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UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Chenopodium ambrosioides L. (PAICO), SOBRE Candida
albicans CEPA ATCC 10231
PRESENTADA POR:
BACH. GIOVANNA BETSABETH YAURI MAMANI
BACH. ESPERANZA FAUSTA CHAMBILLA APAZA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO
ASESORA:
Mg. Diana Lucía Díaz Montoya
AREQUIPA – PERÚ
2018
i
UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
Chenopodium ambrosioides L. (PAICO)SOBRE Candida
albicans CEPA ATCC 10231
PRESENTADA POR:
BACH. GIOVANNA BETSABETH YAURI MAMANI
BACH. ESPERANZA FAUSTA CHAMBILLA APAZA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO
APROBADO POR:
PRESIDENTE DEL JURADO Dr. Berthing Calderón Rondón
PRIMER MIEMBRO DEL JURADO Mg. Larry Ramos Paredes
SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO Q.F. Carmen Burgos Macedo
i
AGRADECIMIENTO
A Dios por ser nuestro guía y protector.
A nuestros padres, hermanos, familiares y amigos que de una u
otra manera nos incentivaron con sus ´palabras de aliento para
culminar nuestros estudios.
A nuestra asesora: Diana Lucia Díaz Montoya por su apoyo en la
realización de este trabajo.
Al Mg. Q.F. Elvis Gilmar Gonzáles Condori por su motivación y
apoyo.
A nuestros docentes de la Universidad Privada Autónoma del Sur.
A los que hicieron posible el nacimiento de nuestra querida
Universidad para formar profesionales de bien social.
Giovanna Yauri Mamani y Esperanza Chambilla Apaza
ii
DEDICATORIA
A Dios por guiar mi camino y no abandonarme.
A mis queridos padres Martin y Valeria por su amor incondicional
y sacrificio para darme educación y dedicarse a formarme para
ser una persona de bien.
A mis hermanos, sobrinos, familiares y amigos que de una u otra
manera supieron darme palabras de aliento para continuar mis
estudios.
Giovanna Yauri Mamani
iii
DEDICATORIA
Esta tesis va dedicada a Dios por darme la vida, a los seres
maravillosos que Dios me puso en la tierra que son mis padres:
Margarita Apaza y Cirilo Chambilla por enseñarme a luchar por
lo que quiero, a ser humilde y dedicada para llegar al camino del
éxito y felicidad.
A mis hermanos: Lourdes, Marleni, Alvaro por su apoyo
incondicional.
Del mismo modo a mi esposo. Salomon Monrroy y mis tres grandes
tesoros: kevin, franck y Jhanndely por confiar y darme esta
oportunidad de un sueño que estaba por concluir los amo a todos.
Esperanza Chambilla Apaza
iv
RESUMEN
El uso de plantas medicinales para el tratamiento de enfermedades es común en el
Perú, además es considerado uno de los países más ricos en diversidad florística.
Por esta razón esta investigación tuvo por objetivo evaluar el efecto antimicótico del
extracto etanólico a partir de hojas de Chenopodium ambrosioides L. conocida
como “paico” sobre cepa de Candida albicans ATCC 10231.
El extracto etanólico a partir de hojas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
obtenidos por el método de extracción por Soxhlet dio como resultado un
rendimiento promedio de 4.91 ± 0.29 % de extracto seco. Por otro lado, se
identificaron flavonoides por la prueba de Shinoda, dando como resultado la
aparición de un color rojizo característico de las isoflavonas.
Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria del extracto de Chenopodium
ambrosioides L. “paico” sobre Candida albicans ATCC 10231 mediante el método
de diluciones en caldo peptonado, inhibiendo el crecimiento de estas levaduras a
la concentración de 0,80% (8mg/mL).
Posteriormente, se evaluó la Concentración Mínima Fungicida del extracto de
Chenopodium ambrosioides L. “paico” sobre Candida albicans ATCC 10231 dando
como resultado la misma concentración de extracto de 8 mg/ml equivalente al
0.80% por el método de siembra en placa en agar sabouraud.
La sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 se determinó a diversas
concentraciones de extracto etanólico de Chenopodium ambrosioides L. “paico”,
encontrándose que a concentraciones de 50.0, 20.0, 10.0, 5.0, y 2.5% se producen
halos de inhibición de crecimiento de 17.82, 14.62, 9.35, 8.70 y 7.40mm de
diámetro, respectivamente. Sin embargo, ninguna concentración presenta halos
comparables a la acción antimicótica del clotrimazol al 1%.
Palabras claves:
Chenopodium ambrosioides L., Candida albicans, Concentración mínima inhibitoria,
Concentración mínima fungicida, pruebas de sensibilidad.
v
ABSTRACT
The use of medicinal plants for the treatment of diseases is common in Peru, it is
also considered one of the richest countries in floristic diversity.
For this reason, the present investigation aimed to evaluate the antifungal effect
of the ethanolic extract from leaves of Chenopodium ambrosioides L. known as
"paico" against strains of Candida albicans ATCC 10231.
The ethanolic extracts from leaves of Chenopodium ambrosioides L. "paico"
obtained by the extraction method by Soxhlet resulted in an average yield of 4.91
± 0.29% of dry extract. On the other hand, flavonoids were identified by the
Shinoda test, resulting in the appearance of a reddish color characteristic of
isoflavones.
The Minimum Inhibitory Concentration of Chenopodium ambrosioides L. "paico"
extract on Candida albicans ATCC 10231 was determined by means of the
microdilution method in broth, inhibiting the growth of these yeasts at a
concentration of 0.80% (8mg / ml).
Subsequently, the Minimum Fungicide Concentration of the extract of
Chenopodium ambrosioides L. "paico" on Candida albicans ATCC 10231 was
evaluated, resulting in the same concentration of extract of 8 mg / mL equivalent
to 0.80% by the plating method. On Sabouraud agar.
The sensitivity of Candida albicans ATCC 10231 was determined at various
concentrations of ethanolic extract of Chenopodium ambrosioides L. "paico"
found that at concentrations of 50.0, 20.0, 10.0, 5.0 and 2.5% achieve halos of
inhibition of yeast growth at averages of 17.82 , 14.62, 9.35, 8.70 and 7.40mm of
diameter, respectively. However, no concentration presents halos comparable to
the antifungal action of clotrimazole at 1%.
Key words:
Chenopodium ambrosioides L., Candida albicans, minimum inhibitory concentration,
minimum fungicidal concentration, tests of sensitivity.
vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS
AGRADECIMIENTO i
DEDICATORIA ii
RESUMEN iv
ABSTRACT v
INDICE DE CONTENIDOS vi
ÍNDICE DE FIGURAS ix
ÍNDICE DE TABLAS x
TABLA DE ABREBIATURAS xi
INDICE DE ANEXOS xii
INTRODUCCIÓN xiii
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1. Planteamiento del problema de investigación 1
1.2. Formulación del problema 3
1.3. Objetivos de la investigación 4
1.3.1. Objetivo general 4
1.3.2. Objetivos específicos 4
1.4. Justificación del estudio 5
vii
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes de investigación 6
2.2. Base teórica 13
2.2.1. Paico 13
2.2.2. Candidiasis 16
2.2.3. Clotrimazol 20
2.2.4. Actividad antimicótica 21
2.3. Definición de Términos 22
2.4. Hipótesis 23
2.4.1. Hipótesis general 23
2.4.2. Hipótesis específicas 23
2.5. Variables 24
2.5.1. Definición conceptual de la variable 24
2.5.2. Definición operacional de la variable 24
2.5.3. Operacionalización de la variable 25
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN 26
3.1. Tipo y nivel de investigación 26
3.2. Descripción del ámbito de la Investigación 26
3.3. Población y muestra 27
3.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 27
CAPÍTULO IV
RESULTADOS 41
viii
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN 58
CONCLUSIONES 62
RECOMENDACIONES 63
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 64
ANEXOS 70
ix
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 1-metil-4-(1-metiletil)-2,3- dioxabiciclo[2.2.2] oct-5-eno
(Ascaridol).
14
Figura 2 1-[(2-clorofenil)-difenil-metil]imidazol (Clotrimazol). 20
Figura 3 Chenopodium ambrosioides L. (paico). 30
Figura 4 Sistema de extracción Soxhlet. 31
Figura 5 Reacción química en la prueba de Shinoda. 33
Figura 6 Preparacion de placas para el antibiograma. 39
Figura 7 Hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico). 41
Figura 8 Extracción por Soxhlet. 43
Figura 9 Extracto seco de Chenopodium ambrosioides L. (paico). 44
Figura 10 Presencia de isoflavonas. 45
Figura 11 Cepa de Candida albicans ATCC 10231. 46
Figura 12 Reactivación de la cepa ATCC 10231 de Candida
albicans.
47
Figura 13 Método de dilución en tubos. 48
Figura 14 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) y Concentración Mínima Fungicida (CMF) sobre
Candida albicans cepa ATCC 10231.
51
Figura 15 Sensibilidad bacteriana 52
Figura 16 Bloxplot data del efecto antimicótico sobre candida
albicans ATCC 10231
57
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Clasificación Taxonomía de Chenopodium ambrosioides L. 13
Tabla 2 Método de determinación de CMI por dilución en tubo. 36
Tabla 3 Identificación y tipificación de hojas de paico. 42
Tabla 4 Rendimiento extracto obtenido en las extracciones por Soxhlet. 44
Tabla 5 Concentración Mínima inhibitoria (CMI). 49
Tabla 6 Concentración Mínima Fungicida (CMF). 50
Tabla 7 Sensibilidad de Candida albicans al extracto de paico, clotrimazol
y etanol (Halos de inhibición).
53
Tabla 8 Análisis de varianza. 54
Tabla 9 Test de Tukey. 55
xi
INDICE DE ABREVIATURAS
1. CMI Concentración Mínima Inhibitoria
2. CMF Concentración Mínima Fungicida
3. UFC Unidades Formadoras de Colonias.
4. OMS Organización Mundial de la Salud.
5. ANOVA Análisis de varianza.
6. CMB Concentración Mínima Bactericida.
7. VIH Virus de la inmunodeficiencia humana.
8. SDA Agar Sabouraud Dextrosa.
9. HUSA Herbarium de la Universidad San Agustín de Arequipa.
10. S Sensible.
11. R Resistente.
12. I Intermedio.
13. % R Porcentaje de rendimiento.
14. A Peso de vaso en gramos.
15. B Peso de vaso con extracto seco.
16. M Peso de la muestra.
17. TWEEN 80 Surfactante hidrofílico.
18. TLC Thin layer chromatography (cromatografía de capa fina).
xii
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1 Identificación y tipificación taxonómica de Chenopodium
Ambrosioides L
71
ANEXO 2 Hojas de certificación de la cepa con ATCC 10231 72
ANEXO 3 Rendimiento de extracción de Chenopodium ambrosioides L. 75
ANEXO 4 Gráfico de test de Tukey 76
ANEXO 5 Test de normalización 77
ANEXO 6 Hojas seleccionadas y desinfectadas de Chenopodium
Ambrosioides L. (paico).
78
ANEXO 7 Secado de las hojas de Chenopodium Ambrosioides L. (paico). 78
ANEXO 8 Triturando las hojas de Chenopodium Ambrosioides L (paico). 79
ANEXO 9 Preparación de la escala de Mc. Farland. 79
ANEXO 10 Colonias de Candida albicans ATCC 10231 después de la
incubación.
80
ANEXO 11 Activando la cepa de Candida albicans ATCC 10231. 80
ANEXO 12 Preparación de placas con agar Sabouraud 81
ANEXO 13 Gelidificación de la preparación de agar sabouraud después
de autoclavar en placas Petri.
81
ANEXO 14 Tubos conteniendo diluciones: Extracto etanólico de paico
(tubos del 1 al 8); tubo 9: control (+) y tubo 10: control (-).
82
ANEXO 15 Medición de halos de inhibición usando el Vernier. 82
xiii
INTRODUCCIÓN
El conocimiento de la existencia de plantas medicinales viene desde nuestros
antepasados que usaron una diversidad de plantas para aliviar y en algunos
casos curar sus dolencias; es por eso y teniendo en consideración que la
incidencia por infección de candida está aumentando, y la necesidad de tener
una alternativa terapéutica con efecto eficaces y seguros, como se les atribuye
a las plantas con propiedades medicas a lo que se suma el uso empírico del
(paico) para infecciones fúngicas por parte de pobladores de bajos recursos
económicos1. Es por tal motivo que realizamos la siguiente tesis con la finalidad
de aclarar su efectividad; a fin de emplear agentes antifúngicos naturales y de
esta manera reducir el uso de los fármacos tradicionales.
En estos últimos años la Organización Mundial de la Salud (OMS) hizo un
llamado a todos los países y pidió que incentiven el uso racional de fármacos,
motivando la investigación y desarrollo de nuevos agentes antibacterianos55.
Se ha presentado un aumento de enfermedades fúngicas en años recientes; esto
debido al aumento considerable de pacientes inmunocomprometidos, como
pacientes con quimioterapia, nutrición parenteral, cirugía de trasplante, el uso de
agentes antimicrobianos de amplio espectro, los pacientes con Sida, quienes son
altamente susceptibles a las infecciones oportunistas como son las
enfermedades fúngicas56.
Las células humanas y fúngicas son muy similares ya que estas comparten gran
parte de las vías del metabolismo intermediario, utilizan enzimas muy parecidas
y no es posible encontrar blancos que acepten la selectividad requerida para
obtener un antimicótico seguro y eficaz. 57.
En vista que en muchas investigaciones a nivel mundial se ha estudiado que la
variedad de plantas aromáticas poseen actividad antibacteriana, antiparasitaria,
antimicótica y con efectos insecticidas58 y considerando que Chenopodium
ambrosioides L. se le atribuye efectos antifúngicos, realizamos la presente tesis
xiv
con el fin de determinar la actividad fúngica del extracto etanólico de hojas de
Chenopodium ambrosioides L. de la Irrigación la Cano, Distrito la Joya,
Departamento de Arequipa, sobre Candida albicans.
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1. Planteamiento del problema de investigación
La candida, es un hongo polimórfico debido a que puede presentar
morfología levaduriforme, puede crecer como hongo filamentoso formando
hifas verdaderas. Es considerado un comensal oportunista que existe como
parte de la microbiota del área mucocutánea, gastrointestinal y
genitourinaria, coloniza las membranas mucosas en el 30 a 60 % en los
seres humanos. Bajo ciertas condiciones y en el hospedero susceptible, es
capaz de causar infecciones superficiales y sistémicas, siendo el hongo
patógeno principal del ser humano1.
Los factores de virulencia de este patógeno oportunista incluyen su
habilidad para sobrevivir como comensal, la adherencia a células del
hospedero, la secreción de enzimas degradativas y el cambio de
morfología1. Estos factores de virulencia juegan un papel en cada etapa de
la infección por Candida albicans2.
El género Candida comprende aproximadamente 200 especies, el más
importante patógeno de los clasificados dentro del género Candida es la
Candida albicans. Se reproduce por medio de esporas y es de amplia
distribución cosmopolita3. Sin embargo, en la actualidad existe un aumento
en la incidencia de infecciones documentadas por otras especies distintas
a la Candida albicans, por ejemplo, Candida tropicalis, Candida krusei.
Estas levaduras son productoras de micosis “oportunistas” en el organismo
algunas veces inmunodeprimidos. La Candida albicans, es la que produce
patologías con más frecuencia en el hombre causando variadas
manifestaciones clínicas4.
Etimológicamente hablando, la candidiasis, es una infección cosmopolita.
Su incidencia ha aumentado considerablemente en los últimos 20 años. Las
levaduras son causantes del 7,45% de las micosis, el 25% de las micosis
2
superficiales y entre el 75 y 88% de las infecciones fúngicas hospitalarias.
Afecta a individuos de cualquier edad, sexo o grupo étnico3.
Las levaduras del género Candida están en la naturaleza, en el suelo y
agua dulce, vegetales, frutas, exudado de árboles, granos y en general toda
sustancia rica en hidratos de carbono simples4.
La Candida albicans es el más importante agente productor de micosis en
humanos, estas causan desde alteraciones superficiales como rash leve
hasta infecciones invasivas. Las infecciones superficiales pueden afectar la
piel, uñas y mucosas. En tal sentido, la piel húmeda y las mucosas oral y
vaginal son lugares donde la infección candidiásica es frecuente.
En el embarazo, la vejez y la infancia son frecuentes las candidiasis
superficiales y lo mismo sucede en personas que usan prótesis dentales y
diabéticos. En personas con inmunodeficiencias celulares, como las
infectadas por el VIH.
En España, se han reportado casos de candidiasis entre mujeres jóvenes
de 18 a 29 años, al haber hecho uso de servicios higiénicos públicos5.
3
1.2. Formulación del problema
A. Problema principal
¿Cuál es la actividad antimicótica del extracto etanólico de hojas secas
de Chenopodium ambrosioides L. “paico” sobre Candida albicans CEPA
ATCC 10231, comparada con clotrimazol al 1%?
B. Problemas secundarios
¿Existirá la presencia de flavonoides en el extracto etanólico de las
hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”?
¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto
etanólico de hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
sobre Candida albicans cepa ATCC 10231?
¿Cuál es la Concentración Mínima Fungicida (CMF) del extracto
etanólico de las hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
sobre Candida albicans cepa ATCC 10231?
¿Cuál es el grado de sensibilidad que presenta Candida albicans cepa
ATCC 10231 al extracto etanólico de las hojas secas de Chenopodium
ambrosioides L. “paico”, mediante la técnica de difusión en disco
comparado con clotrimazol al 1%.
4
1.3. Objetivos de la investigación
1.3.1. Objetivo general
Determinar la actividad antimicótica del extracto etanólico de las
hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico” sobre Candida
albicans cepa ATCC 10231.
1.3.2. Objetivos específicos
Extraer mediante el equipo Soxhlet los metabolitos de las hojas secas
de Chenopodium ambrosioides L. “paico”.
Identificar la presencia de flavonoides en el extracto etanólico de las
hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico” mediante a
prueba de Shinoda.
Determinar la sensibilidad que presenta Candida albicans cepa ATCC
10231 sobre el extracto etanólico de las hojas secas Chenopodium
ambrosioides L. “paico”, mediante la técnica de difusión en disco
comparado con clotrimazol al 1%.
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto
etanólico de las hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
sobre Candida albicans cepa ATCC 10231.
Determinar la Concentración Mínima Fungicida (CMF) del extracto
etanólico de las hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
sobre Candida albicans cepa ATCC 10231.
5
1.4. Justificación del estudio
Considerando que la candidiasis es una infección primaria o secundaria,
causada por levaduras del género Candida, con manifestaciones clínicas
extremadamente variables de evolución aguda, subaguda, crónica o
episódica, en las cuales el hongo puede causar lesiones cutáneas, muco-
cutáneas, profundas o diseminadas, causada generalmente por Candida
albicans y que puede afectar a cualquier persona sin diferenciar edad o
clase social, cabe la necesidad de brindar una alternativa de tratamiento
para dicha enfermedad, en tal sentido, la medicina tradicional a base de
plantas medicinales es un campo muy atractivo y se presenta como una
alternativa terapéutica para patologías específicas por su bajo costo y fácil
acceso de la población de bajos recursos económicos. En nuestro país
tenemos una gran variedad de plantas con muchas propiedades, las cuales
podrían utilizase como alternativa terapéutica.
El paico “Chenopodium ambrosioides L.”, es una planta aromatica de olor
fuerte, a la cual se le atribuye propiedades antiinflamatorias, antisépticas,
antiparasitarias y efecto antimicótico, por lo que, considerando las
afecciones producidas por la candidiasis, resulta importante determinar el
efecto antimicótico de las hojas secas de Chenopodium ambrosioides L.
(paico) y además compararlo con un producto que se expende en el
mercado Farmacéutico.
6
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes de investigación
2.1.1. Internacionales
Pardo AK, et al. (2011). En su trabajo de investigación titulado
“Determinación de la actividad antifúngica de extractos de Lantana
cámara frente a Cándida spp. Infectio”. Determinaron si los extractos de
la planta Lantana cámara presentan actividad antifúngica frente a seis
especies de Candida spp y un aislamiento humano de origen primario. Se
obtuvieron los extractos etanólicos totales por el método de percolación y
se hizo fraccionamiento cromatográfico con eluyentes de diferente
polaridad. Se caracterizaron los grupos funcionales mediante
espectroscopía infrarroja12.
La actividad antifúngica se evaluó frente a seis especies de Candida spp.
(C. albicans, C. dubliniensis, C. krusei, C. guillermondii, C. tropicalis, C.
parapsilosis y un aislamiento primario de C. albicans). La prueba de
inhibición del crecimiento se hizo con un ensayo en suero humano,
observando con absorbancia a 600 nm las curvas de crecimiento
relacionadas. El análisis por espectroscopía infrarroja demostró la
presencia de flavonoides en los tallos y en las hojas de L. cámara. Se
encontró una fracción de tallo que inhibió el crecimiento de C. dublinensis
y C. albicans, tanto para la cepa de referencia como para el aislamiento
primario, y otra que inhibió C. guillermondii. Una fracción de hojas inhibió
C. krusei. Se concluye que existe fracciones con presencia de flavonoides
y con efecto antifúngico en el tallo y en las hojas de L. cámara12.
7
Martínez S. et al. (2011). Realizaron un estudio in vitro de la actividad
antifúngica de extractos vegetales del género Baccharis sobre
Candida albicans” con la finalidad de buscar alternativas para el control
del crecimiento de microorganismos patógenos, se investigó la actividad
antifúngica de plantas del género Baccharis, utilizando extractos no polares
y polares, de las especies Baccharis latifolia, Baccharis genistelloides,
Baccharis obtusifolia, Baccharis papillosa, Baccharis santelicis, sobre
cepas ATCC de Candida albicans . Presentando actividad inhibitoria los
extractos de Baccharis latifolia13.
Por otra parte, Yánez G. y Velasteguí R. Evaluaron la actividad
antimicrobiana y Fitoquímica de extractos de plantas medicinales
frente a los microorganismos patógenos Escherichia coli y Candida
albicans. Emplearon 4 metodologías de obtención de extractos de 8
especies vegetales. Las metodologías de extracción involucraron solventes
de diferente polaridad tales como: agua, etanol y hexano14.
Las plantas medicinales estudiadas fueron: Albahaca (Ocimum basilicum),
ambo (Nicandra physalodes), guayaba (Psidium guajava), hierba luisa
(Cymbopo goncitratus), matico (Aristeguietia glutinosa), ortiga negra (Urtica
dioica), paico (Chenopodium ambrosioides), tomillo (Thymus vulgaris). Los
resultados obtenidos con el extracto etanólico de paico demostró que inhibe
en un 100% el crecimiento de Escherichia coli a una concentración de 2500
mg/l. Para la levadura Candida albicans el extracto etanólico de paico y el
extracto etanólico de tomillo demostraron que inhiben el crecimiento de la
levadura a una concentración de 2500 mg/L14.
El subsecuente análisis Fitoquímica determinó que las hojas de paico y
tomillo contienen metabolitos secundarios tales como: Aceites esenciales,
taninos, flavonoides y triterpenos, esteroides, alcaloides (paico) y
saponinas (tomillo) 14.
8
2.1.2. Nacionales
Scavino, RR, Saldaña CA. (2015). En su trabajo de investigación
titulado “Evaluación de la actividad antifúngica in vitro del extracto
etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia (Indano) frente a
Cándida albicans y Trichophyton rubrum, por el método de
macrodilución”. Evaluaron la Actividad Antifúngica In Vitro mediante el
Método de macrodilución para hongos, con el extracto etanólico de la
corteza de Byrsonima crassifolia (Indano). La muestra fue recolectada
en la Zona Reservada Allpahuayo - Mishana; la muestra se identificó
taxonómicamente en el Herbarium Amazonense de la Universidad
Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) y fue depositada para su
conservación en la Xiloteca de la Facultad de Ingeniería Alimentarias –
UNAP. La determinación del screening fitoquímico se realizó en el
laboratorio de la Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias -
UNAP. Las dosis del extracto fueron 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625,
0.78125, 0.39063 y 0.1953 mg/mL, se utilizó como control positivo
ketoconazol obteniendo un CMI de 2.5 µg/mL y fluconazol obteniendo un
CMI de 3.12 µg/mL. El screening fitoquímico del extracto etanólico de la
corteza de Byrsonima crassifolia (Indano) evidenció la presencia de
Taninos, flavonoides, lactonas y azucares reductores; para el estudio de
la actividad antifúngica In Vitro mediante el Método de macrodilución
para hongos se utilizó cepas de Candida albicans ATCC 90028 y
Trichophyton rubrum ATCC 28188. El extracto etanólico de la corteza de
Byrsonima crassifolia (Indano) permitió evaluar la actividad antifungica
Candida albicans ATCC 90028 que evidenció un CMI de 1.5625 mg/mL
en comparación con la otra cepa en estudio Trichophyton rubrum ATCC
28188 que evidenció como resultado un CMI de 0.39063 mg/mL8.
Por otra parte, Palacios, Z. et al, (2009). En su trabajo de investigación
titulado “Actividad antifúngica in vitro de extractos crudos de Piper
tuberculatum”. Investigaron la actividad antifúngica de los extractos
crudos de inflorescencias, hojas y tallos de plantas silvestres, obtenidos
con CH2Cl2: MeOH (2:1), EtOH y decocción y de plantas in vitro obtenido
con CH2Cl2: MeOH (2:1). Los extractos crudos exhibieron actividad
9
antifúngica sobre Trichophyton rubrum, Microsporum canis y M. gypseum.
(CMI) observada con los extractos CH2Cl2: MeOH (2:1), EtOH y
decocción, sobre Trichophyton rubrum, Microsporum canis y M. gypseum
fue 0,1 mg/mL para inflorescencias y hojas, y 0,1 a 0,5 mg/mL para tallos.
En plantas in vitro la inhibición en el crecimiento de T. rubrum y M. canis
fue 100% en 0,5 mg/mL y para M. gypseum fue 95% en 1,5 mg/mL de
concentración 9.
Por otra parte, García N, E. (2002). Realizó la evaluación de la acción
de los componentes sólidos de Chenopodium ambrosioides sobre
Ascaris suum y Trichuris trichiura, in Vítro. Donde utilizaron 120
parásitos adultos para cada uno de las especies, a concentraciones de 4
mg/mL, 6 mg/mL, 8 mg/mL distribuidos en grupos, testigo, control positivo
(albendazol) y problema. Para evaluar los efectos, antihelmínticos de la
planta usada, se utilizó las concentraciones que resultaron más efectivas,
sobre Ascaris suum y Trichuris trichiura10.
Se encontró que la concentración de 8 mg/mL ssfe. Chenopondium
ambrosioides presentó mayor eficacia antihelmíntica en Ascaris suum (6
horas) y en Trichuris trichiura 12 horas) 1.2 mg/mL de ssfe; produciéndose
inmovilidad, espasticidad, concluyendo que Chenopondium ambrosioides
es eficaz frente a Ascaris suum y Trichuris trichiura10.
Por otro lado, Rojas N.; Del Castillo C. (2016). Determinaron la
actividad antibacteriana in vitro del extracto acuoso y etanólico de
las hojas de Chenopodium ambrosioides (paico), frente a
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia
coli, mediante los métodos de difusión en agar y macrodilución. La
muestra vegetal, fue recolectada del Jardín Botánico del Instituto de
MeLdicina Tradicional (IMET)- Es Salud-Iquitos, se identificó
taxonómicamente en el Herbarium Amazonense-UNAP y se depositó
para su conservación en la Xiloteca de la Facultad de Ingeniería de
Industrias Alimentarias (FIIA-UNAP). La determinación se realizó en el
laboratorio del área de microbiología de FIIA-UNAP, para el estudio de la
actividad antibacteriana in vitro, mediante los métodos de difusión en agar
10
y macrodilución se utilizó cepas bacterianas de Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli
ATCC 35218. Los resultados obtenidos por el método de difusión en agar
a concentraciones de 12mg y 6mg; no evidenciaron actividad
antibacteriana en los extractos acuoso y etanólico de las hojas de
Chenopodium ambrosioides frente a dichas cepas bacterianas; y por el
método de macrodilución demostró concentración mínima inhibitoria
(CMI) tanto para el extracto acuoso y etanólico en 32mg/mL para
Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, una CMI de 8mg/mL para
Staphylococcus aureus con el extracto etanólico, mientras que para
Concentración Mínima Bactericida no se obtuvieron evidencia alguna.
Estos resultados mostraron ser inactivo y poco activo de acción
antibacteriana de los extractos contra los microorganismos empleados en
el estudio11.
2.1.2. A nivel local
Tapia M. (2013). En su trabajo de investigación titulado “Actividad
antifúngica del extracto etanólico de hojas de Myrcianthes ferreyrae
“Arrayán” y de sus hongos endófitos frente a Candida albicans
ATCC 18804”. Evaluó la actividad antifúngica de extractos etanólicos de
hojas de la planta Myrcianthes ferreyrae “Arrayán” y de hongos
endofíticos aislados de la misma, frente a Candida albicans ATCC 18804.
Para eso se recolectó muestras de hojas de Myrcianthes ferreyrae
“Arrayán” del distrito de Atiquipa en la provincia de Caravelí, de las cuales
de aislaron 18 hongos endofíticos. Los hongos se cultivaron en placas
Petri y la obtención de los extractos se realizó utilizando etanol como
solvente extractor. Para la evaluación se utilizó el método de microdilución
en caldo basado en el método M27-A2 del Instituto de estándares clínicos
y laboratoriales (CLSI) para encontrar la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI). Se colectaron 30 muestras de hojas de 10 especímenes de la
planta problema, a partir de estas se aislaron 18 hongos endofíticos. Para
el método de microdilución se emplearon los 18 extractos etanólicos de
hongos endofíticos y 1 extracto de hojas de la planta, de los cuales el de
la planta obtuvo una CMI de 31.25 ug/ml, mientras que en el caso de todos
11
los extractos de hongos endofíticos no hubo una concentración inhibitoria.
Dado este resultado se realizó el tamizaje fitoquímico del extracto
etanólico de Myrcianthes ferreyrae “Arrayán” por medio de pruebas de
coloración, precipitación y por cromatografía en capa fina, encontrándose
la presencia de antraquinonas, flavonoides como la rutina, ácido
clorogénico, hiperósido, vitexina y quercitina, taninos, terpenos como el
geraniol, linalol y cineol, triterpenos y esteroides. En conclusión, los
resultados obtenidos indican que el extracto etanólico de Myrcianthes
ferreyrae “Arrayán” tiene actividad antifúngica a una concentración de
31.25 ug/ml, mientras que los hongos endofíticos aislados de la planta no
presentan actividad hasta una concentración de 200 ug/ml6.
Por otro lado, Nina VM, Huallpa JN. (2012). En su trabajo de
investigación titulado “Actividad antifúngica y antibacteriana in vitro
del aceite esencial de Eugenia caryophyllata (clavo de olor) frente a
C. albicans, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y S. pyogenes”.
Determinaron la actividad antifúngica y antibacteriana in vitro del aceite
esencial de Eugenia caryophyllata (clavo de olor) frente a Candida
albicans, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes. Los botones florales de Eugenia
caryophyllata fueron obtenidos en una especería de la ciudad procedente
de Madagascar. El aceite esencial se obtuvo por destilación con arrastre
de vapor de agua (Hidrodestilación), con un rendimiento promedio del 4%.
El control de calidad para el aceite esencial, se realizó en el laboratorio
de control de calidad de la Universidad Católica de Santa María, en las
cuales se determinaron las características organolépticas y fisicoquímicas
obteniendo la densidad del aceite esencial de 1,0463 g/mL y el índice de
refracción 1,5285. Se determinó los siguientes componentes: eugenol
92.53 %; cariofileno 1,79 % y fenol 5,68 %; estos compuestos validan la
actividad antifúngica y antibacteriana del aceite esencial de Eugenia
caryophyllata7.
La determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica del aceite
esencial de Eugenia caryophyllata se determinó por el método de dilución
en caldo para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
12
Concentración Mínima Bactericida (CMB). También se usaron los
métodos de excavación placa cultivo y Kirby Bauer para determinar la
sensibilidad antifúngica y antibacteriana. Según los estudios realizados
por el método de dilución podemos decir que la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI), para Escherichia coli y Staphylococcus aureus de 5
ug/mL. La Concentración Mínima Bactericida (CMB) para Staphylococcus
aureus 20 ug/mL y 5ug/mL para Escherichia coli; pero en las bacterias de
Pseudomona aeruginosa y Streptococcus pyogenes no tuvo ningún
efecto. La Concentración Mínima Fungicida (CMF) para Candida albicans
fue de 10 ug/mL7.
En la determinación de la sensibilidad de aceite esencial de Eugenia
caryophyllata 40 ug fue: para Escherichia coli de 20 mm; Candida albicans
de 13.5 mm y Staphylococcus aureus 11 mm, estos resultados fueron
comparados con los discos de sensibilidad con los diferentes tipos de
antibióticos, el cual nos dio como resultados: con Ceftazidima:
Escherichia coli y Staphylococcus aureus fueron de 18mm y 19 mm
respectivamente, con Amikacina: Staphylococcus aureus y Escherichia
coli fueron de 20mm y 22 mm respectivamente, y con Anfotericina B para
Candida albicans fue de 24.5 mm. El aceite esencial de Eugenia
caryophyllata (clavo de olor) presenta mayor efecto antibacteriano y
antifúngico frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida
albicans, a diferencia de Pseudomona aeruginosa y Streptococcus
pyogenes no tuvo ningún efecto antibacteriano7.
13
2.2. Base teórica
2.2.2. Paico
A. Descripción botánica
Chenopodium ambrosioides L. (paico) es una planta aromática, perenne,
más o menos pubescente, de olor fuerte con el tallo usualmente
postrado, de aproximadamente 40 cm de altura; las hojas son oblongo-
lanceoladas y serradas, 1cm de ancho y de entre 4 cm de longitud, con
flores pequeñas en panículos terminales densos, cada uno con cinco
sépalos; el cáliz persistente circunda al fruto, y las semillas son negras y
no mayores a 0,8 mm de longitud15, 17.
B. Ubicación taxonómica
Chenopodium ambrosioides L., familia Chenopodiace (sinon:C.
antherminticum A. Gray., Botrys ambrosioides L., Blitum ambrosioides
L.), es conocida en México como epazote o hierba del zorrillo; paico,
bitia, caa-ne, en Argentina y Perú; hierva de Santa María, mastruz, en
Brazil; ‘worm grass’, ‘Mexican tea’, ‘fit weed’, en EUA; aritasou, en Japón;
simé kontwá, patois en Dominica14, 15.
Tabla 1. Clasificación Taxonomía de Chenopodium ambrosioides L.
Reino Plantae
Filo Angiospermae
Clase Magnoliopsida
Orden Caryophyllales
Familia Amaranthaceae
Género Chenopodium
Especie Ch. ambrosioides
Nombre Común Paico
Fuente: Kumar R., Kumar A. et al. Evaluation of Chenopodium ambrosoides oil as a potential source of antifungal, antiaflatoxigenic and antioxidant activity. elsevier 200719.
14
C. Composición química
Dentro de los principios activos se considera: Por destilación se obtiene
aceite esencial, en mayor porcentaje en los frutos: de 0,6 a 1,0% y menor
en los tallos foliáceos: 0,30 a 0,35%. Los componentes principales son
ascaridol, componente activo responsable del efecto antiparasitario,
pcimeno, (-) limoneno, (+) alcanfor, artasona, safrol, N-docosano, N-
hentriacontano, Nheptacosano, N-heptacosano, ß pineno, metadieno,
Salicilato de metilo,dimetil sulfoxido,d terpineol y otros componentes18,20.
El aceite esencial de C. ambrosioides L. está compuesto principalmente por
ascaridol el cual se caracteriza por ser un líquido incoloro, o ligeramente
amarillo, de consistencia no muy viscosa, con olor penetrante y pungente
parecido al alcanfor, con un sabor ligeramente amargo que se extrae de la
planta completa, especialmente de las semillas y frutos, por destilación a
vapor. Es irritante a las mucosas del tracto gastrointestinal y la sobredosis
causa fatalidades en hombres y ratones15, 23.
Figura 1. 1-metil-4-(1-metiletil)-2,3- dioxabiciclo[2.2.2]oct-5-eno (Ascaridol) Fuente: ChemDraw Proessional 2018
D. Propiedades del paico
Se ha reportado la actividad antiprotozoaria, contra Tripanosoma cruzi
Plasmoldium falciparum y Leishmania amazonnsis15, 24.
15
Chenopodium ambrosioides es una planta muy aromática y medicinal
usada habitualmente para la eliminación de los parásitos
intestinales22, 25. De esta planta se obtienen aceites esenciales y se
utilizan más las hojas y ramas de donde se obtiene el ascaridol el cual
es el más importante ya que se le atribuye propiedades
antiparasitarias, antimaláricas, antifúngicas, relajantes musculares,
antibacterianas y entre otras mas17, 26.
En trabajos de investigación, le atribuyen propiedades como:
Calmar el dolor de estómago
Agilizar la memoria
Curar el espanto
Como purgante: las bebidas de las hojas machacadas con jugo
de limón y sal.
Contra dolores de estómago/cólicos: el té de las hojas.
Antidiarreico pediátrico: tomar la infusión de las ramitas.
Contra los obsesos: baños en hojas crudas o cocidas.
Antitusígeno: tomar el cocimiento de las hojas.
Antihelmíntico (áscaris, oxiuros): el jugo crudo proveniente de
exprimir las hojas machacadas con limón.
Contra la gastritis: tomar la infusión de las hojas.
Contra abscesos dentales.
Contra resfriado: tomar el cocimiento de las hojas.
Para curar enfermedades de la piel: Se hacen lavados con el
cocimiento de la planta.
Contra artritis: tomar infusión de las hojas20, 22, 23,25.
16
2.2.3. Candidiasis
La candidiasis es una micosis causada por diversas especies de
levaduras del género Candida, organismos comensales muy frecuentes
y causa importante de un amplio espectro de infecciones en piel,
mucosas y a nivel sistémico, que pueden manifestarse como
enfermedades de poca relevancia clínica, hasta potencialmente
mortales. El hallazgo de estos organismos como agentes infecciosos
involucrados en enfermedades sistémicas intrahospitalarias, ha
aumentado en los últimos años27, 29.
La distribución geográfica de la candidiasis es universal y más de 70%
de los casos reportados son causados por C. albicans serotipo B28.
Cualquier tejido puede ser afectado, por lo que existe una gran
diversidad de cuadros clínicos, asociados directamente al estado
inmunológico del paciente. Las candidiasis superficiales (mucosas y piel)
son frecuentes, de fácil tratamiento y no atentan contra la vida del
paciente, en tanto que las sistémicas de evolución aguda o crónica son
generalmente graves. La mayoría de estas infecciones se originan a
partir de un foco endógeno (tracto gastrointestinal o respiratorio) aunque
no se descarta la participación de fuentes externas30.
A. Candida albicans
Candida albicans es un hongo dimórfico, es decir, se desarrolla de
forma distinta en función de la temperatura de crecimiento, como
levadura, normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de
aspecto filamentoso, a 25ºC en la naturaleza. Pertenece al filo
Ascomycota y se reproduce de forma asexual por gemación31.
En forma de levadura presenta un aspecto de células redondas u
ovaladas, de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños
grupos, mientras que, en forma de hongo filamentoso, las células se
alargan y se diversifican tomando la apariencia de filamentos, pseudo-
hifas o pseudo-micelio31.
Las especies comúnmente asociadas a la infección vaginal por
Candida son: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis,
Candida krusei y Candida guillermond. Hay que tener en cuenta la
existencia de más de 100 diferentes especies de Candida e incluso, la
17
Candida albicans, la especie más frecuente, tiene más de 200 cepas
distintas. La gama es bastante amplia. Aproximadamente, 85% a 90%
de las Candidiasis vulvovaginal es debido a Candida albicans.
A la infección clínica producida por levaduras del género Candida spp.
se le conoce también como Candidiasis. La especie involucrada más
frecuentemente como agente etiológico es Candida albicans, que
pertenece a la microbiota gastrointestinal, vaginal, orofaríngea, piel
periorificial y algunos pliegues cutáneos32. Su capacidad de producir
patología va a depender de una interacción entre los mecanismos
patogénicos del hongo y los sistemas de defensas cutáneos y
sistémicos del propio huésped, se desconoce el tiempo preciso de
incubación y éste varía entre persona y persona. Entre las causas más
importantes que favorecen la aparición de una candidiasis podemos
señalar33.
Locales: Humedad, sudoración, obesidad, ropa apretada u
oclusiva, zonas con mucho roce cutáneo, uso de prótesis, uso
de apósitos no permeables. Las causas locales son muy
importantes, especialmente porque son factores en alguna
medida evitables.
Fisiológicos: Lactantes, adultos mayores, menstruación,
embarazo.
Sistémicos: Endocrinopatías como diabetes mellitus y
enfermedades tiroideas, leucemias y linfomas, hiperuricemia,
síndrome de Cushing.
Enfermedades debilitantes e inmunodeficiencias: Infección
por VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), desnutrición
severa y neoplasias.
Por medicamentos o tratamientos médicos: Corticosteroides,
antibióticos de amplio espectro, inmunosupresores, citotóxicos,
radioterapia y anticonceptivos34.
Puede tener diferentes presentaciones: Diseminadas, localizadas o
profundas, cuadros sistémicos y otros en que lo más relevante es la
18
respuesta alérgica. Los cuadros clínicos son más frecuentes en
dermatología y se definen de acuerdo al área corporal afectada35.
B. Patologías
a) Candidiasis o moniliasis:
Infección superficial que aparece principalmente en individuos con
las defensas bajas, afecta a la piel (intertrigo), a las mucosas (oral,
genitourinaria o digestiva) y a las uñas (paroniquia o perionixis). Los
síntomas son enrojecimiento, picazón y malestar. En personas con
cáncer, trasplantados o con Sida la infección puede hacerse
sistémica (candidemia), y puede llegar a ser mortal31.
b) Candidiasis bucal
Históricamente es una de las presentaciones clínicas más
características, descrita por Hipócrates en pacientes recién nacidos
con placas blanquecinas en sus bocas. La más conocida
clínicamente es la algorra, muguet o algodoncillo, y se ve con más
frecuencia en lactantes y en pacientes inmunodeprimidos36.
Son placas blanquecinas algodonosas, con una adherencia
variable a la mucosa, sobre una base enrojecida que puede afectar
diferentes zonas de la mucosa oral37,38.
Además, existen otras formas clínicas menos frecuentes, como:
Eritematosa aguda (atrófica), en que la superficie es brillante
y roja39.
Crónica en placas, que presenta placas blanquecinas en la
lengua que no se desprenden y se ven más en fumadores40.
Erosiva, más frecuente en personas añosas con áreas de
inflamación bajo la prótesis dentaria.
Lengua negra vellosa, en que existe hipertrofia de las papilas
y un color negro verdoso que se asocia a Geotrichum spp. y
Candida spp35.
19
c) Candidiasis periungueal
Se denomina paroniquia a la inflamación del pliegue ungueal,
ocurre en pacientes que mantienen las manos húmedas por
razones laborales o por la costumbre de llevarse las manos a la
boca. Se manifiesta con inflamación y salida de pus a la presión y
la terapia con antibióticos no tiene respuesta34.
Dentro de este tipo de candidiasis se halla la onicomicosis
producida por Candida spp. lo cual ocurre cuando dicho hongo
infecta con cierta frecuencia las uñas de las manos. Se manifiesta
clínicamente con onicolisis y cambio de color variable entre blanco,
amarillento y negruzco. Es muy infrecuente que infecte y produzca
patología en las uñas de ortejos (dedos de los pies) 34.
Las onicomicosis de pies son más frecuentes que de las manos,
predomina la afectación de la uña del primer dedo con relación a
las otras, esto se aplica particularmente para dermatofitos y otros
mohos no dermatofitos; sin embargo, las infecciones por levaduras
del género Candida afectan preferentemente las uñas de las
manos y el pliegue ungueal 41.
Por otro lado, Las levaduras siguen en frecuencia a los
dermatofitos y son responsables de 5% a 17% de las onicomicosis
en general. La especie más frecuentemente aislada es Candida
albicans40, esta especie forma parte de la flora normal del tracto
digestivo y no se encuentra habitualmente colonizando la piel41.
d) Candidiasis genital
Candida spp. puede trasmitirse a la pareja en el caso que uno de
ellos presente la patología, especialmente después de una relación
sexual traumática, pero para que ocurra el cuadro clínico lo
habitual es que existan factores predisponentes43.
20
2.2.4. Clotrimazol
El clotrimazol (nombre comercial Canesten) es un fungistático Imidazólico,
que actúa frente a dermatofitos, levaduras (candida), también actúa sobre
Trichomonas vaginalis, microorganismos gram negativos como
Bacteroides Gardnerella vaginalis y microorganismos gram positivos como
Streptococci Staphylococci44.
Figura 2. 1-[(2-clorofenil)-difenil-metil]imidazol
Fuente: Chem Draw Proessional 2018
A. Mecanismo de acción
El mecanismo principal de acción del clotrimazol es la inhibición de la
división y crecimiento de hongos. Este fármaco clotrimazol altera la
permeabilidad de la pared celular fúngica e inhibe la actividad de
enzimas dentro de la célula. Estudios demuestran que las
concentraciones mínimas de clotrimazol causan la fuga de compuestos
de fósforos intracelulares hacia el medio ambiente junto con la
descomposición de los ácidos nucleicos celulares y una aceleración en
la salida de K+. Esto conduce eventualmente a la muerte de la célula.
No se propaga apreciablemente a través del cuerpo del usuario, pero
se mantiene en el punto de aplicación45, 46.
B. Indicaciones
Clotrimazol un antifúngico de amplio espectro se puede combinar
con betametasona,dexametasona,prednisolona que son activos
antiflamatorios y antipruriginosos, más el antibiótico bactericida
gentamicina
21
En general, está indicado en dermatosis de diversas etiologías
susceptibles a la corticoterapia y que están acompañadas de
infecciones bacterianas y/o micóticas de la piel.
Micosis dérmicas causadas por dermatofitos, levaduras, mohos y
otros hongos (tinea, candidiasis, pitiriasis versicolor) 44.
C. Contraindicación
Hipersensibilidad al clotrimazol, también a cualquier otro antifúngico del
grupo de los imidazoles o alguno de los excipientes45, 47.
2.2.5. Actividad antimicótica
Definición
Se entiende por actividad antifúngica o antimicótica a toda sustancia que
tiene la capacidad de evitar el crecimiento de algunos tipos de hongos o
incluso de provocar su muerte46.
A. Sensibilidad antimicótica
Concentración mínima inhibitoria
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se define como la mínima
concentración de antimicrobiano (en mg/mL) que inhibe el crecimiento
visible de un microorganismo después de 24 horas de incubación a
37°C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros
métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de
confirmar resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el
resultado obtenido por otros métodos es indeterminado48.
Concentración mínima fungicida
La Concentración Mínima Fungicida (CMF), se define como la mínima
concentración de antimicótico que elimina a más del 99,9% de los
hongos viables después de un tiempo determinado de incubación
(generalmente 24 - 72 horas) 48.
22
2.3. Definición de Términos
Hongo:
Son organismos eucariotas entre los que se encuentran los mohos, las
levaduras y los organismos productores de setas. Se distinguen de las
plantas en que son heterótrofos; y de los animales que tienen paredes
celulares, como las plantas, pero compuestas por quitina, en vez
de celulosa, y que se alimentan por absorción, como las plantas28.
Infección:
Invasión y multiplicación de agentes patógenos en los tejidos de un
organismo5.
Metabolito secundario:
Los metabolitos secundarios son aquellos compuestos orgánicos
sintetizados por el organismo que no tienen un rol directo en
el crecimiento o reproducción del mismo. A diferencia de lo que sucede
con los metabolitos primarios, la ausencia de algún metabolito
secundario no le impide la supervivencia, si bien se verá afectado por
ella, a veces gravemente20.
Concentración:
Es la proporción o relación que hay entre la cantidad de soluto y la
cantidad de disolvente, donde el soluto es la sustancia que se disuelve17.
Crecimiento bacteriano:
Es un componente esencial de la función microbiana ya que es una
célula individual que tiene un periodo de vida determinado y la especie
se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la población
celular59.
23
2.4. Hipótesis
2.4.2. Hipótesis general
Dado que las hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico) dentro de
su composición química presenta metabolitos secundarios con efecto
antimicrobiano, es probable que el extracto etanólico de dicha planta
vegetal presente propiedades antimicóticas contra Candida albicans en
pruebas in vitro.
2.4.3. Hipótesis específica
Es probable Identificar flavonoides en el extracto etanólico de las
hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
del extracto etanólico de las hojas secas de Chenopodium
ambrosioides L. “paico” sobre Candida albicans cepa ATCC 10231.
Es probable determinar la Concentración Mínima fungicida (CMF)
del extracto etanólico de las hojas secas de Chenopodium
ambrosioides L. “paico” sobre Candida albicans cepa ATCC 10231.
Es probable determinar el grado de sensibilidad que presenta
Candida albicans cepa ATCC 10231 al extracto etanólico de las
hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”, mediante la
técnica de difusión en disco comparado con clotrimazol al 1%.
24
2.5. Variables
2.5.2. Definición conceptual de la variable
Variables Definición conceptual
Independiente
Extracto etanólico de
Chenopodium ambrosioides L.
(paico).
Un extracto, es una sustancia
obtenida por extracción de una
parte de una materia prima. A
menudo usando un solvente como
etanol, agua o una mezcla
hidroalcohólica.
Dependiente
Actividad antimicótica sobre
Candida albicans ATCC
10231.
Posee actividad antimicrobiana
sobre diversos microorganismos,
cuyos compuestos responsables
son los metabolitos secundarios.
Fuente: Elaboración propia (2018)
2.5.3. Definición operacional de la variable
Variables Definición conceptual
Independiente
Extracto etanólico de hojas
secas de Chenopodium
ambrosioides L. (paico).
Se utilizó una cantidad de 20g. de
Chenopodium ambrosioides L.
previamente desecada y pulverizada.
Como estractante se utilizó etanol.
Dependiente
Actividad antimicótica
sobre Candida albicans
cepa ATCC 10231.
Las CMI, CMF y sensibilidad se
realizaron en Agar Sabouraud
Dextrosa (SDA).
Fuente: Elaboración propia 2018.
25
2.5.4. Operacionalización de variables
TIPO DE VARIABLE INDICADOR SUBINDICADOR IN
DE
PE
ND
IEN
TE
Extracto etanólico
de Chenopodium
ambrosioides L.
(paico).
Concentración del
extracto de hojas de
Chenopodium
ambrosioides L.
(paico).
Concentración del
extracto de hojas
secas de
Chenopodium
ambrosioides L.
(paico) mg/mL.
DE
PE
ND
IEN
TE
Actividad
antimicótica
sobre Candida
albicans ATCC
10231.
Concentración
Mínima Inhibitoria Turbidez
Concentración
Mínima Fungicida. .
Crecimiento de UFC
(Unidades
Formadoras de
Colonias).
Sensibilidad del halo
de Inhibición
antimicrobiana.
Diámetro del halo de
inhibición de
crecimiento de la
levadura (mm).
Fuente: Elaboración propia 2018
26
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1. Tipo y nivel de investigación
3.1.1. Nivel de la Investigación:
Experimental
3.1.2. Tipo de Investigación:
Según manipulación de variables: Experimental
Según número de mediciones: Transversal
Según la temporalidad: Prospectivo
Enfoque: Cuantitativo
Por el propósito o finalidad: Aplicada
Paradigma: Positivista
3.2. Descripción del ámbito de la Investigación
3.2.1. Ubicación espacial
El presente trabajo se realizará en la región, provincia y departamento
de Arequipa, en la Universidad Privada Autónoma del Sur.
3.2.2. Ubicación temporal
Universidad Privada Autónoma del Sur; periodo diciembre 2017 hasta
febrero del 2018.
27
3.3. Población y muestra
Población
Cepa de Candida albicans ATCC 10231.
Hojas desecadas de Chenopodium ambrosioides L. (paico),
provenientes de la Irrigación la Cano, Distrito la Joya.
Muestra
Se utilizó 1.200 kg de hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico),
provenientes de la Irrigación la Cano, Distrito la Joya, Departamento de
Arequipa.
3.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos
3.4.1. Material Biológico
Cepa de Candida albicans ATCC 10231
Hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico)
3.4.2. Materiales, reactivos y equipos
Material de vidrio
Buretas
Baguetas
Cámara cromatográfica
Capilares de vidrio
Embudos de vidrio
Fiola de 25 y 50 mL
Matraces de vidrio 100, 500 y 1000 mL.
Placas Petri de vidrio de 60 x 15mm y 100 x 15mm
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL
Probeta graduada de: 50 y 100 mL
Tubos de ensayo
Varillas de vidrio
Vasos de precipitado: 50, 100, 250, 500 mL
28
Asa de Digralsky
Equipos y Aparatos
Refrigeradora
Estufa
Autoclave
Balanza analítica
Equipo de Soxhlet
Cocina eléctrica
Frascos estériles color ámbar
Asa de Kohle
Gasas estériles y Algodón.
Espátulas
Gradilla de metal para tubos de ensayo
Micropipeta graduada
Papel Aluminio
Papel filtro rápido
Papel Kraft
Pinzas
Pulverizador
Soporte universal
Mecheros
Reactivos
Medios de Cultivo
Agua destilada
Cloruro férrico
Etanol a 96°
Suero fisiológico
Tween 80
Agar Sabouraud
Caldo peptonado
29
3.4.3. Recolección, almacenamiento e identificación de las hojas de
Chenopodium ambrosioides L. (Paico)
Las hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico) como se muestra
en la Figura 3, fueron provenientes de la Irrigación la Cano, Distrito la
Joya, Departamento de Arequipa. Para posteriormente envolverlas en
papel Kraft, para luego ser identificadas en el laboratorio de la
Universidad Nacional de San Agustín.
- Estabilización de la materia vegetal
Las plantas, al ser arrancadas de su medio natural, alteran su
equilibrio metabólico, proliferando reacciones y fenómenos que
degradan la droga vegetal recolectada.60
Inhibición enzimática
Consiste en la eliminación del agua de la planta hasta valores
inferiores al 10%; ya que la presencia de agua altera su conservación.
Al descender la cantidad de agua, las enzimas detienen su actividad
y quedan inhibidas.
Se procedió a recolectar las hojas de Chenopodium
ambrosioides L. de forma manual por la mañana cuando ha
desaparecido el rocío.
Seguidamente se eligió las hojas verdes, enteras, y por lo tanto
se consideró la exclusión de las hojas descoloridas y las que
fueron atacadas por insectos.
Posteriormente se llevó a la estufa a 40°C observando cada
minuto el proceso de desecación, hasta bajar a menos de 10%
la humedad. Esto hace que las enzimas que contiene la célula
se inhiban y la célula de la hoja quede intacta y no se deforme y
estén aptos para empezar la parte de la extracción.60
30
Figura 3. Chenopodium ambrosioides L. (paico) Fuente: Elaboración propia 2017
3.4.4. Identificación de taninos en extracto etanólico de Chenopodium
ambrosioides L. (paico)
A. Obtención del extracto etanólico por Soxhlet
El método de extracción por Soxhlet consiste en hacer interaccionar
el material biológico pulverizado en la cámara de extracción con el
solvente que viene evaporado desde el balón, en cual precipita en el
condensador y arrastra hacia el balón los metabolitos secundarios
afines al solvente, dicho proceso se repite hasta el agotamiento total
de la muestra49.
Características del solvente:
Etanol
Conocido como alcohol etílico, este compuesto químico obtenido a
partir de la fermentación de los azucares que se encuentran en los
vegetales61. El etanol al 96° (96% del volumen es etanol y el 4% es
agua) que se presenta en condiciones normales como un líquido
incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78.4 °C. Es soluble
en agua en cualquier proporción.
31
Procedimiento
En la Figura 4 se presenta el sistema de extracción por Soxhlet. En la
cámara de extracción se llevó la muestra empaquetada en papel filtro
rápido, en el balón se adicionaron 150 mL de etanol el cual con la
ayuda de una cocina eléctrica fue calentado hasta evaporar el
solvente de tal forma que interaccione con el material biológico en la
cámara de extracción, dicho proceso se desarrolló durante
aproximadamente 6 horas que equivale a 40 vueltas donde se
consiguió el agotamiento de la muestra49. La solución resultante fue
denominada extracto etanólico, el cual fue empleado para los análisis
posteriores49.
Figura 4. Sistema de extracción Soxhlet Fuente: ACD/Chem Sketch 2018
Rendimiento del extracto
Para determinar el rendimiento del extracto se procedió a evaporar el
solvente a Baño María hasta sequedad. Para la determinación del
porcentaje de rendimiento se usó la siguiente fórmula49.
%𝑅 =𝐵 − 𝐴
𝑀× 100
Dónde:
- %R: Porcentaje de rendimiento
- A: Peso de vaso (g)
- B: Peso de vaso con extracto seco
- M: Peso de muestra.
32
A. Identificación del tipo de taninos
En un tubo de ensayo se adicionó 20 gotas de cloruro férrico al 5
%, 20 gotas de extracto etanólico de Chenopodium ambrosioides
L. (paico)
Interpretación
Taninos hidrolizables o gálicos: Dan coloración azul negruzco.
Taninos condesados: Dan coloración verde a marrón50.
3.4.5. Identificación de Flavonoides por la prueba de Shinoda
Fundamento
Los flavonoides fueron identificados usando la prueba de Shinoda que
se fundamente en la oxidación del magnesio en medio ácido.
El hidrogeno liberado produce por reducción al ion flavilio de color rojo
escarlata que varía de un rosa pálido hasta escarlata50.
Figura 5. Reacción química en la prueba de Shinoda Fuente: ChemDraw Professional 15.0 2018
Procedimiento
En un tubo de ensayo se adicionaron una cantidad de extracto etanólico,
luego limaduras de magnesio y dos gotas ácido clorhídrico concentrado50.
33
Interpretación
La coloración de naranja al rojo indica la presencia de flavonas
La coloración rojo carmesí, purpura y azul indican presencia de
flavononas.
El color amarillo pálido o incoloro indica presencia de flavonas y
flavonoles.
Una coloración de amarillo rojizo indica presencia de isoflavonas50.
3.4.6. Escala de Mc Farland
Fundamento
El patrón o La escala de Mc Farland es una escala que consiste en una
serie de tubos con presencia de un precipitado de sulfato de bario
(BaSO4) como resultado de la reacción entre el cloruro de bario al
1.175% y el ácido sulfúrico al 1%. Dicha escala se clasifica por la
intensidad de la turbidez en un espectrofotómetro usando una celda de
cuarzo de 1cm de paso óptico; es así que para el estándar 0,5 de Mc
Farland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm debe estar
entre 0,08 a 0,153.
3.4.7. Reactivación de la cepa
La activación de la cepa de Candida albicans ATCC 10231 que fue
adquirida en el laboratorio KwikStik y almacenada para su conservación
en un intervalo de temperaturas entre 2 a 8 °C.
Procedimiento
Para viabilizar la cepa ATCC 10231 de Candida albicans se sembró el
contenido del vial en el medio de agar Sabouraud y fue incubado a 37
°C por 24 horas.
3.4.8. Evaluación de la Actividad Antimicrobiana
34
A. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)
Método de Dilución del Caldo
Este método de evaluación se fundamenta en determinar la
sensibilidad del microorganismo (Candida), realizando diluciones
seriadas del agente antimicrobiano en caldo peptonado, para luego
agregar una suspensión bacteriana estandarizada con la escala de Mc
Farland. Finalmente se observa la turbidez como señal de crecimiento
microbiano53.
Preparación de la solución madre
Un volumen de 640 mg extracto seco de Chenopodium ambrosioides
L. (paico) en presencia de tween 80 se le adicionó 450 μL de agua
estéril hasta completar 1000 μL, de este modo se obtuvo una emulsión
homogénea cuya concentración fue de 640 mg/mL de extracto53.
Preparación del inoculo
Un inóculo equivalente a una concentración de 108 UFC/mL, fué
preparado llevando una cantidad de colonias haciendo uso de un asa
de kolle a 5 mL del caldo peptonado. La turbidez del medio fué
semejante a la del tubo N°5 de la escala de Mac Farland, incubándose
a 37°C por 24 horas53.
Preparación de diluciones
Se procedió a realizar una dilución de 1:100 del inoculo a la escala de
Mc Farland para obtener una solución de 106 UFC /ml, es decir hizo una
dilución tomándose 0.1 mL del inoculo de 108 UFC/ml y se agregó 9,9
mL del caldo peptonado. Luego se procedió de la siguiente manera
como se muestra en la Tabla 2. En este sentido se procedió de la
siguiente manera:
Se colocó a cada tubo 500 μL de caldo peptonado (10 tubos) a
excepción del tubo 1 que se puso 900 μL.
Al tubo 1 se añadió 100 μL de solución madre, mezclar y retirar 500
μL que se añade al tubo 2.
35
Del tubo retirar 500 μL y añadir al tubo 3 se mezcló y así
sucesivamente hasta el tubo 8.
El tubo 9 solo contiene caldo peptonado y suspensión bacteriana
(control positivo).
El tubo 10 solo contiene solución madre (control negativo).
Posteriormente, se añadió a cada tubo 500 μL del inoculo a la
concentración de 106 UFC/mL.
Se incubaron los tubos por 24 horas a 37 °C en la incubadora.
Pasado el tiempo se observó la turbidez de los tubos para
identificar el punto de ruptura.
B. Determinación de la Concentración Mínima Fúngica (CMF)
Método de dilución en agar
El método de dilución en agar determina la mínima concentración de
extracto que produce la muerte de más del 99,9% de las bacterias en
estudio53.
Procedimiento
Los tubos de ensayo en la determinación de la CMI se procedieron
a sembrar en placas con agar Sabouraud.
Se sellaron las placas Petri y se dejó incubando durante 24 horas
a una temperatura de 37 °C.
Para la interpretación se observó si el crecimiento era positivo en
alguna de las concentraciones estudiadas, luego se procedió a
indicar el punto de corte, que indicó la CMF53.
36
Tabla 2. Método de determinación de CMI por dilución en tubos.
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)
Solución Madre (640 mg/mL) 100 500 500 500 500 500 500 500 _ 500
Caldo Peptonado (µL) 900 500 500 500 500 500 500 500 500 _
Concentración Inicial 64 32 16 8 4 2 1 0.5 640
Inoculo (µL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 _
Volumen Final (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.5
Concentración Final (mg/mL) 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 _ 640
Fuente: Elaboración propia 2018
T=Tubo, (+) = control positivo, (-) = control negativo.
37
C. Determinación de la sensibilidad antimicótica comparada con
clotrimazol al 1%.
Método de Dilución en Discos (Kirby – Bauer)
El principio básico de este método consiste en que el disco impregnado
con el antibiótico o sustancia a investigar la cual toma contacto con la
superficie húmeda del agar53.
El resultado es una zona de inhibición del desarrollo con borde
delineado; los cuales se expresan como; sensible (S), intermedio (I), y
resistente (R). Siendo entre 30 y 35 mm altamente sensible, de 20 a 30
mm sensibles, de 15 a 20 intermedio y menores a 15 mm resistentes53.
Preparación de los discos
Se elaboran discos de papel filtro Whatman de aproximadamente 6 mm
de diámetro, los cuales fueron esterilizados en la autoclave por 15
minutos a 121°C, posteriormente fueron almacenados en un frasco
previamente esterilizado53.
Inoculación de los discos
Una vez esterilizados los discos fueron impregnados con las diferentes
concentraciones de extracto y clotrimazol al 1%53.
Determinación de la sensibilidad microbiana
Preparación de placas con agar Sabouraud
Se pesó 13 g de agar Sabouraud en un matraz de 250 mL.
Se agregó 200 mL de agua destilada.
Se llevó a la cocina para ser sometida a calor para su dilución.
Se llevó a esterilizar en la autoclave por un periodo de tiempo de
15 minutos a 121°C.
Pasado este tiempo se sacó el agar de la autoclave y se procedió
a agregar el agar en placas Petri53.
38
Preparación de diluciones del extracto de Chenopodium
ambrosioides L. (paico).
Para el estudio de sensibilidad se avaluaron las siguientes
concentraciones:
Al 50 %, se colocó en un tubo de ensayo 50 mg de extracto seco
más 100 µL de etanol.
Al 20 %, se colocó en un tubo de ensayo 20 mg de extracto seco
más 100 µL de etanol.
Al 10 %, se colocó en un tubo de ensayo 10 mg de extracto seco
más 100 µL de etanol.
Al 5 %, se colocó en un tubo de ensayo 5.0 mg de extracto seco
más 100 µL de etanol.
Al 2.5 %, se colocó en un tubo de ensayo 2.5 mg de extracto seco
más 100 µL de etanol.
Aplicación de discos para determinar la sensibilidad
antibacteriana
Los discos de papel filtro fueron impregnados con las diversas
concentraciones de extracto y clotrimazol al 1 % luego se dejó en
contacto por 8 minutos para asegurar la fijación precisa de las
concentraciones a estudiar53.
Se preparó el inóculo de Candida albicans comparada con la
escala de Mac Farland.
Con un gotero se colocó una cantidad adecuada del inóculo y con
la ayuda el asa de Digralsky se extendió el inóculo en las placas
Petri.
Se colocó los discos de papel filtro de acuerdo al porcentaje de
extracto según la zona rotulada de la placa.
Se llevaron a incubar a la estufa a 37°C. por 24 horas.
39
Finalizado el tiempo se procedió a medir los halos de inhibición53.
Figura 6. Preparación de placas para el antibiograma Fuente: propia
3.4.9. Análisis de Varianza
El análisis de varianza (ANOVA), se refiere en general a un conjunto
de situaciones experimentales y procedimientos estadísticos para el
análisis de respuestas cuantitativas de unidades experimentales. El
problema más sencillo de ANOVA se conoce como el análisis de
varianza de un solo factor o diseño completamente al azar, éste se
utiliza para comparar dos o más tratamientos, dado que sólo
consideran dos fuentes de variabilidad, los tratamientos y el error
aleatorio54.
40
En este todas las corridas experimentales se deben de realizar en un
orden aleatorio. De esta manera, si durante el estudio se hacen 𝑁
pruebas, éstas se corren al azar, de manera que los posibles efectos
ambientales y temporales se vayan repartiendo equitativamente entre
los tratamientos54.
41
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
La presente investigación tuvo como objetivo determinar el efecto
antimicótico del extracto etanólico a partir de las hojas secas de
Chenopodium ambrosioides L. (paico) sobre cepa de Candida albicans
ATCC 10231. Los resultados se detallan a continuación.
4.1. Recolección e identificación
Las hojas de paico (Figura 7) fueron recolectadas en la irrigación la Cano,
Distrito de la Joya, Departamento de Arequipa; las cuales fueron
identificadas en el Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad
Nacional de San Agustín de Arequipa, identificándose como Chenopodium
ambrosioides L.
Figura 7. Hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico) Fuente: Elaboración propia 2018.
42
Los resultados de la identificación y tipificación son detallados a
continuación en la Tabla 3.
Tabla 3. Identificación y tipificación de las hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. (paico).
DIVISIÓN Magnoliophyta
CLASE Magnoliopsida
SUBCLASE Caryophyllidae
ORDEN Caryophyllales
FAMILIA Amaranthaceae
GÉNERO Chenopodium
ESPECIE Chenopodium ambrosioides L.
Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa. 2017
4.2. Extracto etanólico de hojas de Chenopodium ambrosioides L.
Los extractos fueron obtenidos usando como solvente etanol en un sistema
de extracción por Soxhlet, tomándose como muestra 20 gramos de hojas
secas de paico previamente trituradas para garantizar mejor interacción con
el solvente. (Ver Figura 8).
43
Figura 8. Extracción por Soxhlet de Hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico)
Fuente: Elaboración propia 2018
El procedimiento de extracción duró aproximadamente 6 horas, tiempo en
el cual se produjo el agotamiento de la muestra. Finalizado el procedimiento
se recuperó el solvente y el extracto concentrado se llevó a aun vaso
previamente tarado donde, posteriormente se procedió a evaporar el
solvente en baño maría hasta el agotamiento total del solvente.
44
Figura 9. Extracto seco de Hojas de Chenopodium ambrosioides L.
(paico). Fuente: Elaboración propia 2018
El porcentaje de rendimiento se muestran a continuación en la Tabla 4, logrando como resultado promedio de 4.91 ± 0.29 %.
Tabla 4. Rendimiento de las Hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. (paico) obtenido en las extracciones por Soxhlet.
Extracción Rendimiento
(% R)
1 4.59
2 5.05
3 4.52
4 4.92
5 5.23
6 5.13
Promedio 4.91
Desviación estándar 0.29
Fuente: Elaboración propia *Excel 2016
45
4.3. Identificación de flavonoides de las Hojas Secas de Chenopodium
ambrosioides L. (paico) por la prueba de Shinoda
La identificación de flavonoides se realizó mediante la prueba de Shinoda,
dando como resultado la aparición de un color rojizo característico de
isoflavonas. La coloración se muestra en la Figura 10, el tubo de ensayo de
la izquierda es el blanco que contiene etanol y magnesio metálico; el tubo
del medio es el extracto de las Hojas Secas de Chenopodium ambrosioides
L. (paico) antes de la reacción en el tubo de la derecha se muestra el
resultado de la prueba de shinoda, donde se observa la presencia de
flavonoides.
Figura 10. Presencia de isoflavonas en el extracto de las Hojas secas de Chenopodium
ambrosioides L. (paico). Fuente: Elaboración propia 2018
46
4.4. Evaluación de la actividad antimicrobiana de las hojas secas de
Chenopodium ambrosioides L. (paico) sobre la Cepa de Candida
albicans ATCC 10231
La cepa de Candida albicans ATCC 10231 fue obtenida de laboratorios
KwikStik como se muestra a continuación en la Figura 11.
Figura 11. Cepa de Candida albicans ATCC 10231 Fuente: Elaboración propia 2018
Se reactivó la cepa de Candida albicans ATCC 10231 al sembrarse en el
medio de agar sabouraud e incubándose a 37 °C por 24 horas. (ver
Figura12)
47
Figura 12. Reactivación de la cepa ATCC 10231 de Candida albicans. Fuente: Elaboración propia 2018.
4.5. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
La Concentración Mínima Inhibitoria CMI se determinó por el método de
dilución en caldo peptonado, evaluando concentraciones finales de 32, 16,
8, 4, 2, 1, 0.5 y 0.25 mg/mL del extracto de hojas de Chenopodium
ambrosioides L. a los cuales se agregó un inoculo de Candida albicans de
500 µL y al tubo 9 control positivo, no se le agrego extracto de paico y un
control negativo, el cual no contenía la levadura, pero si concentración
madre de 640 mg/mL del extracto etanólico (ver Figura 13).
48
Figura 13. Tubos conteniendo diluciones en tubos de extracto etanólico de paico (tubos del 1 al 8); tubo 9: control (+) y tubo 10: control (-).
Fuente: Elaboración propia 2018.
En la Tabla 5 se observan los resultados obtenido luego de las 72 horas
de incubación, hallando presencia de turbidez a partir del tubo 4, que
indica crecimiento bacteriano (Figura 13), por lo cual la Concentración
Mínima Inhibitoria, es 8 mg/mL o 0.80% de extracto.
49
Tabla 5. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto de Hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. (paico).
Descripciones
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)
Concentración Final (mg /mL) 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 - 640
Concentración Porcentual (%) 3.20 1.60 0.80 0.40 0.20 0.10 0.05 0.03 0 50
Candida albicans ATCC 10231 repetición 1 - - - + + + + + + -
Candida albicans ATCC 10231 Repetición 2 - - - + + + + + + -
Candida albicans ATCC 10231 repetición 3 - - - + + + + + + -
*(+) Crecimiento microbiano positivo; (-) crecimiento microbiano negativo
Fuente: Elaboración propia 2018.
50
4.6. Concentración Mínima Fungicida (CMF)
La Concentración Mínima Fungicida (CMF) fue realizada por la técnica de
siembra en placa, a partir de los tubos del ensayo de CMI, por lo cual, se
sembraron en agar Sabouraud los tubos del 1 al 5 con el fin evaluar el
crecimiento microbiano.
En la Tabla 6 se presentan los resultados los cuales mostraron crecimiento
de Candida albicans a partir de las placas de los tubos 4 y 5; por otro lado,
en las placas donde se sembraron inóculos de los tubos 1, 2 y 3, no existe
crecimiento de la levadura; por lo cual, el punto de corte y Concentración
Mínima Fungicida fue de 8 mg/mL equivalente al 0.80 % de extracto de
Chenopodium Anbrosioides L.
Tabla 6. Concentración Mínima Fungicida (CMF) de extracto de Chenopodium ambrosioides L.
(+) Crecimiento microbiano positivo (-) crecimiento microbiano negativo.
Fuente: Elaboración propia 2018
Descripción Placas
T1 T2 T3 T4 T5
Concentración Final (mg/mL) 32 16 8 4 2
Concentración Porcentual (%) 3.20 1.60 0.80 0.40 0.20
Candida albicans ATCC 10231
Repetición 1 - - - + +
Candida albicans ATCC 10231
Repetición 2 - - - + +
Candida albicans ATCC 10231
Repetición 3 - - - + +
51
Finalmente, en la Figura 14 se presenta los valores de Concentración
Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Antifúngica de 0.80 % en
ambos casos.
Figura 14. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Fungicida (CMF) sobre Candida albicans ATCC 10231. Fuente: Elaboración propia *Excel 2016
4.7. Determinación de la sensibilidad microbiana comparada con
clotrimazol 1 % sobre Candida albicans cepa ATCC 10231.
Se determinó la sensibilidad bacteriana de concentraciones de 50, 20, 10,
5 y 2.5 % de extracto por el método de dilución en discos en placas con
agar Sabouraud (Figura 15), por otro lado, los diámetros se midieron
usando un vernier.
0,8 0,8 0,80,8 0,8 0,8
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
ENSAYO 1 ENSAYO 2 ENSAYO 3
Co
nce
ntr
ació
n d
el e
xtra
cto
(%
)
REPETICIÓN 1 REPETICIÓN 2 REPETICIÓN 3
52
Figura 15. Sensibilidad bacteriana de concentraciones de extracto de Hojas secas de
Chenopodium ambrosioides L. (paico). Fuente: Elaboración propia 2018
Los halos de inhibición correspondiente a los ensayos por el método de
dilución en discos fueron desarrollados haciendo 12 repeticiones por cada
concentración, además se evaluó un disco con etanol y otro con clotrimazol
al 1%. Los resultados se observan en la Tabla 7.
53
Tabla 7. Sensibilidad de Candida albicans a clotrimazol y etanol. (Halos de inhibición)
Concentración de
extracto
Halo de Inhibición (mm)
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12
Clotrimazol 24.6 22.9 22.8 23.8 22.8 22.9 23.1 22.4 22.0 23.1 23.5 22.6
50.00% 18.3 18.0 17.8 18.1 17.6 17.4 17.6 17.9 17.8 17.6 17.8 18.0
20.00% 16.3 17.9 14.6 17.9 14.9 14.2 14.2 12.4 9.9 11.9 11.4 19.8
10.00% 9.7 9.2 9.1 9.0 9.4 9.6 8.9 9.2 9.3 9.7 9.4 9.8
5.00% 8.9 8.6 8.9 8.5 8.6 8.9 8.7 8.9 8.5 8.6 8.8 8.5
2.50% 8.0 7.9 7.8 7.5 7.4 7.2 7.4 6.9 7.1 7.5 7.4 7.5
Etanol 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Fuente: Elaboración propia (Excel 2016)
54
Los discos impregnados de etanol no presentaron halo de inhibición. Sin
embargo, a partir de una concentración de 2.5% se puede observar halos
de inhibición desde de 6.9 a 18.3 mm de diámetro. Clotrimazol mostró
halos de inhibición entre 22.0 a 24.6 mm. Por otro lado, para poder
comparar la sensibilidad de las diversas concentraciones de extracto de
hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico), etanol y clotrimazol al
1% sobre Cepa de Candida albicans ATCC 10231 se procedió a realizar
un análisis de varianza, obteniendo como resultado que el valor crítico
para F es menor al valor de F experimental (Fc: 2.0219<Fexp: 505.5) y la
probabilidad es menor a 0.05 razón por la cual se concluye que al menos
un grupo es diferente al 95% de confianza (Tabla 8).
Tabla 8. Análisis de varianza del extracto de hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. (paico), etanol y clotrimazol al 1% sobre Cepa de Candida albicans ATCC 10231.
Origen de La
variaciones
Suma de
cuadrados GL
Promedio
de los
cuadrados
F Probabili
dad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 4126.04 6 687.67 505.5 1.0x10-59 2.219
Dentro de los
grupos 104.74 77 1.36
Total 4230.79 83
* Fc:2.0219<Fexp:505.5; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95% de confianza).
55
Para poder evaluar que grupos son iguales o diferentes en cuanto a la
sensibilidad microbiana se aplicó un test de Tukey como se observa en la
Tabla 9.
Tabla 9. Test de Tukey del extracto de hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. (paico), etanol y clotrimazol al 1 % sobre cepa de Candida albicans ATCC 10231
Factor N
Promedio
del halo
de Inhibición
Grupo
Clotrimazol 13 23.04 A
50.00% 13 17.82 B
20.00% 13 14.62 C
10.00% 13 9.35 D
5.00% 13 8.70 D E
2.50% 13 7.47 E
Etanol 13 0.00 F
Fuente: Minitab 17
En la Figura 16 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondiente
a los datos obtenidos, luego de realizar los ensayos de sensibilidad
bacteriana de las diversas concentraciones de extracto de Hojas de
Chenopodium ambrosioides L. (paico), etanol y clotrimazol al 1%
ensayados sobre Candida albicans ATCC 10231, dando como resultado
que ninguna concentración del extracto de (paico) se iguala al antimicótico
clotrimazol al 1%.
56
Por otro lado, las concentraciones de 50, 20 y 10% logran halos de
inhibición de 17.82, 14.62 y 9.35mm, finalmente no se presentó halos de
inhibición en los ensayos realizados con etanol. No hay diferencia
significativa entre las concentraciones de 5 y10% de extracto, finalmente
no hay diferencia significativa a concentraciones de 2.5 y 5.0 %.
57
Figura 16. Boxplot Data del efecto antimicótico sobre Candida albicans ATCC 10231.
Fuente: OriginPro 9 2018
clot
rimazo
l
50 %
20 %
10 %
5 %2.5
%
Etano
l
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Ha
lo d
e In
hib
ició
n (
mm
)
58
CAPÍTULO V
DISCUSIÓNES
La presente investigación determinó la actividad antimicótica del extracto
etanólico a partir de las hojas secas de Chenopodium ambrosioides L.
conocida como “paico” sobre Candida albicans cepa ATCC 10231
obtenidas de Laboratorios KwikStik. Dicho estudio fue desarrollado
basándose en antecedentes del uso de aceites, esencias y extractos
como los resultados obtenidos por Pacheco49. y Oviedo50. Que
determinaron que dichos extractos y aceites esenciales presentaron
actividad antibacteriana frente a géneros como Staphylococcus,
estreptococos y pseudomonas.
Las hojas de paico fueron recolectadas de la Irrigación la Cano del distrito
de la Joya del departamento de Arequipa, que fueron identificadas como
hojas de Chenopodium ambrosioides L. en el Herbarium Areqvipense
(HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa. (Fig.7)
En la Tabla 4 se observan las extracciones realizadas por el método de
extracción por Soxhlet a partir de 150 gramos de hojas secas trituradas
de material biológico dando como resultado un rendimiento promedio de
4.91 ± 0.29% de extracto seco. Pacheco47, en su investigación determinó
un rendimiento porcentual promedio de 15.67% usando el mismo método
de extracción por Soxhlet, pero como solvente uso al éter de petróleo.
Oviedo48, encontró un porcentaje de rendimiento de 32.4% en hojas
usando etanol al 70% por maceración. En la presente investigación se
determinó un menor rendimiento debido a que se usó como solvente
etanol y el método fue por Soxhlet.
Se observó la identificación de flavonoides realizada por la prueba de
Shinoda, dando como resultado luego de la reacción con el magnesio en
medio alcohólico un color rojizo característico de isoflavonas. Pacheco49,
59
identificó presencia de terpenos y taninos en su extracto etéreo y no
flavonoides. Oviedo50, identificó flavonoides por la reacción de Shinoda en
extractos etanólicos obtenidos por maceración. En comparación con esta
investigación se identificaron específicamente isoflavonas, resultados
similares a Oviedo, pero distintos a Pacheco debido a que uso aceite
esencial de paico (Fig.10).
Los resultados de la evaluación por triplicado de la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) determinada por el método de diluciones en caldo
evaluando concentraciones finales de 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 y 0.25 mg/mL
de extracto, Obtenido luego de las 72 horas de incubación, un resultado
de CMI de 8 mg/mL equivalente al 0.80% de extracto. Pacheco49, encontró
que la CMI en el extracto etéreo fue de 75 mg/mL equivalente a un 7.5%
y en su aceite esencial una CMI de 30 µL/mL equivalente a un 3%. Goka52,
evaluó la actividad fungicida frente Candida albicans de tres distintas
cepas ATCC a partir de aceite esencial logrando CMI entre 1 y 2 μg/ml
equivalentes al 0.1 y 0.2%, por otro lado, Tapia6, encontró una CMI de
31.25 μg/mL equivalente a un 3.12%, usando extractos etanólicos de
Myrcianthes ferreyrae “Arrayán”, así mismo, Scavino8, obtuvo como
resultado una CMI de 1.5625 mg/mL (0.16%) de extracto etanólico. En la
presente investigación el extracto presenta una mejor actividad fungicida
en términos de CMI que los aceites obtenidos por Pacheco49, sin
embargo, Goka52, Tapia6 y Scavino8 obtuvieron mejores resultados, dicha
diferencia se debe a que las especies vegetales son de distinta
procedencia y las matrices son distintas. (Fig.4)
La Concentración Mínima Fungicida (CMF) fue realizado por el método de
siembra en placa en agar Sabouraud a partir de los tubos del ensayo de
CMI, en la Tabla 6 se presentan los resultados dando como resultado una
CMF de 8 mg/mL equivalente al 0,80% de extracto que coincide con la
CMI. Pacheco49, encontró que la CMF en el extracto etéreo fue de 75
mg/equivalente a un 0.75% y en su aceite esencial una CMF de 30 µl/mL
equivalente a un 3%. Goka52, evaluó la actividad fungicida frente Candida
albicans de tres distintos ATCC a partir de aceite esencial logrando CMF
60
de 2 mg/mL equivalentes al 0.2%, por otro lado, Nina7 determinó una CMF
de 10 μg/mL equivalente al 1% de aceite esencial. En la presente
investigación el extracto presenta una mejor actividad fungicida en
términos de CMI que los aceites obtenidos por Pacheco49, sin embargo,
Goka52 obtuvo mejores resultados, dicha diferencia se debe a que las
especies vegetales son de distinta procedencia y las matrices son
distintas, así mismo, se obtuvieron mejores resultados que Nina6 y
Pacheco49, debido a que Pacheco uso extracto, sin embargo Nina usó
aceite esencial y la diferencia de resultados se debería a la variabilidad
biológica de dichas especies usadas.
Se determinó la sensibilidad microbiana de concentraciones de 50, 20, 10,
5 y 2.5% de extracto etanólico por el método de dilución en discos en
placas con agar Sabouraud, haciendo 12 repeticiones por cada
concentración, además se evaluó un disco con etanol y otro con
clotrimazol al 1%. En la Tabla 7 se observa que los discos impregnados
de etanol no presentaron halo de inhibición. Sin embargo, a partir de una
concentración de 2.5% se puede observar halos de inhibición desde de
6.9 a 18.3 mm de diámetro. Clotrimazol mostró halos de inhibición entre
22.0 a 24.6 mm.
Al comparar la sensibilidad de las diversas concentraciones de extracto
de hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. (paico), etanol y
clotrimazol al 1% sobre Candida albicans cepa ATCC 10231 se obtuvo
como resultado que el valor crítico para F es menor al valor de F
experimental (Fc:2.0219<Fexp:505.5) y la probabilidad es menor a 0.05
razón por la cual se concluyó que al menos un grupo es diferente al 95%
de confianza.
En la Figura 16 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondiente
a los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad
bacteriana de las diversas concentraciones del extracto de las Hojas de
Chenopodium ambrosioides L. (paico), etanol y clotrimazol al 1%
ensayados sobre Candida albicans cepa ATCC 10231, dando como
resultado que ninguna concentración de extracto de paico se iguala al
clotrimazol al 1%.
61
En la Tabla 9 se observan los resultados luego de la prueba de Tukey
donde se extrae que ninguna concentración de extracto se iguala al
clotrimazol al 1%. Así mismo, las concentraciones de 50, 20 y 10% logran
halos de inhibición promedios de 17.82, 14.62 y 9.35 mm
respectivamente, no hay diferencia significativa entre las concentraciones
de 5 y 10% de extracto, y a concentraciones de 2.5 y 5.0%. Finalmente,
no se presentó halos de inhibición en los ensayos realizados con etanol
(control negativo) demostrando que el etanol no influye en la evaluación
fungicida del extracto etanólico del paico.
62
CONCLUSIONES
1. Se obtuvo el extracto etanólico de Chenopodium ambrosioides L. “paico” a
partir de hojas secas, mediante el equipo Soxhlet, lográndose un rendimiento
de 4.9 ± 0.29% de extracto seco.
2. El extracto etanólico de las Hojas secas Chenopodium ambrosioides L.
“paico” dio resultado positivo a flavonoides por la prueba de Shinoda, dando
como resultado un color rojizo característico de isoflavonas.
3. La levadura de Candida albicans cepa ATCC 10231 presenta sensibilidad
intermedia al extracto etanólico de paico a las concentraciones de 20 y 50%,
con halos de inhibición promedio de 14.62 y 17.82 mm, respectivamente; y
resistente a concentraciones de 2.5, 5.0 y 10%.
4. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto de las hojas secas de
Chenopodium ambrosioides L. “paico” sobre Candida albicans cepa ATCC
10231 es de 8 mg/mL de extracto, equivalente al 0,80%.
5. La Concentración Mínima Fungicida (CMF) del extracto de las hojas secas de
Chenopodium ambrosioides L. “paico” Candida albicans cepa ATCC 10231
es de 8 mg/mL de extracto equivalente al 0,80%.
6. El extracto etanólico de hojas secas de Chenopodium ambrosioides L.
“paico” tiene actividad antimicótica sobre Candida albicans cepa ATCC
10231 a las concentraciones de 10, 20,50%.
63
RECOMENDACIONES
1. Se recomienda evaluar el efecto antimicrobiano del extracto etanólico de
hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico” sobre otros
microorganismos.
2. Evaluar el efecto antimicótico in vivo y otros ensayos posteriores usando
extracto etanólico de hojas secas de Chenopodium ambrosioides L. “paico”
que permitan la aplicación de los resultados de esta investigación en la
terapéutica fungicida.
64
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70
ANEXOS
71
Anexo1: Identificación y tipificación taxonómica.
72
Anexo 2: Hojas de certificación de la cepa con ATCC 1023
73
74
75
Anexo 3: Rendimiento de extracciones del extracto de hojas de Chenopodium
ambrosioides L. (paico).
Peso en gramos
N° Vaso vacío Vaso + extracto
seco Extracto seco Peso de planta % R
1 44.4832 45.4008 0.9176 20.0012 4.59
2 42.2231 43.2341 1.0110 20.0009 5.05
3 43.3992 44.3042 0.9050 20.0004 4.52
4 42.7823 43.7659 0.9836 20.0003 4.92
5 44.9131 45.9592 1.0461 20.0012 5.23
6 43.8230 44.8491 1.0261 20.0002 5.13
76
Anexo 4: Gráfico de test de Tukey de etanol y clotrimazol al 1 % sobre Cepa
de Candida albicans ATCC 10231.
50 clotrimazol20 clotrimazol
20 5010 clotrimazol
10 5010 20
5 clotrimazol5 505 205 10
2.5 clotrimazol2.5 502.5 202.5 102.5 5
Etanol clotrimazolEtanol 50Etanol 20Etanol 10Etanol 5
Etanol 2.5
-30 -20 -10 0
MeanDiff (significant difference)
MeanDiff (nonsignificant difference)
77
Anexo 5: Test de normalización
78
Anexo 6: Hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico)
Anexo 7: Secado de las hojas de Chenopodium ambrosioides L. (paico).
79
Anexo 8: Trituración de las hojas Chenopodium ambrosioides L. (paico).
Anexo 9: Preparación de la escala de Mc.Farland.
80
Anexo 10: Colonias de Candida albicans después de la incubación.
Anexo 11: Activando la cepa de Candida albicans ATCC 10231.
81
Anexo 12: Preparación de placas con agar Sabouraud.
Anexo 13: Gelidificación del agar sabouraud en placas petri
82
Anexo 14: Tubos conteniendo diluciones: Extracto etanólico de paico (tubos del
1 al 8); tubo 9: control (+) y tubo 10: control (-).
Anexo 15: Medición de halos de inhibición usando el Vernier.
