises quantitativas entre estrutura química e atividade biológica
(QSAR). Várias estratégias foram desenvolvidas para compreender os diversos
parâmetros físico-químicos numa pequena série de compostos ou grupo de teste.
Entre estas, podemos citar os métodos de Hansch (HANSCH; FUJITA, 1964;
43
FUJITA; IWASA, HANSCH, 1964), Craig (CRAIG, 1971), Topliss (TOPLISS, 1972), e
mais recentemente, o método modificado de Topliss (YUNES et al, 2002).
O Método Manual de Topliss é baseado na equação de Hansch (TOPLISS,
1972). É um método prático que consiste na utilização de uma chave para seleção
dos análogos a serem sintetizados. A atividade de um análogo específico é
comparada com a atividade do análogo que o precede na chave, permitindo que o
número de moléculas a serem sintetizadas seja reduzido. Este método é útil
principalmente quando não é possível sintetizar um grande número de moléculas
necessárias para produzir uma equação de Hansch precisa. O Método Manual de
Topliss, além de não contemplar todos os análogos possíveis de serem sintetizados,
tem limitações devido à exigência de que o composto protótipo tenha ao menos um
anel aromático não fusionado, onde devem ser adicionados os substituintes da
chave. Entretanto, como muitos fármacos usados atualmente satisfazem esta
exigência, este método pode ser uma das estratégias utilizadas no descobrimento
de novos análogos mais efetivos (THOMAS, 2000).
O método manual consiste na análise dos resultados da atividade
farmacológica de cinco compostos que possuam anel aromático na sua estrutura e
que estejam presentes os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3, e 4-OCH3
(CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES, 1993).
A partir da avaliação dos resultados é proposta a seleção de novos
substituintes que podem aperfeiçoar a atividade farmacológica das moléculas em
estudo. Aos parâmetros relacionados π e σ, baseados nos estudos de correlação de
Hansch, Topliss incluiu também os efeitos estéreos (Es), que em muitos casos
exercem maior influência. Sendo assim, a avaliação da atividade biológica está
relacionada aos parâmetros hidrofóbicos (π), eletrônicos (σ) e estéreos (Es)
(THOMAS, 2000).
Este método orienta uma síntese mais racional e objetiva, pois, fazendo
primeiramente uma análise e comparação dos resultados da atividade biológica com
a estrutura química das moléculas podem-se prever modificações estruturais
objetivando a obtenção de uma molécula mais potente que as precursoras
(WERMUTH, 2004).
O planejamento adequado de variações na estrutura molecular de um
composto pode resultar em derivados mais eficazes por apresentarem maior
44
atividade com menor toxicidade, além de apresentarem características
farmacotécnicas otimizadas. Uma vez obtido um composto biologicamente ativo,
pode se lançar mão de estratégias de modificação molecular, também chamada de
variação molecular ou manipulação molecular, que se constitui, certamente no
método mais usado e recompensador para otimizar essa atividade. A correlação
entre a estrutura química e atividade biológica pode ser quantificada e então é
denominada de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship - Relação
Quantitativa entre Estrutura Química e Atividade Biológica) (TAVARES, 2004).
As relações quantitativas de estrutura-atividade correlacionam dentro de uma
série de compostos congêneres, a afinidade dos ligantes aos seus sítios ativos,
constantes de inibição, constantes de velocidade e outras atividades biológicas, ou
ainda certas características estruturais, como átomos, grupos ou descritores
moleculares, tais como lipofilicidade, polarizabilidade, propriedades eletrônicas ou
estéreas (CAMPOS-BUZZI, CECHINEL-FILHO, CORRÊA, 2010).
A abordagem fisiológica, pode servir de embasamento para as estratégias
modernas utilizadas para o planejamento racional de novos protótipos, o que permite
planejar a estrutura química de uma nova molécula com base na definição prévia do
mecanismo de ação terapêutica. Esta ação, dependerá do local de interação entre o
novo fármaco e o sítio ativo, para que ocorra a alteração de um determinado
processo bioquímico (BARREIRO, FRAGA, 2008).
Técnicas de screening virtual estão sendo utilizadas para analisar problemas
de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET). Assim, com
o intuito de filtrar e selecionar compostos que possam ter características de
fármacos, o Log P e a massa molar incluídos nas regras de Lipinski, são importantes
parâmetros a serem usados (YUNES; CECHINEL-FILHO, 2012).
A lipofilia é uma das características físico-químicas mais importantes para o
estudo e o planejamento de fármacos. O estudo da influência da lipofilia permite
prever a permeabilidade e biodisponibilidade do fármaco no meio aquoso
extracelular ou nos tecidos celulares. Este parâmetro foi avaliado em fármacos com
as mais variadas atividades farmacológicas, como os analgésicos,
anticonvulsivantes, ansiolíticos, anti-inflamatórios, antifúngicos, antivirais e
antitumorais, estes estudos permitiram a identificação de determinados padrões
moleculares úteis na construção de novas moléculas biologicamente ativas
(NOGUEIRA et al, 2008).
45
A pesquisa de Lipinski iniciou devido à observação de um grande número de
candidatos à fármacos, inicialmente promissores, terem sido abandonados em
estágios avançados de pesquisa, em virtude de problemas relacionados à
propriedades farmacocinéticas inadequadas (CAMPOS-BUZZI, CECHINEL-FILHO,
CORRÊA, 2010).
A regra de Lipinski, também denominada regra dos 5, objetiva estimar a
solubilidade e a permeabilidade de fármacos administrados pela via oral, predizendo
a influência da estrutura química na absorção de uma substância, uma vez que a
previsão dos processos farmacocinéticos logo nos estágios iniciais da pesquisa é de
extrema importância para o desenvolvimento de um candidato a fármaco. De acordo
com Lipinski, os critérios a serem analisados são: a massa molar, a qual não deve
exceder 500 g/mol; o Log P, cujo valor limite é 5; e os grupos doadores (NH + OH) e
aceptores (N + O) de ligação hidrogênio, cujas somatórias não devem ultrapassar a
5 e 10, respectivamente. Apenas classes de compostos que são substratos para
transportadores biológicos e produtos naturais são consideradas exceções à regra
(LIPINSKI et al, 2001).
A absorção pode ser determinada pelo grau de dissolução no fluido
gastrointestinal, difusão passiva através da membrana intestinal ou perfusão via
sistema porta (MARTIN; KUTTER; AUSTEL, 1989). Propriedades físico-químicas
dos fármacos-protótipo e fatores fisiológicos influenciam no limite deste processo e
podem afetar a extensão da absorção. Geralmente os descritores físico-químicos
das moléculas candidatas à fármacos podem ser utilizados para predizer se a
absorção será por difusão passiva. Alguns estudos têm demonstrado a importância
de se obter previamente dados relacionados à absorção intestinal, sendo necessária
certa afinidade entre a estrutura lipofílica e a membrana celular. Estudos nesta área
demonstraram que aceptores e doadores de ligação de hidrogênio são importantes
para a absorção gastrointestinal de fármacos por difusão passiva (ZHAO et al,
2001).
Clark (1999) e Palm (1997) desenvolveram um método teórico, baseado nas
propriedades dinâmicas da superfície - área de superfície polar total (TPSA), para
predizer a absorção intestinal em humanos. Os dados de absorção podem ser
expressos de diferentes formas. Os métodos tradicionais utilizam a porcentagem
para expressar a extensão de absorção. Esta forma de apresentação tem a
vantagem de ser muito simples direta e de fácil compreensão. Zhao e colaboradores
46
(2002) descreveram os cálculos necessários e apresentaram tabelas com os
cálculos utilizando resultados da análise da regressão linear entre a porcentagem de
absorção e descritores como o Log P, ou TPSA e os descritores de Abraham
(refração molar (E), polarizabilidade (S), acidez para ligações de hidrogênio (A),
basicidade para ligações de hidrogênio (B) e volume de McGowan (V)) (ABRAHAM,
1993).
Além dos descritores de Lipinski e a porcentagem de absorção, tem-se
utilizado outros parâmetros moleculares como a solubilidade, Drug likeness, Drug
score e toxicidade para avaliar a biodisponibilidade das moléculas candidatas a
fármacos. Estes parâmetros podem ser calculados através de software específicos
(Molinspiration e OSIRIS), através da análise do desenho da estrutura nos
programas.
A solubilidade aquosa de uma substância afeta significativamente suas
características de absorção e distribuição. Uma baixa solubilidade resulta em uma
baixa absorção, desta forma, com este dado, procura-se modificar a estrutura da
molécula a fim de evitar a síntese de substâncias fracamente solúveis. O valor
estimado da solubilidade (Log S) é apresentado em forma logarítmica (base 10) na
unidade mol/litro. Dados experimentais estimaram que o valor para uma substância
apresentar boa solubilidade deve ser maior que - 4mol/L (ORGANIC CHEMISTRY
PORTAL, 2015).
Existem diferentes formas de como avaliar a drug likeness (farmaco-
semelhança) de uma substância, podendo ser usado como base os descritores
topológicos, impressões digitais da estrutura, Log P e pesos moleculares. O
programa OSIRIS Property Explorer, pode ser utilizado para prever a drug likeness
com base em fragmentos das substâncias sintetizadas comparando-as com uma
base de dados com 3300 medicamentos comercializados e 15 mil produtos químicos
(supostamente não-fármacos) disponíveis no mercado produzindo uma lista
completa de todos os fragmentos disponíveis. A pontuação drug likeness avalia a
freqüência de ocorrência de cada fragmento na estrutura individual. Cerca de 80%
dos fármacos comercializados têm valor positivo ao passo que os fragmentos “não-
fármacos” em sua grande maioria apresenta valores negativos (HASSAN et al,
2015).
47
A pontuação drug score, considera os valores de drug likeness, Log P; Log S;
peso molecular e riscos de toxicidade e os combina em um valor global de um
potencial novo candidato a fármaco, sendo calculado usando a seguinte equação:
DS é a drug score e Si são as contribuições de Log P, Log S, peso molecular
e drug likeness (π) obtidos a partir da equação (2),que é uma curva de ranhura 'a' e
'b' são parâmetros para Log P, Log S, peso molecular e drug likeness (1, -5), (1, 5),
(0,012, -6) e (1, 0) , respectivamente. 'ti' são as contribuições dos tipos e risco de
toxicidade e tem valores de 1,0, 0,8 e 0,6 por nenhum risco, risco médio e alto risco,
respectivamente. Um valor positivo de drug score indica que a molécula tem
predominantemente grupos farmacofóricos e pode ser um fármaco em potencial
(ORGANIC CHEMISTRY PORTAL, 2015; HASSAN et al, 2015).
A grande maioria dos fármacos deve seus efeitos à sua ligação específica a
uma biomacromolécula ou alvo molecular, geralmente uma enzima ou um receptor.
Porém, quando a estrutura do biorreceptor não é conhecida, o desenho molecular do
candidato a novo fármaco inicia-se pela estrutura da micromolécula endógena
envolvida na patologia do processo em questão, variando-se o índice de similaridade
molecular, de tal forma que se identifique um análogo ativo, e neste ponto a intuição
química tem papel fundamental. Desta forma, é imprescindível a estreita ligação
entre a química e a farmacologia para o desenvolvimento de novas substâncias
ativas (BARREIRO, 2001; CECHINEL-FILHO; YUNES, 2001).
Os estudos em síntese orgânica determinam as condições experimentais
ideais para a preparação de derivados e o estabelecimento de parâmetros
estruturais que indiquem o caminho a ser seguido quando se deseja obter
compostos biologicamente ativos e mais potentes que seus precursores (CAMPOS-
BUZZI, 2007).
48
3.4 Chalconas
As chalconas são substâncias de interesse medicinal, uma vez que são
abundantemente encontradas na natureza, em plantas rasteiras ou superiores como
metabólitos secundários na biossíntese dos flavonóides e também podem ser
obtidos sinteticamente (CORREA et al, 2001; CAMPOS-BUZZI et al, 2006; YADAV
et al, 2011).
São moléculas de cadeia aberta que contêm dois anéis aromáticos ligados
por um fragmento enona de três carbonos, ou seja, são cetonas α,β-insaturadas, em
que um anel aromático está diretamente ligado à carbonila e o outro ao carbono β da
função olefínica. Estes anéis são identificados como anel A (advindos da cetona) e
anel B (advindos do aldeído) (Figura 5). Biologicamente, elas também podem ser
definidas como uma classe de compostos pertencentes à família das fitoalexinas
produzidas durante a biossíntese de flavonoides (PAXTON, 1981; YADAV et al,
2011; BUKHARI et al, 2014).
Figura 5 - Núcleo fundamental das chalconas
O
A B
2'
3'
5'
4' 6'
23
4
5
6
As chalconas naturais ocorrem principalmente como pigmento nas pétalas,
justificando o nome derivado do grego chalcos = bronze, mas também têm sido
encontradas em caules, raízes, folhas, frutos e sementes de uma variedade de
plantas. O isômero trans da chalcona é considerado a forma termodinamicamente
mais estável e, portanto encontrada em maior concentração nas plantas. A presença
dos derivados hidroxilados também é uma característica química marcante, assim
como a insaturação α, β (porção cetona) a qual é atribuída uma série de atividades
biológicas (NI; MENG; SIKORSKI, 2004).
As chalconas possuem duplas ligações conjugadas e um sistema de elétrons
π completamente deslocalizados em ambos anéis aromáticos. As moléculas que
possuem tal sistema têm baixo potencial redox e maior probabilidade de sofrer
49
reações de transferência de elétrons. Além disso, a introdução de substituintes nos
dois anéis arila também desperta interesse, pois levam a conclusões de relação
estrutura-atividade (REA) úteis e, assim, ajudam a sintetizar chalconas
farmacologicamente ativas, menos tóxicas e mais eficazes (NOWAKOWSKA, 2007;
PATIL; MAHAJAN; KATTI, 2009; YADAV et al, 2011).
Chalconas são precursores versáteis na síntese de compostos heterocíclicos.
Do ponto de vista da síntese orgânica, a porção enona é importante para a
transformação estrutural das chalconas. Atuando como um eletrófilo, as chalconas
podem reagir com um nucleófilo na adição de Michael. Em uma reação de
ciclocondensação, as chalconas podem atuar como um bi-eletrófilo que reage com
um bi-nucleófilo, sendo uma via atrativa para a síntese de compostos heterocíclicos,
como o derivado de pirazolina, oxirano, pirano, oxopirimidina, isoxazolina, derivados
de piridina, derivados de benzheteroazepina, e outros heterociclos (SUWITO et al,
2014).
Apesar de ser um produto natural, fonte de inúmeras pesquisas científicas, o
isolamento pioneiro de chalconas só foi realizado em 1910 por Kametaka e Perkin,
mediante manipulação de extratos da espécie Carthamus tinctorius - flores de
açafrão. Um fator de diversificação encontrado nas chalconas naturais é a natureza
e a posição dos substituintes presentes nos anéis A e B. Geralmente, observam-se
grupos hidroxilas, metoxilas, O-glicosilas, C-glicosilas e C-alquilas, distribuídos nas
posições orto, meta e para. A partir dos adventos da química orgânica sintética é
possível produzir esses biocompostos com uma variedade de substituintes, de forma
cada vez mais versátil (BIEBER, 1999).
A técnica mais empregada para a obtenção de chalconas é a partir da
condensação aldólica (condensação de Claisen-Schmidt), na qual aldeídos e
acetofenonas reagem na presença de um catalisador ácido ou básico (ABUO-
RAHMA et al, 2012; BUKHARI et al, 2014).
As reações de condensação de Claisen-Schmidt entre aril-cetonas e
derivados de benzaldeído mostram-se a estratégia sintética mais utilizada para a
construção do núcleo chalcônico. Uma vez formadas tais biomoléculas, diversas
outras reações podem ser feitas para a introdução de átomos ou grupos no
esqueleto das chalconas para utilizá-las como material de partida na tentativa de
obter novas substâncias. Dentre as alterações estruturais mais descritas na
50
literatura, podem-se citar as reações de halogenação na ligação dupla α-β-
insaturada (ABUO-RAHMA et al, 2012; BUKHARI et al, 2014).
3.5 Pirimidinas
Em química orgânica, compostos cíclicos que contêm no mínimo um átomo
no anel que não seja o carbono são chamados heterociclos. A maioria dos
heteroátomos contidos nos heterociclos são o nitrogênio, o oxigênio e o enxofre.
Na natureza, os heterociclos são de grande importância. Mais da metade de
todos os produtos naturais contêm heterociclos em sua estrutura. Heterociclos
contendo nitrogênio são particularmente muito difundidos na natureza entre eles a
pirimidina (KACHROO, PANDA, YADAV, 2014).
Pirimidinas são anéis heterocíclicos de 6 membros, compostos por nitrogênio
e carbono. As substituições de C-H em meta em relação ao outro no anel benzênico
por dois átomos de nitrogênio (posição 1 e 3), forma o anel pirimidínico (Figura 6). A
reatividade dos átomos de carbono 2, 4, 5 e 6, bem como os substituintes ligados a
eles variam individualmente (HIREMATH, 2010).
Estão presentes na natureza de várias formas e fazem parte da estrutura de
antibióticos, vitaminas e hormônios. São comumente reconhecidos nas bases de
RNA e DNA sendo mais abundantes na citosina, timina e uracila. O nitrogênio
contido nos heterocíclicos desempenha um papel importante na química medicinal e
também contribui para a sociedade, ajudando em diferentes processos da vida
(ARIKKATT et al, 2014; SUWITO et al, 2014).
Figura 6 – Estrutura do núcleo pirimidínico
A origem do termo pirimidina data por volta de 1884 quando Pinner criou o
termo a partir de uma combinação das palavras piridina e amidina por causa da
N1
2
6
N3
5
4
51
semelhança estrutural com estes compostos. Desde os estudos iniciais, numerosas
modificações têm sido feitas na estrutura original tornando-a um interessante objeto
de estudo (HIREMATH, 2010).
O anel pirimidinínico é essencialmente plano. A deficiência de elétrons na
posição orto e para relativamente ao átomo de nitrogênio eletronegativo é mais
acentuada na pirimidina do que em outras diazinas, como a pirazina e pirazidina. Isto
porque os dois átomos de nitrogênio das 1,3-diazinas são posicionados de modo
que seus efeitos individuais reforçam um ao outro, e assim atuam um uníssono. Por
isso que o efeito resultante é maior na pirimidina do que nas suas diazinas
isoméricas, onde os efeitos eletrônicos dos dois átomos de nitrogênio antagonizam
parcialmente uns aos outros de modo que os carbonos C-2, C-4 e C-6 no anel
pirimídico tornam-se fortes centros eletropositivos, enquanto que a o carbono C-5
retém eletronegatividade, embora em menor grau. Reagentes eletrofílicos quase
invariavelmente atacam a pirimidina na posição C-5, local de maior deficiência de
elétrons, facilitando reações de nitração, halogenação ou sulfonação. Embora os
carbonos C-2, C-4 e C-6 do anel pirimidínico sejam um melhor alvo para o ataque
nucleofílico direto, apenas alguns exemplos de reação são conhecidos em que a
substituição nucleofílica do hidrogênio ocorra de forma direta (HIREMATH, 2010).
A síntese de pirimidinas tem sido de grande interesse para a química orgânica
devido a sua ampla variedade de atividades biológicas. Em 1818, Gasfare B. isolou
o primeiro derivado pirimidínico, o Aloxana (Figura 7), através da oxidação do ácido
úrico com ácido nítrico. O primeiro exemplo importante da síntese de pirimidinas foi a
síntese do ácido barbitúrico (Figura 7), em 1878, através da reação do ácido
malônico e uréia (HIREMATH, 2010; ARIKKATT et al, 2014; SUWITO et al, 2014).
Figura 7 – Estruturas do Aloxana (1) e Ácido barbitúrico (2)
NHNH
O
O
O
O
(1)
NHNH
O
O O
(2)
52
A rota de síntese mais comum para a obtenção de derivados de pirimidinas
acontece através da condensação de compostos 1,3-dicarbonilados com reagentes
tendo um fragmento N-C-N, tais como a ureia, uma amidina, ou guanidina. A
utilização de um ortoéster formamida ou em combinação com amonia como um
reagente de N-C-N substituto potencial para a síntese de pirimidinas também tem
sido relatadas. Nestas condições tem sido obtida uma série de pirimidinas
substituídas (TYAGARAJAN; CHAKRAVARTY, 2005).
Os métodos de síntese de pirimidinas são classificados com base nos
componentes empregados na ciclização pirimidínica. A reação de ciclização pode
ocorrer utilizando-se um, dois ou três componentes. A ciclização para formação do
núcleo pirimidínico que utiliza um componente envolve a ciclização intramolecular de
certos intermediários de cadeia aberta. Um exemplo deste tipo é a reação do
derivado de N-cianoamina para 2-aminopirimidina, em meio básico. A utilização de
dois componentes para a obtenção do núcleo pirimidínico envolve a condensação de
dois reagentes. Um dos componentes utilizados pode contribuir com 3, 4 e 5 átomos;
enquanto o outro componente pode contribuir com 3, 2 ou 1 átomo respectivamente.
Quando se utiliza três componentes para a síntese do núcleo pirimidínico, cada um
dos componentes contribui com dois átomos para a reação de ciclização. Um
exemplo é a reação do acetileno com duas moléculas de nitrila na presença de
trifluoreto de boro (HIREMATH, 2010).
As condições reacionais para a formação do núcleo pirimidínico também
podem variar, podendo ser realizadas em temperatura ambiente, refluxo
convencional ou irradiação por microondas. A irradiação de microondas tem sido
utilizada desde a década de 1980 como uma forma alternativa para acelerar reações
orgânicas endotérmicas. A radiação de microondas pode ser focada no meio de
reação e transferir eficientemente a energia diretamente para as espécies reagentes,
ocorrendo um sobreaquecimento de um modo muito mais rápido, quando
comparado com o aquecimento por convecção regular, facilitando, assim, as
transformações químicas pretendidas. Como resultado, muitas reações orgânicas
são realizadas usando energia de microondas, como cicloadição, adições ao grupo
carbonila, substituições eletrofílicas e síntese de heterociclos (XAVIER et al, 2013).
Os sistemas heterocíclicos exibem uma variedade de bioatividades, incluindo
antitumoral, antifúngica, antimicrobiana, antibacteriana, anti-inflamatória entre outras.
A presença da função insaturada, juntamente com o tipo e posição do substituinte
53
nos anéis aromáticos, estão frequentemente relacionados à atividade biológica
associada a estes derivados através de modificações estruturais do esqueleto
chalcônico (FAVARIN et al, 2013).
3.6 Atividades biológicas, relacionadas à chalconas e derivados
Corrêa e colaboradores (2001), obtiveram várias chalconas com potente
efeito antinociceptivo quando avaliadas no ensaio de dor induzido por formalina. A
chalcona, que não continha grupos substituintes em qualquer anel aromático,
apresentou um valor equipotente a aspirina e paracetamol, fármacos amplamente
empregados na prática clínica (CORRÊA et al, 2001).
Nowakowska (2007) cita estudos que comprovam as propriedades anti-
inflamatórias de diversos derivados de chalconas, entre eles: dimetilamino-
chalconas, trimethoxi-chalconas, (com vários padrões de fluoração), chalconas com
grupos prenil ou geranil e derivados de chalcona isolados de frutos de Mallotus
philippinensis. Todos estes compostos foram testados in vitro e apresentaram
atividade inibitória sobre a produção de NO e PGE2 em células RAW 264.7, ativadas
por lipopolissacarídeo (LPS) e redução de edema de pata induzido por carragenina.
Além disso, estes compostos inibiram a NO sintase induzível (iNOS), ciclooxigenase
2 (COX-2), interleucina 6 (IL-6) e a expressão de mRNA do gene IL-1β
(NOWAKOWSKA, 2007).
Tran e colaboradores (2009), sintetizaram 18 derivados da 2‟-hidroxichalcona,
e avaliaram quanto a atividade inibidora de PGE2 e a citotoxicidade dos compostos,
utilizando ensaios de viabilidade celular por MTT. Os dados obtidos mostraram que,
seis chalconas apresentaram atividades biológicas mais acentuadas que o composto
original. Os requisitos estruturais para a atividade inibidora dos análogos de 2‟-
hidroxichalcona sobre a produção de PGE2 a partir de células RAW 264.7 podem ser
utilizadas como se segue: (i) a concomitância de, pelo menos, dois grupos alcoxi no
anel B de chalconas em que um grupo substituído na posição 4 e o outro substituto
em 3 - ou 5- na posição do anel B pode aumentar a atividade inibitória para a
produção de PGE2, (ii) o radical benziloxi desempenha um papel importante no
estabelecimento de interações fortes entre chalcona e COX-2, (iii) a inibição da
produção de PGE2 a partir de células RAW 264.7 de derivados da 2‟-
54
hidroxichalcona não está associado com a sua citotoxicidade. As informações da
relação estrutura atividade (REA) são significativas para projetar e desenvolver
novos compostos com maior atividade anti-inflamatória (TRAN et al, 2009).
Com o objetivo de sintetizar novas moléculas derivadas de chalconas com
atividade anti-inflamatória, Jantan e colaboradores (2014), investigaram através de
testes in vitro, 4 séries, totalizando 17 moléculas a capacidade de inibição das
enzimas COX-1 e COX-2. Foram testados também ensaios para lipoxigenase (LOX),
para TNF-α e IL-6. Após avaliação, constatou-se que as chalconas avaliadas
apresentaram potencial inibitório contra COX-1, COX-2 e LOX, bem como
apresentaram bons resultados nos testes de inibição de IL-6 e TNF-α. Estudos
adicionais foram sugeridos para a otimização dos efeitos anti-inflamatórios (JANTAN
et al, 2014).
Pirimidinas que possuem grupo hidroxila desempenham papel vital nos
processos biológicos. Os fármacos obtidos sinteticamente, com pirimidinas
hidroxiladas ou derivados pirimidínicos em sua estrutura estão associados a várias
atividades terapêuticas. Foram descritos exemplos como o 5-fluoracil, como
antitumoral, idoxuridina e trifluridina como antivirais; zidovudina e estavudina com
atividade anti- HIV, trimetoprim e sulfadiazida, como agentes antibacterianos;
minoxidil e prazosina como anti-hipertensivos, e outros com atividade anti-
tuberculose, anti-inflamatória , diurética, antimalária e cardiovascular (AMIR; JAVED;
KUMAR, 2007; FAVARIN et al, 2013).
Modica e colaboradores (2000) sintetizaram uma série de
tiazolotienopirimidinonas e os testes para a atividade anti-inflamatória e analgésica
foram promissores (MODICA et al, 2000).
Bekhit e colaboradores (2003) relataram a síntese de duas séries de
derivados pirimidínicos os quais foram avaliados através do ensaio edema de pata
induzido por carragenina, sendo os compostos mais ativos avaliados in vitro sobre a
atividade inibitória das enzimas COX-1 e COX-2 humanas. Alguns compostos
apresentaram notável atividade anti-inflamatória e pouco ulcerogênica (BEKHIT et al,
2003).
Sondhi e colaboradores (2005) sintetizaram derivados pirimidínicos mono, bi e
tricíclicos e submeteram a testes para avaliar a atividade anti-inflamatória e
analgésica através do edema de pata induzido por carragenina. Alguns dos
55
compostos testados apresentaram boa atividade anti-inflamatória (SONDHI et al,
2005).
Moléculas tricíclicas que possuem como característica comum a 1,2-diaril
substituição no anel heterocíclico central ou no sistema de anel carbocíclico
representam uma importante classe de inibidores da COX-2 seletivos. O anel
pirimidínico tem sido pouco usado como molde para a síntese de novos inibidores
seletivos COX-2. As pirimidinas e as pirimidinas condensadas são uma importante
classe de compostos heterocíclicos e exibem um grande espectro de atividades
biológicas. O núcleo pirimidínico contendo cloro na posição 2 mostra atividade anti-
inflamatória significativa (ORJALES et al, 2008; SINGOUR et al, 2012).
Bukhari e colaboradores (2012) sintetizaram uma série de chalconas e
análogos pirimidínicos e avaliaram a capacidade anti-inflamatória destas moléculas
através da inibição da atividade da ciclooxigenase in vitro, utilizando ensaio
imunoenzimático (EIA). Concluiu-se, através dos resultados obtidos que as
chalconas e pirimidinas sintetizadas apresentaram potencial anti-inflamatório além
de uma excelente inibição da COX-2 comparado a inibição da COX-1, ou seja,
compostos seletivos (BUKHARI et al, 2012).
56
57
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Purificação e Caracterização estrutural dos derivados
As reações de síntese, bem como a pureza preliminar das moléculas foram
monitoradas por cromatografia em camada delgada (CCD). Os procedimentos
utilizados para a purificação foram: recristalização, cromatografia em coluna (CC),
cromatografia automatizada de baixa pressão e extração reativa. A caracterização
das moléculas sintetizadas foi realizada através da verificação do ponto de fusão
(PF), espectroscopia no infravermelho (IV) e espectroscopia de ressonância
magnética nuclear de próton (RMN-1H) e carbono (RMN-13C).
Para a técnica de CCD foram utilizadas placas de sílica gel 60 F254 em folhas
pré-revestidas de alumínio da marca Merck®. Para este procedimento foram
utilizados sistemas solventes em diferentes polaridades: hexano/acetato de etila
(90:10; 80:20; 70:30 e 50:50). As substâncias sintetizadas foram visualizadas na
CCD através da luz UV de ondas curtas e longas.
Para a recristalização foram utilizados os solventes, etanol e clorofórmio.
A cromatografia em coluna (CC) foi realizada em coluna de vidro, utilizando a
sílica gel 60 (0,063-0,200mm) – Merck, como fase estacionária.
Para a cromatografia em baixa pressão foi utilizado o equipamento de
Cromatografia Flash Isolera Four - Biotage, Estados Unidos.
A extração reativa foi realizada através funil de separação, utilizando-se
clorofórmio e solução de HCl 10%.
O ponto de fusão das moléculas foi determinado diretamente através do
equipamento MQAPF-302 - Microquímica.
As análises espectrométricas no infravermelho foram realizadas em
espectrômetro de infravermelho por Transformada de Fourier - IR Prestige-21. As
amostras foram trituradas com brometo de potássio (KBr) e os espectros obtidos por
aquisição direta pela técnica de espectroscopia por refletância difusa no
infravermelho médio com transformada de Fourier (DRIFTS). O registro das
absorções foi feita em escala de centímetro recíproco (cm-1).
Os espectros de RMN 1H e RMN 13C foram obtidos através do equipamento
de espectrometria Bruker – Advance – DPT-300 - 300 MHz. Os deslocamentos
58
químicos foram expressos em valores adimensionais (δ = ppm) em relação ao
tetrametilsilano (TMS). Para a realização destas análises as amostras foram
dissolvidas em clorofórmio deuterado (CDCl3) ou acetona deuterada (CD3CO) As
constantes de acoplamento (J) foram expressas em Hertz (Hz). Os sinais foram
indicados como: s= simpleto; d= dupleto; dd= duplo dupleto; t= tripleto e m=
multipleto.
4.2 Síntese de chalconas
A escolha dos substituintes foi baseada no princípio de Topliss (TOPLISS,
1977) na tentativa de verificar uma possível relação entre a estrutura química e
atividade biológica.
As chalconas foram sintetizadas segundo uma derivação do método geral de
condensação aldólica de Claisen-Schmidt (CORRÊA et al., 2001; 2008). As
chalconas foram preparadas a partir de uma mistura equimolar de benzaldeídos
(substituídos ou não) e acetofenonas dissolvidos em etanol na presença de
hidróxido de sódio (Esquema 1). A mistura foi submetida à agitação magnética em
temperatura ambiente até a verificação do término da reação. A formação de
produtos foi monitorada por cromatografia em camada delgada utilizando como
eluente hexano:acetato de etila (80:20); ao término das reações os produtos foram
isolados. Quando necessário, as substâncias sintetizadas foram submetidas à
purificação por recristalização ou por métodos cromatográficos apropriados.
Esquema 1 - Esquema geral de reação de síntese para obtenção de chalconas
CH3
O
+H
O
R1
O
R1
NaOH / EtOH
Nota: R1 (CHH) = H; R
1 (CHM) = 4-CH3; R
1 (CHX) = 4-OCH3; R
1 (CHCl) =4-Cl; R
1 (CHDCl) = 3,4 Cl2,
R1 (CHNM) = 4-N(CH3)2; R
1 (CHOH) = 4-OH.
59
(2E)-1,3–difenilprop-2-en-1-ona (CHH)
Foram utilizados 2,91 mL (0,025 mmol) de acetofenona e 2,53 mL (0,025
mmol) de benzaldeído na presença de 5 mL (0,062 mmol) de hidróxido de sódio
50%, p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao término da
reação, monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner
com etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A caracterização da
molécula foi realizada através do ponto de fusão e espectro de infravermelho (Anexo
C), sendo identificado como (2E)-1,3–difenilprop-2-en-1-ona.
(2E)-3-(4-metilfenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHM)
Foram utilizados 2,91 mL (0,025 mmol) de acetofenona e 3,08mL (0,025
mmol) de tolualdeído na presença de 5 mL (0,062 mmol) de hidróxido de sódio 50%,
p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao término da reação,
monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner com
etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A caracterização da molécula
foi realizada através do ponto de fusão e espectro de infravermelho (Anexo C),
sendo identificado como (2E)-3-(4-metilfenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona.
(2E)-3-(4-metoxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHX)
Foram utilizados 2,91 mL (0,025 mmol) de acetofenona e 3,03 mL (0,025
mmol) de anisaldeído na presença de 5 mL (0,062 mmol) de hidróxido de sódio 50%,
p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao término da reação,
monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner com
etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A caracterização da molécula
foi realizada através do ponto de fusão e espectro de infravermelho (Anexo C),
sendo identificado como (2E)-3-(4-metoxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona.
60
(2E)-3-(4-clorofenil)-1-fenillprop-2-en-1-ona (CHCl)
Foram utilizados 2,91 mL (0,025 mmol) de acetofenona e 3,51g (0,025 mmol)
de 4-clorobenzaldeído na presença de 5 mL (0,062 mmol) de hidróxido de sódio
50%, p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao término da
reação, monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner
com etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A caracterização da
molécula foi realizada através do ponto de fusão e espectro de infravermelho (Anexo
C), sendo identificado como (2E)-3-(4-clorofenil)-1-fenillprop-2-en-1-ona.
(2E)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHDCl)
Foram utilizados 2,91 mL (0,025 mmol) de acetofenona e 4,37g (0,025 mmol)
de 3,4-clorobenzaldeído na presença de 5 mL (0,062 mmol) de hidróxido de sódio
50%, p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao término da
reação, monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner
com etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A caracterização da
molécula foi realizada através do ponto de fusão e espectro de infravermelho (Anexo
C), sendo identificado como (2E)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona.
(2E)-3-[4-(dimetilamino)fenil]1-fenilprop-2-en-1-ona (CHNM)
Foram utilizados 2,91 mL (0,025 mmol) de acetofenona e 2,91g (0025 mmol),
de 4-dimetilaminobenzaldeído na presença de 5 mL (0,062 mmol) de hidróxido de
sódio 50%, p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao término
da reação, monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de
Büchner com etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A
caracterização da molécula foi realizada através do ponto de fusão e espectros de
infravermelho e RMN1H e RMN 13C (Anexo B), sendo identificado como (2E)-3-[4-
(dimetilamino)fenil]1-fenilprop-2-en-1-ona.
61
(2E)-3-(4-hidroxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHOH)
Foram utilizados 2,91mL (0,025 mmol) de acetofenona e 3,053 g (0,025
mmol) de 4-hidroxibenzaldeído na presença de 9,92 mL (0,124 mmol) de hidróxido
de sódio 50%, p/v, dissolvidos em etanol (20 mL) sob agitação magnética. Ao
término da reação, monitorada por CCD, o precipitado formado foi filtrado em funil de
Büchner com etanol gelado e mantido em dessecador por 24 horas. A
caracterização da molécula foi realizada através do ponto de fusão e espectros de
infravermelho, RMN1H e RMN 13C (Anexo B), sendo identificado como (2E)-3-(4-
hidroxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona.
4.3 Síntese dos derivados pirimidínicos
Os derivados pirimidínicos foram sintetizados reagindo as chalconas iniciais
(CHH; CHM; CHX, CHCl; CHDCl, CHNM e CHOH) com cloridrato de guanidina e
hidróxido de sódio em etanol (Esquema 2), através da adaptação das técnicas
descritas por Chandrasekaran e Nagarajan (2005); Thanh e Mai (2009) e Bansal,
Chaudhary e Kothiyal (2013).
As moléculas foram obtidas em diferentes condições reacionais: temperatura
ambiente, refluxo e microondas. Para a síntese em reator de microondas foi utilizado
o equipamento CEM - Focused Microwave Synthesis Sistem, modelo Discover.
progresso das reações foi acompanhado por cromatografia de camada delgada
(CCD). Ao término da reação a mistura reacional foi vertida em gelo para a
precipitação do produto. Substâncias variando tons de amarelo a laranja conforme a
molécula foi obtida na forma sólida. Os sólidos foram filtrados a vácuo, sendo
lavados em água gelada durante a filtração e deixados em dessecador por um
período de 72 horas. As purificações foram realizadas através de recristalização em
clorofórmio ou cromatografia de coluna (CC) ou cromatografia automatizada de
baixa pressão ou extração reativa, conforme a necessidade de cada substância,
utilizando solvente adequado. Após o processo de purificação obteve-se cristais na
cor branca ou levemente amarelada. As moléculas foram caracterizadas por ponto
de fusão, IV e RMN-1H e RMN-13C (Anexo A).
62
O
R1 +
NH
NH2 NH2
NaOH
NN
NH2
R1ClH-
Esquema 2- Esquema geral de obtenção de aminopirimidinas derivadas de chalconas
Nota: R
1 (AMH) = H; R
1 (AMM) = 4-CH3; R
1 (AMX) = 4-OCH3; R
1 (AMCl) =4-Cl; R
1(AMDCl) = 3,4 Cl2;
R1 (CHNM) = 4-N(CH3)2; R
1 (CHOH) = 4-OH.
4.3.1 Síntese dos derivados pirimidínicos em temperatura ambiente
4,6-difenilpirimidin-2-amina (AMH)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4165 g (0,01 mmol) de
chalcona CHH. A mistura reacional foi mantida sob agitação até o término da reação
monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas. O produto final foi identificado como 4,6-
difenilpirimidin-2-amina.
4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4445 g (0,01 mmol) de
chalcona CHM. A mistura reacional foi mantida sob agitação até o término da reação
monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-
metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
63
4-(4-metoxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMX) Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4765 g (0,01 mmol) de
chalcona CHX. A mistura reacional foi mantida sob agitação até o término da reação
monitorada por CCD. . Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-
metoxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-(4-clorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMCl)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4854 g (0,01 mmol) de
chalcona CHCl. A mistura reacional foi mantida sob agitação até o término da reação
monitorada por CCD. . Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-
clorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-(3,4-diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMDCl)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,5543 g (0,01 mmol) de
chalcona CHDCl. A mistura reacional foi mantida sob agitação até o término da
reação monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a
precipitação do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi
filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi
identificado como 4-(3,4-diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
64
4-[4-(dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-2-amina (AMNM)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,5026 g (0,01mmol) de
chalcona CHNM. A mistura reacional foi mantida sob agitação por até o término da
reação monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a
precipitação do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi
filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi
identificado como 4-[4-(dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-(4-hidroxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina(AMOH)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 1,44 mL (0,09 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a agitação
magnética por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4485 g (0,01 mmol) de
chalcona CHOH. A mistura reacional foi mantida sob agitação por até o término da
reação monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a
precipitação do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi
filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi
identificado como 4-(4-hidroxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
4.3.2 Síntese dos derivados pirimidínicos em refluxo convencional
4,6-difenilpirimidin-2-amina (AMH)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4165g (0,01 mmol) de chalcona
CHH. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação monitorada
por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto
e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em
dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4,6-difenilpirimidin-2-
65
amina.
4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4445 g (0,01 mmol) de chalcona
CHM. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação monitorada
por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto
e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em
dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-metilfenil)-6-
fenilpirimidin-2-amina.
4-(4-metoxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMX) Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4765 g (0,01 mmol) de chalcona
CHX. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação monitorada
por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto
e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em
dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-metoxifenil)-6-
fenilpirimidin-2-amina.
4-(4-clorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMCl)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4854 g (0,01 mmol) de chalcona
CHCl. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação monitorada
por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto
e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em
dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-clorofenil)-6-
fenilpirimidin-2-amina.
66
4-(3,4-diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMDCl)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4854 g (0,01 mmol) de chalcona
CHDCl. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação
monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(3,4-
diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-[4-dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-2-amina (AMNM)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 0,72 mL (0,045 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,5026 g (0,01 mmol) de chalcona
CHNM. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação
monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-[4-
dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-(4-hidroxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMOH)
Foram adicionadas 0,5732 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 10 mL
de etanol e 1,44 mL (0,09 mmol) de hidróxido de sódio 50% submetendo a refluxo
por 2 horas. Após este período foi acrescentada 0,4485 g (0,01 mmol) de chalcona
CHOH. A mistura reacional foi mantida em refluxo até o término da reação
monitorada por CCD. Na sequência a reação foi vertida em gelo para a precipitação
do produto e mantida em geladeira por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e
mantido em dessecador por 72 horas e o produto final foi identificado como 4-(4-
hidroxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
67
4.3.3 Síntese dos derivados pirimidínicos em refluxo por reator de microondas
4,6-difenilpirimidin-2-amina (AMH)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,18 g (0,045 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2082 g (0,01 mmol)
de chalcona CHH. A mistura reacional foi mantida em refluxo por microondas, na
potência de 180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a
reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira
por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72
horas e o produto final foi identificado como 4,6-difenilpirimidin-2-amina.
4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,18 g (0,045 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2223 g (0,01 mmol)
de chalcona CHM. A mistura reacional foi mantida em refluxo por microondas, na
potência de 180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a
reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira
por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72
horas e o produto final foi identificado como 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-(4-metoxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMX)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,18 g (0,045 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2383 g (0,01 mmol)
de chalcona CHX. A mistura reacional foi mantida em refluxo por microondas, na
potência de 180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a
reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira
por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72
horas e o produto final identificado como 4-(4-metoxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
68
4-(4-clorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMCl)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,18 g (0,045 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2427 g (0,01 mmol)
de chalcona CHCl. A mistura reacional foi mantida em refluxo por, na potência de
180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a reação foi
vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira por 24 horas.
O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72 horas e o produto
final foi identificado como 4-(4-clorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina.
4-(3,4-diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMDCl)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,18 g (0,045 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2771 g (0,01 mmol)
de chalcona CHDCl. A mistura reacional foi mantida em refluxo por microondas, na
potência de 180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a
reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira
por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72
horas e o produto final foi identificado como 4-(3,4-diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-
amina.
4-[4-(dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-2-amina (AMNM)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,18 g (0,045 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2513 g (0,01 mmol)
de chalcona CHNM. A mistura reacional foi mantida em refluxo por microondas, na
potência de 180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a
reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira
por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72
horas e o produto final foi identificado como 4-[4-(dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-
2-amina.
69
4-(4-hidroxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMOH)
Foram adicionadas 0,286 g (0,03 mmol) de cloridrato de guanidina em 3 mL
de etanol e 0,36 g (0,09 mmol) de hidróxido de sódio submetendo a refluxo por
microondas por 5 minutos. Após este período foi acrescentada 0,2242 g (0,01 mmol)
de chalcona CHOH. A mistura reacional foi mantida em refluxo por microondas, na
potência de 180 watts, até o término da reação monitorada por CCD. Na sequência a
reação foi vertida em gelo para a precipitação do produto e mantida em geladeira
por 24 horas. O precipitado foi filtrado a vácuo e mantido em dessecador por 72
horas e o produto final foi identificado como 4-(4-hidroxifenil)-6-fenilpirimidin-2-
amina.
4.4 Relação Estrutura -Atividade - Método de Topliss
Foram sintetizadas sete moléculas para a série de chalconas e sete
respectivos derivados pirimidínicos. Todas as moléculas apresentavam anel
aromático na estrutura, apresentando os seguintes substituintes: H, 4-CH3, 4-OCH3,
4-Cl e 3,4-Cl2. (TOPLISS, 1977; CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES, 1993) e
também os substituintes 4-N(CH3)2 e 4-OH. Para a obtenção da série de chalconas
foram utilizados como reagentes os aldeídos: benzaldeído, 4-metoxialdeído, 4-
metilbenzaldeído, 4-clorobenzaldeído, 3,4-diclorobenzaldeído, 4-
dimetilaminobenzaldeído e o 4-hidroxibenzaldeído, salientando que as substituições
ocorreram no anel B das estruturas. As pirimidinas foram obtidas a partir da série de
chalconas. Todas as moléculas foram avaliadas in vitro quanto à inibição da
atividade das enzimas COX-1 e COX-2 sendo determinados os valores de CI50
(Concentração que inibe 50% da enzima) a fim de verificar uma possível relação
estrutura atividade biológica através da ordem de potência dos parâmetros
hidrofóbicos, eletrônicos e estéreos (Tabela 1).
70
Tabela 1- Ordem de potência para parâmetros físico-químicos proposta por Topliss
Substituintes Parâmetros físico-químicos de Topliss
π
2π-π2
σ
π+ σ
2π-σ
π-σ
π-2σ
π-3σ
Es
3,4-Cl2
1 1-2 1 1 1 1-2 3-4 5 2-5
4-Cl
2 1-2 2 2 2-3 3 3-4 3-4 2-5
4-CH3
3 3 4 3 2-3 1-2 1 1 2-5
4-OCH3
4-5 4-5 5 5 4 4 2 2 2-5
H
4-5 4-5 3 4 5 5 5 3-4 1
Fonte: Adaptado de TOPLISS, 1977
Após a obtenção da ordem de potência para a atividade biológica dos
derivados avaliados, foi possível compará-la com a ordem dos parâmetros
apresentados na Tabela 1, e desta forma verificar quais fatores interferem na
atividade relacionada. A tabela 2 apresenta a proposta de novos substituintes em
função dos parâmetros hidrofóbicos e eletrônicos, com a finalidade de obtenção de
novas moléculas mais ativas com consequente validação do método.
Tabela 2- Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos prováveis parâmetros mais ativos
Prováveis parâmetros mais ativos
Seleção de novos substituintes
π, π + σ, σ
3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2;
4-c-C5H9
π, 2π - σ, π - σ
4-CH(CH3)2; 4-c(CH3)3; 3,4(CH3)2;
4-O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2
π - 2σ, π - 3σ, σ
4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2;4-NHC4H9;
4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3, 4-OCH3
2π - π2
4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3-CH3;
3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl2
Fonte: Adaptado de TOPLISS, 1977
71
4.5 Análise "In silico": Cálculos teóricos computacionais
Os valores de massa molecular (MM), Log P, aceptores de ligação de
hidrogênio (N + O), doadores de ligação de hidrogênio (NH + OH), número de
violações e número de ligações rotacionais, foram obtidos a partir do programa free
molinspiration online, através do JME Editor, cortesia Ertl da Novartis, disponível no
site: http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties. Os dados de solubilidade,
TPSA, Drug likeness e Drug score foram obtidos através do programa OSIRIS
Property Explorer on line, disponível no site: http://www.organic-
chemistry.org/prog/peo.
4.6 Porcentagem de absorção
Analisando as opções de métodos e modelos, apresentados por Zhao e
colaboradores (2002), para a obtenção da porcentagem de absorção, optou-se pelo
método que utiliza o valor do TPSA e o modelo: %Abs = 109 - (0,354 x TPSA).
4.7 Avaliação da atividade inibitória para COX-1 e COX-2
As moléculas sintetizadas foram submetidas a ensaios in vitro para a
determinação da atividade inibitória para COX-1 e COX-2 através do kit para ensaio
imunoenzimático COX (ovine) Inhibitor Screening Assay Kit (no 560101, Cayman
Chemical, Ann Arbor, MI , EUA).
Os ensaios foram realizados no laboratório de Biologia Molecular pela
professora Karina Elisa Machado.
4.7.1 Preparo das amostras (inibidores e controles)
As moléculas sintetizadas e os controles foram dissolvidos em DMSO e
testados na concentração final de 100 µM. Todas as análises foram realizadas em
duplicata.
72
Para os controles foram selecionados indometacina e celecoxibe, inibidores
com atividade seletiva e conhecida para COX-1 e COX-2, respectivamente.
4.7.2 Avaliação da atividade inibitória "in vitro" da COX-1 e COX-2
As chalconas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl, CHNM, CHOH),
aminopirimidinas (AMH, AMM, AMX, AMCl, AMDCl, AMNM, AMOH) e controles
(Indometacina e Celecoxibe) foram dissolvidos em DMSO. Após dissolução foram
preparadas as soluções iniciais, na concentração de 100 µM/mL, através da adição
de 970 µL de solução tampão (0,1 M Tris-HCl pH 8,0 contendo 5 mM de EDTA e
2 mM de fenol), 10 µL das enzimas COX-1 ou COX-2, 10 µL de heme e 10 µL das
moléculas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl,CHNM, CHOH, AMH, AMM, AMX,
AMCl, AMDCl, AMNM, AMOH) ou dos controles (Indometacina e Celecoxibe).
A reação foi incubada por 5 minutos a 37°C, posteriormente foi adicionado
10 µL de ácido araquidônico (AA), na concentração de 100 mM. A reação foi
bloqueada após 2 minutos pela adição de 10 µL de ácido clorídrico (HCl), na
concentração de 1 M. Os tubos foram retirados do banho maria e adicionado a cada
um 20 µL de cloreto de estanho (SnCl2).
A ciclooxigenase catalisa o primeiro passo na biossíntese de ácido
araquidônico (AA) para prostaglandina H2 (PGH2). A prostaglandina F2α (PGF2α),
produzida a partir de PGH2, por redução com cloreto de estanho, é medida através
do ensaio Imunoenzimático (EIA) (Tabela 3). Este ensaio baseia-se na competição
entre as prostaglandinas (PG) e um conjugado PG-acetilcolinesterase (PG-marcado)
em uma quantidade limitada de anti-soro PG. A quantidade de um conjugado PG-
acetilcolinesterase, que é capaz de se ligar ao anti-soro PG, é inversamente
proporcional à concentração das PGs nos poços. Uma vez que a concentração do
conjugado PG-acetilcolinesterase é mantida constante, enquanto a concentração
das PGs testadas varia, conforme a capacidade de inibição de cada composto.
73
Tabela 3- Reagentes utilizados para a reação de EIA Poço Tampão EIA Padrão/Controle/
Amostra
Marcador
(Trace)
Antisoro
Branco (Blk) - - - -
Atividade Total
(TA)
- - 5 µL (passo de
desenvolvimento)
-
Ligações não
específicas (NSB)
100 µL - 50 µL -
Ligação Máxima
(B0)
50 µL - 50 µL 50 µL
Padrões/Controles/
Amostras
- 50 µL 50 µL 50 µL
A placa (Figura 8) foi elaborada com base nas instruções do fabricante, e
incubada por 18 horas protegida da luz, a temperatura ambiente e com agitação
constante.
Figura 8- Imagem ilustrativa da composição da placa utilizada no ensaio
Fonte: Adaptado de COX (ovine) Inhibitor Screening Assay Kit, 2014.
74
Durante a incubação o conjugado PG-acetilcolinesterase se liga ao anticorpo
monoclonal previamente ligado ao poço. A placa foi lavada e em seguida 200 µL do
Reagente de Ellman, que contém o substrato para a acetilcolinesterase, foi
adicionado ao poço. A leitura da reação foi realizada por ELISA a 405 nm, após 1
hora de incubação no escuro sob agitação (Figura 9).
A intensidade desta cor produzida foi diretamente proporcional à quantidade
de prostaglandinas presente nas amostras ou controles.
A porcentagem de inibição foi calculada pela comparação dos poços tratados,
com as moléculas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl, CHNM, CHOH, AMH, AMM,
AMX, AMCl, AMDCl, AMNM, AMOH) ou controles (Indometacina e Celecoxibe), com
a ligação máxima para COX-1 ou COX-2. A concentração que provoca 50% de
inibição (CI50 uM/mL) foi calculada para cada composto a partir da curva de resposta
(concentração-inibição). Os ensaios foram realizados em duplicata.
Figura 9- Imagem ilustrativa da reação de EIA
Fonte: Adaptado de COX (ovine) Inhibitor Screening Assay Kit, 2014.
75
4.8 Avaliação in vitro da citotoxicidade e dos efeitos das aminopirimidinas
AMM, AMX, AMOH e AMNM na produção de óxido nítrico em neutrófilos
estimulados com LPS in vitro.
Este experimento foi realizado no laboratório de Biologia Molecular pelo
professor José Roberto Santin.
4.8.1 Obtenção de Neutrófilos Migrados para o Peritônio
Foram injetados 3 mL de solução de glicogênio de ostra (1%, i.p.) para
estimular o recrutamento de leucócitos para cavidade peritoneal de camundongos
Swiss. Após um período de 4 horas, os animais foram novamente anestesiados e
exsanguinados por secção da artéria carótida. Em seguida, 3 mL de solução tampão
fosfato-salina (PBS) foram injetados na cavidade peritoneal e após suave
massagem, as células foram removidas com auxílio de pipeta Pasteur. As células
obtidas foram submetidas à centrifugação (600 g, 15 min, 4ºC) e o pellet formado foi
ressuspendido em 1 mL de meio DMEN suplementado com 10% de Soro Fetal
Bovino. A quantificação total de neutrófilos foi feita em câmara de Neubauer. Um
total de 1 x 106 neutrófilos foram adicionados por poço em placas de cultura de 96
poços, com volume final completado para 300 µL com meio DMEN, para obtenção
da cultura celular empregada nos ensaios descritos abaixo.
4.8.2 Viabilidade Celular
Para excluir possíveis efeitos citotóxicos dos compostos AMM, AMX, AMOH e
AMNM sobre neutrófilos, ensaios de viabilidade celular foram realizados. A
viabilidade foi determinada pelo teste de exclusão do corante azul de trypan. Células
viáveis são impermeáveis a este corante, uma vez que sua penetração na célula
indica a perda da integridade de sua membrana. Para tanto, neutrófilos foram
mantidos em cultura por 18 horas com incubação simultânea dos compostos e LPS
(5 µg/mL), em estufa de CO2 (atmosfera úmida, a 37 ºC 5% CO2). Vale ressaltar que
este foi o maior período de incubação empregado neste estudo. Após o período de
76
incubação, 10 µL de suspensão de neutrófilos foram acrescidos a 10 µL de azul de
trypan e a quantificação das células viáveis (não coradas) foi realizada em câmara
de Neubauer.
4.8.3 Determinação do Óxido Nítrico (NO)
O óxido nítrico (NO) foi indiretamente quantificado pela formação de seus
metabólicos nitrato (NO3-) e nitrito (NO2
-), utilizando-se a reação de Griess (GREEN
et al, 1982). Para a quantificação indireta da produção de NO, neutrófilos foram
mantidos em cultura por 18 horas com incubação simultânea dos compostos AMM,
AMX, AMOH e AMNM (1,10 e 100 μM) estimulados ou não com LPS (5 μg/mL), em
estufa de CO2. Após a incubação, a concentração de nitrito (NO2-) foi determinada
no sobrenadante das culturas de neutrófilos utilizando a reação de Griess (1% de
sulfanilamida com 0,1% de α-naftil etilenodiamida, preparado no momento do uso)
em placa de 96 poços. A reação de NO2- com esse reagente produz uma coloração
rósea, que foi quantificada por meio da leitura das densidades óticas. Após 10
minutos de incubação em temperatura ambiente, a absorbância de cada amostra foi
determinada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 550 nm. Curvas-
padrão com concentrações previamente conhecidas de NO2- (0 - 200 μM) também
tiveram as densidades óticas determinadas, permitindo a quantificação dos valores
de nitrito/nitrato, em μM, com auxílio da equação da reta.
4.9. Avaliação da Atividade Antinociceptiva
4.9.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos pesando entre 25 a 35 gramas,
aclimatados a temperatura de 22 ± 2 °C com ciclo claro /escuro de 12 horas
mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados com água e ração “ad libitum”. Os
animais permaneceram no ambiente do teste pelo menos 1 h antes da realização
dos experimentos para se adaptarem.
77
Os experimentos foram realizados pela aluna Karla Capistrano do Curso de
Farmácia da UNIVALI. Todos os experimentos foram realizados de acordo com os
princípios éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional
de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O presente projeto foi submetido
e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade do Vale do
Itajaí - UNIVALI (Protocolo CEUA/UNIVALI 041/15 (Anexo D).
4.9.2 Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
Os diferentes grupos de camundongos foram pré-tratados com os compostos
sintetizados pela via intraperitoneal (i.p.) na dose de 10 mg /kg. Os animais do grupo
controle receberam somente veículo (soro fisiológico e tween 80). Após 30 min foi
aplicado intraperitonealmente (i.p.) ácido acético (0,6 % (v/v), dissolvido em NaCl
0,9% (p/v) numa dose de 0,10 ml /10 g de peso (SOUZA et al., 2003). As contorções
foram quantificadas cumulativamente durante 20 minutos e o indicativo de
antinocicepção foi a redução da resposta nociceptiva à contorção, em relação ao
grupo controle. Basicamente as contorções abdominais consistem na contração da
musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das patas posteriores,
de acordo com o método descrito anteriormente (COLLIER et al, 1968).
4.10. Análise estatística
Os resultados obtidos no teste para avaliação da atividade inibitória sobre a
COX-1 e COX-2 foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM). O
ensaio foi realizado em duplicata. A análise estatística foi realizada utilizando-se a
análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste “t” de Bonferroni. Os
valores de p < 0,05 foram considerados significativamente estatísticos.
Os resultados obtidos no teste de determinação do óxido nítrico foram
expressos como a média ± erro padrão da média (EPM). Os dados apresentados
foram comparados pelo teste “t” de Student ou ANOVA. Foi utilizado o teste de
comparações múltiplas (Tukey) para determinar a significância das diferenças
calculadas entre os valores para a condição experimental. O software GraphPad
78
Prism 5.0 (San Diego, CA, EUA) foi utilizado. As diferenças foram consideradas
significativas para p < 0,05.
Os dados obtidos para os testes in vivo foram avaliados através do parâmetro
DI50 (dose que reduz a resposta para 50% em relação ao controle) os quais foram
apresentados como média geométrica acompanhada de seu respectivo limite de
confiança em nível de 95%. As análises estatísticas dos resultados foram realizadas
através do programa estatístico Graphpad Instat, por meio de análise de variância
seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnett.
Valores de p < 0,05 serão considerados como indicativos de significância. Os
valores de DI50 foram estimados a partir de experimentos individuais.
79
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese das chalconas
As chalconas foram sintetizadas, reagindo-se quantidades equimolares de
acetofenona com diferentes benzaldeídos, através de uma derivação do método
geral da reação de condensação aldólica de Claisen-Schmidt (CORREA et al.,
2001). O mecanismo destas reações ocorre em quatro etapas, conforme
apresentado no Esquema 3, para a obtenção da chalcona (CHH). Na primeira etapa
ocorre a remoção do próton do carbono metílico da acetofenona, promovido a partir
da ação catalítica do NaOH, ocorrendo a formação do íon enolato, que se torna
estável por ressonância. Na segunda etapa o íon enolato atua como nucleófilo
(carbânion) atacando o carbono da carbonila proveniente dos diferentes aldeídos
aromáticos, formando um alcóxido. Na terceira etapa o alcóxido remove um próton
de uma molécula de água para formar um aldol. Na quarta etapa, ocorre a remoção
do hidrogênio α devido à sua acidez, seguida da eliminação da hidroxila β formando
uma dupla ligação. A estrutura formada é estabilizada pela ressonância das duplas
ligações conjugadas.
Esquema 3 - Mecanismo de Reação de Condensação Aldólica
1a. Etapa
OH-
+
H
O
CH2-
O
CH2
O-
+ O
H
H
2a. Etapa
H
O
+CH2
-
O O-
O
80
Esquema 3 - Mecanismo de Reação de Condensação Aldólica (continuação)
3a. Etapa
O-
O
+ O
H
H
OH O
+ OH-
4a. Etapa
OH O
H H + OH-
OH O-
+ OH2
O
+ OH-
As chalconas sintetizadas estão descritas na literatura, e foram utilizadas
como intermediárias para a síntese das estruturas pirimidínicas. Na avaliação
biológica as chalconas foram testadas juntamente com os derivados pirimidínicos
com a finalidade de avaliar a atividade anti-inflamatória das moléculas e comparar os
resultados relacionando as alterações estruturais entre a chalcona e o seu
respectivo derivado pirimidínico. Os substituintes foram selecionados segundo o
método de Topliss a fim de verificar possível relação estrutura atividade biológica e
consequentemente direcionar sínteses posteriores, a partir da introdução de novos
substituintes a fim de sintetizar moléculas mais potentes que as iniciais.
Os valores de Rf apresentados na Tabela 4 foram calculados utilizando como
eluente hexano:acetato de etila (80:20). As chalconas foram purificadas através de
recristalização em etanol e a pureza foi acompanhada através de cromatografia de
camada delgada, sendo determinada por comparação dos pontos de fusão obtidos
com os dados fornecidos na literatura e teoricamente através do software Science
Finder. A síntese da série de chalconas foi realizada a temperatura ambiente. O
tempo reacional variou entre 4,5 a 36,4 horas com rendimentos entre 60,80 a
97,06%.
Os diferentes tempos de reação estão relacionados às propriedades dos
substituintes em doar ou sacar elétrons do anel aromático ocasionando alterações
na densidade eletrônica da carbonila tornando-a mais ou menos reativa. Os
substituintes com propriedades doadoras tornam a densidade eletrônica da carbonila
81
parcialmente positiva e desta forma menos reativa, o contrário ocorre quando os
substituintes têm propriedades sacadoras, tornando a densidade eletrônica da
carbonila parcialmente negativa, ou seja, mais reativa. Ao considerarmos apenas os
parâmetros fisico-químicos eletrônicos, a reação de formação da chalcona CHDCl
apresentou o menor tempo reacional, seguido da reação para formação da CHCl,
isto porque o átomo de cloro atua como sacador de elétrons tornando a carbonila
mais susceptível, o que facilita a reação e desta forma diminuindo o tempo reacional.
Para as chalconas CMX e CHM, analisando a influência dos substituintes no tempo
reacional, a metoxila é um grupo ativador moderado, ou seja, doador de elétrons,
dificultando a formação do produto final, principalmente quando comparado ao metil
que é um ativador fraco, sendo assim não foi observado um parâmetro eletrônico de
substituição tendo em vista que a chalcona CHX reagiu em tempo inferior a chalcona
CHM. Para as chalconas CHNM e CHOH o tempo reacional foi maior comparado
aos outros substituintes principalmente porque se trata de grupos que são fortes
ativadores o que dificulta a reação aumentando consequentemente o tempo de
formação do produto desejado. O grupamento hidroxila além de ser um forte ativador
do anel devido às características ácidas deste substituinte fez-se necessário utilizar
uma quantidade maior de hidróxido de sódio para que ocorresse a reação.
Tabela 4: Dados de obtenção da série de chalconas
Substituinte
R
Código Tempo
(h)
Rend.*
(%)
R.f. P.F **(oC)
Literatura***
P.F **(oC)
Obtida
H CHH 6,6 60,80 0,68 55,0-56,0 57,7-58,7
4-CH3 CHM 7,6 88,29 0,70 95,0-99,0 97,4-98,4
4-OCH3 CHX 11,5 97,06 0,63 79,0**** 74,2-75,2
4-Cl CHCl 5,3 79,39 0,71 113,0-115,0 111,8-113,5
3,4-Cl2 CHDCl 4,5 62,52 0,71 114,0-115,0 114,5-115,9
4-OH CHOH 36,4 93,75 0,24 183,0-184,0**** 200,5-202,0
4-N(CH3)2 CHNM 15,2 86,92 0,53 113,0-114,0**** 115,1-116,2
Nota: *Rendimento sem recristalização;** Ponto de Fusão;***SANTOS,2008;****Science finder
CH3
O
+H
O
R
O
RNaOH
A B
82
Avaliando os resultados da síntese de chalconas realizada por Santos (2008),
onde foram obtidas as mesmas moléculas, com exceção das moléculas CHOH e
CHNM, nas mesmas condições reacionais, observou-se que o tempo reacional
variou de 3,5 a 12 horas com rendimentos entre 68 e 95% e os valores do ponto de
fusão foram semelhantes. Desta forma podemos verificar pontos compatíveis com a
padronização da técnica.
São apresentados na sequência os dados das chalconas obtidas neste
trabalho:
(2E)-1,3–difenilprop-2-en-1-ona (CHH)
O
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C15H12O (208,25518 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 4.
IV vmax/cm-1 DRS/KBr: 3084,18 – 3024,38 (CH-Ar); 1664,57 (C=O); 1608,63 (C=C);
752,24, 688,59 (C-H arom mono-substituido)
(2E)-3-(4-metilfenil)-1-fenillprop-2-en-1-ona (CHM)
O
CH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C16H14O (222,28176 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 4.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3057,17 – 2914,44 (CH-Ar); 1654,92 (C=O); 1597,06 (C=C);
817,82 (C-H arom di-substituido); 752,24, 688,59 (C-H arom mono-substituido)
83
(2E)-3-(4-metoxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHX)
O
OCH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C16H14O2 (238,28116 g/mol).,demais dados apresentados na
tabela 4.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3057,17 – 2841,15 (CH-Ar); 1654,92 (C=O); 1598,99 (C=C);
825,53 (C-H arom di-substituido); 779,24, 690,52 (C-H arom mono-substituido)
(2E)-3-(4-clorofenil)-1-fenillprop-2-en-1-ona (CHCl)
O
Cl
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C15H11ClO (242,70024 g/mol),demais dados apresentados na
tabela 4.;
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3084,18 – 3034,03 (CH-Ar); 1654,92 (C=O); 1604,77 (C=C);
825,53 (C-H arom di-substituido); 775,38, 690,52 (C-H arom mono-substituido)
(2E)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHDCl)
O
Cl
Cl12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C15H10Cl2O (277,1453 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 4.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3084,18 – 3030,17 (CH-Ar); 1664,57 (C=O); 1608,63 (C=C);
812,03 (C-H arom tri-substituido); 771,53, 686,66 (C-H arom mono-substituido)
84
(2E)-3-(4-hidroxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHOH)
O
OH
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C15H12O2 (224,2545 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 4.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3215,34 (bl -OH); 3167,12 – 3020,53 (CH-Ar); 1649,14
(C=O); 1598,99 (C=C); 1219,01 (C-O); 835,18 (C-H arom di-substituido); 781,17,
690,52 (C-H arom mono-substituido)
RMN1H (CD3CO/TMS) δ dado em ppm: 8,94 (s, 1H, OH); 8,13 – 8,10 (d, 2H, H3/5);
7,79 – 7,74 (d,1H, J: 15,90 Hz, Hα); 7,74 – 7,52 (m, 5H, H2‟-6‟); 7,57 – 7,52 (d, 1H, J:
15,90 Hz, Hβ); 6,95 – 6,92 (d, 2H, H2/6).
RMN13C (CD3CO/TMS) δ dado em ppm: 189,9 (C=O); 160,9 (C4); 145,2 (C3/5); 139,6
(C1‟); 133,4 (C2‟,6'); 131,6 (C3‟/5‟); 129,53 (C2/6); 129,23 (C4‟); 127,7 (C1); 119,8 (C);
116,8 (C).
(2E)-3-[(4-dimetilamino)fenil]-1-fenilprop-2-en-1-ona (CHNM)
O
NCH3
CH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
Fórmula Molecular: C17H17NO (251,3229 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 4.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3086,11 – 2806,43 (CH-Ar); 1649,14 (C=O); 1597,06 (C=C);
85
1344,38, 1174,65 (C-N); 815,89 (C-H arom di-substituido); 777,31, 690,59 (C-H arom
mono-substituido)
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 8,01 – 7,99 (d, 2H, H3/5); 7,82 – 7,77 (d,1H, J:
15,60 Hz, Hα); 7,57 – 7,46 (m, 5H, H2‟-6‟); 7,37 – 7,31 (d, 1H, J: 15,60 Hz, Hβ); 6,73 –
6,70 (d, 2H, H2/6); 3,05 (s, 6H, CH3).
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 190,7 (C=O); 145,8 (C4); 139,1 (C1‟); 132,2
(C3,5); 128,8 (C2,6/2‟,6'); 130,4 (C2‟/6‟); 128,5 (C2/6); 128,3 (C3‟/5‟ e 4‟); 117,1 (C1); 112,0
(C); 40,2 (CH3).
5.2 Síntese das pirimidinas
As pirimidinas foram obtidas a partir das chalconas previamente sintetizadas
(CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl, CHNM e CHOH), utilizando cloridrato de guanidina
e hidróxido de sódio na proporção 1:3:4,5 e etanol como solvente. As moléculas
foram obtidas utilizando métodos de agitação magnética à temperatura ambiente,
refluxo convencional e refluxo por reator de microondas, através da adaptação das
técnicas descritas por Chandrasekaran e Nagarajan (2005); Thanh e Mai (2009) e
Bansal, Chaudhary e Kothiyal (2013).
As chalconas são precursores versáteis na síntese de estruturas
heterocíclicas. Agindo como um eletrófilo, as chalconas podem reagir com um
nucleófilo em uma adição de Michael. Em uma reação de ciclocondensação, as
chalconas podem reagir como um bi-eletrófilo o qual reage com um bi-nucleófilo,
sendo esta uma rota atrativa para a síntese de compostos heterociclos, como os
derivados pirazolínicos, oxopirimidinas, derivados piridínicos e outros heterociclos
(SUWITO et al, 2014)
Para a obtenção das pirimidinas derivadas de chalconas a partir da guanidina
como um bi-nucleófilo sugere-se que os mecanismos destas reações ocorram ou via
adição de Michael ou iniciando através do ataque a carbonila acílica.
Inicialmente foi necessário realizar uma reação de “ativação” do cloridrato de
guanidina para que tivesse seus grupos amino livres e, portanto nucleofílicos. Para
isto reagiu-se com NaOH em uma reação ácido-base, gerando a guanidina e NaCl.
86
Considerando a primeira hipótese esta reação ocorre a partir do ataque
nucleofílico do NH2 da guanidina ao carbono β da chalcona formando um
intermediário aniônico (etapa lenta da reação) o qual estabiliza a partir da abstração
do próton do nitrogênio formando o enolato.
Em seguida o outro grupo amino livre atua como nucleófilo e ataca o carbono
da carbonila formando um ânion alcóxido, o qual remove um próton do nitrôgenio,
formando um aminoálcool.
A hidroxila do aminoálcool é protonado pelo solvente gerando água como um
bom grupo de saída. A base (NaOH) abstrai o próton do nitrogênio para a formação
da dupla ligação. Este processo repete-se com o outro nitrogênio do heterociclo
formando outra dupla ligação e recuperando o próton do solvente. Esta estrutura se
tautomeriza de forma mais estável gerando a aminopirimidina (Esquema 4).
87
Esquema 4 - Proposta para o mecanismo de reação de formação do núcleo pirimidínico através da reação de Michael
O
R + NH
NH2NH2
R
O-
N+
NHNH2
HH
R
OH N
NHNH2
H
R
O N
NHNH2
H
R
NN+
NH
HH
H
O-
OH-
R
NN
NH
HH
O+
H
HOH-
R
NN
NH
H
H
+ OH2
OH-
R
NN
NH
+ H+
R
NN
NH
R
NN
NH2
H+
OH-
R= H; 4-CH3; 4-OCH3; 4-Cl e 3,4-Cl2
NH
NH2NH2 ClH. NaOH
NH
NH2NH2
+ NaCl + OH2
88
Outra possibilidade mecanística desta reação seria o ataque inicial do
nitrogênio nucleofílico sob a carbonila α, β insaturada formando um intermediário
tetraédrico o qual se estabiliza formando um aminoálcool. Este desidrata e gera uma
enamina através da migração da dupla ligação gerando um centro elétrofílico no
carbono β. O carbono eletrofílico é atacado pelo nitrogênio nucleofílico do grupo
amino livre ciclizando em um anel de seis membros, que se estabiliza por
desprotozação do nitrogênio gerando uma molécula de água. O meio básico (NaOH)
abstrai o próton do nitrogênio para a formação da dupla ligação. Esta estrutura se
tautomeriza de forma mais estável gerando a aminopirimidina (Esquema 5).
Esquema 5 - Proposta para a formação do núcleo pirimidínico através do ataque a carbonila acílica
O
R NH
NH2 NH2+ OH-
O-
N+
NH
NH2
H HR
OHH
OH-
OH-
OH-
OH-
OH2
R= H; 4-CH3; 4-OCH3; 4-Cl e 3,4-Cl2
N
OHR
HNH2
NH
N
O+
R
H NH2
NH
H H
N
R
HNH2
NH
+
NN+
R
NHH
H
H
NN
R
NH
H
H
NN
NH
H
R
NN
NH2
R
NH
NH2NH2 ClH. NaOH
NH
NH2NH2
+ NaCl + OH2
89
Os valores de Rf apresentados na Tabela 5 foram calculados utilizando como
eluente hexano:acetato de etila (70:30). As diferenças nos valores de Rf são
relacionadas à polaridade da molécula. Quanto mais polar, maior interação com a
sílica da placa, ou seja, menor a distância de migração e vice-versa. As pirimidinas
foram purificadas através de coluna cromatográfica utilizando como eluente a
mistura de hexano:acetato de etila em diferentes gradientes e a pureza foi
acompanhada através de cromatografia de camada delgada. A caracterização das
moléculas foi feita por comparação dos pontos de fusão obtidos com os dados
fornecidos teoricamente pelo programa Science Finder, IV, RMN-1H e RMN-13C.
A série de pirimidinas apresentou ponto de fusão com intervalos até dois
graus de diferença, caracterizando um bom grau de pureza das moléculas.
Comparando os pontos de fusão obtidos com os pontos de fusão teóricos pode-se
observar que somente a aminopirimidina AMH, apresentou valores do ponto de
fusão próximos aos valores teóricos, as outras moléculas, porém apresentaram
valores acima dos valores estipulados teoricamente, como as moléculas foram
caracterizadas por métodos espectroscópicos e confirmadas as estruturas, pode-se
sugerir que a diferença entre as pontos de fusão teórica e prática seja por diferenças
na conformação ou rearranjo espacial das moléculas após os processos de
purificação.
Tabela 5 – Dados de obtenção da série de aminopirimidinas
Substituinte
R
Código R.f. P.F**
Teórica***
(oC)
P.F**
Obtida
(oC)
H AMH 0,62 135,0-137,0 136,4-137,7
4-CH3 AMM 0,58 120,0-121,0 129,2-130,2
4-OCH3 AMX 0,49 159,0-161,0 179,9-181,7
4-Cl AMCl 0,64 147,0-149,0 163,9-164,5
3,4-Cl2 AMDCl 0,72 NF**** 181,8-183,2
O
R +
NH
NH2 NH2
NaOH
NN
NH2
R
90
4-OH AMOH 0,19 239,0-240,0 250,3-251,0
4-N(CH3)2 AMNM 0,46 140,0-142,0 170,9-172,0
Nota:**Ponto de Fusão ***Science finder; ****Não fornecido
Com o intuito de aperfeiçoar a técnica de obtenção de pirimidinas derivadas
de chalconas, comparando as condições reacionais e os rendimentos, as sínteses
foram realizadas em temperatura ambiente, em refluxo convencional e refluxo por
reator de microondas. Analisando os tempos reacionais apresentados na Tabela 6,
observa-se que para a síntese realizada por agitação magnética a temperatura
ambiente o tempo reacional variou entre 18,6 a 75,4 horas; nas condições de refluxo
convencional o tempo reacional variou entre 6,4 e 41 horas e nas condições de
refluxo por microondas entre 20 e 120 minutos. Em virtude do aumento da
temperatura nas condições de refluxo e microondas, era de se esperar que estas
reações apresentassem um tempo menor de reação comparado à reação em
temperatura ambiente. A temperatura está relacionada à agitação das moléculas.
Quanto mais calor, maior a agitação, pois com o aumento da temperatura no meio
reacional ocorre o aumento da energia cinética aumentando o número de choques
efetivos, diminuindo a energia de ativação e em consequência, o aumento da
velocidade da reação. Ao compararmos os tempos reacionais entre a técnica de
refluxo convencional e por microondas, podemos observar uma diferença
significativa entre elas. Na síntese realizada por refluxo convencional o aquecimento
ocorre por convecção, sem controle da temperatura ou pressão, enquanto que no
reator de microondas o aquecimento ocorre por irradiação, com a possibilidade de
controlar a temperatura, a pressão e a potência do equipamento. A irradiação de
microondas pode ser focada no meio de reação e transferir eficientemente a energia
diretamente para as espécies reagentes, ocorrendo o aquecimento de um modo
muito mais rápido, quando comparado com o aquecimento por convecção regular,
facilitando, assim, as transformações químicas pretendidas. Como resultado, muitas
reações orgânicas são realizadas usando energia de microondas, como cicloadição,
adições ao grupo carbonila, substituições eletrofílicas e síntese de heterociclos
(XAVIER et al, 2013).
Os diferentes tempos de reação entre as moléculas podem ocorrer devido às
propriedades dos substituintes em doar ou sacar elétrons do anel aromático,
91
semelhantemente como foi descrito para as chalconas. Salientando que o
grupamento hidroxila por ser um forte ativador do anel exigiu a adição de uma
quantidade extra de hidróxido de sódio no meio reacional.
Tabela 6 – Dados de rendimento e tempo reacional das aminopirimidinas obtidas por temperatura ambiente, refluxo convencional e refluxo por reator de microondas
Substituinte
R
Código Tempo
(h)
T.A.a
Rend.d
(%)
Tempo
(h)
Refluxob
Rend.d
(%)
Tempo
(min)
Microondasc
Rend.d
(%)
H AMH 23,4 34,37 19,2 30,39 40 39,71
4-CH3 AMM 36,8 37,12 22,0 43,94 20 39,13
4-OCH3 AMX 27,7 36,26 16,4 31,31 40 42,16
4-Cl AMCl 21,3 35,62 8,3 38,27 30 64,38
3,4-Cl2 AMDCl 18,6 37,00 6,4 35,21 20 36,78
4-N(CH3)2 AMNM 56,8 32,24 29,5 30,57 40 36,70
4-OH AMOH 75,4 12,69 41,0 18,41 120 27,53
Nota: a Temperatura Ambiente
b Refluxo Convencional
cRefluxo por microondas
d Rendimento Bruto
Durante a execução das reações foi possível observar diferenças
significativas no tempo e rendimento reacional, quando a guanidina e o hidróxido de
sódio em etanol reagiram primeiramente por um tempo determinado para cada
técnica, antes da adição da chalcona correspondente. Após algumas tentativas, foi
padronizado, o que chamamos de “ativação prévia da guanidina”, em 2 horas, 1 hora
e 5 minutos, para as condições em temperatura ambiente, refluxo convencional e
refluxo por microondas, respectivamente. Ao reagir com o hidróxido de sódio, a
guanidina que está na forma de cloridrato protona liberando o Cl- ficando na sua
forma molecular, formando NaCl e água. Desta forma a molécula de guanidina fica
com um par de elétrons livre para reagir com a chalcona adicionada posteriormente,
solubilizada em etanol.
O
R +
NH
NH2 NH2
NaOH
NN
NH2
R
92
Os rendimentos obtidos na síntese dos derivados pirimidínicos variaram entre
as técnicas de reação. Os resultados estão apresentados na Tabela 6. Para as
reações realizadas em temperatura ambiente os rendimentos obtidos ficaram entre
12,69% a 37,12%. Para as reações em refluxo convencional os valores de
rendimento obtido foram entre 18,41% a 43,94%, e para as reações em refluxo por
reator de microondas os valores de rendimento variaram entre 27,53% e 64,38%.
Como o tempo de reação e os rendimentos aparentemente não apresentaram
uma mesma relação para toda a série julgou-se válido avaliar individualmente cada
molécula relacionando-as com as técnicas de obtenção e assim verificar e comparar
os resultados.
Analisando a molécula AMH verifica-se que apesar da técnica por refluxo
convencional apresentar um tempo 4,2 horas menor que em temperatura ambiente,
o rendimento foi 6,98% menor que este. Na Figura 10 é possível observar que a
técnica de refluxo convencional apresentou uma quantidade maior de subprodutos
(o que diminui ainda mais o rendimento final) comparada à técnica de microondas e
temperatura ambiente.
Figura. 10. - Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMH para comparação visual entre técnicas de obtenção.
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano: acetato 70:30, em luz UV 254 nm; 360nm.
93
Sugere-se que devido o refluxo convencional utilizar aquecimento por um
período prolongado (19,2 horas), possa ser um motivo para gerar subprodutos, o
que acontece em menor proporção quando a reação ocorre por refluxo por
microondas, onde o aquecimento é mais rápido e menos duradouro. Comparado ao
refluxo convencional a reação no microondas aconteceu 30 vezes mais rápida com
rendimento 9,32% maior e comparado a reação em temperatura ambiente, a reação
no microondas ocorreu 40 vezes mais rápida com rendimento 5,34% maior.
Ao compararmos as técnicas para obtenção da molécula AMM pode-se
observar que houve uma diferença no tempo reacional de 14, 8 horas entre a técnica
em temperatura ambiente e em refluxo convencional e rendimento superior de
6,82%. Comparando as condições em temperatura ambiente com o refluxo por
microondas observa-se uma redução do tempo de reação de aproximadamente 110
vezes e rendimento 2,01% superior, e entre o refluxo convencional ao refluxo de
microondas observa-se uma diminuição no tempo reacional de 66 vezes, utilizando o
microondas, porém neste caso obteve-se um rendimento 4,81% inferior. Apesar do
rendimento menor, ao observar a Figura 11, nota-se que a formação de subprodutos
no microondas foi menor comparado às técnicas em temperatura ambiente e refluxo
convencional o que pode significar um rendimento semelhante ou maior, após
submeter às técnicas de purificação.
Figura 11.- Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMM para comparação visual entre técnicas de obtenção
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente ; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano:acetato 70:30, em luz UV 254 nm; 360nm.
94
Ao compararmos os tempos reacionais e os rendimentos para as técnicas de
obtenção da molécula AMX é possível verificar que entre as técnicas em
temperatura ambiente e refluxo convencional ocorre uma redução de 11,3 horas no
tempo reacional, porém com uma redução no rendimento bruto de 4,95%. Entre as
técnicas em temperatura ambiente e microondas ocorre uma redução no tempo de
reação em torno de 41,55 vezes com um rendimento 5,9% maior e entre as técnicas
de refluxo convencional e refluxo por microondas ocorre uma redução no tempo
reacional em torno de 24,6 vezes com um aumento do rendimento em 10,85%.
Analisando a Figura 12, nota-se a formação de subprodutos em todas as técnicas,
aparentando ser um pouco mais acentuada na condição de refluxo convencional.
Figura 12. - Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMX para comparação visual entre técnicas de obtenção
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente ; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano:acetato 70:30, em luz UV 254 nm; 360nm.
Para a AMCl, entre as técnicas de obtenção em temperatura ambiente e
refluxo convencional foi possível constatar uma redução de 13 horas no tempo
reacional com aumento de 2,65% no rendimento. Entre as técnicas em temperatura
ambiente e refluxo por microondas foi observado uma redução do tempo reacional
de 42,6 vezes com um aumento no rendimento de 28,76% um dos melhores
resultados obtidos e por fim entre as técnicas de refluxo convencional e microondas
foi possível obter uma redução de 16,6 vezes o tempo reacional com 26,11% de
95
aumento no rendimento bruto. Na Figura 13 é possível observar que aparentemente
uma menor quantidade de subprodutos ocorre na técnica de refluxo por microondas
comparado a temperatura ambiente e refluxo convencional.
Figura 13- Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMCl para comparação visual entre técnicas de obtenção
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente ; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano:acetato 70:30, em luz UV 254 nm; 360nm.
Para a AMDCl (Figura 14), o tempo reacional apresentou uma redução de
12,2 horas entre as técnicas em temperatura ambiente e refluxo convencional,
porém com decréscimo de 1,79% no rendimento. Entre as técnicas em temperatura
ambiente e microondas também ocorreu redução no rendimento de 0,22% e redução
no tempo de reação de 55,8 vezes. Já entre as técnicas de refluxo convencional e
microondas houve um acréscimo de 1,57% no rendimento com uma redução no
tempo reacional de 19,2 vezes. Aqui vale salientar a necessidade de experimentar
outras proporções de reagentes e condições reacionais relacionados ao tempo e
temperatura, a fim de obter um melhor rendimento, tendo em vista que o substituinte
-3,4Cl2 teoricamente torna o anel mais susceptível à reação, isto porque o átomo de
cloro atua como sacador de elétrons, o que facilita a reação e desta forma diminui o
tempo reacional.
96
Figura 14- Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMDCl para comparação visual entre técnicas de obtenção
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente ; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano:acetato 70:30, em luz UV 254 nm; 360nm..
Ao compararmos os dados obtidos para a molécula AMNM (Figura 15) é
possível verificar uma redução de 27,3 horas no tempo reacional entre as técnicas
em temperatura ambiente e refluxo convencional, porém com uma redução de
1,67% no rendimento. Entre as técnicas em temperatura ambiente e refluxo por
microondas verificou-se redução de 96 vezes o tempo reacional com acréscimo de
4,46% no rendimento. Foi possível constatar também um aumento no rendimento de
6,13% com redução de 44,25 vezes no tempo reacional, ao comparar as técnicas de
refluxo convencional e microondas.
Esta molécula em particular, apresentou muitas dificuldades para a
purificação em virtude dos subprodutos da reação. Pode-se observar o aparecimento
de um maior número de manchas na CCD durante o procedimento da coluna
cromatográfica do que na CCD inicial, o que nos leva a sugerir uma possível
interação da AMNM com a sílica durante o procedimento de separação. Esta
interação pode estar relacionada a uma reação ácido-base entre a sílica, com
propriedades ácidas e a molécula AMNM com característivas básicas.
97
Figura 15- Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMNM para comparação entre técnicas de obtenção
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente ; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano:acetato 70:30, em luz UV 254 nm; 360nm.
Para a molécula AMOH (Figura 16) foi observado uma diminuição de 34,4
horas no tempo reacional com aumento de 5,72% no rendimento entre as técnicas a
temperatura ambiente e refluxo convencional. Entre as técnicas a temperatura
ambiente e refluxo por microondas o tempo reacional foi 37,7 vezes mais rápido com
um acréscimo de 14,84% no rendimento. E por fim entre as técnicas de refluxo
convencional e por microondas, o tempo reacional foi reduzido 20,5 vezes com
aumento de 9,12% no rendimento.
A síntese para obtenção da AMOH foi bastante difícil em virtude das
características do substituinte hidroxila (-OH). Até que o ajuste da quantidade de
hidróxido de sódio fosse estabelecido, algumas tentativas de síntese não obtiveram
êxito. Pois a molécula apresenta característica anfótera, como o grupo amino (NH2)
básico e o grupo fenólico (Ar-OH) ácido, assim durante a reação em meio básico a
hidroxila fenólica consome parte da base sendo necessário aumentar a quantidade
de NaOH para que a reação ocorra, além disso ao terminar a reação é necessário
acidificar lentamente o meio para a precipitação do produto, cuidando para que o sal
do grupo amino não se forme novamente.
98
Figura 16- Imagem da placa de cromatografia em camada delgada (CCD) da aminopirimidina AMOH para comparação entre técnicas de obtenção
Legenda: P=Padrão; T=Temperatura ambiente ; R=Refluxo Convencional; M=Refluxo por microondas. Eluente: hexano:acetato 70:30 e 50:50 em luz UV 254 nm.
Ahmad e colaboradores (2012) realizaram a síntese de 2,4,6-
aminopirimidinas, através dos métodos convencional e microondas e compararam o
rendimento e o tempo reacional para obtenção dessas moléculas. Os rendimentos
obtidos foram de 35% a 49% e 44% a 56%, para o método convencional e
microondas, respectivamente sendo semelhantes aos rendimentos obtidos neste
trabalho. Cada técnica apresenta vantagens e desvantagens, sendo necessário
atentar para as características dos substituintes e principalmente para a formação de
subprodutos que possam reduzir muito o rendimento por conta de perdas durante o
processo de purificação. Não foram encontrados artigos relatando a obtenção de
aminopirimidinas em temperatura ambiente.
No intuito de caracterizar o perfil dos espectros obtidos, selecionou-se a
molécula 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM) para uma descrição mais
detalhada. Desta forma, no espectro de infravermelho apresentado na Figura 17,
verifica-se a presença de bandas de deformações axiais situadas em 3313,71 e
3199,91 cm-1, referentes ao N-H; estas bandas por se apresentarem na forma de
dupleto caracterizam a ligação N-H da amina primária. Na região de 3064,89 e
3034,03 observam-se os C-H aromáticos. Observam-se também bandas de vibração
de deformação axial das ligações do anel na região entre 1631,78 a 1452,40 cm-1,
99
devido a expansão e contração das ligações do anel. Bandas de absorção forte de
deformação axial C-N situa-se em 1365,60 e 1222,87 cm-1. A molécula apresenta
um anel di-substituído na posição 1,4 que pode ser identificado por uma banda em
821,68 e um anel mono-substituído que apresenta as bandas em 769,60 e 698,23
conforme descrito na literatura (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2006; LOPES;
FASCIO, 2004).
Figura 17 - Espectro de IV da 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM) (DRS/ KBr,cm-1)
No espectro de RMN1H (Figura 18), pode-se observar um simpleto em 2,42
ppm referente aos três hidrogênios do substituinte metila ligado ao anel p-substituído
que apresenta os seus sinais como um duplo dupleto, em 7,96 ppm, referente aos
hidrogênios H3/5 e 7,29 ppm, referente aos hidrogênios H2/6, com uma constante de
acoplamento (J) de 8,1 Hz para ambos (detalhe ampliado). O anel não substituído
apresenta seus sinais referentes aos H2'/6' como um multipleto de 8,05 - 8,02 ppm e
os H3'/4'/5' como tripletos sobrepostos em 7,48 ppm. Em 7,43 ppm observa-se um
NN
NH2
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
100
simpleto referente ao H5” do anel heterocíclico, e em 5,33 ppm outro simpleto
atribuído ao NH2.
Figura 18 - Espectro de RMN1H da 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM), (CDCl3, 300MHz)
No espectro de RMN13C (Figura 19), o sinal em 21,43 ppm refere-se ao
carbono do substituinte metila. Este anel p-substituído apresenta sinais de carbonos
em 127 ppm (C3/5); em 134,9 ppm (C4); em 129,5 (C2/6); 104,02 ppm observa-se o
C5", o anel não substituído apresenta os sinais de carbono em 137,9 ppm (C1'); em
130,4 (C4'); em 128,8 ppm (C3'/5') ppm e; 127,1 ppm (C2'/6'). O anel pirimidínico
NN
NH2
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
101
apresenta os sinais de carbono em 140,8 ppm (C1"); 163,8 ppm (C2"); 166,1 ppm
(C4"); 104,0 ppm (C5"); 166,2 ppm (C6").
Figura 19 - Espectro de RMN13C da 4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM), (CDCl3, 300MHz)
São apresentados na sequência os dados das pirimidinas derivadas de
chalconas obtidas neste trabalho:
NN
NH2
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
102
4,6-difenilpirimidin-2-amina (AMH)
NN
NH2
1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C16H13N3 (247,29452 g/mol). demais dados apresentados na
tabela 5.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3469,94, 3319,49, 3192,19 (NH2); 3064,89, 3043,67 (C-H
arom) 1600,92 – 1450,47 (C-H arom); 1363,67, 1234,44 (C-N arom); 765,74, 692,44
(C-H arom monosubstituido).
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 5,39 (s, 2H, NH2); 7,47 (s, 1H, H5‟) 7,49 –
7,51(m, 6H, H3/4/5 e H3'/4'/5'); 8,04 – 8,07(m, 4H, H2/6'e H2'/6');
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 166,2 (C4”/6"); 163,3 (C2"); 137,5 (C1/1"); 130,6
(C4/4"); 128,8 (C2,6/2‟,6'); 127,2 (C3,5/3‟,5); 104,3 (C5");
4-(4-metilfenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMM)
NN
NH2
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C17H15N3 (261,3211 g/mol). demais dados apresentados na
tabela 5.
IV vmax/cm-1 DRS/KBr: 3313,71, 3199,91 (NH2); 3064,89, 3034,03 (C-H arom)
1631,78 – 1452,40 (C-H arom); 1365,60, 1222,87 (C-N arom); 821,68 (C-H arom
disubstituido 1,4); 769,60, 698,73 (C-H arom monosubstituido).
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 2,42 (s, 3H, CH3); 5,33 (s, 2H, NH2); 7,97-7,94
(d, 2H, H3/5, J=8,1Hz), 7,28-7,30 (d, 2H, H2/6, J=8,1Hz); 8,05-8,02 (m, 2H, H2'/6'); 7,47-
7,50 (t, 3H, H3'/4'/5') 7,43 (s, 1H, H5);
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 166,2 (C6"); 166,1 (C4"); 163,6 (C2"); 140,8
103
(C1"); 137,9 (C1'); 134,9 (C4); 130,4(C4'); 129,5(C2/6); 128,8(C3'/5'); 127,1 (C2'/6'); 127,0
(C3/5); 104,0 (C5"); 21,4 (CH3).
4-(4-metoxifenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMX)
NN
NH2
OCH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C17H15N3O (277,3205 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 5..
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3363,86, 3325,28, 3197,98 (NH2); 3034,89, 3014,01 (C-H
arom) 1643,35 – 1516,65 (C-H arom); 1361,74, 1259,52 (C-N arom); 1031,92 (C-O)
821,68 (C-H arom disubstituido 1,4); 771,53, 686,66 (C-H arom monosubstituido).
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 3,88 (s, 3H, CH3); 5,22 (s, 2H, NH2); 6,99-
7,02 (d, 2H, H3/5, J=8,7 Hz); 7,41 (s,1H, H5'); 7,48 – 7,50 (t, 3H, H3'/4'/5'); 8,03-8,06 (d,
2H, H2/6, J=8,7Hz); 8,04 (m, 2H, H2'/6');
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 166,0 (C6"); 165,7 (C4"); 163,6 (C4); 161,1
(C2"); 137,9 (C1); 130,3 (C4'); 130,1 (C1'); 128,7 (C2/6); 128,6 (C3'/5'); 127,1 (C2'/6');
114,1 (C3/5); 103,6 (C5"); 55,4 (OCH3).
4-(4-clorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMCl)
NN
NH2
Cl
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C16H12ClN3 (281,73958 g/mol). demais dados apresentados na
tabela 5.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3493,09, 3313,71, 3192,19 (NH2); 3062,89, 3031,03 (C-H
104
arom) 1631,78 – 1492,90 (C-H arom); 1359,82, 1234,44 (C-N arom); 823,60 (C-H
arom disubstituido 1,4); 769,60, 690,02 (C-H arom monosubstituido).
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 5,23(s, 2H, NH2); 7,43-7,45 (d, 2H, H3/5,
J=9,0Hz); 7,48 (s, 1H, H5'); 7,49-7,51 (t, 3H, H3/'4'/5); 7,99-8,03 (d, 2H, H2/6,J=9,0 Hz);
8,04-8,06 (m, 2H, H2'/6');
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 166,5 (C6"); 164,9 (C4"); 163,6 (C2"); 137,6
(C1'); 136,36 (C1); 166,1 (C4); 130,6 (C4'); 128,9 (C2/6); 128,8 (C3'/5'); 128,4 (C2'/6');
127,1 (C3/5) ; 103,9 (C5").
4-(3,4-diclorofenil)-6-fenilpirimidin-2-amina (AMDCl)
NN
NH2
Cl
Cl
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C16H11Cl2N3 (316,18464 g/mol) demais dados apresentados na
tabela 5..
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3495,01, 3319,49, 3199,91 (NH2); 3069,79, 3032,30 (C-H
arom) 1625,99 – 1460,11 (C-H arom); 1352,10, 1228,66 (C-N arom); 821,68 (C-H
arom disubstituido 1,4); 775,38, 707,88 (C-H arom monosubstituido).
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 5,27 (s, 2H, NH2); 7,41 (s, 1H, H5'); 7,49-7,51
(t, 3H, H3'/4'/5'); 7,55-5,58 (d, 2H, H2‟/6, J=8,4Hz); 7,88-7,92 (dd, 1H, H5); 8,03-8,07 (m,
2H, H6); 8,19-8,20 (d, 1H, H2);
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 166,6 (C6"); 163,6 (C4"); 163,4 (C2"); 137,5
(C4); 137,2 (C3); 134,7 (C1); 133,2 (C1); 130,8 (C2); 130,7 (C5); 129,1 (C6); 128,8
(C3'/5'); 127,2 (C2'/6'); 126,2 (C4'); 103,9 (C5").
105
4-(2-amino-6-fenilpirimidin-4-il)fenol (AMOH)
NN
NH2
OH
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C16H13Cl2N3O (263,293 g/mol), demais dados apresentados na
tabela 5. .
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: 3508,54, 3400,50 (NH2); 3057,17 (C-H arom), 2881,65 –
2479,81 (bl -OH); 1602,85 – 1516,05 (C-H arom); 1363,67, 1232,51 (C-N arom);
1280,73 (C-O); 823,60 (C-H arom di-substituido 1,4); 771,53, 690,52 (C-H arom
mono-substituido).
RMN1H (CD3CO/TMS) δ dado em ppm: 6,04 (s, 2H, NH2); 6,94-6,98 (d, 2H, H2/6,
J=9,3Hz); 7,48-7,51 (t, 3H, H3'/4'/5'); 7,66 (s, 1H, H5'); 8,13-8,17 (d, 2H, H3/5, J=9,3Hz);
8,20-8,24 (m, 2H, H2'/6').
RMN13C (CD3CO/TMS) δ dado em ppm: 166,2 (C6"); 165,9 (C4"); 165,2 (C2"); 160,7
(C4); 138,9 (C1'); 131,0 (C4); 130,0 (C1); 129,6 (C3‟/5‟); 129,4(C2‟/6‟); 127,8 (C2/6); 116,2
(C3'/5'); 102,2 (C5").
4-[(4-dimetilamino)fenil]-6-fenilpirimidin-2-amina (AMNM)
NN
NH2
NCH3
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
Fórmula Molecular: C18H18N4 (290,362 g/mol), demais dados apresentados na tabela
5.
IV vmax/cm-1 DRS/ KBr: DRS/ KBr: 3479,58, 3280,92, 3157,57 (NH2); 3064,89 (C-H
arom) 1612,49 – 1519,91 (C-H arom); 1363,67, 1232,51 (C-N arom); 823,60 (C-H
106
arom disubstituido 1,4); 771,53, 690,52 (C-H arom monosubstituido).
RMN1H (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 3,05 (s, 6H, CH3); 5,37 (s, 2H, NH2); 6,75-6,78
(d, 2H, H2/6, J=9,0 Hz); 7,39 (s, 1H, H5”); 7,48-7,51 (t, 3H, H3'/4'/5'); 7,99-8,02 (d, 2H,
H3/5, J=9,0 Hz); 8,03-8,04 (m, 2H, H2'/6').
RMN13C (CDCl3/TMS) δ dado em ppm: 165,6 (C6"); 165,4 (C4"); 163,1 (C2"); 152,2
(C4); 137,9 (C1); 130,3 (C4‟); 128,8 (C3'/5'); 128,4 (C2'/6');127,1 (C2/6); 124,3 (C1); 111,8
(C3/5); 102,8 (C5"); 40,2 (CH3).
5.3 Análise computacional
Na avaliação "in silico" da predição das propriedades moleculares dos derivados
pirimidínicos sintetizados, foram calculados os parâmetros disponíveis a partir do
programa free Molinspiration online, onde foram obtidos os valores de massa
molecular (MM), Log P, aceptores de ligação de hidrogênio (N + O), doadores de
ligação de hidrogênio (NH + OH), número de violações e número de ligações
rotacionais. Os dados de solubilidade, TPSA, Drug likeness e Drug score foram
obtidos através do programa OSIRIS Property Explorer on line. Os valores de
porcentagem de absorção foram calculados através do método e modelo, descritos
por Zhao e colaboradores (2002). Todos os dados obtidos estão apresentados na
tabela 8.
Inicialmente, entre os parâmetros avaliados podem-se destacar os descritores
de Lipinski (massa molar, a qual não deve exceder 500 g/mol; o log P, cujo valor
limite é 5; e os grupos doadores (NH + OH) e aceptores (N + O) de ligação
hidrogênio, cujas somatórias não devem ultrapassar a 5 e 10, respectivamente)
(LIPINSKI et al, 2001).
Ao analisarmos os descritores de Lipinski apresentados na Tabela 7, é possível
observar que nenhuma das substâncias sintetizadas apresentou violações aos
parâmetros estabelecidos por Lipinski. O valor de MM variou entre 247,30 e 316,19
g/mol. O TPSA ficou entre 51,8 e 72 Å2 e o Log P entre 2,90 e 4,50. Além disso,
apresentaram 3 a 4 aceptores e 2 a 3 doadores de hidrogênio, o que faz com que
estas substâncias possuam boa permeação e biodisponibilidade adequadas a um
candidato a fármaco, sendo este dado apresentado por Bali e colaboradores (2012),
107
que afirmam que substâncias que apresentam baixa permeação e baixa absorção
possuem mais de 5 a 10 doadores e aceptores de hidrogênio, respectivamente.
Bakht e colaboradores (2010), afirmam que para o desenvolvimento de
moléculas com atividades terapêuticas, a biodisponibilidade é uma propriedade
importante.
Boa absorção intestinal, redução da flexibilidade molecular, baixo TPSA são
necessários para que a molécula em desenvolvimento seja biodisponível por via
oral. O valor de TPSA dá uma boa perspectiva sobre a absorção do fármaco que
inclui a absorção intestinal, biodisponibilidade e de penetração da barreira hemato-
encefálica (HASSAN, SHIREEN, MURALEEDHARAN, ABDUL MUJEED, 2015).
De acordo com Swathi e colaboradores (2013), o valor de TPSA inferior a 140 Å2
indica que a substância possui boa permeabilidade na membrana celular.
Além disso, o número de rotações (RB) é importante para as mudanças
conformacionais da molécula e para a ligação das moléculas aos receptores ou
canais. Para existir biodisponibilidade por via oral o RB deve ser menor ou igual à 10
(HASSAN, SHIREEN, MURALEEDHARAN, ABDUL MUJEED, 2015). Para as
moléculas analisadas, o RB ficou entre 2 e 3.
Em relação à solubilidade, a maioria dos fármacos comerciais tem geralmente
valor de Log S maior do que - 4.0 (HASSAN, SHIREEN, MURALEEDHARAN,
ABDUL MUJEED, 2015). Para os valores de Log S das pirimidinas estudadas,
verificou-se que estão entre -5,99 a -4,22, o que indica que são moléculas que não
possuem boa solubilidade em água devido ao caráter lipofílico. Porém, não é um
dado que comprometa a utilização destas substâncias como candidatos a fármacos
se compararmos os resultados das pirimidinas aos controles celecoxibe e
indometacina, que também apresentam valores negativos para solubilidade, -4,17 e
-5,40, respectivamente.
A porcentagem de absorção (% ABS) foi calculada de acordo com Zhao et al.
(2002), apresentando valores entre 83,51 e 90,66% , o que sugere uma ótima
absorção, pois Hassan e colaboradores (2015), consideraram uma boa absorção,
valores entre 55,22 e 73,75%.
Os valores positivos de drug likeness apontam que a substância contém
predominantemente fragmentos que estão frequentemente presentes em fármacos
comercializados, e poucos ou nenhum fragmento considerados não-fármacos
disponíveis (http://www.organicchemistry.org/prog/peo/) (ORGANIC CHEMISTRY
108
PORTAL, 2015; JME, 2015; HASSAN; SHIREEN; MURALEEDHARAN; ABDUL
MUJEED, 2015).
Avaliando a pontuação drug likeness, apresentada na Tabela 7, pode-se
observar que somente a pirimidina AMCl apresentou valor positivo, 0,17, para este
parâmetro. Os valores das demais substâncias variaram entre -2,79 a -0,82. Este
dado também é muito relativo e deve ser avaliado em conjunto com outros dados,
principalmente se observarmos a pontuação -8,11 do celecoxibe.
A pontuação drug score é um termo cumulativo, usado para avaliar o potencial
dos novos candidatos a fármacos, e combina: drug likeness, lipofilicidade,
solubilidade, peso molecular e risco de toxicidade para um valor numérico único. A
pontuação positiva indica a predominância das porções farmacofóricas na molécula
(HASSAN; SHIREEN; MURALEEDHARAN; ABDUL MUJEED, 2015). A série de
piridiminas avaliadas; têm uma pontuação de drug score positivo variando 0,26 a
0,50.
A análise in sílico também foi realizada na série de chalconas com intuito de
comparação dos resultados com os derivados pirimidínicos (Tabela 8). Para os
descritores de Lipinski, as chalconas não apresentaram nenhuma violação O valor
de MM variou entre 208,26 e 277,15 g/mol. O TPSA ficou entre 17,07 e 26,30 Å2 e o
Log P entre 3,53 e 4,52. Apresentaram 1 a 2 aceptores de hidrogênio e apenas a
chalcona CHOH apresentou 1 doador de hidrogênio, o que faz com que esta
chalcona possua melhores características de permeação e biodisponibilidade, desta
série.
Em relação ao número de rotações (RB) os resultados obtidos ficaram entre 3 e
4, o que confere biodisponibilidade por via oral. A solubilidade (Log S), das
chalconas comparada às pirimidinas apresentaram-se mais solúveis com valores
entre -5,31 a -3,54, e quatro substâncias apresentaram valores superiores a -4,0: a
chalcona sem substituição (CHH), -3,84, chalcona com substituinte metoxila (CHX) -
3,86, a chalcona com substituinte hidroxila (CHOH) – 3,54 e a chalcona com o
substituinte dimetilamina (CHNM) – 3,88. Caracterizando uma melhor solubilidade,
segundo Hassan e colaboradores (2015).
A porcentagem de absorção (% ABS) foi calculada de acordo com Zhao et al.
(2002), apresentando valores entre 95,79 e 102,95%.
Avaliando a pontuação drug likeness, apresentada na Tabela 8, pode-se
observar que a chalcona CHCl apresentou o melhor valor positivo, 1,49, valor muito
109
superior ao derivado pirimidínico que foi de 0,17 para este parâmetro. As chalconas
CHDCl, CHX e CHOH apresentaram os valores 0,87, 0,83 e 0,76 respectivamente.
A pontuação drug score das chalconas apresentou valores positivos que
variaram entre 0,15 e 0,71. Ao compararmos aos derivados pirimidínicos é possível
observar valores de drug score para as chalconas CHM, CHCl, CHDCl e CHOH
foram maiores.
Ao compararmos os dados in silico obtidos para a série de chalconas e
aminopirimidinas é possível observar o aumento da massa molar na série
pirimidínica em virtude da formação de mais um anel com consequente aumento do
volume molecular; as diferenças de lipofilicidade foram pequenas sendo as
aminopiridiminas mais lipossolúveis e consequentemente com menor solubilidade
em água (Log S) e maior porcentagem de absorção; as aminopirimidinas têm
características de serem mais bem absorvidas por via gastrointestinal por difusão
passiva do que as chalconas, tendo em vista terem maior número de doadores e
aceptores de hidrogênio, parâmetro relacionado a esta característica.
Em relação às ligações rotacionais as chalconas são mais flexíveis do que as
aminopirimidinas correspondentes, tendo em vista que com a formação do anel
pirimidínico a molécula “perde” uma ligação rotacional tornando-se mais rígida. Ao
compararmos os valores de TPSA entre as chalconas e aminopirimidinas
correspondentes observa-se um aumento nos valores, o que é esperado, pois as
aminopirimidinas são mais polares e este parâmetro está relacionado com a área de
superfície polar total. Boa absorção intestinal, redução da flexibilidade molecular e
baixo TPSA são necessários para que a molécula em desenvolvimento seja
biodisponível por via oral. O valor de TPSA também dá uma boa perspectiva quanto
à penetração da barreira hemato-encefálica (HASSAN et al, 2015).
Avaliando os resultados de Drug likeness foi possível observar que a maioria
das aminopirimidinas apresentou uma menor pontuação do que a chalcona
correspondente, exceto as aminopirimidas AMH e AMNM, que apresentaram valores
maiores. O conceito de Drug Likeness pode ser entendido como compostos que
possuem grupos funcionais e/ou têm propriedades físicas parecidas com a maioria
dos fármacos conhecidos. Essas propriedades, principalmente lipofilicidade,
distribuição eletrônica, características de ligação hidrogênio, tamanho e flexibilidade
molecular e a presença de características farmacofóricas influenciam o
comportamento da molécula em um organismo vivo, incluindo fatores envolvidos nas
110
regras de ADMET. A pontuação Drug score, considera os valores de Drug likeness,
Log P; Log S; peso molecular e riscos de toxicidade e os combina em um valor
global de um potencial novo candidato a fármaco. (ORGANIC CHEMISTRY
PORTAL,2015 ; HASSAN et al, 2015).
Todas as moléculas sintetizadas apresentaram valor positivo de drug score
indicando a presença de grupos farmacofóricos, ou seja, características de fármacos
potenciais.
111
Tabela 7 - Propriedades "in silico" de solubilidade e permeabilidade das aminopirimidinas
R(Cód.)
Descritores de Lipinski
TPSA
(Å2)
Vol.
(Å3)
RB
%
ABS
Solub
LogS
Drug
likeness
Drug
Score
MM (g/mol)
N+O NH+OH Log P Viol.
H(AMH) 247,30 3 2 3,29 0 51,8 229,84 2 90,66 -4,52 -1,68 0,42
4-CH3 (AMM) 261,33 3 2 3,63 0 51,8 246,40 2 90,66 -4,86 -2,79 0,36
4-OCH3 (AMX) 277,33 4 2 3,22 0 61,0 255,38 3 87,40 -4,53 -0,84 0,47
4-Cl (AMCl) 281,75 3 2 3,89 0 51,8 243,37 2 90,66 -5,25 0,17 0,47
3,4-Cl2 (AMDCl) 316,19 3 2 4,50 0 51,8 256,91 2 90,66 -5,99 -0,82 0,32
4-OH (AMOH) 263,30 4 3 2,90 0 72,0 237,85 2 83,51 -4,22 -0,91 0,50
4-N(CH3)2 (AMNM) 290,37 4 2 3,48 0 55,05 275,74 3 89,51 -4,55 -1,42 0,26
Celecoxibe 381,38 5 2 3,61 0 77,99 298,65 4 81,42 -4,17 -8,11 0,37
Indometacina 343,77 5 1 4,13 0 68,54 286,44 3 84,73 -5,40 9,41 0,56
MM=massa molar; N+O= Somatório de N e O (aceptores de ligação hidrogênio); NH+OH= Somatório de NH e OH (doadores de ligação de hidrogênio); LogP=Logarítimo do Coeficiente de Partição; Viol: Violações; TPSA= Área de superfície polar total; Vol= Volume Molecular; RB=ligações rotacionais; %ABS=porcentagem de absorção;; Solub.LogS=Solubilidade. Fonte: Valores calculados nos programas Molinspiration e OSIRIS
112
Tabela 8 - Propriedades "in silico" de solubilidade e permeabilidade das chalconas
R(Cód.)
Descritores de Lipinski
TPSA
(Å2)
Vol.
(Å3)
RB
%
ABS
Solub
LogS
Drug
likeness
Drug
Score
MM (g/mol)
N+O NH+OH Log P Viol.
H(CHH) 208,26 1 0 3,30 0 17,07 201,85 3 102,9 -3,84 -2,88 0,25
4-CH3 (CHM) 222,29 1 0 3,65 0 17,07 218,41 3 102,9 -4,18 -0,94 0,48
4-OCH3 (CHX) 238,29 2 0 3,23 0 26,30 227,40 4 99,68 -3,86 0,83 0,32
4-Cl (CHCl) 242,70 1 0 3,91 0 17,07 215,39 3 102,9 -4,58 1,49 0,62
3,4-Cl2 (CHDCl) 277,15 1 0 4,52 0 17,07 228,92 3 102,9 -5,31 0,87 0,48
4-OH (CHOH) 224,26 2 1 3,33 0 37,30 209,87 3 95,79 -3,54 0,76 0,71
4-N(CH3)2 (CHNM) 251,33 2 0 3,91 0 20,31 247,76 4 101,8 -3,88 -3,31 0,15
Celecoxibe 381,38 5 2 3,61 0 77,99 298,65 4 81,42 -4,17 -8,11 0,37
Indometacina 343,77 5 1 4,13 0 68,54 286,44 3 84,73 -5,40 9,41 0,56
MM=massa molar; N+O= Somatório de N e O (aceptores de ligação hidrogênio); NH+OH= Somatório de NH e OH (doadores de ligação de hidrogênio); LogP=Logarítimo do Coeficiente de Partição; Viol: Violações; TPSA= Área de superfície polar total; Vol= Volume Molecular; RB=ligações rotacionais; %ABS=porcentagem de absorção;; Solub.LogS=Solubilidade. Fonte: Valores calculados nos programas Molinspiration e OSIRIS
113
A estimativa de riscos potenciais relacionados à toxicidade através da
avaliação dos fragmentos das estruturas, também podem ser obtidos através do
OSIRIS property explorer. São avaliados a mutagênicidade, a tumorigenicidade,
efeitos irritantes e efeitos no sistema reprodutivo. O software verifica a existência de
fragmentos na molécula que sejam susceptíveis de causar toxicidade. O
conhecimento preliminar dos riscos de toxicidade é essencial no domínio da
concepção de medicamentos (HASSAN et al, 2015). As chalconas,
aminopirimidinas, indometacina e celecoxibe também foram avaliadas para este
parâmetro, os dados estão apresentados na tabela 9.
Tabela 9 - Resultados do estudo "in sílico" para a presença de fragmentos tóxicos da série de chalconas e pirimidinas
Moléculas Mutagênico Tumorigênico Irritante Sistema reprodutor
Indometacina
Celecoxibe
CHH
CHM
CHX
CHCl
CHDCl
CHOH
CHNM
AMH
AMM
AMX
AMCl
AMDCl
AMOH
AMNM
Legenda Sem Toxicidade Médio Risco para Toxicidade
Alto Risco para Toxicidade
114
A chalcona sem substituição (CHH) apresentou fragmento com alto risco para
mutagenicidade. O fragmento tóxico (Figura 20) com esta característica está
relacionado à ligação insaturada do fragmento enona, tanto que no derivado
pirimidiníco correspondente com a formação do anel, o risco mutagênico deixa de
existir.
Figura 20 - Fragmento mutagênico presente na estrutura da chalcona CHH
Fonte: ORGANIC CHEMISTRY PORTAL, 2015
A chalcona com substituinte metoxila (CHX) apresentou fragmentos de alto
risco para efeitos irritantes e médio risco para efeitos no sistema reprodutor. De
acordo com o programa Osiris Property Explorer, o fragmento da molécula
responsável pela toxicidade está na ligação do carbono e a dupla ligação com o
oxigênio (carbono da carbonila) demonstrado na Figura 21. Ao observarmos o
derivado correspondente, não há fragmentos tóxicos em virturde da formação do
anel pirimidínico. Neste caso o programa não considerou a ligação insaturada como
um fragmento mutagênico.
115
Figura 21- Fragmentos irritante e efeitos sobre o sistema reprodutor presente na estrutura da chalcona CHX
Fonte: ORGANIC CHEMISTRY PORTAL, 2015
A chalcona CHNM apresentou fragmentos de alto risco mutagênico e
tumorigênico. Ao analisarmos a Figura 22, é possível observar que o responsável
pela mutagenicidade é a ligação insaturada da fração enona e o fragmento
tumorigênico está relacionado ao substituinte dimetilamino, à ligação entre o
nitrogênio e a metila. Com a formação do anel pirimidínico no derivado AMNM
116
(Figura 23), a fração enona deixa de existir juntamente com o risco mutagênico
permanecendo somente o risco tumorigênico do substituinte. Nas demais chalconas,
embora possua a porção enona insaturada, os substituintes introduzidos no anel B
da chalcona diminuiram ou anularam o efeito tóxico observado nas chalconas CHH e
CHNM.
Figura 22 - Fragmentos mutagênico e tumorigênico presentes na estrutura da chalcona CHNM
Fonte: ORGANIC CHEMISTRY PORTAL, 2015
117
Figura 23 – Fragmento tumorigênico referente ao substituinte presente na estrutura da aminopirimidina AMNM
Fonte: ORGANIC CHEMISTRY PORTAL, 2015
Avaliando os dados de toxicidade obtidos in silico e comparando os dados
das chalconas e os respectivos derivados pirimidínicos pode-se observar que a
avaliação teórica dos derivados sugere uma maior segurança destes compostos
quanto aos riscos toxicológicos. É importante ressaltar que a avaliação da toxicidade
in silico é apenas uma predição sendo necessária a continuidade dos estudos para a
comprovação destes resultados.
5.4. Ensaio de Inibição da ciclooxigenase (COX) in vitro
A ciclooxigenase é a enzima limitante da velocidade na síntese de
prostaglandinas durante o processo inflamatório. Os níveis de prostaglandinas, em
especial a prostaglandina G2 (PGG2), são muitas vezes utilizados para avaliação da
atividade da ciclooxigenase (BASILE et al, 2012). A COX-1 e COX-2 são enzimas
que catalisam a conversão do ácido araquidônico em PGG2 (por via da atividade da
ciclooxigenase), a subsequente conversão de PGG2 e PGH2 e a redução de PGH2 a
PGF2α (por via da atividade da peroxidase).
118
A atividade das moléculas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl, CHNM, CHOH,
AMH, AMM, AMX, AMCl, AMDCl, AMNM, AMOH) e dos controles (Indometacina e
Celecoxibe) foi realizada utilizando o ensaio imunoenzimático EIA (que avalia a
PGF2α) e os resultados encontram-se na Figura 24.
Figura 24 - Percentual de inibição das enzimas COX-1 e COX-2, frente às moléculas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl, CHNM, CHOH, AMH, AMM, AMX, AMCl, AMDCl, AMNM, AMOH) e controles (Indometacina e Celecoxibe) na concentração de 100µM.
Nota:A atividade foi avaliada utilizando o ensaio imunoenzimático EIA (COX Inhibitor Screening Assay Kit). Cada ponto representa a média ± EPM de dois experimentos. Diferença estatisticamente significante em relação ao grupo controle (branco). * p<,0,5 e ** <0,01 e *** <0,001, utilizando ANOVA one way e post teste t de Bonferroni.
Como pode ser observada na Figura 24, a maioria das moléculas
apresentaram potencial de inibição tanto para a enzima COX-1 quanto para COX-2,
comparados aos respectivos brancos (controle negativo).
Como controles foram utilizados a indometacina, que apresentou 90,70% de
inibição para COX-1 e 37,98% para COX-2 e o Celecoxibe que apresentou 4,30% de
inibição para COX-1 e 74,98% para COX-2, caracterizando assim os controles mais
seletivos para COX-1 e COX-2, respectivamente.
Para COX-1 as moléculas da série das chalconas apresentaram os seguintes
resultados: CHX (66,79%), CHM (66,00%), CHNM (65,87%), CHDCl (55,94%), CHH
(48,32%),CHCl (47,96%) e CHOH (14,59%). As aminopirimidinas apresentaram os
Bra
nco
Indom
etac
ina
Cel
ecoxi
beCHH
CHM
CHX
CHCl
CHDCl
CHM
N
CHOH
AM
H
AM
MAM
X
AM
Cl
AM
DCl
AM
NM
AM
OH
0
20
40
60
80
100
120
***
***
***
***
***
**
******
***
***
**
***
**
***
** **
******
***
*********
***
***
Cox 1
Cox 2
Moléculas (100 µM)
Inib
ição
Co
x (
%)
119
seguintes resultados em relação a inibição da atividade de COX-1: AMNM (84,25%);
AMH (46,73%), AMCl (24,82%), AMM(18,8%), AMX (17,47%), AMDCl (11,50%) e
AMOH (6,65%). Os valores apresentados pelas moléculas CHOH, AMDCl e AMOH,
não foram significativamente estatísticos, podendo estar relacionada a uma maior
seletividade COX-2.
Para COX-2 as chalconas apresentaram os seguintes resultados de inibição:
CHDCl (86,43%), maior que o controle Celecoxibe (74,67%); CHX (67,03%); CHH
(58,20%), CHM (12,71%), CHNM (11,26%), CHCl (4,39%) e CHOH (3,93%). Os
valores de CHM, CHCl, CHNM e CHOH não foram estatisticamente significativos. As
aminopirimidinas apresentaram os seguintes valores para inibição COX-2: AMH
(57,27%), AMNM (52,25%), AMX (42,23%), AMCl (33,54%), AMDCl (29,25%), AMM
(20,35%) e AMOH (14,69%).
Com esses resultados, foi possível calcular o CI50 (µM/mL), que é a
concentração da molécula que inibe 50% da atividade enzimática, os valores estão
descritos na Tabela 7. Para COX-1 o valor de CI50 dos controles foi 0,01548 µM/mL
e 0,16318 µM/mL, para a indometacina e celecoxibe respectivamente. Para as
chalconas os resultados variaram entre 0,08101 µM/mL e 0,22728 µM/mL, sendo
mais efetivas as moléculas CHNM (0,08101 µM/mL), CHCl (0,08478 µM/mL); CHX
(0,08544 µM/mL ) e CHM (0,08915 µM/mL ), com valores bastante próximos. As
aminopirimidinas apresentaram valores entre 0,03237 µM/mL e 0,27135 µM/mL,
sendo as moléculas mais efetivas, AMNM (0,03237 µM/mL) e AMH (0,12851µM/mL).
Para COX-2, os controles indometacina e celecoxibe apresentaram os valores
0,04226 µM/mL e 0,09841 µM/mL, respectivamente. Os valores de CI50 para as
chalconas também estão descritos na Tabela 10 e variaram entre 0,02915 µM/mL e
0,20253 µM/mL, sendo mais efetivas as moléculas CHH (0,02915 µM/mL), CHNM
(0,05129 µM/mL), CHCl (0,05723 µM/mL), CHOH (0,06733 µM/mL) e CHM (0,07364
µM/mL), com valores menores que o controle celecoxibe. Os valores de CI50 COX-2,
para as aminopirimidinas variaram entre 0,02511 µM/mL e 0,07618 µM/mL, toda a
série apresentou resultados mais efetivos que o controle celecoxibe, sendo a
molécula AMH, sem substituintes, a mais efetiva (0,02511 µM/mL).
Analisando os resultados de CI50 para COX-2 entre as chalconas e seus
correspondentes pirimidínicos é possível verificar um aumento na efetividade destes
demonstrado na diminuição dos valores de CI50., com exceção da molécula AMNM.
120
O aumento da efetividade pode estar relacionada a modificação estrutural, tendo em
vista que as aminopirimidinas derivadas de chalconas são estruturas tricíclicas.
O índice de seletividade COX-2 é obtido ao dividir o valor de CI50 COX-1 pelo
valor de CI50 COX-2. Os valores do índice de seletividade das chalconas e
aminopirimidinas estão descritos na Tabela 10.
O celecoxibe é um fármaco com estrutura tricíclica e com conhecida
seletividade COX-2 com valor para este experimento de 1,6581648. Os valores de
seletividade para as chalconas variaram entre 0,5528069 e 5,0785591. A chalcona
sem substituintes (CHH) foi a mais seletiva com valor 5,0785591, bem superior ao
controle. A chalcona CHOH foi a segunda mais seletiva com valor 3,3756126 e a
chalcona CHDCL apresentou menor valor de seletividade, 0,5528069. Relacionado
aos valores de CI50, quanto maior o valor para COX-1 e menor para COX-2, mais
potente para a COX-2 é a substância.
Ao compararmos os índices de seletividade das chalconas e seus respectivos
derivados é possível relacionar o aumento da seletividade com a modificação
estrutural. Este dado fica evidente ao compararmos o índice de seletividade da
molécula CHDCl, a menos seletiva entre as chalconas, com seu derivado AMDCl o
mais seletivo entre as aminopirimidinas. Este dado corrobora as afirmações de
Zargui e Arfael (2011) de que quando é feita uma comparação estrutural entre os
AINEs seletivos para COX-2 e AINEs não seletivos, a composição estrutural que
confere a seletividade para COX-2 é caracterizada por moléculas tricíclicas que
apresentam um anel central hetero ou carbocíclico diaril substituído.
As demais aminopirimidinas apresentaram índice de seletividade superior a
chalcona relacionada, com exceção da molécula AMNM. Com valor 0,4249146. Isto
se deve ao fato de esta molécula ser bastante efetiva tanto para COX-1 quanto para
COX-2. A molécula AMDCl foi a mais seletiva, com valor 6,4733928, seguida da
molécula AMM, com valor 6,1294330.
121
Tabela 10- Valores das CI50 e SI para as moléculas (CHH, CHM, CHX, CHCl, CHDCl,CHNM, CHOH, AMH, AMM, AMX, AMCl, AMDCl, AMNM e AMOH).
Moléculas Cox 1
CI50 µM/mL
Cox 2
CI50 µM/mL
SI
Indometacina 0,01548 0,04226 0,3663038
Celecoxibe 0,16318 0,09841 1,6581648
CHH 0,14804 0,02915 5,0785591
CHM 0,08915 0,07364 1,2106192
CHX 0,08544 0,10181 0,8392102
CHCl 0,08478 0,05723 1,4581391
CHDCl 0,11196 0,20253 0,5528069
CHNM 0,08101 0,05129 1,5794501
CHOH 0,22728 0,06733 3,3756126
AMH 0,12851 0,02511 5,1178813
AMM 0,27135 0,04427 6,1294330
AMX 0,17817 0,03025 5,8899173
AMCl 0,15922 0,03425 4,6487591
AMDCl 0,21045 0,03251 6,4733928
AMNM 0,03237 0,07618 0,4249146
AMOH 0,24174 0,06327 3,8207681
Nota: CI50= Concentração da molécula requerida para produzir 50% inibição / SI = Indice de Seletividade (COX-1 CI50/COX-2 CI50)
Ao analisar o padrão de substituição proposto por Topliss (TOPLISS, 1977),
constata-se que os parâmetros hidrofóbicos e eletrônicos não estão relacionados à
atividade biológica destas moléculas. De acordo com a Tabela 1, para que a
atividade biológica esteja relacionada aos parâmetros estéreos, hidrofóbicos e/ou
eletrônicos faz-se necessário seguir uma ordem de potência determinada. Avaliando
a ordem dos valores de CI50 para a COX-2 das aminopirimidinas, que retrata a
potência das moléculas em inibir 50% da atividade da enzima, observa-se que a
molécula mais potente é a AMH, sem substituição, seguida da molécula AMX, com
substituinte 4-OCH3; AMDCl, com substituinte 3,4-Cl2., AMCl, com substituinte 4-Cl
por fim a AMM, com substituinte 4-CH3 , o que não segue a ordem de potência
122
determinada para os parâmetros hidrofóbicos e eletrônicos propostos por Topliss,
sugerindo que parâmetros estéreos estejam relacionados, pois a AMH, sem
substituição, sendo a mais potente segue a ordem de potência determinada para
estes parâmetros.
Os parâmetros estéreos estão relacionados à presença de um átomo ou
grupo ligante volumoso em uma molécula podendo dificultar o seu contato sob uma
determinada orientação espacial com outra molécula, ou sítio ativo, dificultando ou
tornando inviável uma possível reação entre estas. Além disso, a proximidade
desses mesmos átomos pode levar a uma alteração da geometria da mesma
visando estabelecer um sistema com a menor energia possível (ELIEL; WILEN,
1994).
Apesar de o modelo chave-fechadura ser útil na compreensão dos eventos
envolvidos no reconhecimento molecular ligante-receptor, caracteriza-se como uma
representação parcial da realidade, uma vez que as interações entre a
biomacromolécula (receptor) e a micromolécula (fármaco) apresentam
características tridimensionais dinâmicas. Dessa forma, o volume molecular do
ligante, as distâncias interatômicas e o arranjo espacial entre os grupamentos
farmacofóricos compõem aspectos fundamentais na compreensão das diferenças na
interação fármaco-receptor (BARREIRO; FRAGA, 2008).
Armelin (2010) ao realizar estudos de modelagem molecular com derivados
pirimidínicos e estudos de docking nas enzimas COX-1 e COX-2, constatou que de
uma forma geral a orientação das conformações escolhidas dos compostos no sítio
da COX-2 envolve a formação de ligações de hidrogênio entre os resíduos His90 e
Arg513 do bolso lateral da COX-2, com a porção SO2-CH3 e entre os resíduos
Arg120 e Tyr 355 com os grupos substituintes do anel pirimidínico CF3, Cl,
Se-CH2CH3, SO2- CH2CH3 e OH. As moléculas que apresentaram os resultados
mais favoráveis para a formação do complexo com a COX-2 são apresentados na
Figura 25, tais ligantes tiveram um padrão bem definido de orientações interagindo
com os resíduos His 90, Arg513, Arg120 e Tyr355 e se orientam de maneira
semelhante. Os anéis fenil, tiofenil, cicloxil e pirimidínico interagem com os resíduos
Tyr385, Met522, Val523, Ala527 e Ser530.
Em relação a seletividade COX-2, ao compararmos as estruturas da Figura 21
com as estruturas obtidas neste trabalho espera-se que o grupo amino livre das
aminopirimidinas sintetizadas possam interagir no sítio receptor através de ligações
123
NH
N
N
SO2CH3
CF3
SNH
N
N
SO2CH3
CF3
S
Cl(2)
NH
N
N
SO2CH3
Cl
S
(15)
(17)
NH
N
N
SO2CH3
S
(22)
NH
N
N
SO2CH3
O
S
CH2CH3
(23)
hidrogênio e que as moléculas por serem menores e mais rígidas tenham um
posicionamento mais específico no sítio receptor.
Figura 25 – Derivados Pirimidínicos utilizados nos estudos de Armelin (2010)
Fonte: Adaptado de ORJALES (2008); ARMELIN (2010)
5.5 Avaliação in vitro da citotoxicidade e dos efeitos das aminopirimidinas
AMM, AMX, AMOH e AMNM na produção de óxido nítrico em neutrófilos
estimulados com LPS in vitro.
A determinação da viabilidade celular tem por objetivo verificar o potencial
citotóxico das aminopirimidinas selecionadas a partir da avaliação da integridade da
membrana celular dos leucócitos. A técnica do azul de trypan baseia-se na
permeabilidade das células viáveis, pois uma vez que o corante azul de trypan não é
permeável em células viáveis cujas membranas estão íntegras, consegue permear
124
as células inviáveis (mortas), corando o citoplasma e núcleo em azul, sendo
posteriormente visualizado e quantificado por microscopia óptica, em câmera de
Neubauer (HEBEDA et al, 2011).
Após tratamento e incubação dos neutrófilos com as moléculas em estudo,
pode-se verificar (Figura 26) que as concentrações de 1, 10 e 100 µM, não
provocaram morte celular nas condições basais e nas condições estimuladas por
LPS. A viabilidade celular em condições basais manteve-se entre 90% e 99% e em
condições estimuladas por LPS entre 84% e 99%. Este dado é importante, pois
possibilitou concluir que os demais resultados deste estudo não refletiam
citotoxicidade dos compostos.
Figura 26 – Efeito das aminopirimidinas AMM, AMX, AMOH e AMNM, na viabilidade celular de neutrófilos peritoneais através do Azul de Trypan
Nota: Neutrófilos foram incubados na presença e na ausência de LPS (5 µg/mL) com AMM, AMX,
AMOH e AMNM, nas concentrações de 1, 10 e 100 µM por um período de 18 horas. A viabilidade foi
quantificada por Azul de Trypan através da avaliação por microscopia óptica. Os resultados foram
expressos como a média ± o erro padrão da média das células obtidas de 3-6 animais.
Para investigar a capacidade das moléculas AMM, AMX, AMNM e AMOH em
modificar a secreção de óxido nítrico (NO), neutrófilos peritoneais foram estimulados
ou não por LPS, e tratados com as moléculas selecionadas. O LPS é um
lipopolisacarídeo encontrado na parede celular de bactérias gram-negativa e é
capaz de desencadear uma resposta inflamatória a partir da ativação de receptores
tipo Toll (TRLs) que são expressos na membrana celular de neutrófilos. Após a
ativação específica do TLR4 pelo LPS, ocorre a ativação de vias inflamatórias,
principalmente a via do NF-κB, a qual desempenha um importante papel regulador
na expressão de genes pró-inflamatórios, além de estimular a expressão da enzima
Basal 1 10 100 1 10 100 1 10 100 1 10 1000
30
60
90
120 Basal LPS
AMM (M) AMX (M) AMOH (M) AMNM (M)
via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
)
125
iNOS, a qual é responsável pela produção de óxido nítrico (ALESSANDRI et al,
2013). Os níveis de nitrito (NO2-) foram quantificados nos sobrenadantes celulares e
analisando a Figura (27), observa-se que a concentração de nitrito (NO2-) em
condições basais e tratadas não apresentaram alterações significativas, mantendo-
se próximas da condição basal, ou seja, os compostos provavelmente não atuam
inibindo a via intracelular de produção de óxido nítrico.
Figura 27 – Efeito das aminopirimidinas AMM, AMX, AMOH e AMNM na secreção de Óxido Nítrico (NO) por neutrófilos de peritônio estimulados ou não por LPS
Nota: Neutrófilos foram incubados por 18 horas em meio de cultura basal ou com LPS (5µg/mL)
simultaneamente com cada molécula nas concentrações 1,10 e 100µM ou o controle. Os níveis de
NO2- foram determinados através da Reação de Griess. Os resultados foram expressos como a média
± desvio padrão da média, de células obtidas de 3-6 animais. Os dados foram comparados pelo teste
t de Student ou ANOVA. Teste de comparações múltiplas de Tukey foi utilizado para determinar a significância das diferenças entre os valores calculados para as condições experimentais. Software GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA, EUA) foi utilizado.*P<0,05, **P<0,01 e *** P<0,001 de acordo com o respectivo controle basal; #P<0,01 se acordo com o respectivo controle estimulado por LPS.
No entanto, assim como o aumento na síntese e liberação do NO, já é bem
estabelecido em processos inflamatórios, existe também a síntese e liberação de
outros importantes mediadores os quais tem a função principal de amplificar o
processo inflamatório, com destaque para as citocinas pró-inflamatórias. Dentre as
citocinas pró-inflamatórias, destacam-se o TNF-α e a IL-1β que possuem papel
preponderante em diversas doenças de caráter inflamatório. O TNF-α e a IL-1β,
induzem a produção/liberação de outras citocinas e quimiocinas, expressão de
moléculas de adesão, angiogênese e medeiam efeitos inflamatórios sistêmicos,
como a febre, a hipotensão além de promoverem a neutrofilia (HEBEDA et al, 2011).
Desta forma, para a melhor elucidação dos efeitos anti-inflamatórios das
moléculas selecionadas faz-se necessária à realização de outros ensaios
Basal 1 10 100 1 10 100 1 10 100 1 10 1000
30
60 Basal LPS
AMM (M) AMX (M) AMOH (M) AMNM (M)
***
NO
2-(
M/m
L)
126
relacionados à secreção de fatores pró-inflamatórios como o do fator de necrose
tumoral (TNF-α), prostaglandina E2 (PGE2), entre outros, a fim de direcionar o
provável mecanismo de ação.
5.6 Avaliação da atividade antinociceptiva
Uma análise preliminar das aminopirimidinas foi realizada no intuito de
observar os efeitos analgésicos em comparação aos fármacos utilizados na clínica
médica, como AAS, paracetamol e dipirona.
O modelo do ácido acético tem atuação indireta através da liberação de
mediadores endógenos envolvidos na modulação da nocicepção, incluindo a
bradicinina, serotonina, histamina e as prostaglandinas (WHITTLE,1964). Ribeiro e
colaboradores (2000) mostraram que a nocicepção induzida pelo ácido acético
depende da liberação de citocinas, como a IL-1b, TNF-α e a IL-8 a partir de
macrófagos e basófilos residentes na cavidade abdominal, e que em conjunto com
outros mediadores podem induzir a nocicepção característica observada nesse
modelo.
A atividade antinociceptiva foi avaliada na série de aminopirimidinas
derivadas de chalconas, através da realização da DI50 no modelo de contorções
abdominais induzida pelo ácido acético 0,6% administrado intraperitonialmente nas
doses 3,0 mg/kg, 6 mg/kg e 10,0 mg/kg. Embora este seja um modelo de
nocicepção pouco específico, permite avaliar a atividade antinociceptiva tanto a nível
central quanto periférico (SOUZA, et al.;2003). O modelo de contorções abdominais
tem sido empregado amplamente para análise da atividade analgésica de diferentes
tipos de compostos, uma vez que mostra boa correlação com a ação analgésica
encontrada em outros modelos pré-clínicos, bem como estudos clínicos (CAMPOS-
BUZZI et al., 2006; COSTA, et al., 2007).
As aminopirimidinas apresentaram percentagem de inibição de 50,8% a
67,6% na dose de 10mg/kg (Figuras 28 a 34 e Tabela 11). Estes valores quando
comparados ao AAS, paracetamol e a dipirona, fármacos utilizados na terapêutica,
cujas inibições são de 38%, 35% e 33% respectivamente na mesma dose, foram
superiores (SANTOS, 2008).
127
Considerando os substituintes propostos por Topliss (H, 4-CH3, 4-OCH3, 4-
Cl e 3,4-Cl2), a molécula mais efetiva foi a AMM, com substituinte 4-CH3, que
apresentou um percentual de inibição de 67,6% e DI50 de 22,5 (19,8 - 25,6) µmol/kg
(Figura 28), sendo aproximadamente 6 vezes mais potente que os fármacos
utilizados na clínica como o Ácido Acetil Salicílico (AAS), o Paracetamol e a Dipirona
que possuem valores de DI50 de 133 (73-243) µmol/kg , 125 (104-150) µmol/kg 162
(88-296) µmol/kg, respectivamente (SANTOS, 2008).
Figura 28 - Efeito da aminopirimidina AMM administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett.
Apesar da molécula AMCl, com substituinte 4-Cl, ser a segunda molécula
mais potente apresentando um valor de DI50 22,9 (17,24 - 350,52) µmol/kg (Figura
29), apresentou uma percentagem de inibição 60,2%, sendo menos efetiva que a
molécula AMH, sem substituinte, que apresentou 62,7% de inibição e DI50 24,95
(18,36 - 33,89) µmol/kg (Figura 30), sendo cerca de 6 e 5 vezes mais potente do que
o AAS, respectivamente.
42,4% ** 49,7%
** 67,6%
**
DI50
= 5,88 (5,17 - 6,69) mg/kg
22,5 (19,8 - 25,6) µmol/kg
128
Figura 29 – Efeito da aminopirimidina AMCl administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett.
Figura 30 - Efeito da aminopirimidina AMH administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett
A molécula AMX (Figura 31), com substituinte 4-OCH3, apresentou 61,4%
de inibição e DI50 28,81 (25,17 - 32,99) µmol/kg, seguido da molécula AMDCl (Figura
DI 50 = 6,17 (4,54 - 8,38) mg/kg 24,95 (18,36 - 33,89) µmol/kg
37,0% **
50,21% **
62,7%
**
DI 50 = 6,47 (4,86 - 8,60) mg/kg 22,9 (17,24 - 350,52) µmol/kg
34,8% **
47,4% **
60,2% **
129
32) com 50,8% de inibição e DI50 29,0 (23,84 - 35,29) µmol/kg, sendo
aproximadamente 5 vezes mais potentes do que o AAS.
Figura 31 - Efeito da aminopirimidina AMX administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett.
Figura 32 - Efeito da aminopirimidina AMDCl administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando
comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett.
DI 50 = 9,17 (7,54 - 11,16) mg/kg 29,0 (23,84 - 35,29) µmol/kg
43,6% **
45,2% **
50,8% **
DI 50
= 7,99 (6,98- 9,15) mg/kg
28,81 (25,17 - 32,99) µmol/kg
19,1% *
41,7% **
61,4% **
130
Foram testadas também as moléculas com os substituintes 4-N(CH3)2
(AMNM) e 4-OH (AMOH). A molécula AMNM (Figura 33), apresentou-se mais
potente, com resultado para DI50 15,0 (10,4 - 21,6) µmol/kg e efetividade de 59%,
sendo 9 vezes mais potente que o AAS. A molécula AMOH (Figura 34), apresentou
os valores para DI50 26,36 (23,43 - 29,70) µmol/kg e efetividade de 56,5%, sendo 5
vezes mais potente que o AAS.
Figura 33 - Efeito da aminopirimidina AMNM administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett.
41,1% ** 53,9%
** 59,0% **
DI 50 = 4,36 (3,03 - 6,27) mg/kg 15,0 (10,4 - 21,6) µmol/kg
131
Figura 34 - Efeito da aminopirimidina AMOH administrada em 3 concentrações 3,6 e 10 mg/kg pela via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo ácido acético
Nota: Cada coluna representa uma média de 6 animais por experimento e as barras verticais indicam o EPM (erro padrão médio). Asteriscos indicam diferenças significativas (**p<0,05) quando comparados com o grupo controle, utilizando-se ANOVA seguida do teste Dunnett
Tabela 11 – Dados comparativos do efeito antinociceptivo da série de aminopirimidinas administradas em 3 concentrações 3, 6 e 10 mg/kg pela via intraperitonial no modelo de dor induzida pelo ácido acético
--R (Cod.) Concentrações DI 50
3,0 mg/kg 6,0 mg/kg 10,0 mg/kg mg/kg µmg/kg
4-CH3 (AMM) 42,4 49,7 67,6 5,88 22,5
4-Cl (AMCl) 34,8 47,4 60,2 6,47 22,9
4-H (AMH) 37,0 50,21 62,7 6,17 24,95
4-OCH3 (AMX) 19,1 41,7 61,4 7,99 28,81
3,4-Cl2 (AMDCl) 43,6 45,2 50,8 9,17 29,0
4-N(CH3)2 (AMNM) 41,1 53,9 59,0 4,36 15,0
4-OH (AMOH) 25,6 48,9 56,5 6,94 26,36
Como é possível observar, de acordo com a seleção de substituintes proposto
por Topliss, apresentado na Tabela 1, a correlação entre as estruturas químicas e a
atividade antinociceptiva encontrada não está relacionada com efeitos eletrônicos ou
hidrofóbicos, apenas com efeitos estéreos.
DI 50 = 6,94 (6,17 - 7,82) mg/kg 26,36 (23,43 - 29,70) µmol/kg
25,6% **
48,9% ** 56,5%
**
132
133
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
Foram obtidas 2 séries de substâncias: 1 série de chalconas e 1 série de
aminopirimidinas derivadas das chalconas da série 1. As chalconas foram obtidas
através do método de condensação aldólica e os derivados pirimidínicos foram
obtidos através da ciclização da porção cetônica α, β insaturada, contemplando
entre outros, os derivados sugeridos por Topliss no anel derivado do aldeído.
A reação para obtenção das chalconas foi realizada em temperatura
ambiente, com rendimentos entre 60,80% e 97,06%. As chalconas foram
recristalizadas em etanol e caracterizadas por ponto de fusão e espectroscopia de
infravermelho, obtendo-se as moléculas propostas para este estudo, com alto grau
de pureza.
A reação para obtenção dos derivados pirimidínicos foi realizada em
temperatura ambiente, refluxo convencional e refluxo por microondas. Os
rendimentos variaram entre 12,69% e 37,12%; 18,41% e 43,94% e 27,53% e
64,38%, respectivamente. Através da reação em microondas obteve-se uma
redução de até 110 vezes no tempo de obtenção dos produtos, comparada às outras
técnicas e com rendimento superior em até 28,76%.
A técnica realizada em temperatura ambiente mostrou-se uma boa opção em
relação ao refluxo convencional, por apresentar rendimentos semelhantes e menor
formação de subprodutos, não sendo encontrada descrição desta técnica na
literatura.
As moléculas obtidas foram purificadas através de coluna cromatográfica e
caracterizadas por ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho e ressonância
magnética nuclear de hidrogênio e carbono, comprovando-se a obtenção da série de
derivados propostos, com alto grau de pureza.
Avaliando os resultados da Análise computacional é possível concluir:
As chalconas e derivados pirimidínicos foram avaliados "in silico" quanto as
propriedades de biodisponibilidade, permeabilidade e absorção segundo a
regra dos 5 de Lipinski, não apresentando violações a regra, além de boa
134
porcentagem de absorção e pontuação positiva para drug score, sendo
características importantes para os fármacos protótipos.
Os fragmentos com propriedades tóxicas estão mais relacionados à porção
enona das chalconas CHH e CHNM que ao reagir formando o derivado
pirimidínico perde o potencial tóxico o que sugere uma maior segurança
destes compostos quanto aos riscos toxicológicos. É importante ressaltar que
a avaliação da toxicidade é apenas uma predição sendo necessários maiores
estudos para a comprovação- deste resultado. Contudo, ressalta o perfil
promissor desses compostos para estudos experimentais mais aprofundados.
No ensaio in vitro para avaliar a ação de chalconas e derivados pirimidínicos
sobre a inibição da atividade COX-1 e COX-2, concluiu-se:
A maioria das moléculas apresentou algum potencial de inibição tanto para a
enzima COX-1 quanto para COX-2, comparados aos respectivos brancos
(controle negativo);
Os melhores resultados de inibição da COX-1 da série de chalconas foram:
CHX (66,79%), CHM (66,00%), CHNM (65,87%),
Os melhores resultados de inibição da COX-1 da série de aminopirimidinas
foram: AMNM (84,25%); AMH (46,73%), AMCl (24,82%);
Para COX-2, as chalconas que apresentaram os melhores resultados de
inibição foram: CHDCl (86,43%), maior que o controle Celecoxibe (74,67%);
CHX (67,03%) e CHH (58,20%);
As aminopirimidinas que apresentaram os melhores resultados para COX-2
foram: AMH (57,27%), AMNM (52,25%), AMX (42,23%);
Os valores de CI50 da COX-2, para as aminopirimidinas variaram entre
0,02511 µM/mL e 0,07618 µM/mL, toda a série apresentou resultados mais
efetivos que o controle celecoxibe, sendo a molécula AMH, sem substituintes,
a mais efetiva (0,02511 µM/mL).
135
Os derivados pirimidínicos em sua maioria apresentaram-se mais potentes e
mais seletivos comparados às respectivas chalconas, em especial as
moléculas: AMDCl, AMM, AMX e AMH.
A molécula AMNM não apresentou seletividade COX-2. Isto se deve ao fato
de esta molécula ser bastante efetiva tanto para COX-1 quanto para COX-2.
Em relação à avaliação in vitro da citotoxicidade e dos efeitos das
aminopirimidinas AMM, AMX, AMOH e AMNM na produção de óxido nítrico em
neutrófilos estimulados com LPS, é possível concluir:
As moléculas em estudo não provocaram morte celular nas condições basais
e nas condições estimuladas por LPS. A viabilidade celular em condições
basais manteve-se entre 90% e 99% e em condições estimuladas por LPS
entre 84% e 99%. Este dado é importante possibilitando concluir que os
demais resultados deste estudo não refletiam citotoxicidade dos compostos.
Ao quantificar os níveis de nitrito (NO2-) nos sobrenadantes celulares concluiu-
se que a concentração de nitrito (NO2-) em condições basais e tratadas não
apresentaram alterações significativas, mantendo-se próximas da condição
basal, ou seja, os compostos provavelmente não atuam inibindo a via
intracelular de produção de óxido nítrico.
No ensaio in vivo para avaliar a atividade antinociceptiva dos derivados
pirimidínicos concluiu-se:
A série de aminopirimidinas apresentou percentagem de inibição de 50,8%
a 67,6% na dose de 10mg/kg, resultados estes significativos quando
comparados aos fármacos de referência.
Considerando os substituintes propostos por Topliss, o melhor resultado foi
da AMM, com substituinte 4-CH3, que apresentou um percentual de inibição
de 67,6% e DI50 de 22,5(19,8 - 25,6) µmol/kg sendo aproximadamente 6
vezes mais potente que os fármacos utilizados na clínica.
136
A molécula AMNM, com o substituinte 4-N(CH3)2 , apresentou-se mais
potente, com resultado para DI50 15,0 (10,4 - 21,6) µmol/kg e efetividade de
59%, sendo 9 vezes mais potente que o AAS.
Ao analisar o padrão de substituição proposto por Topliss constata-se que os
parâmetros hidrofóbicos e eletrônicos não estão relacionados à atividade
biológica destas moléculas, sendo influenciadas por efeitos estéreos.
Perspectivas:
Aperfeiçoar as técnicas de síntese a fim de melhorar os rendimentos e as
condições reacionais;
Otimizar a técnica de síntese em temperatura ambiente, tendo em vista ser
uma técnica promissora e não explorada;
Avaliar a atividade antinociceptiva das aminopirimidinas em outros modelos;
Para a melhor elucidação dos efeitos anti-inflamatórios das moléculas
selecionadas, realizar outros ensaios relacionados à secreção de fatores pró-
inflamatórios como o do fator de necrose tumoral (TNF-α), prostaglandina E2
(PGE2), entre outros, a fim de direcionar o provável mecanismo de ação.
Realizar estudos de modelagem molecular (Docking) a fim de direcionar a
modificação estrutural das moléculas obtidas e obtenção de novas moléculas.
137
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147
ANEXO A
Espectros de RMN 1H (300 MHz) e RMN 13C (300 MHz) e Espectro de IV
(DRS/KBr,cm-1), das aminopirimidinas AMM, AMX, AMH,AMCl,AMDCl, AMNM e
AMOH.
148
Figura 35- Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMX
NN
NH2
OCH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
149
Figura 36 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMX
NN
NH2
OCH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
150
Figura 37 -.Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMCl
NN
NH2
Cl
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
151
Figura 38 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMCl
NN
NH2
Cl
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
152
Figura 39 -.Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMM
NN
NH2
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
153
Figura 40 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMM
NN
NH2
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
154
Figura 41-.Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMDCl
NN
NH2
Cl
Cl
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
155
Figura 42 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMDCl
NN
NH2
Cl
Cl
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
156
Figura 43 - Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMH
NN
NH2
1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
157
Figura 44 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMH
NN
NH2
1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
158
Figura 45 - Espectros de RMN 1H e 13C (300 MHz, CDCl3) da aminopirimidina AMNM
NN
NH2
N
CH3
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
159
Figura 46 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMNM
NN
NH2
N
CH3
CH3
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
160
Figura 47 - Espectros de RMN 1H e 13C ( 300 MHz, CD3CO) da aminopirimidina AMOH
NN
NH2
OH
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
161
Figura 48 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da aminopirimidina AMOH
NN
NH2
OH
1
2
3
45
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"5"
6"
162
163
ANEXO B
Espectros de RMN 1H (300 MHz) e RMN 13C (300 MHz) e Espectro de IV (DRS/
KBr,cm-1),das Chalconas CHNM e CHOH
164
Figura 49 - Espectros de RMN 1H e 13C ( 300 MHz, CDCl3) da chalcona CHNM
O
NCH3
CH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
165
Figura 50 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHNM
O
NCH3
CH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
166
Figura 51 - Espectros de RMN 1H e 13C ( 300 MHz, CD3CO) da chalcona CHOH
O
OH
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
167
Figura 52 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHOH
O
OH
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
168
169
ANEXO C
Espectros de IV (DRS/KBr,cm-1),das Chalconas CHH, CHM, CHX, CHCl e CHDCl
170
171
Figura 53 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHH
O
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
172
173
Figura 54 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHM
O
CH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
174
175
Figura 55 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHX
O
OCH3
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
176
177
Figura 56 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHCl
O
Cl
12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
178
179
Figura 57 - Espectro de IV (DRS/ KBr,cm-1), da chalcona CHDCl
O
Cl
Cl12
3
4
5
6
3'
5'
2'1'
4' 6'
180
181
ANEXO D
Parecer da Comissão de Ética no uso de Animais – CEUA/UNIVALI
182
183
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