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I
UNIVERSIDAD PRIVADA AUTONOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA
DETERMINACIÓN DE CROMO HEXAVALENTE POR
ESPECTROFOTOMETRÍA EN AGUAS RESIDUALES
PROVENIENTES DE CURTIEMBRES, AREQUIPA-2018”
PRESENTADA POR:
BACH. MARIBEL HUANCA LUQUE
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
ASESOR:
Mg. Elvis Gilmar Gonzales Condori
AREQUIPA – PERÚ
2019
II
UNIVERSIDAD PRIVADA AUTONOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA
DETERMINACIÓN DE CROMO HEXAVALENTE POR
ESPECTROFOTOMETRÍA EN AGUAS RESIDUALES
PROVENIENTES DE CURTIEMBRES,AREQUIPA-2018”
PRESENTADA POR:
BACH. MARIBEL HUANCA LUQUE
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
APROBADO POR:
PRESIDENTE DEL JURADO
MG.GISELE MARIA DELGADO MONTOYA
PRIMER MIEMBRO DEL JURADO
MG.ANTONIETA SALOME CALIZAYA CHIRI
SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO
Q.F. RUTH ELENA GARATE DE DAVILA
I
DEDICATORIA
Esta tesis se la dedico a Dios quién supo guiarme por el buen
camino, darme fuerzas para seguir adelante y no desmayar en los
problemas que se presentaban, enseñándome a encarar las
adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el
intento.
A mi familia por el apoyo que siempre me brindaron día a día en
el transcurso de cada año de mi carrera universitaria.
A mis padres por su apoyo, consejos, comprensión, amor, ayuda en
los momentos difíciles, y por ayudarme con los recursos necesarios
para estudiar.
A mis hermanos por ser fuente de inspiración y ejemplo, por
ofrecerme su apoyo en todo momento, por su cariño y comprensión.
II
AGRADECIMIENTO
Quiero agradecer primero a Dios porque me dio el don de la
perseverancia para alcanzar mi meta.
A la universidad Privada Autónoma del Sur por haberme aceptado
ser parte de ella y poder estudiar mi carrera anhelada, así como
también a los diferentes docentes que me brindaron sus
conocimientos y su apoyo para seguir adelante día a día.
Agradezco también a mi Asesor de Tesis Mg. Elvis Gilmar Gonzales
Condori por haberme brindado la oportunidad de recurrir a su
capacidad y conocimiento científico, así como también haberme
tenido toda la paciencia del mundo para guiarme durante todo el
desarrollo de la tesis.
Y para finalizar, también agradezco a todos los que fueron mis
compañeros de clase durante todos los niveles de Universidad ya
que gracias al compañerismo, amistad y apoyo moral han aportado
en mí un alto porcentaje a mis ganas de seguir adelante en mi
carrera profesional.
III
RESUMEN
La presente investigación tuvo por objetivo validar un método analítico por
espectrofotometría para la cuantificación de cromo hexavalente bajo el
fundamento de la formación del complejo de color púrpura resultante de
la reacción de la difenilcarbazida con el cromo hexavalente que fue leída
a una longitud de onda de 540 nm.
La linealidad del método fue evaluada tras la lectura de las absorbancias
de soluciones patrón comprendidas en un rango de 0.1 a 1.0 mg/L de
cromo hexavalente dando como resultado un coeficiente de regresión
lineal R2 de 0.9998 por el método de los mínimos cuadrados,
interpretándose al método como lineal ya que dicho coeficiente es
superior a 0.995 que es el requisito mínimo establecido por la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP).
Por otro lado, la sensibilidad del método se evaluó hallando los límites de
cuantificación y detección de 0.0431 y 0.0221 mg/L de cromo hexavalente
respectivamente, así como también, el método resultó ser preciso con
una desviación estándar relativa de 1.19 % siendo este menor a 2.0 %
(valor máximo establecido por la USP). Así mismo es exacto con un
porcentaje de recuperación de 99.28 % y finalmente, es robusto a las
variaciones de analistas, tipos de micropipetas y puntas al cumplir con la
especificación |𝑉𝑥| < 𝑠√2.
IV
ABSTRACT
The objective of the present investigation was to validate an analytical
method by spectrophotometry for the quantification of hexavalent
chromium at the bottom of the formation of the purple complex as a result
of the reaction of diphenylcarbazide with hexavalent chromium that
resulted in a wavelength of 540 nm.
The linearity of the method was improved The absorbance reading of the
solutions was included in a range of 0.1 to 1.0 mg/L of hexavalent
chromium as a result of a linear regression coefficient R2 of 0.9998 by the
least squares method, interpreting the This method is based on a
coefficient greater than 0.995 which is the minimum requirement of the
United States Pharmacopeia (USP).
On the other hand, the sensitivity of the method was evaluated finding the
limits of quantification and detection of 0.0431 and 0.0221 mg / L of
hexavalent chromium respectively, on the other hand, the method turned
out to be accurate with a relative standard deviation of 1.19%, this being
lower 2.0% (maximum value established by the USP). likewise it is
accurate with a recovery percentage of 99.28% and finally, it is robust to
the variations of analyst, type of micropipettes and tips when complying
with the specification|𝑉𝑥| < 𝑠√2.
V
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA .................................................................................................... I
AGRADECIMIENTO ........................................................................................... II
RESUMEN ........................................................................................................ III
ABSTRACT ....................................................................................................... IV
ÍNDICE DE CONTENIDOS ................................................................................ V
ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................... VIII
INDICE DE ANEXOS ........................................................................................ IX
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... X
CAPÍTULO I ....................................................................................................... 1
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ............................................................... 1
1.1. Planteamiento del problema de investigación ....................................... 1
1.2. Formulación del problema ..................................................................... 3
1.3. Objetivos de la investigación ................................................................. 4
1.3.1. Objetivo general..................................................................................... 4
1.3.2. Objetivos específicos. ............................................................................ 4
1.4. Justificación ........................................................................................... 5
CAPÍTULO II ...................................................................................................... 6
MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 6
2.1. Antecedentes Investigativos .................................................................. 6
2.2. Base Teórica ......................................................................................... 9
VI
2.2.1. Cromo .................................................................................................... 9
2.2.2. Espectrofotometría .............................................................................. 17
2.2.3. Espectrofotómetro ............................................................................... 18
2.2.4. Validación de métodos analíticos ........................................................ 23
2.3. Hipótesis ............................................................................................. 24
2.3.1. Hipótesis principal................................................................................ 24
2.3.2. Hipótesis secundaria ........................................................................... 24
2.4. Variables ............................................................................................. 25
2.4.1. Identificación de variables ................................................................... 25
2.4.2. Definición conceptual de variables ...................................................... 25
2.4.3. Definición operacional de variables ..................................................... 25
2.4.4. Operacionalización de variables .......................................................... 26
CAPÍTULO III ................................................................................................... 27
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ...................................................... 27
3.1. Planteamiento Metodológico ............................................................... 27
3.2. Descripción del ámbito de la Investigación ......................................... 27
3.3. Población y muestra ............................................................................ 27
3.4. Técnicas e Instrumentos de recojo de datos ....................................... 28
3.4.1. Materiales, equipos y reactivos ........................................................... 28
3.4.2. Preparación de la solución de Cromo (VI) ........................................... 28
3.4.3. Validación del método analítico para la cuantificación de cromo (VI) en
medios acuosos. .............................................................................................. 31
VII
CAPÍTULO IV ................................................................................................... 35
RESULTADOS ................................................................................................. 35
4.1. Verificación del espectrofotómetro ...................................................... 35
4.1.1. Verificación de la longitud de onda ...................................................... 35
4.2. Validación del método para la cuantificación de cromo hexavalente en
aguas……………….. ........................................................................................ 39
4.2.1. Barrido espectrofotométrico ................................................................. 39
CAPÍTULO V .................................................................................................... 51
DISCUSIÓN ..................................................................................................... 51
CAPÍTULO VI…………………………………………………………………………54
CONCLUSIONES ............................................................................................. 54
RECOMENDACIONES .................................................................................... 55
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 56
VIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Determinación de Cr (VI) con difenilcarbazida. ................................... 30
Tabla 2 Absorbancias promedio de las concentraciones a escala de 1x10-4 M.
............................................................................................................. 36
Tabla 3 Valores de las variables correspondientes al coeficiente de correlación
r2 .......................................................................................................... 37
Tabla 4 Valores de las variables involucradas en el cálculo de “R2” (Coeficiente
de regresión lineal) .............................................................................. 37
Tabla 5 Absorbancias correspondientes a las soluciones de calibración (0.1 a
1-0 mg/L) de cromo hexavalente [Cr (VI)] ............................................ 40
Tabla 6 Valores de las variables correspondientes al coeficiente de correlación
r2, intercepto “a” y pendiente “b” .......................................................... 41
Tabla 7 Valores de las variables involucradas al “a” (intercepto), “b” (Pendiente)
y “R2” (Coeficiente de regresión lineal) ................................................ 41
Tabla 8 Valores de las variables implicadas en la determinación de los límites
de cuantificación y límites de detección ............................................... 45
Tabla 9 Ensayo de precisión ............................................................................ 46
Tabla 10 Valores de los ensayos de exactitud ................................................. 47
Tabla 11 Análisis de la Robustez comparando Micropipetas (ARM) de marca
CAPP (Micropipeta 1) y BOECO (Micropipeta 2) ................................ 48
Tabla 12 Análisis de la Robustez comparando Analistas (ARA) ...................... 49
Tabla 13 Análisis de la Robustez comparando Puntas (ARP) de marca CAPP
reusadas y nuevas ............................................................................... 49
Tabla 14 Análisis de la Robustez comparando Micropipetas CAPP (Micropipeta
1) y BOECO (Micropipeta 2) ................................................................ 50
IX
INDICE DE ANEXOS
ANEXOS………………………………………………………………………………60
ANEXO 1 .......................................................................................................... 61
ANEXO 2……………………………………………………………………………...61
ANEXO 3……………………………………………………………………………...62
ANEXO 4……………………………………………………………………………...62
ANEXO 5……………………………………………………………………………...63
X
INTRODUCCIÓN
En el campo de control de calidad, se realizan análisis de rutina para
resolver muchos y diversos problemas que surgen en la ciencia y la
tecnología. En consecuencia, se deben aplicar criterios altamente
rigurosos al evaluar los métodos analíticos individuales para juzgar su
idoneidad en casos particulares. Podríamos decir que la validación debe
aclarar de antemano qué procedimiento es adecuado y qué no es
adecuado.
Los métodos aplicados en control de calidad deben evaluarse antes para
garantizar de manera más exacta datos confiables.
Por lo tanto, la validación debe considerarse, por un lado, como la
finalización de un desarrollo analítico, por otro lado, como una prueba de
competencia al adoptar un método desarrollado externamente; por lo
tanto, la validación siempre es necesaria, independientemente de si se
aplican los procedimientos estándar nacionales e internacionales
correspondientes. De alguna manera, la validación (y su documentación)
puede considerarse como la tarjeta de presentación de un laboratorio
porque, aparte de los requisitos formales de acreditación, muestra
claramente la competencia de un laboratorio. El tipo, la extensión y la
conducta de una validación correcta nos permiten sacar conclusiones, no
solo sobre la existencia de equipo instrumental adecuado, sino que
también indica que el laboratorio analítico tiene una administración
motivada y empleados competentes. Especialmente, el valor del servicio
al cliente de un laboratorio se hace evidente en la medida en que los
objetivos de calidad analítica están orientados a las necesidades reales
de los clientes que requieren datos analíticos (1,2,3).
Se debe tener cuidado al emitir resultados ya que, por deficiencia de
capacitación en el analista, deterioro de equipos o que los instrumentos
no estén calibrados podrían influir en que los datos no sean confiables.
Entonces la presente investigación busca aportar un procedimiento de
validación para la cuantificación de cromo hexavalente en aguas (1, 2,3).
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1. Planteamiento del problema de investigación
“El cromo es un metal esencial muy tóxico a concentraciones superiores
200 ug/dia para los organismos vivos. El incremento de la actividad
humana ha propiciado un aumento de la presencia de cromo en el medio
ambiente. Las fuentes potenciales de contaminación de cromo son, entre
otras, la minería (extracción de cromitas), el revestimiento de metales
(cromados), procesos de curtidos de pieles, etc. Por tanto, el control del
contenido de este elemento es frecuente y necesario en matrices
ambientales. En particular, la determinación de cromo en suelos es de
especial interés agrícola y ambiental, ya que el suelo actúa como fuente
de microelementos esenciales para las plantas, pero también puede
convertirse en una fuente de contaminantes” (4).
“En los últimos años el desarrollo industrial ha provocado un incremento
en la generación de agentes contaminantes en el ambiente, prueba de
ello son los procesos metalúrgicos,como es el caso de la industria del
cromo (USEPA 2000). Este metal se encuentra entre los primeros 20
elementos más abundantes en la corteza terrestre con una presencia de
100 (μg/g). El Cromo es explotado primordialmente en forma de cromita.
Durante el procesamiento de la cromita se generan compuestos de Cr+6
en las formas de cromato y dicromato, cuyos usos van dirigidos a las
industrias metalúrgica (65 %), de aislantes (18 %) y química (17 %). En el
primer caso se utilizan menas con óxido de cromo (III) (Cr2O3) mayores al
48 % y una relación Cr2O3/FeO> 3, con contenidos de S y P < 1 %. La
industria química tiene una carga de Cr2O3> 44 %, FeO< 14 %, SiO2 < 5
%, mientras que la industria de aislantes tiene la siguiente composición:
Cr2O3> 32 %, SiO2 < 6 % y CaO< 1 % (5).
2
Por otra parte, los compuestos de Cr+6 con mayor importancia industrial
son el dicromato de potasio (K2Cr2O7) y el óxido de Cr+6 (CrO3), para la
generación de metalizados, pinturas, pigmentos y recubrimientos
plásticos, en tanto que el dicromato de sodio (Na2Cr2O7) y los sulfatos
básicos de Cr son utilizados en el curtido de pieles, catalizadores y
conservadores de madera” (5).
En la Ciudad de Arequipa la actividad en curtiembres se desarrolla desde
hace muchos años, en cuyos procesos se encuentra el curtido que resulta
con la aplicación de sales de cromo a los cueros con el fin de evitar su
descomposición o putrefacción. Por tal motivo, la contaminación por
efluentes de curtiembres de suelos y aguas es un factor importante a
estudiar (5).
3
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
A. Problema Principal:
- ¿Cómo validar un método analítico para la determinación de cromo
hexavalente por espectrofotometría en aguas?
B. Problemas secundarios
- ¿Cuál es la linealidad del método de determinación de cromo
hexavalente en aguas?
- ¿Cuáles son los límites de detección y cuantificación del método de
determinación de cromo hexavalente en aguas?
- ¿Cuál es la precisión del método de determinación de cromo
hexavalente en aguas?
- ¿Cuál es la exactitud del método de determinación de cromo
hexavalente en aguas?
- ¿Cómo es la robustez del método de determinación de cromo
hexavalente en aguas?
4
1.3. Objetivos de la investigación
1.3.1. Objetivo general.
Validar un método analítico para la determinación de cromo
hexavalente por espectrofotometría en aguas.
1.3.2. Objetivos específicos.
Determinar la linealidad del método de cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
Hallar los límites de detección y cuantificación del método de
cuantificación de cromo hexavalente en aguas.
Evaluar la precisión del método de determinación de cromo
hexavalente en aguas.
Evaluar la exactitud del método de cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
Evaluar la robustez del método de cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
5
1.4. Justificación
Hoy en día se sabe que para usar un método analítico este debe
someterse a un proceso de validación debido a que la diferencia de las
condiciones ambientales, equipos e instrumentos no son los mismos,
inclusive los reactivos por su procedencia y grado de pureza. Es así que
en la presente tesis se pretende validar un método para la cuantificación
de cromo hexavalente en agua, ya que el cromo se utiliza extensamente
en curtientes en el tratamiento del cuero, ya que dicha industria en
particular, genera gran cantidad de aguas de curtido y restos de pieles de
animales (6).
La presente tesis de validación es necesaria para evaluar los niveles de
cromo presentes en cuerpos de agua ya que la toxicidad crónica
producida por el cromo podría afectar a la salud de las personas, por otro
lado, el cromo puede estar presente en los cuerpos de agua debido ya
que este compuesto no es absorbido completamente por la piel durante
el proceso de curtición y son eliminados junto con las aguas residuales
del proceso sin ningún tratamiento, representando un peligro potencial de
intoxicación (6).
En la ciudad de Arequipa existen diversas industrias que se dedican al
curtido desde hace ya varios años, por lo cual el determinar dicho metal
es de vital importancia para monitorear la contaminación y el impacto
producido por la contaminación antropogénica. En este sentido el
presente proyecto busca validar un método analítico para la
determinación de cromo hexavalente por espectrofotometría del visible en
aguas con la finalidad de contribuir con una metodología para cuantificar
cromo en cuerpos de agua (6).
6
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes Investigativos
a. A nivel internacional
Según Severiche y González (7), “verificación analítica para las
determinaciones de cromo hexavalente en aguas por espectrofotometría”,
En la actualidad la prestación de servicios analíticos de laboratorios, toma
de forma ascendente más auge y utilidad. El efecto de un análisis de
aguas es forjar resultados correctos y confiables, siendo la verificación de
ensayos uno de los aspectos más importantes y factor clave para
conseguir este propósito. La determinación de cromo hexavalente en
aguas por colorimetría con la difenilcarbazida es la metodología analítica
más usada y útil que se conoce en el ámbito científico técnico,
principalmente, por su alta selectividad y también debatida por su reacción
a las interferencias. En el presente estudio se hizo la valoración analítica
del método espectrofotométrico para la determinación de cromo
hexavalente en aguas; el objetivo de este trabajo fue confirmar
correctamente la aplicación del método para el análisis de aguas. Se
trabajaron muestras de diferentes tipos de agua: potable, residual y
superficial, siguiéndose estrictamente los protocolos de verificación. Se
encontraron resultados satisfactorios en precisión y exactitud con el fin de
emitir resultados confiables y reales de la muestra analizada (7).
7
Olmedo et. al. (1) en su proyecto de investigación titulado “Validation of a
method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in
human wholeblood, urine, saliva and hair samples by
electrothermalatomic absorption spectrometry” realizó un monitoreo
biológico de la exposición a metales pesados en toxicología ocupacional,
en dicho estudio, los métodos de cuantificación para la determinación de
Cr, Cd, Mn, Ni y Pb en sangre total, orina, saliva y pelo fueron validados
de acuerdo con los estándares comunes de las normas europeas, siendo
los principales parámetros evaluado los Límites de detección y
cuantificación, rango de linealidad, repetibilidad, reproducibilidad,
recuperación e incertidumbre (1).
b. A nivel nacional
Mocada (2)en su tesis titulada “Validación del método analítico para
la cuantificación de hierro sérico en el laboratorio Quintanilla S.R.L.”
publicada en la Universidad Nacional De Trujillo realizó la validación
del método analítico para la cuantificación de Hierro Sérico, en el
Laboratorio Quintanilla S.R.L. Los parámetros validados fueron:
Linealidad, precisión, exactitud, límite de detección, límite de
cuantificación y robustez; que corresponden a una validación tipo I, según
la USP XXII. Se demostró que el método es lineal, al obtenerse un
coeficiente de correlación r = 0.996646 y un coeficiente de determinación
r2= 0.993303, y al aplicársele el test estadístico de linealidad (t de
Student), se obtuvo un t experimental mayor a t de tablas (43.910164 >
2.16). El método demostró precisión tanto para el ensayo de repetibilidad
(C.V: 0.9148%) como para la precisión intermedia (C.V: 1.0959%) (2).
El método demostró exactitud al evaluarse el test G de Cochran,
obteniéndose un G experimental menor que el G de tablas (0.6443 <
0.871), y de igual modo para el análisis de t Student, obteniéndose un t
experimental menor al t de tablas (1.370 < 2.306). Se determinó un límite
de detección de 0.929 ug/dL y un límite de cuantificación de 3.096 ug/dL.
Finalmente, el ensayo de robustez demostró que no existe variación
8
significativa de los resultados por el cambio temperatura, de analistas y
por el uso de puntas para micropipetas tanto nuevas como usadas (2).
Finalmente,Rodriguezet. al. (8), en su tesis titulada “Validación de un
método espectrofotométrico UV para la cuantificación de
dimenhidrinato en tabletas de 50 mg” publicada en la Universidad
Nacional de Trujillo realizó el análisis de Dimenhidrinato 50 mg tabletas
lote 0010019. Se utilizó agua destilada como disolvente. El ensayo de
Linealidad presentó un coeficiente de correlación de1; el Test Estadístico
de Linealidad y el Factor Respuesta, expresaron conformidad (8).
Al evaluar la Precisión, en el ensayo de la repetibilidad se obtuvo
desviaciones estándar a dos concentraciones tanto para el sistema como
para el método respectivamente: RSD 90% = 0,756522869, RSD 110%
=0,427672703 y RSD 90% = 0,891352366, RSD 110% = 0,698070408.
En la reproducibilidad el coeficiente de variación tanto del método como
del sistema se encontró resultados estadísticamente similares en 2
analistas diferentes y en diferentes días (8).
Para el estudio de Exactitud, el porcentaje de Recuperación del método
fue de 98.83% y de 100.45% para el sistema. En el Test G de Cochran se
obtuvo G experimental menor que G tablas (0.7977), de 0,496484277 y
0,095419579 para el estándar y la muestra respectivamente. Para el
ensayo estadístico t de Student se obtuvo t experimental menor que t tabla
(2,3060041333), de -0,674428225 y 1,831640499 para el estándar y la
muestra respectivamente; por lo que la exactitud es correcta según sus
respectivas especificaciones (8).
El método utilizado en el presente informe demostró ser específico para
determinar el analito entre los excipientes, las muestras fueron sometidas
a degradación por UV, oxidación e hidrólisis ácida y básica. Los
parámetros de revalidación determinados permiten dar como validado al
método espectrofotométrico UV para la cuantificación de dimenhidrinato
en tabletas de 50 mg (8).
9
2.2. Base Teórica
2.2.1. Cromo
A. Descripción
El cromo es un elemento metálico con estados de oxidación de II, III y VI
de los cuales predominan el trivalente (III) y el hexavalente (VI). El estado
divalente es relativamente inestable en condiciones ambientales y se
oxida fácilmente a estado trivalente. Por otro lado, los compuestos de
cromo trivalente son los más estables en condiciones ambientales y se
producen en la naturaleza como minerales. El cromo hexavalente es el
segundo estado más estable siendo su producción natural muy rara se les
atribuye principalmente a fuentes antropogénicas(5).
El cromo existe en una serie de estados de oxidación desde valencia
-2 hasta +6; los estados estables más importantes son 0 (metal
elemental), +3 (trivalente) y +6 (hexavalente). El cromo en el mineral de
cromita se encuentra en estado trivalente, mientras que los procesos
industriales también producen el metal elemental y el cromo hexavalente.
Los efectos sobre la salud del cromo están relacionados al menos
parcialmente con el estado de valencia del metal en el momento de la
exposición. Se piensa que los compuestos trivalentes (Cr [III]) y
hexavalentes (Cr [VI]) son los más importantes desde el punto de vista
biológico. El Cr (III) es un mineral dietético esencial en dosis bajas,
mientras que ciertos compuestos de Cr (VI) parecen ser cancerígenos. No
existen pruebas suficientes para determinar si el Cr (III) o el cromo metal
pueden ser carcinógenos humanos (9,10,11).
B. Usos del cromo
El cromo se utiliza en tres industrias básicas: metalúrgicas, químicas y
refractarias (aplicaciones resistentes al calor). En la industria metalúrgica,
el cromo es un componente importante de los aceros inoxidables y varias
aleaciones metálicas.
10
Las prótesis de articulaciones metálicas hechas de aleaciones de cromo
se emplean ampliamente en ortopedia clínica. En la industria química, el
cromo se usa principalmente en pigmentos de pintura (los compuestos de
cromo pueden ser rojos, amarillos, naranjas y verdes), cromados, curtidos
de cuero y tratamientos de madera. Se utilizan cantidades más pequeñas
en lodos de perforación, tratamiento de agua, catalizadores, fósforos de
seguridad, tóner de copiadoras, inhibidores de la corrosión, químicos
fotográficos y cintas magnéticas. Los usos refractarios del cromo incluyen
ladrillos refractarios de cromo-magnesita para revestimientos de hornos
metalúrgicos y cromita granular para otras aplicaciones resistentes al
calor (9,10,11).
C. Exposición
Los trabajadores en industrias que utilizan cromo, especialmente las
industrias de soldadura de acero inoxidable, producción de cromato,
cromado y pigmento de cromo, donde la exposición es principalmente a
Cr (VI), tienen un mayor riesgo de los efectos del cromo. Se estima que
175,000 trabajadores pueden estar expuestos a Cr (VI) en el lugar de
trabajo de forma regular; el número es mucho mayor si también se
considera la exposición a otros estados de valencia del cromo. En muchas
ocupaciones, la exposición es tanto a Cr (III) como a Cr (VI) como
materiales solubles e insolubles (9,10,11).
Los residentes cerca de las instalaciones de producción de cromato
pueden estar expuestos a niveles de cromo (VI) superiores al fondo.
También existe la preocupación de que los residentes cuyas casas han
sido construidas en vertederos utilizando escorias de fundiciones o
instalaciones productoras de cromato pueden estar expuestos al cromo
por inhalación y contacto dérmico. La contaminación del agua subterránea
puede aumentar la exposición en personas que usan agua de pozo como
fuente de agua potable (9,10,11).
La combustión del carbón y del petróleo contribuye a un estimado de 1723
toneladas métricas de cromo por año en emisiones atmosféricas; sin
embargo, solo el 0,2% de este cromo es Cr (VI).
11
En contraste, se estima que las fuentes de cromado contribuyen con 700
toneladas métricas de cromo por año a la contaminación atmosférica, pero
se cree que el 100% es Cr (VI) (9,10,11).
D. Ruta biológica del cromo
Las rutas de entrada del cromo en el cuerpo humano son la inhalación, la
ingestión y la absorción dérmica. La exposición ocupacional generalmente
ocurre por inhalación y contacto dérmico, mientras que la población
general está expuesta con mayor frecuencia por vía oral a través del
contenido de cromo en el suelo, los alimentos y el agua (9,10,11).
Las tasas de captación de cromo en el tracto gastrointestinal son
relativamente bajas y dependen de varios factores, incluido el estado de
valencia (con Cr [VI] más fácilmente absorbido que Cr [III]), la forma
química (con cromo orgánico más fácilmente absorbida que inorgánica),
la solubilidad en agua del compuesto y el tiempo de tránsito
gastrointestinal. En humanos y animales, menos del 1% de Cr inorgánico
(III) y aproximadamente el 10% de Cr inorgánico (VI) se absorbe desde el
intestino; la última cantidad es ligeramente mayor en un estado de ayuno
(9,10,11).
El porcentaje de absorción de cromo de los pulmones no se puede
estimar. Los datos de algunos experimentos con animales indican que,
con igual solubilidad, los compuestos de Cr (VI) se absorben más
fácilmente que los compuestos de Cr (III), probablemente porque el Cr (VI)
penetra fácilmente en las membranas celulares (8, 9,10).
Los datos de voluntarios y la evidencia indirecta de estudios
ocupacionales indican que la absorción de ciertos compuestos de Cr (VI)
puede ocurrir a través de la piel intacta (9,10,11).
Después de ingresar al cuerpo desde una fuente exógena, el Cr (III) no
atraviesa fácilmente las membranas celulares, sino que se une
directamente a la transformación, una proteína transportadora de hierro
en el plasma.
12
En contraste, el Cr (VI) después de la absorción es rápidamente absorbido
por los eritrocitos y reducido a Cr (III) dentro de la célula.
Independientemente de la fuente, el Cr (III) se distribuye ampliamente en
el cuerpo y representa la mayor parte del cromo en plasma o tejidos. La
mayor captación de Cr (III) como un complejo proteico es por la médula
ósea, los pulmones, los ganglios linfáticos, el bazo, el riñón y el hígado.
Las autopsias revelan que los niveles de cromo en los pulmones son
consistentemente más altos que los niveles en otros órganos (9,10,11).
La excreción de cromo ocurre principalmente a través de la orina sin
retención importante en los órganos. En los seres humanos, el riñón
excreto aproximadamente el 60% de una dosis de Cr (VI) absorbida en
forma de Cr (III) dentro de las 8 horas posteriores a la ingestión.
Aproximadamente el 10% de una dosis absorbida se elimina por excreción
biliar, y pequeñas cantidades se excretan en el cabello, las uñas, la leche
y el sudor. La eliminación del plasma es generalmente rápida (en cuestión
de horas), mientras que la eliminación de los tejidos es más lenta (vida
media de varios días). En voluntarios, las dosis administradas de Cr (VI)
se eliminaron más rápidamente que las de Cr (III) (9,10,11).
E. Aspectos fisiológicos
El cromo (III), un elemento dietético esencial, desempeña un papel en el
mantenimiento del metabolismo normal de la glucosa, la grasa y el
colesterol. El papel nutricional del cromo no se ha delineado a fondo, pero
parece potenciar la acción de la insulina, probablemente en forma de
factor de tolerancia a la glucosa (GTF).
La ingesta diaria segura y adecuada de cromo para adultos está en el
rango de 50 a 200 microgramos por día, aunque los datos son
insuficientes para establecer una cantidad diaria recomendada (9,10,11).
La deficiencia de cromo en la dieta es relativamente poco frecuente; la
mayoría de los casos ocurren en personas con problemas especiales,
como nutrición parenteral total, diabetes o desnutrición.
13
La deficiencia de cromo se caracteriza por intolerancia a la glucosa,
glucosuria, hipercolesterolemia, disminución de la longevidad,
disminución del conteo de espermatozoides y disminución de la fertilidad.
En un paciente que recibió nutrición parenteral total, se corrigió una
neuropatía periférica después de la suplementación con cromo (9,10,11).
Los principales factores que gobiernan la toxicidad de los compuestos de
cromo son el estado de oxidación y la solubilidad. Los compuestos de
cromo (VI), que son agentes oxidantes potentes y, como tales, tienden a
ser irritantes y corrosivos, parecen ser mucho más tóxicos sistémicamente
que los compuestos de cromo (III), dadas cantidades y solubilidades
similares. Aunque los mecanismos de interacción biológica son inciertos,
esta toxicidad diferente puede estar relacionada con la facilidad con la que
el Cr (VI) puede pasar a través de las membranas celulares y su posterior
reducción intracelular a intermediarios reactivos (9,10,11).
F. Efectos sobre la piel
El ácido crómico, los dicromatos y otros compuestos de Cr (VI) no solo
son potentes irritantes para la piel, sino que también pueden ser
corrosivos. En la piel rota, se puede desarrollar una úlcera redonda y
penetrante. Los sitios comunes para estas úlceras persistentes ("orificios
de cromo") incluyen la raíz de la uña, los nudillos y las redes de los dedos,
la parte posterior de las manos y los antebrazos. La úlcera cromática
comienza como una pápula, formando una úlcera con bordes elevados.
Las úlceras pueden penetrar profundamente en los tejidos blandos o
convertirse en el sitio de una infección secundaria, pero no se sabe que
conduzcan a una enfermedad maligna (9,10,11).
La progresión a la ulceración es generalmente indolora, lo que sugiere
toxicidad para los nervios sensoriales periféricos. Las lesiones sanan
lentamente y pueden persistir durante meses (9,10,11).
En concentraciones inferiores a las que resultan en irritación, la
sensibilidad de la piel es el efecto más común después de la exposición a
14
compuestos de cromo, especialmente compuestos de Cr (VI). Hasta el
20% de los trabajadores del cromo desarrollan dermatitis.
La dermatitis alérgica con eczema se ha reportado en impresoras,
trabajadores del cemento, trabajadores de metales, pintores y curtidores
de cuero. Los datos sugieren que un complejo de proteína Cr (III) es
responsable de la reacción alérgica, con Cr (III) que actúa como hapteno
(9,10,11).
G. Efecto sobre el tracto respiratorio
La experiencia ocupacional humana indica claramente que, cuando se
inhala, el cromo (VI) es un irritante del tracto respiratorio, lo que produce
irritación de las vías respiratorias, obstrucción de las vías respiratorias y
posiblemente cáncer de pulmón. La dosis, la duración de la exposición y
el compuesto específico involucrado determinan los efectos del cromo
(9,10,11).
Los efectos irritantes pulmonares después de la inhalación prolongada de
polvo de cromato (VI) pueden incluir irritación crónica, congestión e
hiperemia, rinitis crónica, pólipos del tracto respiratorio superior,
traqueobronquitis y faringitis crónica. Las anomalías en los rayos X
reflejan un agrandamiento de la región hiliar y los ganglios linfáticos,
aumento de las marcas pulmonares peribronquiales y perivasculares y
adherencias del diafragma. Se han encontrado asociaciones consistentes
entre el empleo en las industrias primarias del cromo y el riesgo de cáncer
respiratorio (vea la sección de Efectos carcinogénicos (9,10,11).
La sensibilización pulmonar que resulta en una respuesta asmática es
más común en Cr (VI) que en Cr (III). Se notificó una reacción anafilactoide
tardía en un trabajador de sexo masculino expuesto ocupacionalmente a
los vapores de cromo de los baños de trióxido de cromo (VI) y los humos
de cromo de la soldadura de acero. Un desafío de inhalación posterior con
cromato de sodio dio lugar a una reacción que incluyó urticaria de inicio
15
tardío, angioedema y broncoespasmo acompañado por el triplismo de los
niveles de histamina en plasma (9,10,11).
Se han notificado muchos casos de lesión de la mucosa nasal (mucosa
inflamada, tabique ulcerado, tabique perforado) en trabajadores
expuestos a Cr (VI) en plantas de cromo y curtiembres. Un estudio
realizado en 1983 sobre 43 plantas de cromado en Suecia, donde los
trabajadores estaban expuestos casi exclusivamente al ácido crómico
(VI), reveló que todos los trabajadores con ulceración o perforación de la
mucosa nasal estaban expuestos periódicamente a al menos 20 µg / m3
cuando trabajaban cerca del revestimiento,piscina. (El nivel actual de
exposición permisible en los EE. UU. En el lugar de trabajo para cromatos
y ácido crómico es de 100 µg / m3 durante un período de 8 horas). El
período de exposición para los trabajadores que experimentaron
ulceración de la mucosa nasal varió de 5 meses a 10 años (9,10,11).
H. Efectos renales
Los estudios de soldadores y enchapadores de cromo han encontrado
que los trabajadores con niveles más altos de exposición al cromo en el
aire (típicamente más de 20 µg / m3) muestran daños en los túbulos
renales. Se han reportado efectos renales adversos en humanos después
de la inhalación, ingestión y exposición dérmica al cromo. Los efectos
renales en animales ocurrieron solo después de la administración
parenteral de grandes dosis (9,10,11).
Aunque se ha observado lesión glomerular en los trabajadores con cromo,
la lesión renal predominante es tubular, con dosis bajas que actúan
específicamente en los túbulos contorneados proximales.
La exposición crónica al cromo en dosis bajas generalmente resulta solo
en efectos renales transitorios. Se han encontrado niveles elevados de
ß2-microglobulina en la orina (un indicador de daño tubular renal) en
placas de cromo, y generalmente se han observado niveles más altos en
personas más jóvenes expuestas a concentraciones más altas de Cr (VI).
16
Sin embargo, en un estudio de trabajadores de la curtiembre (exposición
a Cr [III]) cuya duración del empleo osciló entre 1 mes y 30 años, los
niveles de ß2-microglobulina en orina estaban dentro de los límites
normales, aunque los niveles de cromo en orina indicaban claramente la
exposición al cromo. Un umbral urinario sugerido para los efectos
nefrotóxicos es de 15 µg de cromo / g de creatinina (9,10,11).
I. Efectos hepáticos
La exposición aguda al cromo puede provocar necrosis hepática. Las
quemaduras de ácido crómico externas en más del 20% del cuerpo de un
trabajador causaron daño hepático grave e insuficiencia renal aguda. Los
datos limitados indican que la inhalación crónica de compuestos de cromo
también puede causar efectos hepáticos. Se notificó hepatitis aguda con
ictericia en una mujer que había estado empleada durante 5 años en una
fábrica de enchapado de cromo. Las pruebas revelaron grandes
cantidades de cromo urinario y la biopsia de hígado mostró anomalías.
Tres compañeros de trabajo expuestos a nieblas de ácido crómico de los
baños de placas durante 1 a 4 años también tuvieron anomalías hepáticas
leves a moderadas, según lo determinaron las pruebas de función
hepática y las biopsias de hígado (9,10,11).
J. Efectos carcinogénicos
Según la ATSDR, La Agencia Internacional para la Investigación del
Cáncer (IARC) ha determinado que los compuestos de Cromo (VI) son
carcinogénicos en seres humanos. El undécimo Informe sobre Sustancias
Carcinogénicas del Programa Nacional de Toxicología clasifica a los
compuestos de Cromo (VI) como sustancias reconocidas como
carcinogénicas en seres humanos. En un estudio epidemiológico clave en
el que participaron los trabajadores de una planta de producción de
cromato que trabajaron durante más de 1 año desde 1931 hasta 1949, el
porcentaje de muertes por cáncer de pulmón fue del 18,2%; cuando en
realidad se esperaba un 1,2%(8, 9,10).
17
Para los 322 trabajadores por primera vez desde 1931 hasta 1937, el
porcentaje de muertes por cáncer de pulmón fue cercano al 60%, con un
período de latencia de aproximadamente 30 años. Estos estudios se
hicieron en trabajadores que laboraban en industrias de pigmento de
cromo, cromado y ferrocromo (9,10,11).
K. Efectos reproductivos y del desarrollo
No hay estudios que hayan demostrado que el cromo causa defectos de
nacimientos en seres humanos.
Algunos estudios en animales han demostrado que la exposición a dosis
altas durante la preñez puede producir abortos, bajo peso de nacimiento
y alteraciones en el desarrollo del esqueleto y del sistema reproductivo.
Los efectos sobre el desarrollo en animales pueden deberse en parte a
la toxicidad del cromo sobre las madres. Los efectos adversos del
desarrollo en animales incluyen paladar hendido, hidrocefalia, osificación
tardía, edema y cierre incompleto del tubo neural. (9,10,11).
2.2.2. Espectrofotometría
La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y
se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática
(de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de
la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como
consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a
P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de
luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a
medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa (12).
18
2.2.3. Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento que mide la cantidad de fotones
(la intensidad de la luz) absorbida por la muestra líquida después de pasar
un haz de luz a través de la solución (11).
Espectrofotómetro UV-visible utiliza luz sobre el rango de ultravioleta (185
– 400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) de espectro de radiación
electromagnética(12).
El espectrofotómetro de infrarrojo utiliza luz en el espectro de infrarrojos,
en un rango de 700 a 15,000 nm del espectro de radiación
electromagnética (12).
En la espectrofotometría del visible, la absorción o la transmisión de una
sustancia se pueden determinar por el color observado (12).
La instrumentación básica de todos los espectrofotómetros consta de 7
partes: fuente de luz, colimador, monocromador, selector de longitud de
onda, contenedor de muestra, detector y dispositivo digital (13).
El funcionamiento del espectrofotómetro básicamente empieza cuando la
fuente de luz blanca de un bulbo se enfoca en un colimador haciéndolo
pasar a través de una ranura fina hacía el monocromador, el cual divide
el haz de luz blanca en sus colores componentes, los diferentes colores
en los que se divide tienen una longitud de onda diferente. Posteriormente
se encuentra una segunda hendidura fina que es el selector de longitud
de onda, el cual selecciona sólo un color de luz. La luz pasa a través de
un recipiente que contiene la muestra líquida en el interior. Un detector de
luz mide la cantidad de luz que se transmite a través de la muestra, y lo
compara con la cantidad de luz emitida por la fuente, la diferencia entre
estos valores da una medida de la cantidad de luz absorbida a través de
la muestra, es decir, la absorbancia (A) o densidad óptica (OD). La
absorbancia varía con la longitud de onda, por lo que las medidas de este
tipo siempre especifican la longitud de onda de la luz que se brilló a través
19
de la muestra. Para finalmente ser traducida la información con la ayuda
de un software y se obtiene el resultado en un dispositivo digital (14).
A. Fuentes de luz.
Para la fuente de luz se utilizan materiales que pueden excitarse a estados
de alta energía por una descarga eléctrica de alta tensión o también por
calentamiento eléctrico, sirven como excelentes fuentes de energía
radiante (14,15).
Las propiedades deseables de una fuente de luz son las siguientes: brillo
a través de una amplia gama de longitudes de onda, estabilidad en el
tiempo, larga vida útil y bajo costo. Aunque no hay fuentes de luz que
tengan todas estas propiedades, las fuentes de luz más utilizadas
actualmente son las lámparas halógenas, utilizadas para las regiones
visible e infrarroja cercana y las lámparas de deuterio utilizadas para la
región ultravioleta. Por otro lado, a veces también se utilizan las lámparas
de xenón (14,15).
a) Lámpara halógena
Es también conocida como lámpara de tungsteno o de cuarzo, el
intervalo de longitud de onda está en la región de luz visible, de 320
nm. a 1100 nm. Si un equipo posee sólo una lámpara halógena,
significa que el instrumento sólo puede medir la luz visible. La vida útil
general de la lámpara halógena es de aproximadamente 2000 horas,
o más (14,15).
b) Lámpara Deuterio
La lámpara de deuterio o lámpara D2, tiene un rango de longitud de
onda que va de 190 a 370 nm. Debido a su comportamiento a altas
temperaturas, el vidrio no es adecuado, por lo que requiere cuarzo,
MgF₂, etc. Su tiempo de vida es de aproximadamente 1000 horas.
(14,15).
20
Para que un espectrofotómetro abarque las regiones UV/Vis, se
necesita una lámpara de deuterio con lámparas halógenas, para cubrir
toda la longitud de onda UV y luz visible (14,15).
c) Lámpara de xenón
La lámpara de xenón ofrece una fuente de luz de alta energía, y puede
alcanzar un estado estable en un corto período de tiempo. Cubre toda
la gama de longitudes de onda UV/vis, de 190 a 1100 nm. La luz de
xenón parpadea en una frecuencia de 80 Hz, por lo que el tiempo de
vida es más largo que la lámpara de deuterio o halógena. Sin embargo,
el costo de una lámpara de xenón es mucho mayor (15).
d) Lámpara led
La lámpara LED puede producir una sola longitud de onda de luz, por
lo tanto, no requiere un monocromador. Su vida útil es muy larga, tiene
poca variación en el ancho de banda, y es estable, además es una
fuente de luz de bajo costo (14,15).
B. Lente condensador (colimador)
El colimador óptico que consiste en un tubo que tiene un lente convexo en
un extremo y una abertura ajustable en el otro, el lente recibe toda la luz
emitida por la fuente de luz y la hace pasar a través de la abertura hacia
el monocromador o prisma (15).
C. Selectores de longitud de onda
Los selectores de longitud de onda son de 2 tipos, filtros o
monocromadores: (13).
a) Filtros
Existen diferentes tipos de filtros, los de interferencia y cuñas de
interferencia, son los que se basan en la interferencia óptica (adición de
ondas destructivas) para proporcionar bandas estrechas de radiación,
21
donde el espesor de la capa dieléctricadetermina la longitud de onda de
la radiación transmitida (12).
Por otro lado, tenemos a los filtros de absorción, que son de vidrio
coloreado o de un tinte que absorbe la longitud de onda que queremos
rechazar, donde los anchos de banda son extremadamente grandes (30
a 250 nm). La combinación de dos filtros de absorción de diferentes λ
max puede producir un filtro de paso de banda (13).
b) Monocromador
El monocromador, también conocido como prisma o rejillas de difracción
son elementos dispersivos típicos. Un monocromador resuelve la
radiación policromática en sus longitudes de onda individuales y aísla
estas longitudes de onda en bandas muy estrechas.
Para la región visible, los prismas están hechos de vidrio y para la región
UV, de cuarzo o de sílice. Los prismas solían ser utilizados comúnmente
como elementos dispersivos en los espectrómetros, pero recientemente,
las rejillas de difracción se han convertido en el tipo de elemento
dispersivo más utilizado. Las redes de difracción utilizadas en los
espectrofotómetros tienen aproximadamente 2.000 ranuras paralelas por
milímetro cortadas a intervalos iguales.
En comparación con los prismas, las rejillas son superiores ya que
producen resoluciones del espectro para toda la gama de longitudes de
onda (14).
D. Contenedores de muestra
Los contenedores de muestras son cubetas ópticamente transparentes de
vidrio, plástico, cuarzo o sílice. El plástico y el vidrio no se pueden utilizar
para mediciones de luz en la región UV, ya que absorben luz UV por
debajo de 310 nm (13,15).
Por otro lado el sílice y el cuarzo se pueden utilizar tanto para medidas de
luz UV y luz visible, ya que no absorben la luz UV. Puesto que el cuarzo
absorbe luz por debajo de 190 nm, pueden usarse cubetas de fluoruro de
litio que transmiten radiaciones hasta 110 nm. Las cubetas estándar están
22
hechas de cuarzo y tienen una trayectoria óptica de 1 cm y contienen de
1 a 3 mL de solución, además existen las minicubetas, que tienen una
capacidad de 0,3 – 0,5 mL (13,15).
E. Dispositivos de detección
Es el último elemento en el espectrofotómetro, la mayoría de los
detectores dependen del efecto fotoeléctrico. La corriente es entonces
proporcional a la intensidad de la luz y por lo tanto una medida de la
misma. Los requisitos importantes para un detector incluyen: alta
sensibilidad para permitir la detección de bajos niveles de energía
radiante, tiempo de respuesta corto, estabilidad a largo plazo, una señal
eléctrica que se amplifica fácilmente para un aparato de lectura típico
(13,15).
Los fotomultiplicadores y los fotodiodos de silicio son detectores típicos
utilizados con espectrofotómetros para las regiones UV y visible (13,15).
a) Fotomultiplicador
Es un detector que utiliza el hecho de que los fotoelectrones son
descargados de una superficie fotoeléctrica cuando se somete a luz
(efecto fotoeléctrico externo).
Los fotoelectrones emitidos desde la superficie fotoeléctrica causan
repetidamente emisión de electrones secundarios en dinodos dispuestos
secuencialmente, produciendo en última instancia una salida grande para
una intensidad de luz relativamente pequeña. La característica más
importante de un fotomultiplicador es que alcanza un nivel
significativamente alto de sensibilidad que no se puede obtener con otros
sensores ópticos. Las características de sensibilidad espectral de un
fotomultiplicador están determinadas principalmente por el material de la
superficie fotoeléctrica (14).
b) Fotodiodo de silicio
Es un detector que utiliza el hecho de que las propiedades eléctricas de un
detector cambian cuando se expone a la luz (el efecto fotoeléctrico
interno). En comparación con los fotomultiplicadores, los fotodiodos de
23
silicio ofrecen ventajas tales como bajo coste, poca localidad de
sensibilidad en la superficie receptora de luz y el hecho de que no se
requiere una fuente de alimentación especial (13).
Incluso respecto a la sensibilidad, si la intensidad de la luz es relativamente
grande, pueden obtener datos fotométricos que no sean inferiores a los
obtenidos con fotomultiplicadores (14).
Por otro lado, el cromo es un metal duro, gris acero muy resistente a la
oxidación, incluso a altas temperaturas. Es el sexto elemento más
abundante en la corteza terrestre, donde se combina con hierro y oxígeno
en forma de mineral de cromita. La Unión Soviética, Sudáfrica, Albania y
Zimbabwe juntas representan el 75% de la producción mundial de
cromita.
El mineral de cromita no se ha extraído en los Estados Unidos desde
1961; en 1985, este país se volvió completamente dependiente de la
importación para su suministro de cromo primario (9,10,11).
2.2.4. Validación de métodos analíticos
A. Precisión
Establece el grado de acomodación o correlación dentro de un grupo de
medidas del mismo valor.
La precisión representa una medida de la capacidad de repetibilidad y
reproducibilidad de las medidas por un instrumento (16).
B. Repetibilidad: establece la precisión de un instrumento cuando el
conjunto de medidas de la misma magnitud se realiza de forma repetitiva
y utilizando las mismas condiciones de medida. Las condiciones de
repetibilidad incluyen:
El mismo procedimiento de medida.
El mismo criterio de lectura.
El mismo instrumento de medida utilizando las mismas condiciones.
El mismo sistema.
Medidas sucesivas con poco intervalo de tiempo entre ellas (16).
24
C. Reproducibilidad: establece la precisión del proceso de medida cuando
el conjunto de medidas se realiza bajo condiciones de medida cambiantes
(16).
D. Exactitud
Hace referencia tanto a la veracidad como a la precisión de un equipo de
instrumentación. Define la concordancia de una medida respecto del valor
verdadero de la magnitud que se mide, y es afectada tanto por los errores
sistemáticos (veracidad) como por los errores aleatorios (precisión) (16).
E. Linealidad
La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad entre
la concentración de analito y su respuesta. Este paso de la validación es
necesario si se va a trabajar con un solo estándar en las determinaciones
de rutina, aunque pueden aceptarse métodos no lineales, si se opera con
estándares múltiples cada vez (16).
2.3. Hipótesis
2.3.1. Hipótesis principal
Dado que los métodos para determinar analitos por métodos
instrumentales deben garantizar los resultados reportados es probable
validar un método analítico para la determinación de cromo hexavalente
por espectrofotometría en aguas
2.3.2. Hipótesis secundaria
Es probable hallar la linealidad del método para la cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
Es probable hallar los límites de detección y cuantificación del método de
determinación de cromo hexavalente en aguas.
Es probable determinar la precisión del método de cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
Es probable determinar la exactitud del método de cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
Es probable determinar la robustez del método de cuantificación de cromo
hexavalente en aguas.
25
2.4. Variables
2.4.1. Identificación de variables
Variable Independiente: Método para la determinación de cromo
hexavalente en aguas
Variable dependiente: Validación
2.4.2. Definición conceptual de variables
Variable Independiente
Método para la determinación de cromo hexavalente en aguas:
Método espectrofotométrico para la cuantificación de cromo
hexavalente usando difenilcarbazida en aguas obtenido de las zonas
aledañas a la laguna de oxidación de la ciudad de Arequipa.
Variable dependiente
Validación
Evaluar los parámetros de linealidad evaluando el coeficiente de
correlación lineal (r2), sensibilidad determinando la cantidad mínima de
cromo hexavalente detectado y cuantificado por el método, precisión
evaluando parámetros de repetibilidad y reproducibilidad, exactitud
determinada por el método de recuperación y finalmente la robustez
evaluando por el método de Youden& Steiner.
2.4.3. Definición operacional de variables
Variable Independiente
Método para la determinación de cromo hexavalente en aguas:
Se determinará el cromo por espectrofotometría del rango visible usando
difenilcarbazida (DFC) en medio ácido en presencia de nitrato de sodio.
Variable dependiente
Validación
26
Evaluar los parámetros de linealidad evaluando el coeficiente de
correlación lineal (r2>0.995), sensibilidad determinando los límites de
detección y cuantificación, precisión evaluando el coeficiente de
correlación lineal que debe ser menos a 2.0 %, exactitud determinada por
el método de recuperación con un porcentaje entre 90 y 100 %, y
finalmente la Robustez evaluando por el método de Youden & Steiner.
2.4.4. Operacionalización de variables
Tabla 1. Operacionalización de variables
Variable
INDEPENDIENTE Indicador Subindicador
Método para la
determinación de cromo
hexavalente en aguas
Agua Gramos y
mililitros
Variable
DEPENDIENTE Indicador Subindicador
Validación del método
Linealidad evaluando el
coeficiente de
correlación lineal
r2>0.995
Precisión evaluando
repetibilidad y
reproducibilidad
CV%<2.7%
Sensibilidad evaluando
los límites de detección
y cuantificación
Agua (mg/L)
Exactitud por el
porcentaje de
recuperación
90%-110%
Robustez por el Método
de Youden& Steiner
Interacción de
factores como
tipo de
micropipeta,
analista y puntas.
Fuente. Elaboración propia
27
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1. Planteamiento Metodológico
Nivel, Tipo y Diseño de la Investigación
Nivel de la investigación
Experimental
Tipo de investigación
Según manipulación de variables: Experimental
Según número de mediciones: Transversal
Según la temporalidad: Prospectivo
Enfoque: Cuantitativo
Paradigma: Positivista
Diseño de la investigación
Experimental
3.2. Descripción del ámbito de la Investigación
Ubicación espacial
El presente trabajo de investigación se desarrolló en los laboratorios
de la de la Universidad Privada Autónoma del Sur.
Ubicación temporal
El presente trabajo de investigación fue desarrollado entre los meses
de setiembre, octubre y noviembre de 2018.
3.3. Población y muestra
a. Población
Las muestras de agua fueron recolectadas de la laguna de oxidación
de RIO SECO.
28
b. Muestra
5 litros de efluente de curtiembre.
c. Muestreo
No probabilístico.
3.4. Técnicas e Instrumentos De Recojo De Datos
3.4.1. Materiales, equipos y reactivos
A. Reactivos
1,5 – difenilcarbazida
Ácido clorhídrico concentrado
Dicromato de potasio p.a.
B. Materiales
Fiolas de 5, 10, 25, 50, 100, 500 y 1000 mL
Gradillas
Lunas de reloj
Micropipetas de 100 a 1000 µL
Papel Kraft
Puntas para micropipeta
Vasos de precipitados de 100 y 150 mL
C. Equipos
Espectrómetro visible
Estufa
D. Software
El presente estudio se realizó usando software para la evaluación de
datos como Microsoft Excel Professional y OriginPro 9.0
3.4.2. Preparación de la solución de Cromo (VI)
a. Solución Madre de cromo (VI)
Se preparó una solución madre de cromo (VI) a una concentración de 500
mg/L (ppm) a partir de dicromato de potasio. Para ello se pesó 1 g del
reactivo, el cual, se secó a 105 °C por 1 hora para eliminar la humedad
presente, finalmente, luego del secado se pesó 141.4 mg de dicromato
de potasio (K2Cr2O7) disolviéndolo con agua destilada en una fiola de 100
mL (17,18,19,20,21).
29
b. Solución estándar (10 ppm)
1 ml de la solución Madre de cromo (VI) fue diluida con agua destilada en
una fiola de 50 mL obteniendo así una solución estándar de 10 ppm de
K2Cr2O7 (17,18,19,20,21).
c. Solución ácido clorhídrico (HCl) 0.5 N
Se preparó la solución al 0.5 N a partir de una solución de ácido clorhídrico
concentrado. Se midió 4.2 ml de HCl al 0.5 N en una fiola de 100 ml que
previamente tenía agua destilada y luego se enrazó (17,18,19,20,21).
d. Solución nitrato de sodio (NaNO3) 0.1 M
Se pesó 4.2510 g de nitrato de sodio (NaNO3) disolviéndolo en agua
destilada en una fiola de 500 mL para luego enrasar hasta aforo
(17,18,19,20,21).
e. Solución de difenilcarbazida a una concentración de 5 mg/mL
Se pesó 0.25 g de difenilcarbazida .La preparación se desarrolló en una
fiola de 50 ml cubierta con papel aluminio para evitar que la luz
interaccione con la solución y se enrazó con etanol (17,18,19,20,21).
f. Soluciones estándar o patrones
A continuación, en la Tabla 1 se observa el procedimiento para la
preparación de las soluciones estándar a concentraciones de 0, 0.1, 0.2,
0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y1.0 mg/L las cuales se dejaron en reposo
durante 10 minutos antes de leer al espectrofotómetro a 540 nm.
(17,18,19,20,21).
En la Tabla 1 se muestra el procedimiento para la determinación de cromo
donde se muestra que para la elaboración de la curva de calibración se
prepararon soluciones estándar con concentraciones de 0,0.1, 0.2, 0.3,
0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1 mg/L de Cr (VI) a partir de una solución
madre de dicromato de potasio equivalente a una concentración de Cr (VI)
de 500 mg/L, dichas soluciones estándar fueron preparadas en fiolas de
10 mL en presencia de 5 mL de NaNO3 0.1 M, 1 mL HCl 0.5 N y 0.5 mL
30
de DFC 5 mg/mL, luego se dejaron reaccionar durante 10 minutos para
luego leer las absorbancias en un espectrofotómetro a 540 nm
(17,18,19,20,21).
Tabla 1 Determinación de Cr (VI) con difenilcarbazida.
Cr (VI)10 mg/L
(mL)
NaNO3
0.1M
(mL)
HCl 0.5 N
(mL)
DFC
5mg/mL
(mL)
Volumen
final (mL)
0 5.0 1.0 0.5 10.0
0.1 5.0 1.0 0.5 10.0
0.2 5.0 1.0 0.5 10.0
0.3 5.0 1.0 0.5 10.0
0.4 5.0 1.0 0.5 10.0
0.5 5.0 1.0 0.5 10.0
0.6 5.0 1.0 0.5 10.0
0.7 5.0 1.0 0.5 10.0
0.8 5.0 1.0 0.5 10.0
0.9 5.0 1.0 0.5 10.0
1.0 5.0 1.0 0.5 10.0
Dejar en reposo 10 minutos para el desarrollo de color
Fuente. Adaptado de Ramírez (18)
Es necesario destacar que, el cromo (VI) reacciona con la
difenilcarbazida (DFC) la cual en medio ácido se oxida a
difenilcarbazona y el cromo es reducido a cromo (III), como se observa
en la ecuación 3 (Ec. 1) (17,18,19,20,21).
𝐷𝑖𝑓𝑒𝑛𝑖𝑙𝑐𝑎𝑟𝑏𝑎𝑧𝑖𝑑𝑎 + 𝐶𝑟+6 → 𝐷𝑖𝑓𝑒𝑛𝑖𝑟𝑐𝑎𝑟𝑏𝑎𝑧𝑜𝑛𝑎 + 𝐶𝑟+3
(Ec. 1)
Con motivo de lo expuesto, la difenilcarbazona forma un quelato con el
cromo (III) en relación 3 a 1 respectivamente, así pues, en la Figura 1
se observa como 3 moléculas de difenilcarbazona se unen con enlaces
covalentes coordinados a una molécula de Cr (III), cabe mencionar que
podría encontrarse en forma de cloruro por la presencia de dicho anión
en el proceso de formación de dicho quelato (17,18,19,20,21).
31
Figura 1Complejación de la difenilcarbazona con Cr+3
Fuente:Adaptado de Ramírez (18) en Chemsketch
3.4.3. Validación del método analítico para la cuantificación de cromo (VI)
en medios acuosos.
a. Linealidad
La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad
entre la concentración de analito y su respuesta. Este paso de la
validación es necesario si se va a trabajar con un solo estándar en
las determinaciones de rutina, aunque pueden aceptarse métodos no
lineales, si se opera con estándares múltiples cada vez. Además,
conjuntamente se determina el rango lineal, es decir, el intervalo
comprendido entre la concentración mínima y máxima de analito para
el cual el método ha sido probado y dentro del cual se puede efectuar
el dosaje por interpolación en una curva estándar, y se determina la
curva de regresión 𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥 (16,19).
32
Siendo a y b (Ec. 1 y Ec. 2) los estimadores de la ordenada al origen
y pendiente respectivamente, n el número de mediciones, Xi la
concentración e Yi, el valor medido en el ensayo i,
Independientemente de la apariencia de la recta, resulta conveniente
evaluar los estimadores de la regresión en un intervalo de confianza
dado (p = 0,05) (16,19).
n
XX
n
YXYX
b
ii
ii
ii
2
2
(Ec. 1)
n
XbYa
ii
(Ec. 2)
Posteriormente se evaluó el coeficiente de correlación lineal r2 que
según la USP debe ser mayor a 0.995 para que un método sea
considerado lineal (r2>0.995), dicho parámetro se determina
mediante la siguiente formula (16,19).
n
YY
n
XX
n
YXYX
r
ii
ii
ii
ii
2
2
2
2
(Ec. 4)
b. Sensibilidad
a. Límites de detección y cuantificación (Sensibilidad)
Para la determinación de los límites de detección (LD) se usó la
siguiente formula: (16,19).
𝐿𝐷 =𝑌𝑏𝑙 + 3𝑆𝑏𝑙
𝑏×
1
√𝑛
(Ec. 5)
Para la determinación de los límites de cuantificación (LC) se usó la
siguiente formula: (16,19).
𝐿𝐶 =𝑌𝑏𝑙 + 10𝑆𝑏𝑙
𝑏×
1
√𝑛
(Ec. 6)
33
c. Precisión
Es la dispersión de la medida alrededor de un valor medio (16,19).
Preparación del ensayo
Se preparan muestras que contengan Cr (VI) para luego proceder a
determinar su concentración 6 veces, dicho procedimiento debe ser
realizado por el mismo analista (16,19).
Análisis estadístico
La precisión está relacionada con la dispersión de las medidas
alrededor de su valor medido o central y corresponde al grado de
concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica
repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea
(16,19).
La precisión se expresa matemáticamente como la desviación
estándar,, este por s o más comúnmente como la desviación estándar
relativa (DSR) o coeficiente de variación (CV) (16,19).
1
1
2
n
XX
S
n
i
i
(Ec. 7)
Donde n es el número de medidas, es el valor medido en el ensayo i y
el estimador de la medida de la población calculado como:
n
Xn
i
i 1X
(Ec. 8)
34
Por su parte, la desviación estándar relativa o coeficiente de variación
se calcula como:
X
100
SDSR
(Ec. 9)
Ambos estimadores, desviación estándar y desviación relativa permiten
evaluar la incertidumbre en la estimación de la medida (error aleatorio,
correspondiente a la dispersión de datos alrededor de la medida). La
precisión de un método deberá estudiarse (16,19).sobre:
El sistema, evaluando la dispersión de al menos 6 lecturas del estándar.
La precisión debe medirse en condiciones repetitivas (mismo analista,
mismo día, mismo instrumento) y en condiciones reproducibles
(diferente analista diferente día, diferente instrumento) (16,19).
Así la USP indica una DSR del sistema de no más de 2%, leyendo 5
veces una solución estándar, aunque pueden obtenerse en condiciones
apropiadas valores inferiores al 1% e incluso menores (16,19).
35
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
La presente investigación que tuvo por finalidad validar un método para la
cuantificación de cromo hexavalente (Cr+6) en aguas cuyos resultados se
detallan a continuación.
4.1. Verificación del espectrofotómetro
En primer lugar, antes de realizar la validación del método para cuantificar
cromo hexavalente fue necesario verificar la longitud de onda del
espectrofotómetro para lo cual se usó al permanganato de potasio que a
menudo se utiliza para verificar las inflexiones características del mismo
a fin de verificar el buen funcionamiento del espectrofotómetro.
4.1.1. Verificación de la longitud de onda
Para la verificación de la longitud de onda primero se realizó un barrido
espectrofotométrico de 400 a 650 nm en el “Espectrofotómetro UNICO
modelo 2100” usando una solución de KMnO4 a una concentración de
0.0003 M dando como resultado la Figura 2 mostrando inflexiones a
longitudes de onda de 485, 505, 525, 540 y 570 nm.
400 450 500 550 600 650
0.0
0.5
1.0
Ab
so
rba
ncia
Longitud de onda (nm)
Figura 2 Espectro de absorción de la solución de KMnO4 0.0003 M. con Inflexiones en 485, 505, 525, 540 y 570 nm comparables a parámetros establecidos.
Fuente. Elaboración propia
36
Por otro lado, se construyó una curva de calibración con concentraciones
de permanganato de potasio de 0.0001, 0.0002, 0.0004, 0.0006 y 0.0008
M con la finalidad de verificar la longitud de onda del “Espectrofotómetro
UNICO modelo2100”, obteniendo los resultados de la Tabla 2 donde se
observa las absorbancias promedio obtenidas luego de la lectura por
triplicado de las concentraciones de permanganato de potasio a
concentraciones de 0.0001 a 0.0008 M.
Tabla 2 Absorbancias promedio de las concentraciones a escala de 1x10-4 M.
KMnO4 (mol/L) Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Absorbancia
promedio
0.0001 0.174 0.224 0.184 0.194
0.0002 0.404 0.454 0.414 0.424
0.0004 0.900 0.950 0.910 0.920
0.0006 1.370 1.420 1.380 1.390
0.0008 1.823 1.873 1.833 1.843
*mol/L=concentración molar
Fuente. Elaboración propia
Para evaluar la linealidad de la longitud de onda se procedió a calcular
el “R2” (Coeficiente de regresión lineal) para el cual se usó el método de
los mínimos cuadrados dando como resultado los valores de la Tabla 3.
En dicha tabla se calculó XiYi, Xi2 y Yi
2 con la finalidad de calcular las
sumatorias (Ʃ) de cada columna para poder reemplazar dichos valores
en la ecuación 4 (Ec. 4).
37
Tabla 3 Valores de las variables correspondientes a al coeficiente de correlación r2
n Xi Yi Xi Yi Xi2 Yi
2
1 0.0001 0.194 0.00002 0.00000001 0.03764
2 0.0002 0.424 0.00008 0.00000004 0.17978
3 0.0004 0.920 0.00037 0.00000016 0.84640
4 0.0006 1.390 0.00083 0.00000036 1.93210
5 0.0008 1.843 0.00147 0.00000064 3.39665
Ʃ 0.0021 4.771 0.00278 0.00000121 6.392561
*Ʃ=sumatoria; Xi= Concentración de KMnO4 (mol/L); Yi=Absorbancia
Fuente. Elaboración propia
Los resultados de las variables involucradas en el cálculo de “R2”
(Coeficiente de regresión lineal) se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4 Valores de las variables involucradas en el cálculo de “R2” (Coeficiente de regresión lineal)
Fórmulas Valor
Ʃ Xi Yi 0.00278
Ʃ Xi 0.0021
Ʃ Yi 4.771
Ʃ Xi2 0.00000121
Ʃ Yi2 6.392561
(Ʃ Xi)2 0.00000441
(Ʃ Yi)2 22.762441
n 5
*Ʃ=sumatoria; Xi= Concentración de KMnO4 (mol/L); Yi=Absorbancia
Fuente. Elaboración propia
Una vez obtenidos los valores de la Tabla 4 se procedió a calcular el
coeficiente de regresión lineal “r2” de la siguiente manera:
38
a. Reemplazando los valores de la Tabla 4 en la ecuación 4(Ec. 4)
b. Dando como resultado un coeficiente de regresión “r” de 0.99987
c. El cuadrado del resultado anterior dio el coeficiente de regresión
lineal R2 de 0.9997 siendo este superior al 0.995 por lo que el
método resultó ser lineal.
d. Graficando los valores obtenidos se evidencia gráficamente la
linealidad de la longitud de onda como se observa en la Figura 3.
0.0000 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008 0.0009
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Ab
so
rban
cia
Concentración (M)
y = 2368.232x -0.041
R2 = 0.99965
Figura 3 Gráfico de calibración correspondiente a la concentración vs la absorbancia
Fuente. Elaboración propia
𝑟 =0.00278 −
0.0021×4.771
5
√(0.00000121 −0.00000441
5) (6.3926 −
22.762
5)
𝑟 = 0.99987
𝑅2 = 0.9997
39
Con los resultados obtenidos se culminó con la verificación de la longitud
de onda del equipo que mostró condiciones aptas para continuar con la
presente tesis.
4.2. Validación del método para la cuantificación de cromo hexavalente
en aguas.
4.2.1. Barrido espectrofotométrico
El barrido espectrofotométrico realizado entre 450 a 750 nm dio como
resultado el espectro que se observa en la Figura 4 donde se evidencia
que se obtiene una absorbancia máxima a una longitud de onda λ de 540
nm.
450 500 550 600 650 700 750
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Absorb
ancia
Longitud de onda (nm)
540 nm
Figura 4 Barrido espectrofotométrico de complejo purpura entre la difenilcarbazona y el Cr+3 (λ de absorción máxima= 540nm)
Fuente. Elaboración propia
Por lo expuesto, en la presente validación se trabajó a una longitud de
onda de 540 nm.
40
4.2.2. Soluciones de calibración
Las soluciones de cromo hexavalente a concentraciones de 0.1, 0.2, 0.3,
0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1.0 ppm fueron leídas en el espectrofotómetro
dando como resultado absorbancias que se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5 Absorbancias correspondientes a las soluciones de calibración (0.1 a 1-0 mg/L) de cromo hexavalente [Cr (VI)]
Cr (VI)
mg/L
Absorbancia
1
Absorbancia
2
Absorbancia
3 Promedio
Desviación
Estándar
0.1 0.047 0.037 0.033 0.039 0.007
0.2 0.114 0.105 0.096 0.105 0.009
0.3 0.169 0.157 0.163 0.163 0.006
0.4 0.233 0.225 0.231 0.230 0.004
0.5 0.297 0.298 0.299 0.298 0.001
0.6 0.371 0.359 0.363 0.364 0.006
0.7 0.429 0.429 0.427 0.428 0.001
0.8 0.498 0.491 0.483 0.491 0.008
0.9 0.570 0.554 0.553 0.559 0.010
1.0 0.623 0.614 0.616 0.618 0.005
Fuente. Elaboración propia
4.2.3. Linealidad
Para evaluar la linealidad de la longitud de onda se procedió a calcular el
“R2” (Coeficiente de regresión lineal) para el cual se usó el método de los
mínimos cuadrados por lo que fue necesario calcular las variables XiYi, Xi2
y Yi2dando como resultado los valores de la Tabla 6.
En dicha tabla se calculó XiYi, Xi2 y Yi
2 con la finalidad de calcular las
sumatorias (Ʃ) de cada columna para poder reemplazar dichos valores en
las ecuaciones 2, 3 y 4 (Ec. 2, Ec.3 y Ec. 4).
41
Tabla 6 Valores de las variables correspondientes al coeficiente de correlación r2, intercepto “a” y pendiente “b”
n Xi Yi Xi Yi Xi2 Yi
2
1 0.1 0.039 0.0039 0.01 0.002
2 0.2 0.105 0.0210 0.04 0.011
3 0.3 0.163 0.0489 0.09 0.027
4 0.4 0.230 0.0919 0.16 0.053
5 0.5 0.298 0.1490 0.25 0.089
6 0.6 0.364 0.2186 0.36 0.133
7 0.7 0.428 0.2998 0.49 0.183
8 0.8 0.491 0.3925 0.64 0.241
9 0.9 0.559 0.5031 0.81 0.312
10 1.0 0.618 0.6177 1 0.382
Ʃ 5.5 3.295 2.3464 3.85 1.432
*Ʃ=sumatoria; Xi= Concentración promedio de Cr (VI) (mg/L);
Yi=Absorbancia, n=número de datos
Fuente. Elaboración propia
Los resultados de las variables involucradas en el cálculo de “r2”
(Coeficiente de regresión lineal) se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7 Valores de las variables involucradas al “a” (intercepto), “b” (Pendiente) y “R2” (Coeficiente de regresión lineal)
Fórmulas Valor
Ʃ Xi Yi 2.346
Ʃ Xi 5.5
Ʃ Yi 3.295
Ʃ Xi2 3.85
Ʃ Yi2 1.432
(Ʃ Xi)2 30.25
(Ʃ Yi)2 10.855
n 10
Fuente. Elaboración propia
42
Una vez obtenidos los valores de la Tabla 6 se procedió a calcular la
pendiente “b” de la siguiente manera:
a. Reemplazando los valores de la Tabla 7 en la ecuación 2(Ec. 2)da
como resultado lo siguiente
b. Finalmente se obtiene que la pendiente de los datos de la Tabla 7
es 0.6477.
Por otro lado, para el cálculo del intercepto se procedió de la siguiente
manera:
a. Reemplazando los valores de la Tabla 7 en la ecuación 3(Ec. 3)da
como resultado lo siguiente
b. Finalmente se obtiene que el intercepto con el eje x de los datos de
la Tabla 6 es -0.0268.
Con los datos obtenidos se obtuvo la ecuación de la recta reemplazando
en la ecuación general (Ec. 10)dando como resultado:
(Ec. 10)
(Ec. 11)
Para el cálculo del coeficiente de regresión se procedió de la siguiente
manera:
𝑏 =2.346 −
5.5×3.295
10
3.85 −30.25
10
𝑏 = 0.6477
𝑎 =3.295 − 0.6477(5.5)
10
𝑎 = −0.0268
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥
𝑦 = 0.6477𝑥 − 0.0268
43
a. reemplazar los valores de la Tabla 7 en la ecuación 4 (Ec. 4) da como
resultado un coeficiente de correlación “r” de 0.9999
b. El cuadrado del resultado anterior dio el coeficiente de regresión lineal
R2 de 0.9998 siendo este superior al 0.995 por lo que el método
resultó ser lineal.
c. Graficando los valores obtenidos se evidencia gráficamente la
linealidad de la longitud de onda como se observa en la Figura 5
0.0 0.5 1.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Ab
so
rban
cia
Cr+6
(mg/L)
y=0.6477x-0.0268
R2=0.9998
Figura 5 Gráfico de calibración correspondiente a la concentración de cromo hexavalente vs la absorbancia promedio.
Fuente. Elaboración propia
𝑟 =2.346 −
5.5×3.295
10
√(3.85 −30.25
10) (1.432 −
10.855
10)
𝑟 = 0.9999
𝑅2 = 0.9998
44
4.2.4. Sensibilidad
Para la determinación de la sensibilidad se halló la ecuación de la recta
de la misma forma como se explicó en el apartado anterior, para lo cual
se relacionó la concentración de cromo hexavalente versus la desviación
estándar usando los valores de la Tabla 5, dando como resultado la
ecuación de la recta de la Figura 6.
𝑦 = 0.00614 − 0.00091𝑥
(Ec. 12)
0.0 0.5 1.0
0.000
0.005
0.010
De
svia
ció
n e
stá
nd
ar
Cr+3
(mg/L)
y = 0.00614-0.00091x
Figura 6 Gráfico correspondiente a la concentración de cromo hexavalente versus la desviación estándar.
Fuente. Elaboración propia
Para el cálculo se consideraron las siguientes variables que se muestran
en la Tabla 8.
45
Tabla 8 Valores de las variables implicadas en la determinación de los límites de cuantificación y límites de detección
Variable Interpretación Fuente Valor
b Pendiente Ec. 11 0.6477
Ybl Intercepto Ec. 11 -0.0268
Sbl Intercepto Ec. 12 0.00614
n 10
Fuente. Elaboración propia
Usando los valores de la Tabla 8y reemplazando en las ecuaciones 5 y 6
(Ec. 5 y Ec.6) se obtienen los límites de detección y cuantificación
respectivamente dando como resultado que:
El límite de cuantificación es de 0.0431 mg/L
El límite de detección es de 0.0221 mg/L
4.2.5. Precisión (Repetibilidad)
En la Tabla 9 se presentan los resultados de la evaluación de la precisión
del método después de leer las 6 muestras de efluente de curtiembre.
Como se observa en dicha tabla la desviación estándar relativa DSR fue
de 1.19 % siendo este valor menor a lo estipulado por la USP que refiere
que un método es considerado preciso cuando la DSR es menor a 2.0 %.
46
Tabla 9 Ensayo de precisión
n Concentración
1 0.239
2 0.246
3 0.245
4 0.243
5 0.240
6 0.242
Promedio 0.242
s 0.0029
DSR 1.19
Fuente. Elaboración propia
4.2.6. Exactitud
En la Tabla 10 se presentan los resultados luego de la evaluación de la
exactitud del método dando como porcentaje de recuperación un valor del
99.28 % estando este valor en el rango de aceptación para que un método
sea considerado exacto que es entre 90 y 110 %.
Evaluando la recuperación del método se usó la siguiente fórmula:
𝑡𝑒𝑥𝑝 =[100 − 𝑅]𝑛1/2
𝐷𝑆𝑅
𝑡𝑒𝑥𝑝 =[100 − 99.28]61/2
0.70
𝑡𝑒𝑥𝑝 = 2.519
𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎(5, 0.05) = 2.571
𝑡𝑒𝑥𝑝 < 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
No hay diferencia entre la recuperación media y 100 % por que el método
es exacto.
47
Tabla 10 Valores de los ensayos de exactitud
Fuente. Elaboración propia
Concentración
de muestra
Cr (VI) mg/L
Concentración de
adición estándar
Cr (VI) mg/L
Concentración
Teóricade(muestra + adición
estándar)
Cr (VI) mg/L
Concentración
experimental
Recuperación “R” (%)
(%𝑹 =𝐄𝐱𝐩𝐞𝐫𝐢𝐦𝐞𝐧𝐭𝐚𝐥
𝐓𝐞ó𝐫𝐢𝐜𝐚× 𝟏𝟎𝟎)
0.239 0.3 0.539 0.540 100.28
0.246 0.3 0.546 0.538 98.57
0.245 0.3 0.545 0.538 98.85
0.243 0.3 0.543 0.537 98.85
0.240 0.3 0.540 0.535 99.13
0.242 0.3 0.542 0.542 99.99
Promedio 99.28
Desviación estándar 0.69
DSR 0.70
48
4.2.7. Robustez
Para el cálculo de la robustez del método se ensayaron 3 factores siendo estos
el tipo de micropipeta(CAPP y BOECO), el analista (Analista 1 y Analista 2) y el
tipo de punta (reutilizada y nueva).
Para dicho parámetro se calcularon los valores de |𝑉𝑥|que corresponde a las
diferencias existentes entre las variables estudiadas.
En primer lugar, se compararon las absorbancias analizadas obtenidas al
preparar una solución de cromo hexavalente de aproximadamente 1 mg /L dando
como resultado un |𝑉𝑥| de 0.0234 luego de la comparación las absorbancias
correspondientes a las pipetas CAPP (Micropipeta 1) y BOECO (Micropipeta 2),
los resultados se observan en la Tabla 11.
Tabla 11 Análisis de la Robustez comparando Micropipetas (ARM) de marca CAPP (Micropipeta 1) y BOECO (Micropipeta 2)
Factores Absorbancia ARM
|𝑽𝒙|
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 1 0.590
0.607
0.0234
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 2 0.597
Micropipeta 1 Analista 2 Punta 1 0.605
Micropipeta 1 Analista 2 Punta 2 0.638
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 1 0.576
0.584 Micropipeta 2 Analista 1 Punta 2 0.597
Micropipeta 2 Analista 2 Punta 1 0.565
Micropipeta 2 Analista 2 Punta 2 0.598
Fuente. Elaboración propia
En segundo lugar, se compararon las absorbancias analizadas obtenidas al
preparar una solución de cromo hexavalente de aproximadamente 1 mg /L dando
como resultado un |𝑉𝑥| de 0.011 luego de la comparación las absorbancias
correspondientes a los analistas 1 y 2, los resultados se observan en la Tabla
12.
49
Tabla 12 Análisis de la Robustez comparando Analistas (ARA)
Factores Absorbancia ARA
|𝑽𝒙|
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 1 0.590
0.590
0.011
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 2 0.597
Micropipeta 1 Analista 2 Punta 1 0.605
Micropipeta 1 Analista 2 Punta 2 0.638
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 1 0.576
0.601 Micropipeta 2 Analista 1 Punta 2 0.597
Micropipeta 2 Analista 2 Punta 1 0.565
Micropipeta 2 Analista 2 Punta 2 0.598
Fuente. Elaboración propia
En tercer lugar, se compararon las absorbancias analizadas obtenidas al
preparar una solución de cromo hexavalente de aproximadamente 1 mg /L dando
como resultado un |𝑉𝑥| de 0.0236 luego de la comparación las absorbancias
correspondientes a las puntas 1 y 2 siendo estas reusadas y nuevas
respectivamente, los resultados se observan en la Tabla 13.
Tabla 13 Análisis de la Robustez comparando Puntas (ARP) de marca CAPP reusadas y nuevas
Factores Absorbancia ARP
|𝑽𝒙|
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 1 0.590
0.584
0.0236
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 2 0.597
Micropipeta 1 Analista 2 Punta 1 0.605
Micropipeta 1 Analista 2 Punta 2 0.638
Micropipeta 1 Analista 1 Punta 1 0.576
0.607 Micropipeta 2 Analista 1 Punta 2 0.597
Micropipeta 2 Analista 2 Punta 1 0.565
Micropipeta 2 Analista 2 Punta 2 0.598
Fuente. Elaboración propia
Finalmente, para evaluar la robustez en los casos expuestos se calculó la
siguiente fórmula:
50
2√𝑠
Siendo s el valor de la desviación estándar relativa hallada en el ensayo de
repetibilidad, dando como resultado 1.68.
Tabla 14 Análisis de la Robustez comparando Micropipetas CAPP (Micropipeta 1) y BOECO (Micropipeta 2)
Factores Especificación Resultados
Micropipeta
|𝑉𝑥| < 𝑠√2
0.0234<1.68
Analista 0.0011<1.68
Puntas nuevas y usadas 0.0236<1.68
Fuente. Elaboración propia
Comparando con la especificación (Tabla 14) se obtiene que el método es
robusto a las variaciones de analista micropipetas y puntas.
Finalmente, en la Tabla 15 se muestran los resultados de los parámetros de
validación establecidos por la USP logrando cumplir con todos y concluir que el
método esta validado para cuantificar cromo hexavalente en cuerpos de agua.
Tabla 15 Resumen de los resultados de validación
Fuente. Elaboración propia
Parámetro IUPAC
USP
Valor
Hallado Requisito Interpretación
Linealidad Obligatorio R2=0.9998 R2>0.995 Conforme
Sensibilidad
(Límite de detección) Obligatorio 0.0221 mg/L - Conforme
Sensibilidad
(Límite de
Cuantificación)
Obligatorio 0.0431 mg/L - Conforme
Precisión Obligatorio DSR=1.19 % DSR<2.7% Conforme
Exactitud Obligatorio R= 99.28% 90<R<110 Conforme
Robustez Obligatorio |𝑉𝑥| < 𝑠√2 |𝑉𝑥| < 𝑠√2 Conforme
51
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
La presente investigación fue desarrollada con la finalidad de validar un
método analítico para la cuantificación de cromo usando la
espectrofotometría del visible basada en la reacción de cromo
hexavalente con la 1,5-difenilcarbazida, por ello, la presente está
justificada ya que Gunzler (22), indica que la validación se debe realizar
en todo laboratorio ya que esto supone que cada laboratorio no solo valida
sus propios procedimientos, sino que también puede demostrar
eficientemente por sus propios datos su propia competencia con respecto
a la aplicación de procedimientos estándar. En particular, esto requiere
una revalidación periódica que debe realizarse de manera flexible de
acuerdo con las circunstancias específicas, A su vez, Olmedo et. al. (1)
refiere que, los métodos validados en un laboratorio determinado deben
verificarse y revalidarse siempre que sean adoptados por otro laboratorio.
Por otro lado, D’ilio et.al. (23), indica que la validación de los métodos
analíticos se ha convertido en un requisito básico para aquellos
laboratorios que trabajan en el control oficial de alimentos u otras
muestras.
Otro punto importante es que, aplicando métodos validados de acuerdo
con procedimientos y criterios de desempeño comunes, se puede
garantizar la calidad y la comparabilidad de los resultados analíticos
(23,24). Para corroborar la veracidad del método es usual evaluar los
métodos ,se usan materiales de referencia certificados sin embargo,
cuando no se disponen materiales de este tipo la veracidad se puede
evaluar mediante el método de adición estándar, porque no se dispone de
materiales de referencia adecuados para la especiación de cromo
(25,26,27).
52
En la presente investigación se usaron materiales de vidrio con menor
rango de error o clase A, un espectrofotómetro UNICO 2100 verificado,
Balanza analítica verificada y micropipetas de dos marcas diferentes.
Gunzler (22) y la Farmacopea de los Estados Unidos o “US
Pharmacopeia” conocido por sus siglas USP (3) indican que la validación
de un método, es importante en un laboratorio para que las características
de rendimiento del método cumplan con las especificaciones relacionadas
con el uso previsto de los resultados analíticos. Las características de
rendimiento determinadas incluyen linealidad, teniendo como condición
que el coeficiente R2 deba ser mayor a 0.995, sensibilidad expresados en
límite de detección, límites de cuantificación, robustez, precisión siendo la
desviación estándar relativa menor del 2.0 % y exactitud debiendo estar
el porcentaje de recuperación entre 90 y 110 %, dicha recuperación es
una alternativa de evaluación de la veracidad que también se conoce por
el nombre de exactitud que se realiza analizando como mínimo 6 muestras
y deben ser contrastadas usando normas internacionales como la USP o
IUPAC (3,28). En la presente validación se puede notar en la Tabla 15
que se cumplen con todos los parámetros indicados por la USP y estando
todos dentro de los estándares establecidos, el método cumple con los
requisitos de validación de la USP.
Severiche (29), realizó la verificación analítica para las determinaciones
de cromo hexavalente en aguas por espectrofotometría obteniendo como
resultado una desviación estándar relativa DSR de 3.57 %, un coeficiente
de correlación de 0.999957, con limites de detección y cuantificación de
0.966 µg/L y 0.0031 mg/L. En comparación con la presente investigación
se obtuvo una DSR menor del 2 %, sin embargo, se obtuvieron menores
valores en cuanto a la linealidad del método y en cuanto a la sensibilidad
Severiche reportó resultado que notan que su método es más sensible
que podría deberse a que los espectrofotómetros no son de la misma
marca y no presentan las mismas especificaciones.
53
Por otro lado, otra investigación realizada en el Instituto Nacional de
Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT) (30), en su investigación de
determinación de cromo hexavalente en aire (fracción inhalable) – Método
de captación en filtro / Cromatografía iónica encontró valores de precisión
de 2.10 % y un porcentaje de recuperación del 91 %, en cambio en la
presente investigación se obtuvo mejores resultados ya que la precisión
hallada fue del 1.19 % y una recuperación del 99.28 %.
Molina (31), desarrolló la validación de las técnicas para determinación de
molibdeno y cromo en agua residual, tratada, cruda y de níquel en agua
residual mediante espectrometría de absorción atómica por llama directa
para el laboratorio de análisis de aguas y alimentos UTP cuyas
determinaciones se efectuaron con un espectrofotómetro de absorción
atómica SHIMADZU AA-7000 obteniendo porcentajes de recuperación
entre 80.74 % y 179.57 %, DSR entre 7.57 % y 21.15 % sin embargo en
la presente investigación dichos parámetros cumplieron con la
normatividad para términos de validación de métodos analíticos.
Macas (32), realizó la validación de métodos analíticos para la
determinación de cloro libre residual, cromo hexavalente, cromo total y
nitritos en muestras de agua, en el centro de investigaciones y control
ambiental “CICAM” y obtuvo un coeficiente de correlación para cromo
total, igual a 0,999958 límites de detección y c 0,003 y 0,02 mg/L para el
método de cromo hexavalente exactitud fue de 94,3 a 100,14 % para
Cromo hexavalente. Dichos resultados son similares a los obtenidos en la
presente investigación por lo cual ambos métodos cumplen con la
normativa internacional referente a la validación de métodos.
Finalmente, Tatayo (33), realizó la validación de métodos analíticos para
la determinación de cloro libre residual, cromo hexavalente, cromo total y
nitritos en muestras de agua, en el centro de investigaciones y control
ambiental “CICAM” obtuvo un Coeficiente de correlación lineal de
0.99772, un porcentaje de recuperación de 98 % y una precisión de 5 %.
Dichos resultados son semejantes a los obtenidos de Tatayo en cuanto a
54
la linealidad y recuperación, sin embargo, en la precisión el presente
método esta por debajo del 2.0 % lo cual indica que es más preciso que
el método de Tatayo.
CAPÍTULO VI
CONCLUSIONES
Primera: Resultó ser lineal al obtener un coeficiente de regresión lineal
R2 de 0.9998 siendo este superior a 0.995 establecido por la USP.
Segunda: Dio como resultado que la mínima cantidad de cromo
hexavalente que el método puede cuantificar y detectar es de 0.0431 y
0.0221 mg/L respectivamente.
Tercera: Es preciso con una Desviación Estándar Relativa DSR de 1.19
% siendo este menor a 2.0 % (valor máximo establecido por la USP).
Cuarta: Es exacto con un porcentaje de recuperación de 99.28 %.
Quinta: Es robusto a las variaciones de analista, tipo de micropipetas y
puntas de micropipeta al cumplir con la especificación |𝑉𝑥| < 𝑠√2.
55
RECOMENDACIONES
1. Se recomienda usar el método espectrofotométrico desarrollado en la
presente tesis para realizar investigaciones de monitoreo de cromo en
aguas residuales o efluentes de industrias que involucren cromo
hexavalente en sus procesos.
2. Se recomienda usar el método espectrofométrico desarrollado en la
presente tesis para realizar investigaciones de monitoreo de cromo
hexavalente en tóner usado en imprentas y fotocopiadoras.
3. Se recomienda aplicar la metodología desarrollada en la presente tesis
para investigaciones referidas a la remediación ambiental como
fitorremediación, adsorción y precipitación de cromo hexavalente.
4. Se recomienda usar la metodología desarrollada en la presente tesis de
validación para analizar otros metales y extenderlos a otros tipos de
analitos o matrices.
56
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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en el centro de investigaciones y control ambiental “CICAM”. Tesis de
Grado. Ambato: Universidad Técnica de AMbato; 2011.
33. Tatayo J. Validación de métodos analíticos para la determinación de cloro
libre residual, cromo hexavalente, cromo total y nitritos en muestras de agua,
en el centro de investigaciones y control ambiental “CICAM”. Tesis de Título
profesional. Quito: Escuela Politécnica Nacional; 2018.
60
ANEXOS
61
ANEXO 1
Soluciones de calibración
De izquierda a derecha 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y 1.0 mg/L de
cromo hexavalente.
Fuente. Elaboración propia
ANEXO 2
Micropipeta 1 (CAPP) usada para el ensayo de robustez
Fuente. Elaboración propia
62
ANEXO 3
Micropipeta 2 (BOECO) usada para el ensayo de robustez
Fuente. Elaboración propia
ANEXO 4
Lectura de soluciones en el espectrofotómetro UNICO modelo 2100
Fuente. Elaboración propia
63
ANEXO 5
Materiales utilizados en laboratorio UPADS
Fuente. Elaboración propia
