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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
THAISE BOEING
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA E
CICATRIZANTE GÁSTRICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS
FOLHAS DE Vernonia condensata Baker (ASTERACEAE)
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
THAISE BOEING
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA E
CICATRIZANTE GÁSTRICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS
FOLHAS DE Vernonia condensata Baker (ASTERACEAE)
Dissertação submetida ao programa de pós-graduação em Ciências farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade
Itajaí (SC)
Julho de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
B669a
Boeing, Thaise. 1991-
Avaliação da atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica
do extrato etanólico das folhas de Vernonia condensata Baker
(ASTERACEAE) / Thaise Boeing. – Itajaí (SC), 2015.
109 f. : il. ; tab. ; fig.
Cópia do computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí.
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientador: Prof.º Dr. Sergio Faloni de Andrade”
Bibliografia: p. 95 - 109
1. Vernonia condensata Baker. 2. Boldo baiano. 3.
Gastroproteção. 4. Antiúlcera. I. Título.
CDU: 616.33
Francisléia Paula Padilha Sales – CRB 14/1131
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA E
CICATRIZANTE GÁSTRICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS
FOLHAS DE Vernonia condensata Baker (ASTERACEAE)
Thaise Boeing ‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Sérgio Faloni de Andrade, Doutor
Orientador
__________________________________________________________ Clóvis Antonio Rodrigues, Doutor
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Dr. Sérgio Faloni de Andrade (Univali) Presidente
______________________________________ Dr. José Roberto Santin (Univali)
Membro
______________________________________ Dr. Rivaldo Niero (Univali)
Membro
______________________________________
Dra. Luisa Mota da Silva (Univali) Membro
____________________________________ Dra. Clélia Akiko Hiruma (Unesp)
Membro
Itajaí (SC), 31 de julho de 2015
Dedicatória
Aos meus pais, Sirio e Neusa por me instigarem a buscar o melhor de mim, assim como aprendi com o exemplo deles.
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Neusa Salete Locatelli Boeing e Sirio Boeing, por
todo esforço empreendido para tornar possível a realização dos meus sonhos, por
tudo aquilo de que abriram mão em meu nome, pelo apoio integral que me dão a
cada dia independente das minhas escolhas, e ainda, por me amarem e me
compreenderem sempre.
Ao meu namorado Thiago André Prim Fuchs, agradeço pelo carinho, apoio e
compreensão em mais esta jornada da minha vida.
Ao meu irmão Frantchesco Boeing por todas as palavras de incentivo, mas
principalmente, por tonar a escrita deste trabalho mais divertida.
Ao meu orientador Profº Dr. Sérgio Faloni de Andrade, a quem admiro e sou
grata pela paciência, oportunidade, confiança e por todos os ensinamentos
transmitidos.
A amiga Dr. Luísa Mota da Silva, por ter me co-orientado e ser responsável
por grande parte do que aprendi neste processo, além de dividir generosamente seu
conhecimento comigo, também dividiu sua casa.
Agradeço os demais professores da banca examinadora, Dr. José Roberto
Santin, Dr. Rivaldo Niero e Dra. Clélia Akiko Hiruma por contribuir imensamente para
melhoria deste trabalho e especialmente para minha formação.
Sou grata ao professor e amigo Philipe Costa por ter me incentivado a seguir
neste caminho, e ter acreditado na minha capacidade, mesmo quando eu não o
fazia.
Agradeço a todos os colegas de laboratório que me auxiliaram em algum
momento do processo, mas de forma particular ao amigo Lincon Bordigon Somensi
que colaborou em quase todos os experimentos realizados, sempre partilhando das
minhas dificuldades e vitórias, ao Benhur Cury, um exemplo de iniciação científica,
ao Marcel Petreanu pelo suporte fitoquímico e ao Rafael Conde pelo auxílio e
cuidado com os animais.
A Capes pelo apoio financeiro.
E finalmente, a Deus, por eu ter a tantas pessoas a quem agradecer e por
guiar todos os meus passos.
Muito Obrigada!
“Mesmo que a vida seja difícil, há sempre algo que
você pode fazer para ter sucesso nela. Enquanto
há vida, há esperança”.
Stephen Hawking
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA E CICATRIZANTE GÁSTRICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS
FOLHAS DE Vernonia condensata Baker (ASTERACEAE)
Thaise Boeing
Julho de 2015 Orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Dr. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 111 Vernonia condensata Baker, conhecida popularmente como boldo-baiano, tem o uso de suas folhas difundido pela população como agente antiulcerogênico e no tratamento da dispepsia. Diante do exposto, na tentativa de contribuir com a validação científica do uso terapêutico, diferentes modelos experimentais de úlcera gástrica foram empregados. Neste aspecto, o extrato bruto etanólico (EBE) das folhas de V. condensata e as frações de hexano (FHX), diclorometano (FDM) e acetato de etila (FAE), foram utilizados. Inicialmente, a atividade gastroprotetora foi avaliada pelo modelo de úlcera induzida por etanol em ratos, e posteriormente no modelo de úlcera induzida por indometacina. Carbenoxolona (200 mg/kg, v.o) foi o controle positivo destes modelos. A atividade cicatrizante gástrica do extrato e omeprazol (20 mg/kg, v.o) foi avaliada no modelo de úlcera induzida por ácido acético 80%, após tratamento por 7 dias, 2 vezes ao dia. Neste modelo, também foram analisados o conteúdo de mucina pelo método histoquímico de PAS, atividade da mieloperoxidase (MPO), e parâmetros do estresse oxidativo. Os efeitos sobre a secreção gástrica foram avaliados pelo método de ligadura do piloro com e sem estímulo de secretagogos (Histamina, Pentagastrina e Betanecol), onde o muco aderido foi quantificado e atividade péptica foi mensurada. Além disso, efeitos do EBE no esvaziamento gástrico e trânsito intestinal em camundongos foram analisados, bem como o efeito in vitro do extrato diretamente sobre a atividade da MPO, inibição da enzima H+,K+ATPase e potencial sequestrador do radical DPPH. O tratamento com EBE 30 e 300 mg/kg e FHX (33 mg/kg), FDM (35 mg/kg), FAE (24 mg/kg) reduziram a lesão provocada por etanol absoluto em relação ao controle negativo (67,11 ± 8,90 e 60,09 ± 16,26 mm2, respectivamente) em 55 e 87% e 44, 97 e 69% respectivamente. As mesmas doses do extrato reduziram de maneira significativa as lesões induzidas por indometacina (80 mg/kg, v.o) em 80 e 71% respectivamente em relação ao veículo (8,58 ± 1,72). Na úlcera induzida por ácido acético, EBE (300 mg/kg) reduziu a lesão em 43% em relação ao controle negativo (115 ± 8,46 mm2), aumentando o conteúdo de mucinas, SOD e CAT e reduzindo a atividade da MPO e conteúdo de LOOH. Além disso o EBE reduziu volume, acidez e aumentou o pH da secreção gástrica basal, bem como na secreção estimulada por pentagastrina e betanecol. No entanto, não inibiu a atividade péptica ou aumentou conteúdo de muco aderido. Adicionalmente, EBE reduziu o esvaziamento gástrico e transito intestinal. In vitro, não inibiu a enzima H+,K+ATPase e a MPO, mas inibiu o radical DPPH em baixas concentrações (1 µg/mL). Paralelamente, a triagem fitoquímica confirmou a presença de triterpenos e compostos fenólicos no extrato. Em conjunto, os resultados confirmaram a ação gastroprotetora popularmente atribuída a V. condensata e demonstraram grande potencial cicatrizante gástrico a sua atividade, apontando que, estas atividades são provavelmente relacionadas a um mecanismo anti-secretor por bloqueio nas vias gastrinérgica e colinérgica
associado a diminuição da infiltração de neutrófilos, redução do estresse oxidativo e aumento de mucinas. Contudo, mais estudos são necessários para detalhar o mecanismo de ação, bem como para avaliar os efeitos tóxicos e então garantir o uso seguro desta planta medicinal. Palavras-chave: Vernonia condensata Baker. Boldo baiano. Gastroproteção. Antiúlcera.
EVALUATION OF GASTROPROTECTIVE ACTIVITY AND GASTRIC HEALING OF ETHANOLIC EXTRACT OF THE LEAVES OF Vernonia
condensata Baker (ASTERACEAE)
Thaise Boeing
July /2015
Supervisor: Prof. Sérgio Faloni de Andrade, Dr. Area of Concentration: Natural products and Bioactive Synthetic Substances. Number of Pages: 111 Vernonia condensata Baker is popularly known as boldo baiano. Its leaves are broadly used as an antiulcerogenic agent, and in the treatment of dyspepsia. In view of this, different experimental models were used, seeking to contribute to the scientific validation of the therapeutic use of this specie. Crude ethanolic extract of the leaves of V. condesata (EBE) and hexane (FHX), dichloromethane (FDM) and ethyl acetate fraction (FAE) were used. Initially, the gastroprotective model of ethanol-induced ulcers in rats was employed, and subsequently, the indomethacin-induced ulcer model. Carbenoxolone (200 mg/kg, p.o) was used as positive control in these models. The gastric healing activity of the extract and omeprazole (20 mg/kg, p.o) was evaluated in the ulcer model induced by 80% acetic acid, after treatment for 7 days, 2 times a day. In this model, mucin content by the histochemical method of PAS, myeloperoxidase activity (MPO), and oxidative stress parameters were also analyzed. The effects on gastric secretion were assessed by the pylorus ligation method with and without secretagogue stimuli (Histamine, Pentagastrin and Bethanechol), in which the adhered mucus was also quantified and peptic activity was measured. Moreover, the EBE effect on gastric emptying and intestinal transit in mice were evaluated, as well as the in vitro effect of the extract on MPO activity, inhibition of H+,K+ATPase enzyme and scavenger potential of DPPH. The treatment with EBE 30 and 300 mg/kg, FHX (33 mg/kg), FDM (35 mg/kg), FAE (24 mg/kg) reduced the injury induced by absolute ethanol in relation to the negative control (67.11 ± 8.90 and 60.09 ± 16.26 mm2, respectively) in 55% and 87% and 44%, 97% and 69%, respectively. The same doses of the extract also significantly reduced the lesions induced by indomethacin (80 mg/kg, p.o), in 80% and 71%, respectively. In the acetic acid induced ulcer, EBE (300 mg/kg) reduced the lesion at 43% compared to the negative control (115 ± 8.46 mm2), increasing the mucin content, CAT and SOD and reducing MPO activity, and LOOH content. Moreover EBE reduced the volume and acidity, and increased the pH of the basal gastric secretion, as well as the secretion stimulated by pentagastrin and bethanechol. However, it did not alter the peptic activity or adhered mucus content. Furthermore, it reduced gastric emptying and intestinal transit. In vitro, EBE did not inhibit the enzymes H+,K+ATPase and MPO, but inhibited the DPPH at low concentrations (1 µg/mL). Parallel to this, the phytochemical screening confirmed the presence of phenolic compounds and triterpenes in the extract. Together, the results confirmed the gastroprotective action popularly attributed to V. condensate, and demonstrates its good potential for gastric healing. These activities are probably related to an anti-secretory mechanism, blocking the gastrinergic and cholinergic pathways, associated with decreased of the neutrophil infiltration, reduced oxidative stress, and increased mucin content. However, further studies are required to detail the mechanism of action, evaluate the toxic effects and in this way ensure the safe use of this medicinal plant.
Keywords: Vernonia condensata Baker. Boldo baiano. Gastroprotection. Antiulcer
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fotografia das folhas Vernonia condensata Baker. ................................... 32 Figura 2. Esquema da divisão anatômica do estômago. .......................................... 35 Figura 3. Esquema representativo da glândula oxíntica. .......................................... 36 Figura 4. Imagens representativas do efeito gastroprotetor do EBE no modelo de
úlcera induzida por etanol em ratos. ................................................................... 62 Figura 5. Efeito do tratamento com as frações obtidas a partir do EBE no modelo de
úlcera induzida por etanol em ratos. ................................................................... 63 Figura 6. Imagens representativas do efeito gastroprotetor do EBE no modelo de
úlcera induzida por indometacina em ratos. ........................................................ 64 Figura 7. Atividade sequestradora do radical DPPH do EBE in vitro. ....................... 65 Figura 8. Efeito do EBE no modelo de úlcera induzida por ácido acético em ratos.. 66 Figura 9. Análise macroscópica (A, B e C) e microscópica (D, E e F) das úlceras
gástricas crônicas induzidas por ácido acético em ratos. .................................... 67 Figura 10. Efeito do EBE sobre atividade da MPO nas úlceras gástricas induzidas
por ácido acético em ratos. ................................................................................. 68 Figura 11. Efeito do EBE diretamente sobre atividade da MPO in vitro. .................. 68 Figura 13. Efeito do EBE na atividade péptica da secreção gástrica coletada no
experimento de ligadura do piloro. ...................................................................... 74 Figura 14. Efeito do EBE na secreção gástrica no experimento de ligadura do piloro
com estímulo da Histamina. ................................................................................ 76 Figura 15. Efeito do EBE na secreção gástrica no experimento de ligadura do piloro
com estímulo da Pentagastrina. .......................................................................... 77 Figura 16. Efeito do EBE na secreção gástrica no experimento de ligadura do piloro
com estímulo do Betanecol. ................................................................................ 78 Figura 17. Efeito do EBE sobre a atividade da enzima H+K+ ATPase in vitro........... 79 Figura 18. Efeito do EBE sobre o esvaziamento gástrico em camundongos. .......... 80 Figura 19. Efeito do EBE sobre o Trânsito intestinal em camundongos. .................. 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Efeito do tratamento com EBE no modelo de úlcera induzida por etanol em
ratos. ................................................................................................................... 62 Tabela 2. Efeito do tratamento com EBE no modelo de úlcera induzida por
indometacina em ratos. ....................................................................................... 64 Tabela 3. Efeito do EBE sobre indicadores de estresse oxidativo SOD, CAT, GSH e
LOOH nas úlceras gástricas induzidas por ácido acético em ratos. .................... 70 Tabela 4. Avaliação toxicológica preliminar em relação ao peso dos órgãos dos
animais com úlcera induzida por ácido acético. .................................................. 72 Tabela 5. Efeito do EBE na secreção gástrica basal no experimento de ligadura do
piloro.................................................................................................................... 73 Tabela 6. Efeito do EBE no doseamento de muco aderido a mucosa gástrica de
animais do experimento de ligadura do piloro. .................................................... 75
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido ascórbico
AINES – Anti-inflamatório não esteroidal
AMPc – Adenosina 3’,5'-monofosfato cíclico
ANOVA – Análise de variância
ATC – Ácido tricloroacético
ATP – Trifosfato de adenosina
CAT – Catalase
Cbn - Carbenoxolona
CCK-A – Colecistoquinina A
CCK-B - Colecistoquinina B
CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
COX – Cicloxigenase
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DPPH – 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
DTNB – Ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
ECL – Células enterocromafins
EBE – Extrato bruto etanólico das folhas de Vernonia condensata
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
FAE – Fração Acetato de Etila
FDM – Fração diclorometano
FHX – Fração hexano
GO – Glutationa oxidase
GPx – Glutationa peroxidase
GSH – Glutationa reduzida
GSSH – Glutationa oxidada
GST - Glutationa S-transferase
GR – Glutationa redutase
H+, K+ ATPase – Bomba hidrogênio, potássio adenosina trifosfatase
H2 – Receptor de histamina tipo 2
i.d – Via intraduodenal
LOOH – Hidroperoxidação lipídica
M3 – Receptor muscarínico subtipo 3
MPO – Mieloperoxidase
NO – Óxido nítrico
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
Ome - Omeprazol
OMS – Organização mundial da Saúde
PAS - Ácido periódico de Schiff
PGE2 – Prostaglandina E2
PGI2 – Prostaciclina I2
Pi – Fosfóro inorgânico
ROS – Espécies reativas de oxigênio
SOD – Superóxido dismutase
TGI – Trato gastrointestinal
TRIS – Tris (hidroximetil) aminometano
Vei - Veículo
v.o – via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 25
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 27
2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 27
2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 27
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 29
3.1 Plantas medicinais ............................................................................................ 29
3.2 Vernonia condensata Baker ............................................................................. 30
3.2.1 Composição química ..................................................................................... 32
3.2.2 Atividade biológica......................................................................................... 33
3.3 Fisiologia do estômago e secreção gástrica .................................................. 34
3.4 Úlcera gástrica ................................................................................................... 38
3.4.1 Conceito e epidemiologia .............................................................................. 38
3.4.2 Agentes agressores da mucosa ................................................................... 39
3.4.3 Agentes defensivos da mucosa .................................................................... 41
3.4 Terapia antiúlcera .............................................................................................. 43
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 47
4.1 Fármacos, reagentes e solventes .................................................................... 47
4.2 Coleta e preparação do extrato ........................................................................ 47
4.3 Determinação do perfil fitoquímico ................................................................. 47
4.4 Ensaios farmacológicos ................................................................................... 48
4.4.1 Animais ........................................................................................................... 48
4.4.2 Avaliação da atividade gastroprotetora ....................................................... 48
4.4.3 Determinação das doses ............................................................................... 48
4.5 Modelos agudos de úlcera gástrica ................................................................. 49
4.5.1 Modelo de úlcera induzida por etanol .......................................................... 49
4.5.2 Modelo de úlcera induzida por anti-inflamatório não esteroidal ................ 49
4.6 Estudo in vitro da atividade sequestradora de radicais livres (DPPH) ......... 50
4.7 Avaliação da cicatrização gástrica .................................................................. 50
4.7.1 Modelo de úlcera crônica induzida por contato com ácido acético .......... 50
4.7.2 Avaliação microscópica ................................................................................. 51
4.7.3 Preparação do tecido ulcerado para os ensaios bioquímicos. .................. 52
4.7.4 Concentração de proteína nas amostras ..................................................... 52
4.7.5 Quantificação dos níveis enzimáticos de mieloperoxidase (MPO) ........... 52
4.7.6 Determinação in vitro da atividade enzimática de meiloperoxidase (MPO)
.................................................................................................................................. 53
4.7.7 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH). ................................... 53
4.7.8 Quantificação de grupos sulfidrílicos não proteicos (GSH) ...................... 54
4.7.9 Quantificação dos níveis de superóxido dismutase (SOD) ....................... 54
4.7.10 Quantificação da atividade enzimática da catalase (CAT) ....................... 55
4.8 Toxicologia preliminar ...................................................................................... 55
4.9 Avaliação da secreção gástrica, muco e atividade péptica .......................... 55
4.9.1 Ligadura de piloro .......................................................................................... 55
4.9.2 Atividade péptica ........................................................................................... 56
4.9.3 Doseamento de muco na mucosa gástrica ................................................. 56
4.9.4 Ligadura do piloro estimulada por Pentagastrina, Betanecol e Histamina
.................................................................................................................................. 57
4.10 Avaliação da atividade da H+ K+ ATPase in vitro ........................................ 58
4.11 Esvaziamento gástrico e transito intestinal ................................................. 59
4.12 Análise estatística ........................................................................................... 60
5 RESULTADOS ...................................................................................................... 61
5.1 Determinação do perfil fitoquímico ................................................................. 61
5.2 Avaliação da atividade gastroprotetora .......................................................... 61
5.2.1 Úlcera induzida por etanol ............................................................................ 61
5.2.2 Úlcera induzida por anti-inflamatório não esteroidal ................................. 63
5.3 Atividade antioxidade in vitro (DPPH) ............................................................. 64
5.4 Avaliação da cicatrização gástrica .................................................................. 65
5.4.1 Efeito de V. condensata sobre a atividade da MPO após a indução de
úlcera gástrica crônica por ácido acético ............................................................ 67
5.4.2 Efeito de V. condensata sobre indicadores do estresse oxidativo ........... 69
5.4.3 Avaliação histoquímica do conteúdo de mucinas ...................................... 70
5.5 Análise toxicológica preliminar ....................................................................... 71
5.6 Avaliação da secreção gástrica, atividade péptica e muco .......................... 72
5.6.1 Ligadura do piloro ......................................................................................... 72
5.6.2 Atividade péptica ........................................................................................... 73
5.6.3 Doseamento de muco aderido a mucosa gástrica...................................... 74
5.6.4 Ligadura do piloro estimulada por agentes secretagogos ......................... 75
5.7 Efeito de V. condensata sobre a atividade da H+K+ ATPase in vitro ............. 78
5.8 Esvaziamento gástrico e trânsito intestinal .................................................... 79
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 81
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 93
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 95
ANEXO – PARECER COMITÊ DE ÉTICA ........................................................... 111
25
1 INTRODUÇÃO
A úlcera gástrica é considerada um problema de saúde global (LAU et al.,
2011), caracterizada por lesão profunda na parede estomacal envolvendo toda a
espessura da mucosa e penetrando através da camada muscular (TARNAWSKI,
2005). Esta patologia é resultado de um desequilíbrio entre agentes protetores
(barreira de muco, secreção de muco, regeneração celular, produção de
prostaglandinas) e agentes agressores (secreção de ácido e pepsina) da mucosa
gástrica (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008; YUHONG; IRENEUSZ;
RICHARD, 2006).
Algumas lesões ulcerosas podem ser de origem microbiana, como por
exemplo pela Helicobacter pylori e, raras vezes, por outros processos infeciosos
bacterianos, virais e parasitários, sobre tudo em pacientes imunodeficientes. Outras
lesões são de natureza imunopática, como por exemplo, autoimune e imunoalérgica
(CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009), por estresse, ou ainda agentes químicos,
tais como anti-inflamatórios não esteroidais (AINES), consumo de cigarros e bebida
alcoólica (BELAICHE et al., 2002; LI et al., 2014).
Atualmente, as opções de tratamento incluem fármacos antiácidos e
principalmente, os antagonistas de receptores de histamina tipo 2 e inibidores
irreversíveis da bomba de prótons, os quais atuam inibindo a secreção gástrica
(BANIĆ et al., 2011). No entanto, estes fármacos podem provocar hiperplasia em
células enterocromafins podendo levar a indução de câncer gástrico (BABU et al.,
2010) e, efeitos adversos tais como hipersensibilidade, arritmia, impotência,
ginecomastia e desordens hematopoiéticas (SHEEN; TRIADAFILOPOULOS, 2011).
Reconhecendo os problemas com a terapêutica existente, torna-se evidente a
necessidade de buscar novos tratamentos que atuem em diferentes alvos
terapêuticos, sejam mais efetivos e apresentem menos efeitos colaterais (KLEIN-
JUNIOR et al., 2010).
A pesquisa com plantas medicinais tem sido, e continua a ser considerada
uma abordagem promissora para a procura de novos fármacos (BUTLER;
FONTAINE; COOPER, 2014). Estima-se que dos 1.135 novos medicamentos
aprovados entre 1981 e 2010, 50% foram originados de produtos naturais
(NEWMAN; CRAGG, 2012), contudo, mais de 95% da biodiversidade do mundo não
26
foi avaliada para qualquer atividade biológica, existindo ainda o desafio de acessar e
valorizar de maneira eficiente esta diversidade química natural (DAVID;
WOLFENDER; DIAS, 2015). Em relação a patologia estudada, as plantas têm um
papel importante, porque muitos extratos e/ou compostos isolados tem mostrado
resultados promissores e com mecanismos de ação diferentes dos fármacos
usualmente disponíveis para o tratamento da úlcera gástrica (SCHMEDA-
HIRSCHMANN; YESILADA, 2005).
Em vista da biodiversidade global, o gênero Vernonia representa uma parte
do grande grupo de plantas medicinais utilizadas em todo o mundo, incluindo o
Brasil (ERASTO; GRIERSON; AFOLAYAN, 2006). Este gênero possui
aproximadamente 1.500 espécies e tem sido utilizado popularmente para tratar
vários tipos de doenças, incluindo distúrbios gastrointestinais (DA SILVA et al.,
2013).
V. condensata Baker pertence à família Asteraceae, é comumente conhecida
como boldo baiano (RIVERA, 2006), figatil ou necroton (DA SILVA et al., 2013).
Tradicionalmente, tem sido utilizada como analgésico, anti-inflamatório, antitérmico,
antianêmico, antibacteriano, hepatoprotetor e como agente antiúlcera (ALVES;
NEVES, 2003; LORENZI; MATOS, 2008).
Na literatura, existem estudos sobre sua atividade anti-inflamatória
(VALVERDE et al., 2001), toxicidade (MONTEIRO et al., 2001; RISSO; SCARMINIO;
MOREIRA, 2010) e atividade analgésica e antiúlcera (FRUTUOSO et al.; 1994). No
entanto, em relação a úlcera gástrica, o estudo realizado por Frutuoso et al. (1994),
avaliou apenas a atividade de uma fração polar do extrato aquoso da planta na
metodologia de úlcera induzida por indometacina, insuficiente para avaliar e
compreender o efeito da espécie. Em relação ao perfil fitoquímico, constituintes
como compostos fenólicos, alcaloides, taninos, saponinas, flavonoides, terpenoides
e esteroides foram detectados (BRASIL, 2014; TOYANG; VERPPOORTE, 2013)
Então, por meio da necessidade de buscar novas alternativas para o
tratamento da úlcera gástrica, bem como a lacuna existente em relação a atividade
da espécie estudada e o potencial das plantas medicinais como fonte terapêutica, o
presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade gastroprotetora e
cicatrizante gástrica do extrato etanólico das folhas de V. condensata Baker em
diferentes modelos experimentais in vivo.
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade gastroprotetora e cicatrizante gástrica do extrato etanólico
obtido das folhas de Vernonia condensata Baker.
2.2 Objetivos específicos
a) Obter o extrato etanólico das folhas de V. condensata por maceração e as
frações (hexano, diclorometano e acetato de etila) por partição líquido-líquido.
b) Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato etanólico e das frações.
c) Avaliar o efeito cicatrizante gástrico do extrato e os mecanismos envolvidos
neste efeito.
d) Avaliar o efeito do extrato etanólico sobre a secreção gástrica e produção
de muco.
e) Avaliar o efeito do extrato sobre o esvaziamento gástrico e o trânsito
intestinal.
28
29
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Plantas medicinais
O uso de produtos naturais pela humanidade ocorre desde os primórdios da
civilização, onde nossos ancestrais buscavam tratamento para alívio e cura das
doenças nos recursos da natureza, notadamente, plantas, animais e minerais
(CALIXTO et al., 2008). A história do desenvolvimento das civilizações Oriental e
Ocidental é rica em exemplos do emprego dos recursos naturais na medicina, como
o uso da Morfina, isolada a partir da Papaver somniferum em 1804 (BARREIRO;
BOLZANI, 2009).
As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribuem de forma significativa para a divulgação das virtudes terapêuticas dos
vegetais, prescritos com frequência, pelos efeitos medicinais que produzem, apesar
de não terem seus constituintes químicos conhecidos (MACIEL et al., 2002). De fato,
a experiência tem evidenciado que quando se procura obter substâncias ativas
através de plantas, é muito mais provável encontrar atividade biológica naquelas
orientadas pelo seu uso popular do que nas escolhidas ao acaso (YUNES;
CECHINEL FILHO, 2001).
Provavelmente, o melhor exemplo do papel da etnomedicina em guiar a
descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos está relacionado aos
fármacos antimaláricos, particularmente Quinina e Artemisina. O primeiro composto
foi isolado das cascas de espécies de Cinchona, tradicionalmente utilizada por
grupos indígenas na região amazônica para o tratamento da febre e, que serviu de
base para síntese de Cloroquina e Mefloquina; no entanto, a resistência a estas
substâncias também levou a descoberta de Artemisina a partir do uso de Artemisia
annua pela medicina tradicional chinesa igualmente para o tratamento da febre
(CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2012). O tratamento da sintomatologia da úlcera
gástrica ou gastrite com plantas medicinais também é bastante comum na medicina
tradicional de diversos países (SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005).
Ao longo da última década, o interesse em medicamentos derivados a partir
de plantas superiores, especialmente fitoterápicos aumentou expressivamente.
Cerca de 25% de todos medicamentos modernos são diretamente ou indiretamente
30
derivados de produtos naturais (CALIXTO, 2000; WHO, 2011). Dos 1.135 novos
medicamentos aprovados entre 1981 e 2010, 50% foram desta fonte (NEWMAN;
CRAGG, 2012). Particularmente, há uma grande importância relacionado aos
medicamentos antitumorais e para doenças infecciosas, dos quais aproximadamente
60 e 75%, respectivamente, são moléculas oriundas ou derivadas de produtos
naturais (McCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). Além disso, a
Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que aproximadamente 65% da
população mundial baseia-se, principalmente, em medicamentos tradicionais
derivados de plantas para seus cuidados primários a saúde (CRAGG; GROTHAUS;
NEWMAN, 2012).
Ademais, ao considerarmos a perspectiva da busca de novos compostos
bioativos em fontes vegetais, devemos abordar dois pontos de vista básicos, a
diversidade molecular que é superior àquela dos processos de síntese industrial e a
função biológica, onde os produtos gerados em organismo que apresentam muitas
similaridades com o metabolismo dos mamíferos podem exibir propriedades
adicionais àquelas esperadas inicialmente (SIMÕES et al., 2003). É importante
ressaltar que a natureza tem “feito” química combinatória por eras, e não apenas
uma ou duas décadas, e desta forma vem selecionando produtos dessa biblioteca
combinatória que tem vantagem biológica específica (McCHESNEY;
VENKATARAMAN; HENRI, 2007).
No Brasil existe um grande potencial na pesquisa com plantas medicinais em
relação a busca de novos fármacos, principalmente, porque há florestas tropicais
extensas onde a maior parte da flora é quimicamente desconhecida (MESQUITA, et
al., 2005). Embora o Brasil contemple cinco principais biomas, designados como
floresta amazônica, cerrado, mata atlântica, pantanal e caatinga (SOUZA et al.,
2008), dados disponíveis revelam que apenas 5-15% das cerca de 250.000 espécies
de plantas superiores foram sistematicamente, quimicamente e farmacologicamente
investigadas (BUDOVSKY; YARMOLINSKY; BEM-SHABAT, 2015; CRAGG;
NEWMAN, 2007; GUERRA; NODARI, 2003).
3.2 Vernonia condensata Baker
O gênero Vernonia pertence à família Asteraceae e possui aproximadamente
1.500 espécies que têm sido utilizadas popularmente para tratar vários tipos de
31
doenças, incluindo doenças de origem inflamatória, malária, febre, verminoses, dor,
diurese, câncer, e várias desordens gastrointestinais (DA SILVA et al., 2013). Muitas
espécies de Asteraceae são utilizadas como plantas medicinais, com variadas
indicações terapêuticas, preparos e utilizações (LOLIS; MILANEZE-GUTIERRE,
2003). De acordo com Dematteis e Fernandez (1998), do ponto de vista sistemático
Vernonia é um dos gêneros mais complexos da família. Isto se deve principalmente
pela extrema diversidade de formas que o gênero exibe, desde pequenas ervas
rosuladas escaposas até grandes árvores (STUTTS, 1988).
O gênero é distribuído mundialmente, embora seja encontrado principalmente
nas regiões tropicais. Espécies de Vernonia podem crescer em uma grande
variedade de habitats, de grande diversidade ecológica e condições climáticas,
incluindo florestas tropicais, pântanos, áreas úmidas, planícies secas, savanas
tropicais, deserto ou locais secos e até mesmo regiões geladas do leste da América
do Norte (GLEASON, 1923; KEELEY; JONES, 1979).
A espécie V. condensata, é popularmente conhecida por “boldo baiano”
(RIVERA, 2006) “alumã” (LORENZI; MATOS, 2002), “figatil” ou “necroton” (DA
SILVA et al., 2013). Possivelmente é nativa da África tropical, sendo trazida ao Brasil
nos tempos coloniais pelos escravos (LORENZI; MATOS, 2002). A planta cresce em
diferentes regiões do país, onde também é conhecida por ‘assa-peixe’, ‘boldo’,
‘boldo grande’, ‘macelão’, contudo esses nomes populares também são
compartilhados por outras espécies do mesmo gênero (MONTEIRO et al., 2001).
Existe uma relevância econômica a cerca desta planta medicinal, uma vez
que faz parte da lista do "Renisus", que contêm espécies vegetais com potencial
para avançar na cadeia produtiva e gerar produtos fitoterápicos de interesse para o
Sistema Único de Saúde (SUS). Além disso, é encontrada no Formulário de
fitoterápicos da farmacopeia brasileira, onde está indicada para o tratamento da
úlcera gástrica e dispepsia (BRASIL, 2009; BRASIL, 2011).
Alguns sinônimos botânicos são encontrados: Vernonanthura condensata
(Baker) H. Rob., Vernonia bahiensis Toledo, Vernonia sylvestris Glaz e o mais
relevante Vernonia amygdalina (BRASIL, 2014)
As folhas de V. condensata (Figura 1) são ovaladas, de ápice agudo, base
atenuada, bordo serrilhado, hipoestomáticas com estômatos do tipo anomocítico e
dois tipos de tricomas glandulares. O mesofilo é dorsiventral e os feixes vasculares
são colaterais. Ocorrem drusas no pecíolo (LOLIS e MILANEZE-GUTIERRE, 2003).
32
Figura 1. Fotografia das folhas Vernonia condensata Baker.
Fonte: O autor.
3.2.1 Composição química
A droga vegetal apresenta em sua constituição compostos fenólicos,
alcaloides, taninos, saponinas, flavonoides, terpenoides e esteroides (BRASIL, 2014;
TOYANG e VERPPOORTE, 2013).
Dentre estes metabólitos, terpenoides e esteroides parecem ter grande
importância para o gênero Vernonia, haja vista que estudos prévios realizados por
Zanon et al. (2008) levaram ao isolamento de três triterpenos e três fitoesteroides a
partir de uma fração diclorometano de V. tweediana. Também, Bohlmann et al.
(1981) isolou triterpenos de diferentes espécies do gênero e Jakupovic et al. (1987)
lactonas sesquiterpênicas.
Além disso, Valverde e colaboradores (2001) isolaram um glicosídeo
esteroidal (Vernoniosideo B2) a partir de V. condensata, constituinte sugerido como
um dos princípios ativos responsáveis pela atividade analgésica do extrato bruto
polar das folhas desta espécie. Vernolideo e Vernodalol (lactonas sesquiterpênicas)
foram isolados das folhas de V. amygdalina (ERASTO; GRIERSON; AFOLAYAN,
2006), sinônimo botânico de V. condensata. Outros autores, também identificaram
ácido cafeoilquínico, ácido clorogênico, luteolina 7-O-glicosídeo, ácido 1,5-
33
dicafeoilquínico, apigenina-O-glucoronídeo e luteolina no extrato hidroetanólico
(parte da planta não especificada) desta espécie (SALAWU et al., 2011).
Em estudo sobre a ação antioxidante de V. condensata, os autores
detectaram a presença de dois flavonoides (apigenina e luteolina) na fração acetato
de etila do extrato (DA SILVA et al., 2013).
3.2.2 Atividade biológica
As folhas de V. condensata são utilizadas na preparação de infusões, ou
então maceradas para preparação de "sumos" (LOLIS; MILANEZE-GUTIERRE,
2003). Esta planta é utilizada tradicionalmente como analgésico, anti-inflamatório,
antitérmico, antianêmico, antibacteriano, hepatoprotetor e agente antiulcerogênico
(ALVES; NEVES, 2003; LORENZI; MATOS, 2008), também utilizada para diarreia e
proteção contra picadas de cobra (RISSO; SCARMINIO; MOREIRA, 2010).
No estudo realizado por Frutuoso et al. (1994) foi demonstrado que o extrato
aquoso das folhas possui propriedade antinociceptiva. O extrato inibiu de maneira
dose dependente o número de contrações abdominais induzidas por ácido acético
(0,6%) em camundongos. Ainda, demonstrou potencializar a atividade
antinociceptiva induzida por aspirina e indometacina em camundongos, além de
proteger a mucosa gástrica contra efeitos ulcerogênicos provocado por anti-
inflamatório não esteroidal (Indometacina).
Substancias isoladas de V. condensata como derivados do ácido cafeico e
ácido clorogênico administrados oralmente em camundongos demonstraram inibir a
letalidade causada pelo veneno da serpente Bothrops jararaca (PEREIRA et al.,
1994), além disso, já foi demonstrado na literatura a atividade gastroptotetora do
ácido clorogênico em modelos de úlcera induzida por etanol e AINES (SHIMOYAMA
et al., 2013)
Da Silva et al. (2013) testaram a capacidade antioxidante do extrato etanólico
e frações através de diferentes modelos, concluindo que V. condensata é uma
importante e promissora fonte de substâncias bioativas com atividade antioxidante.
Estudos de toxicidade aguda foram realizados por Risso et al. (2010) com
extrato aquoso, cuja DL50 estimada foi maior que 2000 mg/kg. Outros cinco extratos
testados neste mesmo trabalho, também demonstraram DL50 maior que 2000mg/kg
(etanólico, (1:1) acetona: etanol, diclorometano: etanol (1:1:1) acetona:
34
diclorometano: etanol e acetona: etanol: acetato de etila). O sistema extrator com
maior toxicidade aguda foi (1:1:1) acetona: diclorometano: acetato de etila com DL50
de 300mg/kg.
Monteiro et al. (2001) avaliou a toxicidade do chá das folhas de V.
condensata, relatando que a toxicidade oral aguda do extrato aquoso liofilizado é
muito baixa. Ensaio de embriotoxicidade também foi realizado, onde o extrato (0,
500 e 2000 mg/kg) foi administrado em diferentes dias da gestação dos
camundongos. No entanto, os resultados não indicaram risco teratogênico. Do
mesmo modo, não foi encontrado risco de mutagenicidade utilizando teste de Ames.
O único efeito tóxico observado após o tratamento oral foi um ligeiro retardo do
crescimento fetal em doses maiores que 2000 mg/kg em termos de peso corporal/dia
do extrato aquoso liofilizado.
3.3 Fisiologia do estômago e secreção gástrica
A principal função do trato gastrointestinal (TGI) é a digestão e absorção de
nutrientes visando manter o funcionamento normal do organismo. Um dos
seguimentos do TGI é o estômago, órgão composto por diversas camadas de
musculo liso revestido por uma membrana de muco. Anatomicamente dividido em
quatro regiões: cárdia, fundo, corpo e antro (Figura 2) (MERCHANT, 2007;
SCHUBERT; PEURA, 2008). O estômago possui três funções motoras, a de
armazenamento de grandes quantidades de alimento até que possam ser
processadas no duodeno; a mistura desse alimento com as secreções gástricas até
formar o quimo e o esvaziamento do quimo para o intestino delgado em vazão
compatível com a digestão e absorção (HALL; GUYTON, 2011).
Histologicamente a parede do estômago como toda a parede do resto do tubo
digestivo se distribui em 4 camadas estruturalmente sobrepostas, 1) a mucosa
composta por tecido epitelial, membrana basal e lâmina própria; 2) a submucosa,
rica em circulação capilar da parede gástrica; 3) camada muscular, integrada por um
feixe de fibras lisas multidirecional e 4) a camada serosa que é apenas uma unidade
do peritônio visceral (CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009).
35
Figura 2. Esquema da divisão anatômica do estômago.
Fonte: Adaptado de http://www.biologycorner.com/anatomy/digestive/notes_digestive.html
As secreções gástricas são fundamentais para que o estômago desempenhe
seu papel fisiológico, além de células secretoras de muco que revestem toda a
superfície do estômago, a mucosa gástrica tem dois tipos importantes de glândulas
tubulares: glândulas oxínticas ou gástricas e as pilóricas; as glândulas oxínticas
ficam localizadas nas superfícies internas do corpo e do fundo do estômago,
constituindo 80% do estômago proximal, enquanto as pilóricas ficam localizadas na
porção antral que corresponde a 20% do estômago, estas últimas secretam,
principalmente muco, mas também pequena quantidade de pepsinogênio e o
hormônio gastrina (HALL; GUYTON, 2011).
As glândulas oxínticas (Figura 3) são as mais abundantes, formadas por
quatro tipos de células. Primeiramente pelas células mucosas do colo que são
misturadas, sem continuidade, com o epitélio gástrico e secretam basicamente
muco; segundo pelas células parietais que segregam o ácido clorídrico (HCl) e
também o fator intrínseco (necessário para a absorção de vitamina B12),
preferencialmente localizadas no corpo glandular. Em terceiro lugar encontram-se as
células principais, 20 vezes mais frequentes que as anteriores, localizadas
principalmente no fundo glandular e secretoras de pepsinogênio e finalmente as
36
células endócrinas que secretam aminas bioativas e hormônios pépticos e fazem
parte do sistema neuroendócrino difuso sendo distribuidas amplamente como células
enterocromafins, células secretoras de gastrina (célula G), células secretoras de
somatostatina (células D), etc (CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009).
Figura 3. Esquema representativo da glândula oxíntica.
Fonte: Adaptado de http://www.medicinageriatrica.com.br/wp-content/uploads/2013/04/gl%C3%A2ndulas-g%C3%A1stricas.jpg.
Entre as diversas regiões do organismo o estômago é a que possui o
ambiente mais peculiar, principalmente pela quantidade elevada de ácido clorídrico
(HCl), que mantêm o pH entre 0,9 e 2,0. Esse ambiente ácido, além de participar da
digestão, desempenha um papel de extrema importância impedindo a entrada de
microrganismos e, portanto, protegendo o organismo de agentes infecciosos
(BIGHETTI; ANTÔNIO; CARVALHO, 2002). O pH baixo é fundamental para que o
pepsinogênio secretado pelas células mucosas e pépticas das glândulas gástricas
seja clivado para formar a pepsina ativa que possui atividade proteolítica (HALL;
GUYTON, 2011).
As células parietais, ao serem estimuladas, secretam uma solução ácida
contendo cerca de 160 mmol/L de HCl, deixando a concentração de íons hidrogênio
37
3 milhões de vezes maior do que a do sangue arterial. Este HCl é formado nos
canalículos da célula parietal e conduzido até a extremidade secretora da célula que,
tem como principal força motriz para secreção a bomba de hidrogênio-potássio
(H+,K+ ATPase) (HALL; GUYTON, 2011). A estimulação da célula parietal para que a
bomba de hidrogênio-potássio seja ativada ocorre em resposta a três sinais neuro-
humorais: (i) acetilcolina, um neurotransmissor liberado pelas terminações nervosas
vagais; (ii) gastrina, um hormônio local produzido pelas células G e (iii) histamina,
um ativo químico biológico produzido pelas células ECL na parede do estômago
(DACHA et al., 2015).
As células parietais são controladas por outro tipo de células, denominadas
células enterocromafins (ECL) cuja função primária é secretar histamina, estas
células se localizam na submucosa, próxima as glândulas oxínticas (HALL;
GUYTON, 2011). A histamina liberada, promove a estimulação das células parietais
de forma direta ao se ligar com receptores do tipo H2. Estes receptores são
acoplados a proteína G, e quando ativados, estimulam a adenilato ciclase com
geração de adenosina 3’,5'-monofosfato cíclico (AMPc). A secreção ácida
estimulada pela histamina, também pode ocorrer de forma indireta através da sua
ligação a receptores H3, que inibem a secreção de somatostatina (KAZUMORI;
ISHIHARA; RUMI, 2004). Por sua vez, as células ECL são estimuladas a secretar
histamina pelo hormônio gastrina que é secretado pelas células G estimulada por
proteínas da carne e outros alimentos proteicos ingeridos, e também por substâncias
hormonais secretadas pelo sistema nervoso entérico da parede gástrica (HALL;
GUYTON, 2011). A gastrina secretada na corrente sanguínea possui diversos graus
de afinidade para os seus receptores. Estão estabelecidos dois tipos:
colecistoquinina (CCK)-A e CCK-B. A gastrina circulante estimula os receptores de
CCK-B na membrana basolateral das células parietais, causando diretamente a
secreção de ácido gástrico. A libertação de gastrina e sua formação pelas células G
é inibida pela somatostatina secretada a partir de células D dentro do revestimento
do estômago (DACHA et al., 2015).
A acetilcolina é liberada pela estimulação parassimpática, ela estimula a
secreção de pepsinogênio pelas células pépticas, de ácido clorídrico pelas células
parietais, e de muco pelas células da mucosa; em comparação a histamina e
gastrina, estimulam fortemente a secreção de ácido pelas células parietais, mas tem
pouco efeito sobre as demais células (HALL; GUYTON, 2011); A estimulação da
38
secreção ácida, ocorre por ação direta na célula parietal através de receptores
muscarínicos do tipo M3, bem como indiretamente, pela eliminação do efeito
inibitório que a somatostatina exerce tanto nas células parietais como nas células
ECL (MÖSSNER; CACA 2005). Todos estes peptídeos de ação hormonal atuam
através de alteração nos canais de [Ca++] citosólico e de monofosfato de adenosina
cíclica (AMPc), como segundo mensageiro dirigido sobre a ação da H+/K+ ATPase
(CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009).
3.4 Úlcera gástrica
3.4.1 Conceito e epidemiologia
A úlcera gástrica é uma patologia bastante comum, considerada um problema
de saúde global (LAU et al., 2011; ROZZA et al., 2014). Só no continente americano
mais de dois milhões de adultos sofrem deste mal em alguma fase da vida
(FERREIRA, 2005), ocorrendo uma prevalência em homens em relação as mulheres
(SIPPONEN; VARIS; FRAKI, 1990; WU et al., 2008). As mulheres grávidas ou as
mulheres que tomam pílulas anticoncepcionais orais contendo estrogênio
apresentam uma frequência ainda mais reduzida de úlcera duodenal (VESSEY;
VILLARD-MACKINTOSH; PAINTER, 1992). No entanto, mulheres na menopausa
por exemplo, podem ter maior propensão a doença devido a menor secreção de
hormônios (ELIAKIM; ABULAFIA; SHERER, 2000), além disso, pacientes idosos
apresentam maior probabilidade de apresentar lesões devido ao alto consumo de
medicamentos (MIZOKAMI et al., 2012).
A úlcera péptica é uma lesão crônica, usualmente solitária que ocorre em
qualquer parte do trato gastrointestinal que é exposto a ação agressiva do suco
gástrico. A lesão é mais comum no estômago ou duodeno, levando a necrose da
mucosa superficial e também da camada muscular (KLEIN-JUNIOR; SANTIN;
ANDRADE, 2012); caracterizada por perda circunscrita de tecido, ou seja,
escoriação da mucosa (TOLEDO DIAS et al., 2009, BELAICHE et al., 2002). A lesão
pode persistir por até 20 anos, caracterizando-se por episódios repetidos de cura e
re-exacerbação (NAIK et al., 2007).
A patologia é resultado de um desequilíbrio entre agentes protetores (barreira
mucosa, secreção de muco, regeneração celular, produção de prostaglandinas) e
39
agentes agressores (secreção de ácido e pepsina) da mucosa gástrica (SANTIN et
al., 2010; TOLEDO DIAS et al., 2009).
3.4.2 Agentes agressores da mucosa
Algumas lesões ulcerosas podem ser de origem microbiana (Helicobacter
pylori) e, raras vezes, por outros processos infeciosos bacterianos, virais e parasitas,
sobre tudo em pacientes imunodeficientes. Outras lesões são de natureza
imunopática (CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009), estresse e por agentes
químicos, tais como anti-inflamatórios não esteroidais (AINES), consumo de cigarros
e bebida alcoólica (BELAICHE et al., 2002; LI et al., 2014). No entanto, um número
crescente de pacientes tem úlceras não associadas com estas causas, denominado
úlceras idiopáticas, este tipo de úlcera apresenta características únicas e está
associado a maior morbidade e mortalidade (NIV et al., 2014).
A Helicobacter pylori é o principal agente etiológico da úlcera péptica, em
países desenvolvidos chega a 40% e em países em desenvolvimento a taxa é maior
que 80% (SOUZA et al., 2009). H. pylori é um bacilo espiralado gram-negativo
microaerófilo não invasivo, capaz de colonizar a mucosa gástrica. Esta bactéria
secreta a enzima urease e produz amônia em quantidade suficiente para tamponar a
acidez do seu meio ambiente imediato, podendo assim sobreviver no estômago,
além disso, é capaz de produzir endotoxinas que lesam diretamente a mucosa e
produzem ulcerações (PORTH, 2004). É um importante fator causal na patogenese
da gastrite e úlcera por induzir a inflamação, o estresse oxidativo, dano no DNA,
apoptose das células epiteliais e indução da desregulação do ciclo celular (LEE et
al., 2004). Algumas anormalidades têm sido associados com a infecção por H. pylori,
incluindo a produção basal e estimulada de ácido, redução do efeito inibitório da
somatostatina na liberação de gastrina, e inibição da secreção ácida defeituosa em
resposta à distensão antral (CHAN; LEUNG, 2002).
Interessantemente, estudos epidemiológicos também revelaram uma
correlação entre infecção por H. pylori e algumas doenças localizadas fora do
estômago, como deficiência de ferro, trombocitopenia idiopática, deficiência de
vitamina B12, doença hepatobiliar, pancreática, cardiovascular e neurodegenerativa
(FRANCESCHI et al., 2014).
40
O etanol é considerado um dos agentes que induz mais intensamente a
úlcera (HIRUMA-LIMA et al., 2009) por exercer um efeito tóxico diretamente sobre o
epitélio gástrico, levando a formação de lesões necróticas por reduzir o muco e a
produção de bicarbonato (MASSIGNANI et al., 2009), sua ação gera edema na
mucosa, hemorragia, exfoliação de células subepiteliais e infiltração de células
inflamatórias, estas últimas produzem mediadores químicos que contribuem para
vasoconstrição, isquemia e estase na microcirculação levando a morte da células
gástricas (SANTIN et al., 2013). Além disso, o etanol induz estresse oxidativo, onde
espécies reativas de oxigênio (ROS), principalmente ânions superóxido, radicais
hidroxila e peróxidos lipídicos, são conhecidas por provocar o desenvolvimento de
úlcera gástrica (SMITH et al., 1996). Para eliminar ROS, a célula gástrica tem vários
antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, incluindo catalase (CAT), superóxido
dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa reduzida (GSH) e
glutationa S-transferase (GST), mas a geração excessiva de ROS, aumenta
peroxidação lipídica e esgota estes antioxidantes endógenos (BOLIGON et al.,
2014).
Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) também são importantes
causadores de úlcera, eles inibem a enzima cicloxigenase (COX 1 e COX 2) que
catalisa a reação do ácido araquidônico em prostaglandinas (HIRUMA-LIMA et al.,
2009; LEITE, 2004). Prostaglandinas endógenas são responsáveis pela regulação
da secreção de muco e bicarbonato, fluxo de sangue e proliferação de células
epiteliais, portanto, a inibição da síntese das prostaglandinas enfraquece as defesas
da mucosa gástrica, levando à formação de lesões no epitélio gástrico (CRYER,
2000; CHAN; LEUNG, 2002). Os AINEs estão entre as classes de medicamentos
mais prescritos no mundo, cerca de 30 milhões de pessoas os utilizam diariamente
(LUZ et al., 2006).
Motawi e colaboradores (2008), demonstraram que a elevação da secreção
de ácido gástrico, a infiltração de neutrófilos, as alterações na produção de NO e o
estresse oxidativo são mecanismos que contribuem para a ulceração induzida por
indometacina além da inibição de PGE2.
No estresse, a motilidade intestinal é alterada, e, aumenta-se o estímulo para
liberação de HCl, pepsina, histamina e peroxidase, aumentando a produção de
radicais livres (MOLEIRO, 2007). O aumento da peroxidação lipídica tem como
consequência a formação de espécies reativas de oxigênio, levando a formação de
41
lesões no lúmen gástrico (RODRIGUES et al., 2008). A úlcera causada por estresse
também está relacionada a distúrbios causados na microcirculação da mucosa
gástrica e redução na produção de muco (SING; MAJUR, 1999).
3.4.3 Agentes defensivos da mucosa
A mucosa gástrica apresenta mecanismos de defesa que a permitem suportar
a exposição frequente a uma vasta gama de fatores prejudiciais como pH,
osmolaridade e temperatura. Dentre os mecanismos, estão inclusos os de defesa
local e mecanismos neuro-hormonais que serão descritos a seguir:
Barreira de muco, bicarbonato e fosfolipídio: Essa barreira constitui a primeira
linha de defesa da mucosa gástrica, onde muco, bicarbonato e fosfolipídios
surfactantes cobrem a superfície da mucosa mantendo o microambiente neutro (pH
~ 7.0) e impedindo a penetração de pepsina e HCl e assim a digestão proteolítica da
superfície epitelial (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
Células Epiteliais da Superfície: a próxima linha de defesa da mucosa é
formada por uma camada contínua de células epiteliais da superfície que secretam
muco e bicarbonato, prostaglandinas e proteínas de choque térmico (TULASSAY;
HERSZENYI, 2010). Devido à presença de fosfolipídios nas suas superfícies, estas
células são hidrofóbicas e repelem agentes prejudiciais solúveis em água
(LICHTENBERGER, 1999). Interconectadas por junções de oclusão, as células
epiteliais da superfície formam uma barreira que impede a difusão de ácido e
pepsina (MONTROSE et al., 2006). As proteínas de choque térmico têm como
função a manutenção da homeostase celular, elas são formadas em resposta ao
estresse oxidativo, agentes citotóxicos e aumento da temperatura, evitando assim a
desnaturação de proteínas e protegendo as células contra lesões (TANAKA et al.,
2007).
Renovação Celular: O epitélio gástrico tem a capacidade de renovar as suas
células progenitoras da mucosa a cada 2-4 dias, essa característica importante
colabora na manutenção da integridade estrutural da mucosa, fornecendo maior
resistência ao tecido na formação de lesões (TULASAY; HERSZENYI, 2010).
Microcirculação Mucosa: A microcirculação mucosa é um fator essencial para
distribuição de oxigênio, nutrientes e remoção de substâncias tóxicas. Quando a
mucosa gástrica é exposta a agentes irritantes, ocorre, um aumento acentuado e
42
rápido no fluxo sanguíneo da mucosa, este aumento permite a remoção e diluição
do ácido ou agentes nocivos. As células endoteliais produzem potentes
vasodilatadores, como óxido nítrico (NO) e prostaciclina (PGI2) que protegem a
mucosa de lesões causadas por vasoconstritores como leucotrienos, tromboxanos e
endotelina (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
O óxido nítrico (NO) produzido no estômago esta fortemente envolvido nos
processos inflamatórias e vasculares, e ele pode exercer efeitos tanto de protecção
como agressão durante a ulceração gástrica (MUSCARÁ; WALLACE, 1999). A
enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) produz NO que exerce ações de
proteção, produzidas pela vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo, e também
por reduzir as interações endoteliais leucocitárias na microcirculação (KUBES;
SUZUKI; GRANGER, 1991). A expressão e ativação do óxido nítrico sintase
induzivel (iNOS) leva a um aumento da expressão de NO que aumenta injuria
tecidual por evocar a infiltração de células inflamatórias e formação de edema.
Assim, o equilíbrio entre a expressão e atividade de iNOS / eNOS no tecido gástrico
é importante para a produção adequada de NO, que contribui para a manutenção da
estrutura do tecido gástrico em resposta a agentes agressivos (MA; WALLACE,
2000; SANTIN et al., 2013).
Fatores luminais: São vários os componentes de defesa da mucosa na porção
luminal do epitélio gástrico. O suco gástrico apresenta em sua composição
substâncias capazes de reduzir a colonização bacteriana. A secreção de HCl,
imunoglobulinas e lactoferrina, contribuem na formação de um ambiente peculiar,
onde poucas substâncias conseguem se desenvolver (TULASAY; HERSZENYI,
2010).
Prostaglandinas: A geração continua de prostaglandinas (PGE2) e
prostaciclinas (PGI2) pela mucosa é crucial para a manutenção da integridade da
mucosa e a proteção contra agentes ulcerosos e necrosantes. Quase todos os
mecanismos de defesa da mucosa são estimulados ou facilitados por PGs, elas
inibem a secreção ácida, aumentam o fluxo sanguíneo da mucosa, estimulam a
produção de muco e bicarbonato e aceleram a restituição epitelial e cicatrização da
mucosa (TARNAWSKI, 1998).
43
3.4 Terapia antiúlcera
Durante muitos séculos a terapia antiúlcera foi realizada utilizando-se
antiácidos para neutralizar a secreção ácida, restrições alimentares e procedimentos
cirúrgicos (BARROS et al., 2008; KLEIN-JÚNIOR et al., 2010). Hoje em dia, as
principais drogas usadas para tratar essa condição são antagonistas dos receptores
da histamina do tipo 2 (cimetidina, ranitidina, nizatidina e famotidina) e inibidores da
bomba de prótons H+/K+ATPase (omeprazol, lansoprazol, pantoprazol e
esomeprazol) (KUBECOVA et al., 2011; SHEEN; TRIADAFILOPOULOS, 2011).
Ainda existem os antiácidos (hidróxido de magnésio, trissilicato de magnésio,
hidróxido de alumínio e bicarbonato de sódio), anticolinérgicos e drogas que
protegem a mucosa (sulcralfato, quelato de bismuto e misoprostol) e combinação de
antibióticos em casos de úlcera causada por H. pylori. (RANG; DALE; RITTER,
2001).
Os antagonistas dos receptores de histamina tipo 2 agem diretamente sobre
as células parietais provocando diminuição na liberação da secreção gástrica
(YUHONG; IRENEUSZ; RICHARD, 2006), são eficazes na cicatrização de úlceras
gástricas, mas não são capazes de evitar o aparecimento de úlceras recorrentes.
Por esta razão, começaram a ser usados por longos períodos, como terapia de
manutenção. No entanto, após 7 dias de tratamento, tolerância pode ser observada,
seguida por uma redução de 50% na eficácia do tratamento (SACHS et al., 2010).
Os inibidores da bomba de prótons lançados na década de 80, são fármacos
que inibem a secreção de ácido gástrico através da inativação da bomba de prótons
a partir da formação de ligações dissulfeto entre as moléculas reagentes com a
bomba (AIHARA et al., 2003). Esta classe não apresenta decréscimo na eficiência
por tolerância, por esta razão são as drogas mais comumente utilizadas no
tratamento da úlcera gástrica, porem seu uso por períodos prolongados pode causar
sérios efeitos adversos como hipersensibilidade, arritmia, impotência, ginecomastia e
desordens hematopoiéticas (SHEEN; TRIADAFILOPOULOS, 2011), também podem
ocasionar reações adversas graves, como aumento da susceptibilidade à
pneumonia e fraturas ósseas, trombocitopenia, deficiências de ferro e vitamina B12,
hipergastrinemia e câncer (DACHA et al., 2015; EOM; LEE, 2011; THOMSON et al.,
2010).
44
Os fármacos citoprotetores, como o sulcralfato e análogos das
prostaglandinas são capazes de potencializar os mecanismos de proteção da
mucosa e ou proporcionar uma barreira física sobre a superfície da úlcera (RANG,
2007). A droga sulcralfato liga-se seletivamente ao tecido ulceroso necrótico
servindo como barreira para o ácido, pepsina e bile, ele também absorve
diretamente os sais biliares (PORTH, 2004). Outro exemplo desta classe é o
Misoprostol, análogo da prostaglandina E2, que atua inibindo a secreção ácida,
enquanto estimula secreção de muco e bicarbonato (HAWKEY, 2000). Entretanto, o
Misoprostol (Cytotec®) não é utilizado rotineiramente no tratamento da úlcera por ter
ação abortiva, motivo pelo qual sua comercialização foi proibida em
estabelecimentos farmacêuticos (ARONSSON et al., 2007). A Carbenoxolona é um
terpeno que também possui importante atividade antiúlcera, mas não completamente
eficiente por demonstrar severos efeitos adversos (KLEIN-JÚNIOR; SANTIN;
ANDRADE, 2012)
O tratamento de erradicação do H. pylori está indicado para toda úlcera
duodenal ou gástrica, complicada ou não, sintomática ou não e, é particularmente
importante nos casos de úlcera complicada com hemorragia ou perfuração
(RAMÍREZ; TORRES; CARMONA, 2010).
O cumprimento terapêutico e a aparição de resistências antibióticas são os
determinantes principais da eficácia do tratamento da infecção por H. pylori. Neste
sentido, as pautas de tratamento podem ser modificadas em um futuro próximo pelo
aumento da resistência a macrolídeos e quinolonas secundárias. Não foram
detectados até o momento resistências significativas a outros antibióticos como
amoxicilina ou tetraciclinas. Por outro lado, ainda que H. pylori é resistente in vitro a
metronidazol, o tratamento prolongado e em doses altas com este fármaco
consegue a cura da infecção in vivo, inclusive em pacientes infectados por cepas
resistentes (GISBERT et al., 2012).
No tratamento de úlcera ocasionada por H. pylori utiliza-se uma terapia de
combinação a fim de erradicar a bactéria. Este consiste em omeprazol, amoxicilina e
claritromicina (RANG, 2007). A terapia tripla tem sido e continua sendo o tratamento
de primeira linha preconizado a mais de uma década (GISBERT; CALVET, 2006;
EGAN et al., 2007). Todavia a combinação de um inibidor da bomba de prótons,
claritromicina e amoxicilina ou metronidazol, todos eles administrados duas vezes ao
dia, é o tratamento recomendado pelo Grupo europeu de estudos do Helicobacter
45
(MALFERTHEINER et al., 2007). A combinação de ranitidina, citrato de bismuto
junto com os mesmos antibióticos (amoxicilina e claritromicina) também é
recomendada como primeira escolha. A eficácia de erradicação de ambas as pautas
é similar, levando em conta que o bismuto é seguro e geralmente muito bem
tolerado (GISBERT et al., 2005; FORD et al., 2008).
46
47
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Fármacos, reagentes e solventes
Atropina, Betanecol, Carbenoxolona, Histamina, Pentagastrina e Ranitidina
foram adquiridos da Sigma Aldrich e Omeprazol da Medley. Água foi obtida
utilizando sistema Milli-Q (Millipore, Massachusetts, USA). Todos os outros
reagentes e solventes foram de grau analítico.
4.2 Coleta e preparação do extrato
As folhas de V. condensata foram coletadas no munícipio de Itajaí-SC na
Universidade do Vale do Itajaí (S26°55’2”; W48°39’58”) em fevereiro de 2014 e
identificadas pelo engenheiro agrônomo Renê Artur Ferreira, uma exsicata foi
depositada no Herbário Barbosa Rodrigues sob o número (55272). O material
vegetal (2.395g) foi seco a temperatura ambiente, triturado (345g) e submetido a
maceração com etanol 99,6% a temperatura ambiente durante sete dias. Após, a
solução foi filtrada e concentrada em rota evaporador sobre pressão reduzida
obtendo-se aproximadamente 15g (4,34%) de extrato bruto etanólico (EBE).
As frações foram obtidas ressupendendo o EBE com etanol : água (1:1) e
submetendo-o a partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente:
hexano, diclorometano e acetato de etila. Os rendimentos das frações a partir do
EBE foram de (1,65g; 11,05%); (1,79g; 11,95%) e (1,23g; 8,25%), respectivamente.
4.3 Determinação do perfil fitoquímico
O perfil fitoquímico foi realizado seguindo metodologia proposta por Randau
et al. (2004), a fim de detectar a presença de alcaloides, antraquinonas, cumarinas,
esteróis, flavonoides, saponinas, taninos e triterpenos. Além disso, cromatografia em
camada delgada (CCD) foi usada para avaliar a composição química do EBE. Foram
usados como fase móvel hexano : acetona (7:3) e clorofórmio : metanol (8:2) e
reveladores específicos, como anisaldeído para terpenoides e cloreto férrico para
compostos fenólicos. Para efeitos de comparação foram utilizados diferentes
soluções padrões de terpenos e flavonoides (Ugaz, 1994).
48
4.4 Ensaios farmacológicos
4.4.1 Animais
Ratos fêmeas Wistar, pesando entre 150-200g e camundongos fêmeas Swiss
pesando entre 25 e 30g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale
do Itajaí – UNIVALI foram utilizados. Os animais foram mantidos em caixas de
polipropileno, em sala com controle de temperatura (25°C), umidade e ciclos
controlados claro/escuro 12 horas cada. Tendo ração e livre acesso a água.
Doze horas anteriores aos experimentos os animais foram mantidos em jejum
com auxílio de uma grade adicionada ao fundo da caixa para inibir a coprofagia,
permanecendo o livre acesso a água.
As normas preconizadas pelo CONCEA (Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal) sobre os aspectos éticos da experimentação animal foram
respeitadas. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do uso de
animais da Universidade do Vale do Itajaí (protocolo 020/13).
4.4.2 Avaliação da atividade gastroprotetora
Para avaliação da atividade gastroprotetora do extrato etanólico e frações de
V. condensata, foram utilizados diferentes modelos experimentais, todos baseados
em fatores etiológicos da doença, como uso abusivo de álcool, anti-inflamatórios não
esteroidais e aumento da secreção gástrica.
4.4.3 Determinação das doses
No Formulário de fitoterápicos da farmacopeia brasileira (2011) está descrito
que V. condensata é tradicionalmente utilizada na forma de infusão, preparada com
3g de folhas secas em 150 mL de água, ingerida três vezes ao dia, totalizando 450
mL/dia. Usando esta taxa, determinamos o resíduo seco, o qual foi equivalente a
0,59%. Isto significa que há cerca de 2655 mg de resíduo seco em 450 mL de
infuso.
Tomando estes valores como referência, pode-se considerar que para uma
pessoa pesando 80 kg esta posologia significa uma administração de
aproximadamente 33,2 mg/kg/dia de extrato. Então, as doses determinadas foram
49
de 3, 30 e 300 mg/kg, obtendo-se diferença logarítmica apropriada entre elas,
possibilitando estudo dose-resposta e, garantindo a abrangência de uma dose
menor e uma maior aquela recomendada.
As frações testadas: hexano (33 mg/kg), diclorometano (35 mg/kg) e acetato
de etila (24 mg/kg) tiveram as doses determinadas relacionando a dose mais ativa
do extrato no modelo de úlcera induzida por etanol e o rendimento de cada uma a
partir dele.
4.5 Modelos agudos de úlcera gástrica
4.5.1 Modelo de úlcera induzida por etanol
O método empregado foi descrito por Morimoto et al. (1991) com algumas
modificações. Os ratos foram divididos em diferentes grupos (n=6) que foram pré-
tratadas por gavagem com carbenoxolona na dose de 200mg/kg (controle positivo),
veículo (água / 1% tween, controle negativo), EBE nas doses de 3, 30 ou 300mg/kg
e as frações hexano (FHX 33 mg/kg), diclorometano (FDM 35 mg/kg) e acetato de
etila (FAE 24 mg/kg).
Após uma hora, foi administrado aos animais 1mL de Álcool etílico 99,6%
(agente lesivo), e uma hora após a administração do agente lesivo, os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os estômagos foram retirados e
abertos ao longo da curvatura maior, prensados em placas de vidro e digitalizados.
As imagens obtidas foram analisadas em software de análise de imagens
EARP® possibilitando a obtenção da área total de lesão (mm²) para cada grupo,
com este dado, foi possível calcular a redução de lesão em porcentagem,
considerando o controle negativo como 100% de lesão.
4.5.2 Modelo de úlcera induzida por anti-inflamatório não esteroidal
A metodologia empregada foi descrita por Nwafor et al. (2000), com algumas
modificações. Os ratos submetidos a jejum de 12 horas foram divididos em
diferentes grupos (n=6) pré-tratadas por gavagem com carbenoxolona 200 mg/kg
(controle positivo), veículo (água / 1% tween, controle negativo) ou EBE nas doses
de 30 ou 300 mg/kg. Após uma hora os animais receberam 80mg/kg de
indometacina (v.o) solubilizada em solução de bicarbonato 5%.
50
Após seis horas da administração da indometacina os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical, os estômagos foram retirados e abertos ao
longo da curvatura maior, prensados em placas de vidro e digitalizadas a fim de
determinar os parâmetros descritos anteriormente.
4.6 Estudo in vitro da atividade sequestradora de radicais livres (DPPH)
Este procedimento foi realizado de acordo com método descrito por Blois
(1958) e por Chen et al. (2004), com algumas modificações. O potencial redutor do
radical livre estável 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) do EBE foi determinado
através das absorbâncias medidas em espectrofotômetro a 517 nm.
750 µL de solução do extrato em diferentes concentrações (1, 3 e 10 µg/mL)
foram misturadas a 250 μL de solução metanólica de DPPH (1 mg em 25 mL). Após
5 minutos, o decréscimo da absorbância foi mensurado. Solução de ácido ascórbico
(AA: 50 μg/mL) foi utilizada como controle positivo do teste e água ultrapura como
controle negativo (veículo).
4.7 Avaliação da cicatrização gástrica
4.7.1 Modelo de úlcera crônica induzida por contato com ácido acético
A metodologia descrita por Okabe et al. (1971), com algumas modificações,
foi utilizada. Os ratos submetidos a jejum de 12 horas foram divididos em diferentes
grupos (n=6), anestesiadas com xilazina e cetamina (10 mg/kg e 5 mg/kg, i.p.,
respectivamente), e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao processo
apófise xifoide. Após a exposição do estômago, 500 µL de ácido acético 80% foram
colocados em contato com a camada serosa do estômago durante 1 minuto com
auxílio de uma cânula de plástico para delimitar o local de aplicação; após o tempo
determinado, o ácido acético foi removido, o local foi lavado com salina, seco com
algodão e a parede abdominal foi suturada.
Posteriormente a recuperação anestésica, os animais permaneceram em
jejum até o dia seguinte com livre acesso a água. Então, uma dieta alimentar foi
iniciada, constituída de oferta de ração duas vezes ao dia por uma hora durante todo
o tratamento (sete dias). O tratamento foi iniciado no segundo dia após a cirurgia,
51
administrado sempre após 30 min do recebimento da ração; os animais receberam
por via oral omeprazol (Ome) na dose de 20 mg/kg (controle positivo), veículo (água
/ 1% tween, controle negativo) e EBE na dose de 300mg/kg duas vezes ao dia.
Transcorrido os sete dias de tratamento, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical, os estômagos foram retirados e área da lesão foi medida em
comprimento x altura (mm2) com auxílio de uma régua graduada.
4.7.2 Avaliação microscópica
Avaliação histopatológica A lesão ulcerada induzida por ácido acético foi avaliada microscopicamente
de acordo com metodologia de Kallaya e colaboradores (2006) com algumas
modificações. Parte de amostras dos estômagos fixadas em solução Alfac (85%
etanol 80%; 10% formol e 5% ácido acético) e embebidas em parafina, foram
cortadas em secções de 5 μm.
Para avaliação de mudanças histopatológicas, uma parte das lâminas com os
cortes histológicos obtidos foram submetidas à coloração de hematoxilina e eosina
(HE), desidratadas em uma série ascendente de álcoois, diafanizadas em xilol e
montadas entre lâmina e lamínula. Mudanças histopatológicas e da extensão das
úlceras foram observadas em microscópio estereoscópico em aumento de 10x.
Avaliação histoquímica do conteúdo de mucinas
A análise histoquímica para mucina foi realizada de acordo com Mowry e
Winkler (1956). Os cortes histológicos obtidos como descrito anteriormente foram
oxidados em ácido periódico 0,5% por 5 min, lavados em água destilada, corados
com reativo de Schiff por 20 min e lavados em água sulfurosa e em água corrente.
As lâminas foram contracoradas com hematoxilina por 20 s, desidratadas em uma
série ascendente de álcoois, diafanizadas em xilol e montadas entre lâmina e
lamínula. As lâminas foram observadas em microscópio óptico em aumento de 400x
e fotografadas. As glicoproteínas (mucinas) coradas pelo ácido periódico de Schiff
(PAS) foram quantificados com o programa ImageJ® de acordo com descrito por
Pereira et al. (2013).
52
4.7.3 Preparação do tecido ulcerado para os ensaios bioquímicos.
A atividade enzimática da mieloperoxidase (MPO), catalase (CAT),
superóxido-dismutase (SOD), além dos níveis de glutationa reduzida (GSH) e
hidroperóxidos lipídicos (LOOH) foram determinadas.
Os ensaios bioquímicos foram realizados com tecido coletado no experimento
de úlcera crônica induzida por ácido acético, após a análise da lesão.
A parte muscular do estômago foi removida e a parte glandular com toda
lesão ulcerada foi pesada e homogeneizada em tampão fosfato 200 mM pH 6,5; a
quantidade utilizada foi de 3 vezes o volume em relação ao peso de cada tecido.
O homogenato obtido foi imediatamente utilizado para a quantificação dos
níveis de GSH e LOOH, posteriormente foi centrifugado por 20 minutos a 11.000 rpm
a 4°C utilizando uma ultracentrífuga. Com o sobrenadante do centrifugado
quantificou-se a atividade da SOD e CAT e com o precipitado a atividade da MPO.
A preparação do homogenato e todos os procedimentos bioquímicos
descritos a seguir foram realizados em banho de gelo (4°C).
4.7.4 Concentração de proteína nas amostras
A concentração de proteína foi determinada em placa de 96 poços, reagindo 5
µL de amostra com 200 µL de reagente de Bradford 25%, realizando a leitura da
absorbância em espectrofotômetro a 540 nm. Utilizou-se curva padrão de albumina 2
mg/mL (2,5 - 15 µg/mL) para interpolar as médias de cada amostra.
4.7.5 Quantificação dos níveis enzimáticos de mieloperoxidase (MPO)
O precipitado obtido a partir do homogenato, após centrifugação como
descrito no item (4.7.3) foi ressuspendido com 1 mL de tampão fosfato de potássio
0,08 M na presença de 0,5% de hexadeciltrimetilamônio (HTAB). Após agitação em
vórtex as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm por 20 minutos a 4 °C. Em
placas de 96 poços foram adicionados em duplicatas 30 μL do sobrenadante de
cada amostra acrescido de 220 μL de uma solução reacional (100 μL de tampão
fosfato 0,08 M, 85 μL de tampão fosfato 0,22 M e 15 μL de H2O2 0,017%).
53
Posteriormente, a reação foi iniciada com 20 µL de tetrametilbenzidina (TMB -
substrato enzimático que resulta em produto colorido), e incubada por 3 minutos a
37 °C.
Ao término do tempo reacional, 30 µL de acetato de sódio 1,46 M pH = 3,0
foram adicionados em cada amostra para interromper a reação e, a absorbância foi
mensurada em espectrofotômetro a 620 nm. Os resultados foram expressos como
unidade de densidade óptica (mD.O /mg de proteína/ 3 minutos).
4.7.6 Determinação in vitro da atividade enzimática de mieloperoxidase (MPO)
O EBE foi incubado diretamente com amostras de tecidos ulcerados pelo
método de úlcera induzida por ácido acético, tratados apenas com veículo e
portanto, com altos níveis de atividade da MPO; este tecido foi preparado conforme
item 4.7.3.
Em placa de 96 poços, foram adicionados 30 μL do sobrenadante da amostra
de tecido ulcerado com extrato em diferentes concentrações (0,1; 1 e 10 µg/mL) ou
água destilada (usado como veículo do ensaio) e incubado por 15 minutos a
temperatura ambiente. Após este período de incubação o procedimento seguiu
como descrito anteriormente, com adição de solução reacional, TMB e acetato de
sódio para interromper a reação. A absorbância foi mensurada em espectrofotômetro
a 620 nm. Os resultados foram expressos como unidade de densidade óptica (mD.O
/mg de proteína/ 3 minutos).
4.7.7 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH).
O total de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) na mucosa gástrica foi mensurado
conforme metodologia de Jiang et al. (1991).
Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 10 µL de metanol e 100 µL do
homogenato, posteriormente agitou-se os tubos em vórtex e centrifugou-se a 11.000
rpm 20 minutos a 4 °C em ultracentrifuga.
Em placa de 96 poços foram colocados 30 µL do sobrenadante e 140 µL de
meio reacional (Xilenol laranja, Ferro II, hidroxitolueno butilado solubilizados em
metanol) incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. A leitura foi realizada
em espectrofotômetro a 560 nm e, a concentração de LOOH foi determinada para
54
cada 1 mg de tecido. Desta maneira, os resultados foram apresentados como
mmol/mg de tecido.
4.7.8 Quantificação de grupos sulfidrílicos não proteicos (GSH)
Os níveis de GSH na mucosa gástrica foram determinados através do método
de Sedlak e Lindsay (1968). Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 50 μL
do homogenato de cada amostra preparado conforme item (4.7.3) e 40 μL de ácido
tricloroacético (ATC) 12%, os tubos foram agitados em vórtex e centrifugados por 15
minutos a 4.000 rpm 4 °C.
Em placa de 96 poços foram acrescidos 10 μL do sobrenadante, 290 μL de
tampão TRIS 0,4M (pH 8,9) e 5 μL de solução 3,96 mg/mL de DTNB (5,5’-ditiobis 2-
ácido nitrobenzoico) em metanol. Após 15 minutos realizou-se a leitura
espectrofotométrica em 420 nm. Os valores individuais foram interpolados numa
curva padrão de GSH (0,41 – 3,33 µg) e expressos em μg GSH/g tecido.
4.7.9 Quantificação dos níveis de superóxido dismutase (SOD)
As amostras foram preparadas conforme descrito no item (4.7.3), e o método
utilizado para determinação da SOD foi realizado de acordo com Marklund e
Marklund (1974).
Em eppendorf, 20 µL da amostra foram adicionados com 442 µL de tampão
Tris HCl 1 mM com EDTA 5 mM em pH 8,5 e agitado em vórtex. Após, foram
adicionados 25 µL de Pirogalol 1mM e incubados por 20 minutos; a reação foi
interrompida com 12,5 µL de HCl 1N.
Os tubos foram centrifugados por 4 minutos a 14.000 rpm e 200 µL do
sobrenadante foram pipetados para uma placa de 96 poços e lidos em
espectrofotômetro a 205 nm.
Os controles utilizados foram: Tampão Tris-EDTA + amostra e Tampão Tris-
EDTA + pirogalolol, realizados em triplicata. A média dos dois controles foi calculada
e somada, sendo o valor encontrado igual a 100% - 2 Unidades de SOD e, a média
das absorbâncias da amostra 50% - 1 Unidade de SOD. Os resultados foram
expressos em U de SOD/mg de proteína.
55
4.7.10 Quantificação da atividade enzimática da catalase (CAT)
As amostras foram preparadas conforme descrito no item (4.7.3), e a
determinação da atividade da catalase realizada conforme metodologia de Aebi
(1984). Em uma cubeta de quartzo foram adicionados 1960 µL de solução contendo
2,5 mL de Tampão Tris/ EDTA 5mM, pH 8,0; 172,5 µL de peróxido de hidrogênio
30% e 47,35 mL de água milli-Q e 40 µL de cada amostra. Para o branco, utilizou-se
40 µL de água ultrapura. A absorbância foi medida a 240 nm monitorada por 60
segundos. Os resultados foram expressos em mmol/min/mg proteína.
4.8 Toxicologia preliminar
Com a finalidade de avaliar possíveis efeitos toxicológicos provocados pelo
EBE, durante o experimento (4.7.1) onde os animais receberam tratamento durante
7 dias, duas vezes ao dia com veículo (água mais 1% tween), Omeprazol (20 mg/kg
v.o) ou EBE (300mg/kg v.o), foram observados diariamente alterações clínicas e
comportamentais. Ao término do experimento, os animais foram eutanasiados por
deslocamento cervical e os órgãos (baço, coração, fígado, ovários, pulmão, rins, e
útero) foram retirados e pesados. O peso relativo dos órgãos foi calculado através da
equação [(peso do órgão/peso do corpo) × 100] (OECD, 2001).
4.9 Avaliação da secreção gástrica, muco e atividade péptica
4.9.1 Ligadura de piloro
Este experimento foi realizado conforme o método descrito por Shay et al.
(1945), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum de 12
horas e divididos em diferentes grupos (n=6). Cada grupo de animais foi anestesiado
utilizando xilazina e cetamina (10 mg/kg e 5 mg/kg, i.p., respectivamente), e
submetido a uma incisão longitudinal abaixo ao processo xifoide, o estômago foi
exposto e o piloro amarrado com fio de sutura, a administração dos diferentes
tratamentos foi realizado por via intraduodenal: Veiculo: água mais 1% tween, 1
(controle negativo) e EBE nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg. O grupo Omeprazol (20
mg/kg) recebeu o tratamento via oral, 30 minutos antes da ligadura do piloro. Após
56
os tratamentos, as incisões foram suturadas e quatro horas após a cirurgia os
animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As incisões foram reabertas e
após pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do conteúdo gástrico) o
estômago foi retirado.
Os estômagos foram abertos ao longo da curvatura maior, lavados com 3 mL
de água destilada e todo conteúdo gástrico foi coletado em tubo cônico e
centrifugado por 15 min a 5.000 rpm.
Após o processamento do suco gástrico avaliou-se o pH, volume e acidez
total por titulação com hidróxido de sódio 0,1 N e fenolftaleína como indicador ácido-
base. Os resultados foram expressos em mL (volume), pH e mEq[H+] /mL/4h (acidez
total).
4.9.2 Atividade péptica
A quantificação da atividade péptica foi realizada de acordo com o método
descrito por Anson (1938) com algumas modificações. As amostras constituíram 100
μL de suco gástrico coletados a partir da secreção gástrica advinda do experimento
de ligadura do piloro descrito anteriormente (4.9.1). Após a coleta, as amostras
foram transferidas para tubos de eppendorf e incubadas com 500 μL de solução de
albumina bovina (5 mg/mL HCl 0,06N) a 37ºC por 10 min. Para interromper a
reação, foram adicionados 500 μL de ácido tricloroacético 10%, seguido pela
centrifugação dos tubos a 4.000 rpm durante 20 min. Posteriormente, 1 mL do
sobrenadante foi separado e alcalinizado com 5 mL de carbonato de sódio 0,55
mol/L. Então, 500 μL de reagente de Folin 1 N foram adicionados aos tubos e
incubados por 30 minutos em temperatura ambiente. Encerrado o período de
incubação, 300 μL de cada tubo foram transferidos para placa de 96 poços e, a
absorbância das soluções foi determinada por espectrofotômetro a 660 nm. Os
valores individuais foram interpolados em uma curva padrão de tirosina (6,25–200
µg/mL) e os resultados expressos em µM de tirosina/mL/4 hr.
4.9.3 Doseamento de muco na mucosa gástrica
Este ensaio foi realizado utilizando a porção glandular dos estômagos obtidos
no experimento de ligadura do piloro (4.9.1). O tecido coletado foi pesado e imerso
em 5 mL de solução Alcian blue 0,1% preparada em solução de sacarose 0,16 mol/L
57
diluída em acetato de sódio 0,05 mol/L, permanecendo neste durante 2 horas. A
solução de Alcian Blue foi removida, procedendo a lavagem dos estômagos em 5 mL
de solução de sacarose 0,25 mol/L por 15 minutos e por 45 minutos. Após a
remoção da solução de sacarose, solução de cloreto de magnésio 0,5 mol/L foi
adicionada a fim de extrair o corante aderido ao muco do tecido; esta última solução
permaneceu por 2 horas, tendo sido realizado a raspagem dos estômagos com
auxílio de pinças a cada 30 minutos neste período, todo procedimento foi realizado a
temperatura ambiente. Após leve homogeneização do líquido extrator, transferiu-se
1 mL deste para um tubo cônico, onde igual quantia de éter etílico também foi
adicionado. A mistura foi agitada em vórtex e centrifugada por 15 minutos a 3.000
rpm. Posteriormente, 200 µL da fase aquosa foi transferida para uma placa de 96
poços em duplicata, a absorção foi determinada em comprimento de onda de 598
nm. O conteúdo de muco foi calculado usando uma curva padrão de Alcian Blue
(6,25–100 μg/mL), e os resultados foram expressos em μg Alcian Blue/g tecido
(CORNE; MORRISSEY; WOODS, 1974).
4.9.4 Ligadura do piloro estimulada por Pentagastrina, Betanecol e Histamina
O procedimento de ligadura do piloro foi realizado igualmente ao
anteriormente descrito, com grupos de 6 animais distribuídos nos grupos: betanecol
+ veículo, betanecol + atropina, betanecol + extrato; pentagastrina + veículo,
pentagastrina + extrato; histamina + veículo, histamina + ranitidina, histamina +
extrato.
Após executar a ligadura do piloro, os animais receberam por via
intraduodenal veículo (água mais 1% tween), ou atropina (1 mg/kg), ou Ranitidina
(50 mg/kg), ou EBE na dose de 300 mg/kg.
A seguir, a parede abdominal foi suturada e após 1 hora da ligadura os
animais receberam os estímulos secretagogos por via subcutânea: histamina (20
mg/kg), betanecol (2,5 mg/kg) ou pentagastrina (0,4 mg/kg). Quatro horas após a
cirurgia, os animais foram sacrificados e seguiu-se o procedimento para coleta do
suco gástrico conforme descrito anteriormente (4.9.1).
58
4.10 Avaliação da atividade da H+, K+ ATPase in vitro
Para o isolamento e verificação da atividade da enzima H+, K+ ATPase foi
utilizado o estômago de coelho (Oryctolagus cuniculus). O estômago foi removido,
colocado imediatamente em banho de gelo, aberto pela curvatura maior e lavado. A
camada mucosa foi separada da região glandular, procedendo o isolamento dos
microssomos gástricos através da homogeneização do tecido da mucosa em tampão
de homogeneização: Tris.HCl 50 mM (pH 7,4) contendo sacarose 250 mM, MgCl2 10
mM, KCl 5 mM, EDTA 1 mM e coquetel de inibidores de protease 0,01%, utilizando 5
volumes de tampão/g de tecido. O homogenato foi centrifugado a 5.000 rpm durante
20 minutos, então o precipitado foi descartado e o sobrenadante novamente
centrifugado a 30.000 rpm durante 1 hora. Todos os procedimentos foram realizados
à temperatura de 4 °C.
A fase de purificação da H+, K+ ATPase foi realizada por centrifugação em
gradiente descontínuo de sacarose. O precipitado obtido da centrifugação de 30.000
rpm contendo as vesículas com H+, K+ ATPase foi ressuspendido em 3 mL de
sacarose 250 mM e cuidadosamente transferido para um tubo com sacarose 30% e
centrifugado novamente a 30.000 rpm por 1 hora. Duas bandas pequenas e um
precipitado foram obtidos. As membranas sedimentadas na superfície da solução de
sacarose 30% foram coletadas obtendo-se, assim, os microssomos purificados
contendo a enzima H+, K+ ATPase gástrica (KUBO et al., 1995). O material
enzimático foi congelado e guardado a - 80 °C até ser utilizado.
O conteúdo de proteína presente na amostra foi determinado em placa de 96
poços com o reagente de Bradford (conforme item 4.7.4). A caracterização da H+K+
ATPase foi realizada com bloqueio específico da bomba de prótons pelo inibidor
Omeprazol (345 μg/mL), e a fim de descartar a presença de Na+, K+ ATPase,
Ouabaína (728 μg/mL), inibidor específico de Na+, K+ ATPase foi utilizada.
Finalmente a atividade ATPásica foi determinada mediante quantificação do
fósforo inorgânico (Pi) liberado da hidrólise de ATP exógeno, na presença de K+,
pela enzima. A reação foi iniciada pela adição de 100 µl de proteína enzimática a
400 μL de tampão Tris.HCl (pH 7,4) contendo cloreto de magnésio 2,5 mM, cloreto
de potássio 20 mM e ATP 1 mM, na ausência e na presença de EBE (1, 10 e 100
μg/mL). A reação foi encerrada após 20 minutos de incubação a 37 °C pela adição
59
de 50 μL de ATC 50% e esfriamento rápido em banho de gelo (MURAKAMI et al.,
1992).
O fosfato inorgânico produzido foi determinado através da adição às amostras
de 1,5 mL da solução reagente contendo água (4,7 mL), ácido sulfúrico 10 N (0,7
mL), molibdato de amônio 2,4% (0,6 mL) e ácido ascórbico 10% (3 mL). As amostras
foram incubadas por 20 minutos em banho-maria a 37°C e a leitura da placa
realizada em espectrofotômetro a 820 nm. A atividade enzimática foi calculada
usando o coeficiente de extinção do Pi (11.000/M/cm) (BURCI, 2011).
4.11 Esvaziamento gástrico e transito intestinal
O esvaziamento gástrico e o transito intestinal foram avaliados de acordo com
método de Reynell e Spray (1958) com algumas modificações. Camundongos fêmea
foram divididos em grupos com 6 animais cada: Veículo (Vei: água mais 1% tween,
v.o); Tempo zero (TZ: água mais 1% tween, v.o); Atropina (Atro: 3mg/kg, s.c) e EBE
(300mg/kg, v.o).
Uma hora após os tratamentos por via oral ou 30 min após a administração da
atropina, 1 mL do marcador (0,5% de vermelho de fenol em 1,5% de
carboximetilcelulose em água) foi administrado e, imediatamente os animais do
grupo tempo zero foram sacrificados. Após 20 min da administração do marcador, os
demais grupos foram eutanasiados por deslocamento cervical. O abdômen dos
animais foi aberto e o estomago foi removido pinçando suas terminações para evitar
a perda de conteúdo gástrico, então, os estômagos foram abertos e lavados com 7
mL de água; todo este conteúdo foi transferido para um tubo cônico e centrifugado
por 30 min a 1.500 rpm. Uma alíquota de 150 µL do sobrenadante foi misturada com
150 µL de NaOH 0,025 N e a absorbância foi determinada a 598 nm. A absorbância
foi correlacionada com a concentração de vermelho de fenol no estômago, o qual é
dependente do esvaziamento gástrico, tornando possível determinar a porcentagem
de esvaziamento gástrico (EG) pela equação: %EG= 100 – (Abs x100) / Abs TZ.
Para avaliar o transito intestinal, após 20 min da administração do marcador,
o intestino delgado foi removido e com uma régua graduada foi mensurado o
comprimento total do intestino e a distância percorrida pelo marcador. O transito
intestinal pode ser determinado dividindo a distância percorrida pelo vermelho de
fenol pelo comprimento total do intestino e multiplicando este valor por 100.
60
4.12 Análise estatística
Os resultados obtidos foram apresentados como média ± erro padrão da
média de n=6. Utilizou-se a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida por
teste de Bonferroni. As análises foram realizadas usando o Programa GraphPad
Prism versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, EUA). Um valor de P menor que
0,05 foi considerado estatisticamente significativo (SOKAL; ROHLF, 1995).
61
5 RESULTADOS
5.1 Determinação do perfil fitoquímico
Uma análise fitoquímica preliminar por via úmida foi realizada para detectar a
presença de alcaloides, antraquinonas, cumarinas, esteroides, flavonoides,
saponinas, taninos e terpenos no EBE. Dentre as classes avaliadas, a presença
majoritária de flavonoides e terpenoides foi observada.
Além disso, cromatografia em camada delgada (CCD) revelada com
anisaldeído confirmou a presença de terpenoides e revelação com cloreto férrico
também evidenciou a presença de compostos fenólicos. Para efeitos de comparação
foram utilizadas diferentes soluções padrões de terpenos e flavonoides obtidos
anteriormente em nossos laboratórios.
5.2 Avaliação da atividade gastroprotetora
5.2.1 Úlcera induzida por etanol
Os efeitos do EBE sobre as lesões gástricas induzidas pelo etanol são
apresentados na tabela 1. O grupo tratado com veículo, como esperado, apresentou
a maior média de lesão da mucosa gástrica (67,11 ± 8,90 mm²), enquanto que a
carbenoxolona (controle positivo), foi capaz de reduzir significativamente a lesão em
95,36%. O pré-tratamento por via oral com extrato na dose de 3 mg/kg não reduziu a
área lesada em relação ao grupo controle, porém, as doses de 30 mg/kg e mais
efetivamente de 300 mg/kg reduziram em 55,07 e 87,48%, respectivamente,
caracterizando assim, um efeito dose dependente do extrato, apresentando DE50 de
28,4 mg/kg. A figura 4, apresenta as imagens dos estômagos que representam estes
dados.
62
Tabela 1. Efeito do tratamento com EBE no modelo de úlcera induzida por etanol em ratos.
Tratamento (v.o) Dose Área de Lesão (mm²) Redução (%)
Veículo - 67,11 ± 8,90 -
Cbn 200 mg/kg 3,11 ± 1,67*** 95,36
EBE 3 mg/kg 62,34 ± 15,60 7,10
30 mg/kg 30,15 ± 9,30*
55,07
300 mg/kg 8,40 ± 2,30*** 87,48
Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) *** (p < 0,001) comparando com veículo (água / 1% tween). Cbn: Carbenoxolona.
Os animais foram tratados por via oral com Veículo (Vei: Água / 1% tween), Carbenoxolona (Cbn) ou EBE.
No modelo de úlcera induzida por etanol a dose de 300 mg/kg do EBE foi a
que apresentou atividade gastroprotetora mais significativa, então, as doses das
frações foram estabelecidas relacionando esta dose e os rendimentos de extração a
partir do EBE. Os resultados da atividade gastroprotetora das frações acetato de
etila (FAE: 24 mg/kg), diclorometano (FDM: 35 mg/kg) e hexano (FHX: 33 mg/kg)
frente ao agente lesivo etanol estão representados na figura 5.
Neste experimento, o veículo apresentou média de área de lesão da mucosa
gástrica de 60,09 ± 16,26 mm2. A carbenoxolona (controle positivo), reduziu a área
de lesão em 94,82%. Todas as frações demonstraram atividade gastroprotetora, no
entanto, a FDM foi a que apresentou resultado mais significativo em relação ao
Figura 4. Imagens representativas do efeito gastroprotetor do EBE no modelo de úlcera induzida por etanol em ratos.
Vei Cbn
200 mg/kg
EBE
3 mg/kg
EBE
30 mg/kg
EBE
300 mg/kg
63
veículo, reduzindo a área lesada em 97,91% (p < 0,001), seguido pela FAE, com
redução de 69,46% (p < 0,01) e FHX que reduziu a área de lesão gástrica em
44,16% (p < 0,05).
Figura 5. Efeito do tratamento com as frações obtidas a partir do EBE no modelo de úlcera induzida por etanol em ratos.
Vei Cbn FAE FDM FHX0
20
40
60
80
100
Etanol
***
**
***
*
Áre
a L
esad
a (
mm
²)
Os animais foram tratados por via oral com Veiculo (Vei: Água / 1% tween), Carbenoxolona (Cbn 200 mg/kg), fração acetato de etila (FAE 24 mg/kg), diclorometano (FDM 35 mg/kg) ou hexano (FHX 33 mg/kg). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) ** (p < 0,01) *** (p < 0,001) comparando com veículo.
5.2.2 Úlcera induzida por anti-inflamatório não esteroidal
A administração oral de Indometacina 80 mg/kg induziu área de lesão gástrica
média de 8,58 ± 1,72 mm2 para o grupo veículo (controle negativo), a carbenoxolona
(controle positivo) apresentou significativa redução desta área (85,08%). O EBE
também diminui significativamente a área lesada em relação ao controle negativo
nas doses de 30 mg/kg (80,06%) e 300 mg/kg (70,97%), no entanto, as doses
apresentaram a mesma significância estatística (p < 0,01) (Tabela 3 e Figura 6). A
dose de 3 mg/kg não foi testada, uma vez que, não apresentou atividade
gastroprotetora no modelo de úlcera induzida por etanol.
64
Tabela 2. Efeito do tratamento com EBE no modelo de úlcera induzida por indometacina em ratos.
Tratamento (v.o) Dose Área de Lesão (mm²) Redução (%)
Veículo - 8,58 ± 1,72 -
Cbn 200 mg/kg 1,28 ± 0,65** 85,08
EBE 30 mg/kg 1,71 ± 0,73** 80,06
300 mg/kg 2,49 ± 1,19** 70,97
Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via seguida por teste de Bonferroni. ** (p < 0,01) comparando com veículo (água / 1% tween). Cbn: Carbenoxolona
Os animais foram tratados por via oral com Veículo (Vei: Água / 1% tween), Carbenoxolona (Cbn) ou EBE.
5.3 Atividade antioxidante in vitro (DPPH)
A capacidade antioxidante do extrato foi avaliada através do ensaio da
redução da atividade do radical DPPH (Figura 7). Como pode ser observado, o
veículo apresentou média de 46,32 ± 12,22 µM de DPPH, o ácido ascórbico (AA)
usado como controle positivo, reduziu significativamente a atividade do radical,
apresentando média de 7,53 ± 0,13 µM. O extrato apresentou atividade antioxidante
nas concentrações de 1, 3 e 10 µM, reduzindo os níveis do radical em 4,46 ± 0,05;
4,70 ± 0,05 e 0,20 ± 0,10 µM, respectivamente.
Figura 6. Imagens representativas do efeito gastroprotetor do EBE no modelo de úlcera induzida por indometacina em ratos.
Vei Cbn 200 mg/kg
EBE 30 mg/kg
EBE 300 mg/kg
65
Figura 7. Atividade sequestradora do radical DPPH do EBE in vitro.
Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ** (p < 0,01) comparando com veículo (Vei: água / 1% tween).
5.4 Avaliação da cicatrização gástrica
A figura 8, apresenta os resultados do tratamento com omeprazol (20 mg/kg)
e EBE (300 mg/kg) durante 7 dias 2 vezes ao dia de animais com lesões gástricas
induzidas por ácido acético 80%. Os resultados demonstram que omeprazol e EBE
reduziram a área de lesão significativamente (43,04 e 51,05% respectivamente) em
relação ao controle negativo (115 ± 8,46 mm2).
Vei AA 1 3 100
20
40
60
80
**
EBE (g/mL)
** ****
DP
PH
(
M)
66
Figura 8. Efeito do EBE no modelo de úlcera induzida por ácido acético em ratos.
Vei Ome 3000
50
100
150
***
80% Ácido acético
EBE(mg/kg, v.o)
Áre
a L
esad
a (
mm
2)
Os animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: água / 1% tween), Omeprazol (Ome: 20 mg/kg) ou EBE durante 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) ** (p < 0,01) comparando com veículo.
A figura 9 apresenta os dados macroscópicos (Figura A, B e C) e avaliação
histológica (Figura D, E e F) das lesões induzidas por ácido acético 80%. Em
conjunto, estas imagens permitem observar que omeprazol (Figura 9B e 9E) e EBE
(Figura 9C e 9F) promoveram a cicatrização da úlcera gástrica instalada,
comparando com o grupo veículo (9A e 9D).
67
Figura 9. Análise macroscópica (A, B e C) e microscópica (D, E e F) das úlceras gástricas crônicas induzidas por ácido acético em ratos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (água / 1% tween, painel A e D), Omeprazol (Ome: 20 mg/kg, painel B e E) ou EBE (300 mg/kg, painel C e F) durante 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão. As setas indicam o sítio da lesão. M: margem da úlcera e B: base da úlcera.
5.4.1 Efeito de V. condensata sobre a atividade da MPO após a indução de
úlcera gástrica crônica por ácido acético
A indução de lesão gástrica por ácido acético provocou aumento de 4 vezes
na atividade da enzima mieloperoxidase. Este resultado pode ser observado pela
diferença entre o grupo veículo (28 mD.O/mg proteína) e o grupo não ulcerado
(naive: 7,2 mD.O/mg proteína). O tratamento com omeprazol e EBE reduziram de
maneira significativa a atividade da enzima em relação ao grupo controle negativo
em 74,5 e 68,6%, respectivamente (Figura 10).
68
Contudo, quando o EBE (0,1; 1 e 10 μg/mL) foi incubado diretamente com
tecido ulcerado de animais tratados com veículo, a atividade da MPO não foi
modificada (Figura 11).
Figura 10. Efeito do EBE sobre atividade da MPO nas úlceras gástricas induzidas por ácido acético em ratos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (água / 1% tween), Omeprazol (Ome: 20 mg/kg) ou EBE durante 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão gástrica. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) ** (p < 0,01) comparando com veículo.
Figura 11. Efeito do EBE diretamente sobre atividade da MPO in vitro.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: água / 1% tween) 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão gástrica. EBE foi incubado in vitro com tecido ulcerado. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni.
69
5.4.2 Efeito de V. condensata sobre indicadores do estresse oxidativo
A indução de lesão ulcerativa provocada pelo ácido acético aumentou o
estresse oxidativo no tecido gástrico como observado pelos resultados da tabela 3, é
possível visualizar o aumento da concentração de LOOH no grupo veículo em
relação ao grupo naive em 187%. Contudo o tratamento com omeprazol reduziu os
níveis de LOOH significativamente (7,4 ± 0,4 mmol/mg de tecido) em relação ao
controle negativo (13,7 ± 2,2 mmol/mg de tecido), assim como o EBE que
demonstrou resultado ainda mais significativo (5,3 ± 0,9 mmol/mg de tecido).
A indução de lesão ulcerativa diminuiu os níveis de GSH do tecido gástrico,
dado observado pela diferença estatística do controle negativo (Vei 307 ± 43 µg/g
tecido) em relação ao grupo não ulcerado (Naive 474 ± 42 µg/g tecido). Os
tratamentos com EBE 300 mg/kg e omeprazol 20 mg/kg não foram capazes de
restaurar os níveis deste tripeptídeo no tecido.
A lesão causada pelo ácido acético também provocou uma redução nos
níveis das enzimas superóxido dismutase e catalase no grupo veículo (72,7 e 91,7%,
respectivamente) em relação ao grupo naive. No entanto, o EBE aumentou de forma
significativa os níveis destas enzimas (1365 ± 379 U/mg de proteína e 1980 ± 661
mmol/min/mg proteína, respectivamente), em relação ao controle negativo,
restabelecendo-as próximo aos níveis basais do grupo naive (1705 ± 307 U/mg de
proteína e 3125 ± 20 mmol/min/mg proteína), enquanto que o tratamento com
omeprazol não foi hábil em restaurar estes parâmetros.
70
Tabela 3. Efeito do EBE sobre indicadores de estresse oxidativo SOD, CAT, GSH e LOOH nas úlceras gástricas induzidas por ácido acético em ratos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (água / 1% tween), Omeprazol (Ome: 20 mg/kg) ou EBE durante 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão gástrica. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) ** (p < 0,01) comparando com veículo.
5.4.3 Avaliação histoquímica do conteúdo de mucinas
O conteúdo de glicoproteínas (mucinas) das úlceras crônicas induzidas por
ácido acético, foi avaliado pelo método histoquímico de PAS e quantificado com o
programa ImageJ®. A intensidade de marcação das glicoproteínas correspondentes
a mucinas, pode ser observada nas figuras 12A (veículo), 12B (omeprazol) e 12C
(EBE).
O omeprazol não alterou os níveis de mucina, enquanto o EBE aumentou em
119% a quantidade desta glicoproteína com p < 0,001 em relação ao controle
negativo (4,52 ± 0,54 pixels x 106/campo) (Figura 12D).
Tratamento
(v.o)
Dose
(mg/kg)
LOOH
mmol/mg
de tecido
GSH
(µg/g
tecido)
SOD
(U/mg de
proteína)
CAT
(mmol/min/mg
proteína)
Naive - 7,3 ± 0,4* 474 ± 42* 1705 ± 307** 3125 ± 20*
Vei 1 13,7 ± 2,2 307 ± 43 465 ± 103 258 ± 85
Ome 20 7,4 ± 0,4* 282 ± 29 485 ± 116 1980 ± 661
EBE 300 5,3 ± 0,9** 387 ± 60 1365 ± 379** 3041 ± 1120*
71
Figura 12. Níveis de mucina pelo método histoquímico de PAS das úlceras crônicas induzida por ácido acético em ratos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (água / 1% tween, painel A), Omeprazol (Ome: 20 mg/kg, painel B) ou EBE (300 mg/kg, painel C) durante 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão. As imagens são representativas da secção de estômagos de 4 animais, observando-se 5 campos diferentes em cada corte (aumento de 400x, escala 50 μm). As mucinas coradas pelo PAS foram quantificadas com o programa ImageJ®. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. *** (p < 0,001) comparando com veículo.
5.5 Análise toxicológica preliminar
A Análise toxicológica preliminar realizada através do experimento de úlcera
induzida por ácido acético, onde os animais receberam tratamento via oral por 7
dias, duas vezes ao dia com veículo (veículo, água mais 1% tween, 1 mL / kg),
omeprazol (20 mg/kg) ou EBE (300 mg/kg) não revelou nenhuma alteração de
comportamento durante o período de tratamento, bem como, não foram observadas
diferenças macroscópicas e no peso dos órgãos entres os animais tratados com
veículo em relação aos que receberam omeprazol e extrato (Tabela 4).
72
Tabela 4. Avaliação toxicológica preliminar em relação ao peso dos órgãos dos animais com úlcera induzida por ácido acético.
Peso dos órgãos (g)
Órgão Vei (v.o) Ome (v.o) EBE (v.o)
Coração 0,306 ± 0,02 0,322 ± 0,01 0,312 ± 0,01
Pulmão 0,552 ± 0,03 0,719 ± 0,05 0,677 ± 0,04
Baço 0,341 ± 0,03 0,295 ± 0,01 0,286 ± 0,01
Rim (E) 0,336 ± 0,04 0,351 ± 0,01 0,358 ± 0,01
Rim (D) 0,353 ± 0,02 0,301 ± 0,01 0,377 ± 0,01
Fígado 2,760 ± 0,08 2,745 ± 0,08 2,792 ± 0,54
Ovário (D) 0,042 ± 0,01 0,040 ± 0,04 0,060 ± 0,06
Ovário (E) 0,038 ± 0,01 0,051 ± 0,01 0,052 ± 0,01
Útero 0,261 ± 0,02 0,211 ± 0,01 0,195 ± 0,02
Os animais foram tratados por via oral com veículo (água / 1% tween), Omeprazol (Ome: 20 mg/kg) ou EBE durante 7 dias, 2 vezes ao dia, a partir do 2° dia da indução da lesão gástrica. (D: direito; E: esquerdo). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni.
5.6 Avaliação da secreção gástrica, atividade péptica e muco
5.6.1 Ligadura do piloro
Os resultados exibidos na tabela 5, referem-se ao efeito da administração
intraduodenal do EBE sobre a secreção gástrica, avaliado por meio do ensaio de
ligadura do piloro.
O grupo veículo apresentou volume de secreção gástrica de 6,78mL ± 0,55
mL com pH de 1,44 ± 0,16 e acidez total de 0,057 ± 0.005 mEq[H+] /mL/4h. Em
relação a estes valores, omeprazol reduziu significativamente o volume e acidez da
secreção gástrica e aumentou o seu pH, bem como a dose de 300 mg/kg do extrato.
73
A dose de 30 mg/kg do EBE, provocou aumento no pH da secreção gástrica,
mas não reduziu seu volume e acidez. A dose de 3 mg/kg não alterou de forma
significativa os parâmetros avaliados em relação ao controle negativo.
Tabela 5. Efeito do EBE na secreção gástrica basal no experimento de ligadura do piloro.
Tratamento Dose Volume (mL) pH Eq[H+]/mL/4h
Veículo (i.d) - 6,78 ± 0,55 1,44 ± 0,16 0,057 ± 0,005
Ome (v.o) 20 mg/kg 2,88 ± 0,25*** 6,69 ± 0,19*** 0,007 ± 0,003***
EBE (i.d) 3 mg/kg 6,82 ± 1,35 2,48 ± 0,43 0,046 ± 0,016
30 mg/kg 4,80 ± 0,60 2,65 ± 0,31* 0,041 ± 0,008
300 mg/kg 3,53 ± 0,44*** 3,54 ± 0,33*** 0,016 ± 0,006***
Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) *** (p < 0,001) comparando com veículo. Ome: Omeprazol.
5.6.2 Atividade péptica
A figura 13 apresenta os resultados da atividade péptica, como esperado, o
controle positivo omeprazol diminuiu a atividade péptica quando comparado ao
controle negativo (0,650 e 1,119 uM de tirosina/4 h respectivamente). Por outro lado,
o extrato não foi capaz de reduzir este parâmetro, apresentando média de 0,839 uM
de tirosina/4h.
74
Figura 13. Efeito do EBE na atividade péptica da secreção gástrica coletada no experimento de ligadura do piloro.
Os animais foram tratados por via oral com Omeprazol (Ome: 20 mg/kg) e por via intraduodenal com veículo (Vei: água / 1% tween) ou EBE. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ** (p < 0,01) comparando com veículo.
5.6.3 Doseamento de muco aderido a mucosa gástrica
A Tabela 6 apresenta os resultados obtidos para a quantificação de muco
aderido, realizado em animais tratados com omeprazol e EBE no experimento de
ligadura do piloro. Os animais tratados com veículo apresentaram uma média de 172
ug/g de tecido, enquanto aqueles tratados com omeprazol demonstraram um
aumento significativo em comparação com o controle (345 µg/g de tecido). No
entanto, o extrato não foi capaz de aumentar o muco comparado com o controle
negativo, com uma média de 148 µg/g de tecido.
75
Tabela 6. Efeito do EBE no doseamento de muco aderido a mucosa gástrica de animais do experimento de ligadura do piloro.
Tratamento Dose Alcian blue (µg/g tecido)
Veículo (i.d) - 172 ± 5,60
Ome (v.o) 20 mg/kg 345 ± 36,66***
EBE (i.d) 300 mg/kg 148 ± 24,41
Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. *** (p < 0,001) comparando com veículo (água / 1% tween).
5.6.4 Ligadura do piloro estimulada por agentes secretagogos
Considerando o efeito de inibir a secreção gástrica encontrado para o EBE na
dose de 300 mg/kg e, a fim de avaliar o mecanismo de ação pelo qual exerce este
efeito, novos ensaios de ligadura do piloro foram realizados utilizando diferentes
estímulos secretagogos (Histamina, Pentagastrina e Betanecol).
A figura 14 apresenta os resultados do efeito do EBE sobre a secreção
gástrica com estímulo da Histamina. Os resultados demonstraram que a
administração deste secretagogo, como esperado, aumentou o volume e a acidez da
secreção gástrica no grupo controle em relação ao grupo veículo que não recebeu
Histamina; a ranitidina, controle positivo, foi capaz de reduzir a secreção gástrica
com ou sem o estímulo, diminuindo significativamente o volume de secreção, acidez
e aumentando o pH em relação ao controle. No entanto, ao estímulo da Histamina, o
extrato não se comportou da mesma maneira, perdendo a capacidade de alterar
estes parâmetros.
Os resultados da ligadura com estímulo do secretagogo Pentagastrina são
exibidos na figura 15. O volume e acidez da secreção gástrica, aumentaram
significativamente no grupo controle em relação ao veículo que não recebeu
Pentagastrina. O extrato, que diminui volume e acidez e aumentou o pH da secreção
gástrica na ligadura basal, manteve estes efeitos mesmo com o estímulo do
secretagogo.
Perfil semelhante foi observado na ligadura estimulada pelo Betanecol (Figura
16). Os resultados revelaram que o estímulo com o secretagogo aumentou
76
significativamente o volume de secreção gástrica do controle em relação ao veículo
que não recebeu estímulo. A atropina (controle positivo), foi capaz de reduzir o
volume, acidez e aumentar o pH da secreção gástrica com ou sem o estímulo do
Betanecol, bem como o EBE de V. condensata.
Figura 14. Efeito do EBE na secreção gástrica no experimento de ligadura do piloro com estímulo da Histamina.
Os animais piloro-ligados foram tratados por via intraduodenal com Veículo (Vei: água / 1% tween), ranitidina (Ran: 50 mg/kg) ou EBE. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) ** (p < 0,01) *** (p < 0,001) comparando com veículo. +++ (p <0,001) comparado com controle (Cont: água / 1% tween) ### (p < 0,001) comparando com extrato sem administração do secretagogo.
77
Figura 15. Efeito do EBE na secreção gástrica no experimento de ligadura do piloro com estímulo da Pentagastrina.
Os animais piloro-ligados foram tratados por via intraduodenal com Veículo (Vei: água / 1% tween), ou EBE. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. *** (p < 0,001) comparando com veículo. +++ (p <0,001) comparado com controle (Cont: água / 1% tween).
78
Figura 16. Efeito do EBE na secreção gástrica no experimento de ligadura do piloro com estímulo do Betanecol.
Os animais piloro-ligados foram tratados por via intraduodenal com Veículo (Vei: água / 1% tween), atropina (Atp: 1 mg/kg) ou EBE. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ** (p < 0,01) *** (p < 0,001) comparando com veículo. + (p < 0,05) ++ (p < 0,01) +++ (p <0,001) comparado com controle (cont: água / 1% tween) ## (p < 0,01) comparando com extrato sem administração do secretagogo.
5.7 Efeito de V. condensata sobre a atividade da H+, K+ ATPase in vitro
O EBE nas concentrações de 1, 10 e 100 μg/mL não inibiu a atividade da
enzima H+, K+ ATPase in vitro. No entanto, o controle positivo omeprazol na
concentração de 345 μg/mL inibiu a enzima em 40,51 % (Figura 17). A Ouabaína
(728 μg/mL) também não inibiu a enzima, resultado esperado, uma vez que esta
droga é um inibidor específico de Na+, K+ ATPase.
79
Figura 17. Efeito do EBE sobre a atividade da enzima H+K+ ATPase in vitro.
Efeito da Ouabaína (Oua: 728 μg/mL), Omeprazol (Ome: 345 μg/mL) ou EBE sobre a atividade da enzima H+K+ ATPase. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ** (p < 0,01) comparando com veículo (Vei).
5.8 Esvaziamento gástrico e trânsito intestinal
O esvaziamento gástrico foi significativamente diminuído no tratamento com o
EBE 300 mg/kg (42,00 ± 8,31 %) em comparação com o grupo controle (65,62 ±
3,96%), enquanto que as doses de 3 e 30mg/kg não alteraram este parâmetro
(Figura 18).
Os resultados do trânsito intestinal (Figura 19), foram semelhantes aos do
esvaziamento gástrico, o extrato na dose de 300 mg/kg (31,69 ± 7,179 %) reduziu
significativamente este parâmetro quando comparado com o grupo de controle
(61,07 ± 6,24 %). Atropina o controle positivo, como esperado, reduziu o transito
intestinal de forma ainda mais significativa (17,65 ± 7,15 %). As doses de 3 e 30
mg/kg não reduziram o transito intestinal.
80
Figura 18. Efeito do EBE sobre o esvaziamento gástrico em camundongos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: água / 1% tween) ou EBE. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) comparando com veículo.
Figura 19. Efeito do EBE sobre o Trânsito intestinal em camundongos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: água / 1% tween) ou EBE e por via subcutânea com Atropina (Atp: 3 mg/kg). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * (p < 0,05) *** (p < 0,001) comparando com veículo.
Vei 3 30 3000
20
40
60
80
*
EBE (mg/kg, v.o)
Esvazia
men
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ástr
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(%
)
Vei Atro 3 30 3000
20
40
60
80
***
*
EBE (mg/kg, v.o)
Trâ
nsit
o In
testi
nal (%
)
81
6 DISCUSSÃO
A gastrite crônica continua a ser uma das patologias mais comuns com
consequências severas, uma vez que, a inflamação na mucosa gástrica ao longo da
vida resulta na destruição do tecido estomacal, e com o tempo, a piora progressiva
desta lesão eleva os riscos de provocar úlcera péptica e câncer gástrico. Além disso,
disfunções da mucosa gástrica podem promover falhas na absorção de vitaminas
essenciais, tal como a vitamina B12, micronutrientes (ferro, cálcio, magnésio e
zinco), alimentos e medicamentos, podendo causar diversos prejuízos a saúde do
indivíduo. Atualmente, em média, mais da metade da população mundial pode ter
gastrite (SIPPONEN; MAAROOS, 2015) e consequentemente, a úlcera gástrica
acaba afetando um grande número de pessoas (LAU et al., 2011).
A etiologia da úlcera gástrica não é completamente compreendida, mas está
estabelecido que relaciona-se principalmente a um desequilíbrio entre os fatores
protetores e agressores da mucosa gástrica (MARIA-FERREIRA et al., 2014). Dentre
os protetores, destacam-se a produção de muco e bicarbonato, regeneração celular,
fluxo sanguíneo e secreção de prostaglandinas, enquanto os principais agressores
são a secreção de ácido gástrico e pepsina (MALFERTHEINER; CHAN; MCCOLL,
2009; MORINI; GRANDI, 2010). Ademais, a úlcera gástrica pode ser desencadeada
por bactérias como H. pylori (CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009), estresse,
agentes químicos (excessivo consumo de álcool, cigarro e tratamento crônico com
anti-inflamatórios não esteroidais) (BELAICHE et al., 2002; LI et al., 2014) ou, por
nenhum desses fatores, nos casos de úlcera idiopática (NIV et al., 2014).
A terapia antiúlcera clássica e atual consiste em medicamentos supressores
da secreção gástrica, principalmente os antagonistas de receptores de histamina tipo
2 e os inibidores da bomba de prótons (KUBECOVA et al., 2011; SHEEN;
TRIADAFILOPOULOS, 2011). Em casos em que há infecção por H. pylori, uma
abordagem que combina antibióticos com inibidores da secreção gástrica está
estabelecida (MALFERTHEINER et al., 2007). Para outros casos específicos, como
úlcera hemorrágica, abordagens endoscópicas (CALVET; VERGARA; BRULLET,
2005) ou cirúrgicas (LEME; CARVALHO; MALHEIRO, 2003) são realizadas, bem
como, alterações na terapia com AINEs podem ser necessárias (DEEKS, 2013).
No entanto, existem algumas falhas na terapêutica, quando estudos apontam
que a supressão ácida ou a erradicação da H. pylori são insuficientes para um
82
processo cicatricial completo, e assim, aumentam a probabilidade de recorrência da
úlcera após o término do tratamento (KANGWAN et al., 2014); isto torna necessário
o uso prolongado de fármacos antissecretórios (TANG; CHAN, 2012), fator
responsável por provocar uma ampla gama de efeitos adversos destes
medicamentos, como aumento da susceptibilidade à pneumonia e fraturas ósseas,
trombocitopenia, deficiências de ferro e vitamina B12, hipergastrinemia e câncer
gástrico (DACHA et al., 2015; EOM; LEE, 2011; THOMSON et al., 2010).
Esta problemática conduz a pesquisa de novos fármacos antiúlcera, com
objetivo principal de melhorar a segurança, reduzindo a quantidade de efeitos
adversos e aumentar a eficácia, melhorando a cicatrização gástrica. As plantas
medicinais são importantes fontes a serem exploradas neste contexto, inclusive, têm
sido utilizadas em todo o mundo para tratar várias desordens do trato
gastrointestinal, tais como dispepsia, gastrite e úlcera péptica (SAFAVI; SHAMS-
ARDAKANI; FOROUMADI, 2014).
Vernonia condensata é um exemplo de planta medicinal que tem sido
amplamente utilizada pela população para as desordens gastrointestinais, portanto,
este estudo foi realizado para avaliar o efeito da espécie sobre a úlcera gástrica em
diferentes modelos experimentais em animais e investigar os mecanismos de ação
envolvidos no seu efeito, de maneira a contribuir para validação cientifica do uso
popular e avaliar seu potencial terapêutico.
As doses testadas do EBE foram determinadas a partir de uma correlação
entre dados do Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira (2011) e o
resíduo seco determinado, sendo o primeiro modelo farmacológico empregado, o de
úlcera induzida por etanol.
O etanol é um dos agentes ulcerogênicos que induz danos mais intensamente
na mucosa gástrica, promovendo distúrbios na microcirculação, isquemia,
degranulação de mastócitos e diminuição na produção de muco (ABDEL-SALAM et
al., 2001; HIRUMA-LIMA et al., 2009). Além disso, ocorre infiltração de células
polimorfonucleares (BOLIGON et al., 2014), estresse oxidativo, aumento dos níveis
de malondialdeído e diminuição do conteúdo de glutationa total nas células
(MASSIGNANI et al., 2009).
Os dados obtidos demonstraram que o extrato foi capaz de reduzir a lesão
gástrica provocada pelo etanol, verificada no controle negativo, de forma significativa
nas doses de 30 e 300 mg/kg, mas não na dose de 3 mg/kg. A carbenoxolona,
83
utilizada como controle positivo, também reduziu a área de lesão significativamente
em relação ao veículo, resultado esperado, considerando que este terpeno é
conhecido por sua propriedade gastroprotetora (KLEIN-JÚNIOR; SANTIN;
ANDRADE, 2012), ainda que pouco utilizado na clínica devido a seus efeitos
adversos (retenção de sódio e hipocalemia, hipertensão, edema e insuficiência
cardíaca) (NEWALL et al., 1996). O modelo de indução de lesão gástrica por etanol
é ideal para avaliar o potencial gastroprotetor das substâncias (REPETTO; LLESUY,
2002), então, por meio deste, ficou demonstrado o efeito gastroprotetor dose
dependente de V. condensata, com DE50 de 28,4 mg/kg.
Os anti-inflamatórios não esteroidais, como a Indometacina, são conhecidos
indutores de úlcera gástrica quando utilizados por longos períodos (WALLACE,
2001). Desde que as prostaglandinas desempenham um papel crítico na
manutenção do sistema de defesa da mucosa gástrica, a inibição de COX levando a
diminuição delas no tecido é considerado o fator mais importante na patogênese
deste tipo de lesão (MATSUI et al., 2011). Contudo, a secreção ácida gástrica,
infiltração de neutrófilos, alterações na produção de NO e estresse oxidativo são
mecanismos que também contribuem para ulceração causada por Indometacina
(MOTAWI; ELGAWAD; SHAHIN, 2008).
Os AINES não produzem lesões tão intensamente como etanol, mas são a
segunda maior causa de úlcera, principalmente em idosos, atrás apenas da infecção
por H. pylori (HARRIS; MISIEWCZ, 2001). Neste contexto, a úlcera induzida por
Indometacina foi o segundo modelo empregado no estudo. Ambas as doses do
extrato (30 e 300 mg/kg), reduziram de forma significativa a lesão em relação ao
controle negativo. Estes dados, estão de acordo com os apresentados por Frutuoso
et al., (1994), que relatou atividade gastroprotetora para uma fração polar do extrato
aquoso de V. condensata na dose de 200 mg/kg neste mesmo modelo.
Considerando o efeito promissor do EBE, as frações hexano, diclorometano e
acetato de etila também foram avaliadas no modelo de lesão por etanol. Os
resultados demonstraram atividade gastroprotetora para todas as frações. No
entanto, a diminuição da área lesada mais significativa em relação ao controle
negativo foi observada para a FDM. Este dado demonstra que o efeito gastroprotetor
do EBE, provavelmente, está relacionado a um conjunto de substancias ativas, que
por apresentarem características de polaridade distintas, foram separadas em
diferentes frações.
84
A triagem fitoquímica realizada neste estudo, revelou, principalmente
compostos fenólicos e terpenoides, os quais, são importantes classes de metabólitos
secundários do gênero Vernonia e, pelas características de polaridade, devem estar
principalmente nas frações mais ativas do extrato (FDM e FAE). Em estudos
anteriores, Zanon e colaboradores (2008) conduziram ao isolamento de três
triterpenos e três fitoesteroides da fração de diclorometano de V. tweediana. Além
disso, alguns triterpenos e lactonas sesquiterpênicas foram isolados de diferentes
espécies deste gênero (BOHLMANN et al., 1981; JAKUPOVIC et al., 1987).
Adicionalmente, os terpenos são conhecidos por apresentar propriedades
antiúlcera e gastroprotetora (ANDRADE et al, 2008; RODRIGUEZ; HIRUMA-LIMA;
SOUZA BRITO, 2004). Uma revisão sobre compostos antiúlcera de origem vegetal
mostrou que os triterpenos apresentam potencial antiulcerogênico devido a
capacidade para melhorar os fatores protetores da mucosa gástrica (BERTÉ et al.,
2014; LEWIS; HANSON, 1991). Assim como flavonoides, aos quais atribuem-se
capacidade de aumentar o conteúdo local de prostaglandinas, diminuir a secreção
ácida e estresse oxidativo (BORRELLI; IZZO, 2000).
Outros autores, identificaram também a presença do ácido cafeoilquínico,
ácido clorogênico, luteolina 7-O-glicosídeo, ácido 1,5-dicafeoilquínico, apigenina-O-
glucoronídeo e luteolina no extrato hidroetanólico (parte da planta não especificada)
de V. condensata (SALAWU et al., 2011). Dentre estes, o ácido clorogênico foi
estudado recentemente, demonstrando efeito gastroprotetor em modelos de úlcera
induzida por etanol e indometacina. Seu efeito foi relacionado a inibição da migração
de neutrófilos para o tecido e também a diminuição de algumas citocinas
antiinflamatórias e parâmetros do estresse oxidativo (SHIMOYAMA et al., 2013).
Apesar de AINES e etanol atuarem por mecanismos distintos na indução de
lesões gástricas, eles têm em comum a consequência de induzir estresse oxidativo e
diminuir fatores protetores da mucosa. O estresse oxidativo pode causar danos
severos as células da mucosa, induzindo processo de morte celular
(BANDYOPADHYAY et al., 2002; KAPLAN et al., 2012). Neste sentido, substâncias
com propriedade antioxidante podem colaborar para a proteção do tecido estomacal.
A capacidade antioxidante in vitro do EBE foi avaliada pelo método de DPPH,
demonstrando um grande potencial sequestrador de radical livre mesmo em baixa
concentração (1µg/mL). Estes resultados estão de acordo com Da Silva e
colaboradores (2013), que estudaram o potencial antioxidante desta planta utilizando
85
diferentes modelos. Os autores detectaram a presença de dois flavonoides
(apigenina e luteolina) na fração acetato de etila do extrato e os relacionaram a
atividade encontrada. A fração acetato de etila também demostrou atividade
gastroprotetora neste trabalho, provavelmente pela ação antioxidante de compostos
como estes.
Conhecendo então a resposta do extrato nos modelos agudos de lesão, foi
avaliado o potencial de cicatrização da úlcera gástrica de V. condensata utilizando o
método de úlcera induzida por contato com ácido acético 80%.
O interesse em avaliar este modelo, decorre do fato de que a lesão induzida
pelo ácido acético, é a mais semelhante a úlcera humana, tanto no mecanismo
patológico como no mecanismo de cicatrização. Além disso, responde a
medicamentos antiulcerogenicos como inibidores da bomba de prótons, sulcralfato e
fatores de crescimento, ou seja, é um modelo padrão para triagem de novos
fármacos com atividade cicatrizante gástrica. A úlcera gástrica formada é
caracterizada por lesão arredonda profunda na parede gástrica, envolvendo a
espessura da mucosa e camada muscular (OKABE; AMAGASE, 2005). Ainda, sua
estrutura consiste em margem, que possui tecido epitelial formado pela mucosa
adjacente não necrótica e base, constituído de tecido de granulação (tecido
conectivo) (KANGWAN et al., 2014).
Os resultados do tratamento com EBE por 7 dias duas vezes ao dia neste
modelo, demonstraram redução da área da lesão em comparação ao veículo,
inclusive, de maneira mais significativa que o tratamento com omeprazol.
O processo de cicatrização da úlcera é complexo e orquestrado. Envolve a
proliferação e migração das células epiteliais da margem até o tecido granulomatoso
para cobrir a úlcera e iniciar a reconstrução das glândulas (eventos controlados por
fatores de crescimento, prostaglandinas e outras citocinas produzidas pelas células
em regeneração) e, a formação de novos vasos, crucial para suprir a oxigenação e
nutrição do tecido (controlado principalmente por fatores de crescimento endotelial
vascular (VEGF) (KANGWAN et al., 2014).
No entanto, em alguns casos, numerosos neutrófilos e macrófagos persistem
abaixo do tecido regenerado, mesmo após a cicatrização da úlcera. Estes
macrófagos aumentam a produção e liberação de citocinas, levando a quimiotaxia e
acúmulo de neutrófilos que por sua vez, liberam proteases e espécies reativas de
oxigênio lesando o tecido cicatrizado e induzindo a recorrência da úlcera
86
(ARAKAWA et al., 2012). A análise histológica realizada no presente estudo,
confirmou a cicatrização gástrica das lesões tratadas com EBE e omeprazol,
contudo, a fim de investigar a qualidade desta cicatrização gástrica, a migração de
neutrófilos no tecido e o estresse oxidativo foram também avaliados.
Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima encontrada nos grânulos secundários
de neutrófilos, por isso, sua atividade é aceita como indicador da sua infiltração no
tecido (RIBEIRO et al., 2011). No tratamento com V. condensata e omeprazol, a
atividade da MPO foi reduzida em comparação ao grupo veículo, porém, quando
tecidos ulcerados foram diretamente incubados com EBE em diferentes
concentrações, não houve inibição da MPO. Estes resultados indicam que V.
condensata diminuiu de fato a migração de neutrófilos no tecido, e não atuou
inibindo diretamente a enzima; efeito anti-inflamatório que pode ter contribuído para
redução da lesão ulcerada.
A MPO catalisa a oxidação do íon cloreto (Cl-) pelo peróxido de hidrogênio
(H2O2) para formar ácido hipocloroso (HClO), o qual é tóxico para microrganismos
patogênicos mas também prejudicial ao tecido hospedeiro (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2006). Além disso, neutrófilos também são capazes de produzir
radical ânion superóxido (O2 -), então, para evitar a citotoxicidade destas e outras
espécies reativas, as células do trato gastrointestinal possuem um sistema de defesa
antioxidante composto por enzimas e substâncias com potencial sequestrador de
radicais livre (ROZZA et al., 2014).
A presença de processo inflamatório intenso com migração de leucócitos pela
indução de úlcera utilizando ácido acético foi comprovada pelo aumento da atividade
da MPO no grupo tratado com veículo quando comparado a um animal sadio (naive),
e a elevação no estresse oxidativo provocada por estes eventos pôde ser observada
pelo aumento de hidroperoxidação lipídica (LOOH) também no grupo veículo em
relação ao animal normal.
A hidroperoxidação de lipídios da membrana plasmática resulta na liberação
de componentes intracelulares, tais como enzimas lisossomais, que contribuem para
o desenvolvimento da lesão (DEMIR et al., 2003). Porém, animais tratados com
omeprazol e EBE diminuíram LOOH em relação ao grupo veículo.
Os dois principais meios de defesa antioxidantes no organismo podem ser
divididos em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos. Os sistemas não
enzimáticos envolvem a glutationa, um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina)
87
que existe no organismo em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG)
(JÚNIOR et al., 2001). Efetivamente, GSH participa diretamente como um potente
antioxidante e indiretamente como substrato para enzimas antioxidantes como
glutationa oxidase (GO), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR)
(CNUBBEN et al., 2001). Os resultados do tratamento com extrato e omeprazol
demonstraram não elevar os níveis da glutationa reduzida (GSH) em relação ao
veículo, no entanto, não é possível avaliar se isto ocorreu pela diminuição do
peptídeo no tecido ou pelo seu aumento na forma oxidada, o que poderia ser
atestado avaliando-se os níveis de GSSH e das enzimas GPx e GR não exploradas
neste trabalho.
Outros sistemas enzimáticos de defesa antioxidantes operando em conjunto
com as enzimas citadas anteriormente, incluem a superóxido dismutase (SOD),
dependente de Cu2+ e Zn2+ como cofatores, que promove a dismutação do radical
superóxido (O2 -) em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2), e a catalase,
que converte o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água (H2O) e oxigênio (O2)
(JÚNIOR et al., 2001). Em relação a estas enzimas, o tratamento com extrato
aumentou a atividade de ambas em comparação ao grupo veículo. No entanto, o
omeprazol não foi capaz de produzir este efeito, demonstrando a capacidade do
extrato em diminuir o estresse oxidativo de maneira mais eficaz e portanto melhorar
a qualidade da cicatrização gástrica.
Considerando que o muco gástrico também é importante durante o processo
de cicatrização gástrica por proteger as células da mucosa (DA SILVA, 2014), os
níveis de mucina das úlceras crônicas também foram mensurados pelo método
histoquímico de PAS e quantificados pelo software Image J®. Os resultados obtidos,
demonstraram que o tratamento com EBE elevou o conteúdo de mucina em relação
ao veículo, diferente dos animais tratados com omeprazol. Uma vez que, os
principais componentes de proteção pré-epitelial da mucosa gástrica são o muco e o
bicarbonato e o muco é constituído de 95% de água e 5% de glicoproteínas
denominadas mucinas (BERNE et al., 2004), os resultados atestaram um importante
efeito benéfico a proteção da mucosa gástrica por parte do extrato. Inclusive, um
aumento na produção de mucinas seria particularmente importante no tratamento da
úlcera idiopática, que tem sido relacionada com déficit especialmente de mucinas
ligadas a membrana (NIV et al., 2014).
88
O último parâmetro avaliado no experimento de úlcera crônica foi análise
toxicológica preliminar. O tratamento com extrato por 7 dias duas vezes ao dia não
afetou o comportamento, nem mesmo, produziu efeitos clínicos de toxicidade ou
alterou o peso órgãos dos animais. Contudo, para atestar a segurança do extrato,
ensaios mais específicos de toxicidade serão necessários.
Desde que os resultados obtidos até então, demonstraram atividade
gastroprotetora e cicatrizante gástrica do extrato etanólico de V. condensata,
experimentos que colaborassem para elucidação do mecanismo de ação da espécie
estudada foram realizados. Inicialmente, foi avaliado o efeito do extrato no ensaio de
ligadura do piloro, modelo que fornece parâmetros importantes sobre o efeito de
compostos sobre a secreção gástrica (LAKSHMI et al., 2010). Os resultados
demonstraram que o EBE na dose de 300 mg/kg atua inibindo a liberação de
secreção gástrica, bem como diminuindo sua acidez e aumentando o pH. A dose de
30 mg/kg, por outro lado, demonstrou uma tendência em reduzir o volume e acidez
da secreção gástrica, mas apenas o aumento do pH foi significativo. Como
esperado, a menor dose não alterou os parâmetros da secreção, haja visto que
também não apresentou efeito gastroprotetor nos modelos de úlcera induzida por
etanol e indometacina. Além disso, considerando que a administração do extrato foi
por via intraduodenal, estes dados indicam que o extrato é eficaz após absorção,
tem efeito sistêmico e, sua atividade antiúlcera não está relacionada a uma
neutralização local do conteúdo gástrico ou uma barreira física contra agentes
ulcerogênicos.
A atividade péptica da secreção coletada neste modelo também foi avaliada.
O pepsinogênio secretado pelas células principais é catalisado em pepsina, que
possui importante atividade proteolítica (RAUFMAN, 1996). A ativação da enzima
acontece num intervalo de pH da secreção gástrica de 1 a 4, em que a maioria das
proteínas sofre desnaturação (YAMAMOTO, 1975). O extrato não promoveu a
inibição da atividade péptica, provavelmente, por que o aumento do pH provocado
por ele foi menor que 4, então, é provável que a administração de V. condensata
não interfira na digestão proteolítica.
Adicionalmente, o muco aderido a mucosa gástrica também foi avaliado
neste modelo, pela sua importância, como já descrito anteriormente, como agente
protetor da mucosa. Contundo, o extrato não promoveu aumento deste parâmetro.
Como visto anteriormente, no tratamento crônico, EBE produziu significativo
89
aumento na produção de mucinas. Portanto, o resultado de doseamento do muco na
ligadura, demonstra que o efeito de aumentar a produção de mucinas não garante o
aumento na quantidade de muco aderido. No entanto, outro fator a ser considerado,
é que no experimento de ligadura de piloro uma única administração do extrato foi
realizada, enquanto no modelo do ácido acético a administração foi repetida 2 vezes
ao dia durante 7 dias.
Ademais, três mediadores químicos endógenos são responsáveis por
estimular a secreção do ácido clorídrico pela célula parietal, acetilcolina, gastrina e
histamina. Todos estes estímulos resultam na ativação da enzima H+-K+ ATPase que
funciona como bomba de prótons secretando íons H+ (CALABUIG; RELLOSO;
CUBERO, 2009). Então, modelos de ligadura do piloro foram novamente
empregados, desta vez estimulados pelos secretagogos citados, para avaliar os
efeitos de V. condensata nestas vias.
A histamina, contida em células enterocromafins é liberada através de um
mecanismo parácrino; quando liberada, difunde-se pelos espaços intercelulares até
atingir as células parietais, onde liga-se em receptores H2 estimulando a secreção
(BIGHETTI; ANTÔNIO; CARVALHO, 2002). A ranitidina, que é um conhecido
antagonista dos receptores H2 (KUBECOVA et al., 2011) bloqueou o efeito da
histamina sobre a secreção, já o extrato não produziu o mesmo efeito,
demonstrando não atuar por esta via. A gastrina estimula os receptores de CCK-B
na membrana basolateral das células parietais, estimulando a secreção de ácido
gástrico (DACHA et al., 2015), no entanto, a administração do extrato bloqueou o
efeito da pentagastrina. Da mesma maneira, bloqueou a estimulação da secreção
gástrica provocada pelo betanecol, um agonista dos receptores muscarínicos (M3).
Ensaios para avaliar o efeito in vitro do EBE sobre a enzima H+, K+ ATPase
também foram realizados. Inicialmente, a presença da isoforma correta da enzima foi
confirmada pela incapacidade da ouabaína em inibir a atividade ATPásica, por ser
um inibidor específico da enzima Na+ K+ ATPase. Como controle positivo foi utilizado
o omeprazol, inibidor específico não competitivo da enzima H+, K+ ATPase. O EBE
não foi capaz de inibir a enzima, concordando com os resultados obtidos nos
modelos de ligadura do piloro, uma vez que, caso o EBE tivesse sido capaz de inibir
a bomba de prótons in vivo, provavelmente, o EBE teria bloqueado a ação de todos
os secretagogos no modelo de ligadura do piloro, fator não observado.
90
Finalmente, foi avaliado o efeito do extrato sobre o esvaziamento gástrico e
trânsito intestinal, onde os resultados obtidos mostram que a dose de (300 mg/kg) foi
capaz de reduzir estes parâmetros. Sulfato de atropina foi utilizado como controle
positivo na avaliação da motilidade intestinal por ser um antagonista muscarínico, e
assim, diminuir a motilidade gástrica (YAKUBU; SALIMON, 2015).
A atividade da musculatura gástrica é modulada por influências miogênicas,
neurais e hormonais (ROSTAS; MAI; RICHARDS, 2011). A regulação neuronal pode
ser originada primariamente no plexo mioentérico gástrico, o qual também contribui
para a estimulação extrínseca parassimpática (vagal) e simpática (TACK, 2007).
Além disso, diferentes hormônios também regulam a motilidade de forma
estimulatória (gastrina, grelina e motilina) ou inibitória (colecistocina, glucagon,
peptídeo semelhante ao glucagon, peptídeo YY, secretina e somatostatina)
(ROSTAS; MAI; RICHARDS, 2011). Então, os dados destes experimentos
comprovaram a suposta atuação do extrato na via colinérgica e gastrinérgica, uma
vez que a ligadura do piloro demonstrou efeito inibitório de ambas as vias pela
inibição da secreção gástrica mesmo estimulada por betanecol e pentagastrina; e
quando estas vias estão inibidas é esperado que haja redução na motilidade
gástrica, resultado também observado.
De fato, os resultados sugerem que a melhor resposta de V. condensata
ocorre na dose de 300 mg/kg, a qual atua inibindo a secreção gástrica,
provavelmente, por interferir na estimulação gastrinérgica e colinérgica das células
parietais. Em conjunto, todos os dados levantados sobre a atividade do extrato,
atestam um grande potencial do seu efeito, uma vez que seu mecanismo de ação
combina um efeito inibidor da secreção gástrica com efeito antioxidante, aumento da
produção de mucinas e inibição de migração de neutrófilos favorecendo a
cicatrização gástrica. Inclusive, em alguns países a combinação de fármacos como
omeprazol e rebamipida são utilizados para melhorar a qualidade da cicatrização da
úlcera gástrica, devido justamente, a combinação do efeito antissecretório com o
efeito protetor da mucosa, com diminuição de mediadores inflamatórios e estresse
oxidativo que não acontece com o uso do omeprazol somente (PAI et al., 1998;
KANGWAN et al., 2014).
Enretanto, não podemos excluir a possibilidade de outros mecanismos
envolvidos no amplo processo de gastroproteção que não foram avaliados neste
estudo, e, estudos adicionais ainda precisam ser realizados para afirmar os
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compostos responsáveis pelo efeito de V. condensata, embora compostos fenólicos
e triterpenos estejam envolvidos, como observado pela triagem fitoquímica e a
resposta farmacológica das frações testadas. No entanto, os achados deste trabalho
contribuíram para validação cientifica do uso popular da espécie, demonstrando um
grande potencial terapêutico gastroprotetor e cicatrizante gástrico de V. condensata.
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7 CONCLUSÃO
O EBE apresentou atividade gastroprotetora dose dependente no modelo de
úlcera induzida por etanol, sendo as doses efetivas 30 e 300mg/kg. Essas doses
também foram ativas no modelo de úlcera induzida por indometacina.
As frações hexano, acetato de etila e de maneira mais significativa
diclorometano também apresentaram atividade gastroprotetora, indicando,
juntamente com os dados encontrados no perfil fitoquímico a participação de
triterpenos e compostos fenólicos na sua atividade.
EBE apresentou atividade cicatrizante gástrica na dose de 300mg/kg no
modelo de úlcera induzida por ácido acético. Provavelmente este efeito se relaciona
a um mecanismo de inibição da secreção gástrica através das vias colinérgica e
gastrinérgica observadas no modelo de ligadura do piloro, mas também, com a
inibição de migração de neutrófilos no tecido (evidenciada pela indireta diminuição
na atividade da MPO) aumento do conteúdo de mucinas, e diminuição do estresse
oxidativo (evidenciado pela diminuição de LOOH e aumento de SOD e CAT).
Além disso, EBE demonstrou inibir o esvaziamento gástrico e o trânsito
intestinal, mas não a enzima H+, K+ ATPase in vitro, confirmando os dados da
ligadura do piloro que, indicaram atuação do extrato nas vias colinérgicas e
gastrinérgicas por meio do bloqueio da ação dos secretagogos Betanecol e
Pentagastrina, respectivamente.
Em associação, os dados obtidos contribuem para validação científica do uso
popular de V. condendata para o tratamento da úlcera gástrica e dispepsia. Contudo
mais estudos são necessários para detalhar o mecanismo de ação, bem como para
avaliar os efeitos tóxicos e então garantir o uso seguro desta planta medicinal.
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Anexo – Parecer Comitê de Ética
