miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system■　超高感度：わずか 1 pg の total RNA で個々のmiRNA 定量、網羅解析もわずか 40 ng で可能■　高い特異性：わずか 1塩基差も識別可能、ATリッチなmiRNA も識別可能■　高いフレキシビリティ：実験スケールに合わせて選べる 4タイプのmiRNA発現定量 PCR 解析　・ 　miRNome PCR panel…384 ウェルプレートでmiRNA プロファイリング (Human / Mouse & Rat)・ 　 　Focus panel (Cancer or Serum / Plasma)…がん関連または血清/血漿サンプルに関連するmiRNAに特化した解析(Human)　・ 　Pick-&-Mix microRNA PCR Panel…プレートタイプ、PCR 機器、バッチサイズに併せてお好みのプライマーを配置 ・　microRNA Primer set…個別のmiRNA 定量用、膨大なデザイン済プライマーセットは全品検証済み■　秀でた精度：FFPE、LCM、血清／血漿、尿サンプルなど扱いにくいサンプルに最適■　操作が簡便：2ステッププロトコール、所用時間約 3時間、microRNA ごとの cDNA合成は必要なし！■　SYBR® Green 法を利用：融解曲線分析による検証が可能■　テンプレートの増幅不要

図 .1 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Systemの概要step 1A : mature microRNA に polyA tail を付加step 1B : 3'-degenerate ancher と 5'-universal tag 付き polyT プライ マーを用い

た cDNA合成。step 2A : cDNA をテンプレートとし、microRNA 特異的 LNA™ Forward / Reverse

プライマーを用いて PCR 反応。step 2B : SYBR® Green 法による検出

図 .2 miRCURY™ LNA™ Universal RT microRNA PCR Systemの操作の流れ※ プライマーセットは、miRCURY LNA™ SYBR® Green master mix に最適化されています。他社製品などのmaster mix を使用された場合、結果の精度に影響を生ずる可能性があります。

※ Ready-to-use panel、個別のプライマーセットのいずれををお使いの場合も、　 操作の流れは同様です。

　miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR は、市販のmicroRNA リアルタイム PCR システムの中で最も性能と簡便性に優れたシステムで、２つの大きな特徴があります ( 図 .1)。

な重貴。能可用使に験実RCPムイタルアリANRorcimの数複をトーレプンテたし製作で）応反TR（応反成合ANDc-ts1の回１：TRlasrevinU　・　サンプルの節約、手技バラツキの軽減、かつ労力を軽減。

　・　LNA™ PCR 増幅：PCR 増幅プライマー（forward / reverse）は何れもmicroRNA 特異的かつ LNA™最適化済み。そのため、1) 非常に優れた感度と低いバックグラウンドにより、非常に低発現のmicroRNA の定量も高精度、2) 特異性が高く、類似microRNA 配列の識別が可能。

　"Universal RT" かつ "LNA™ 利用および Tmノーマライズ済みプライマー " により、本製品は非常に高感度かつ特異性の高いアッセイを可能としました。わずか 1 pg の total RNA を使用した 1st-cDNA 合成からであっても、各miRNA の高精度かつ信頼のおける定量が可能です。ステムーループや一般的なDNAプライマーを使用する他のmicroRNA リアルタイム PCR システムに比べ、LNA™ を利用したプライマーシステムでは、特に AU塩基を多く含むmicroRNA において、感度の高さが顕著です。　本製品では、わずか１塩基差のmiRNA を識別する実験系をデザインすることが可能です。非常に特異性の高いアッセイのためmature microRNAと precursor microRNA の識別もできます（表 .1)。　さらに、全てのmiRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCRプライマーセットは、高感度であるよう最適化済みです。EXIQON社の社内テストでは、80%以上のPCR反応において少なくとも100コピーのmiRNAが検出でき、ほぼ50%のPCR反応ではわずか10コピーのmicroRNA検出が可能でした。プライマーセットは各ターゲットの特異的増幅、および低いバックグラウンドシグナルとなるよう、EXIQON社でバリデート済です。　わずか３時間で完了する簡潔なプロトコールのため、実験室での労力が軽減されます。また、同一 RT 反応溶液をその後の PCR 反応のテンプレートに使用することで、microRNA 特異的 1st-cDNA 合成が必要な他のシステムに比べて手技が大幅に簡潔化できます。ピペッティング頻度が最低限に抑えられているため、手技によるバラツキも低減します。その結果、日間差だけでなく実験施設間差の少ない再現性の高い実験データを得ることが可能です。

LNA™ miRNA定量システム　～ 他に類をみないmicroRNAプロファイリングシステム ～

無敵の感度と特異性！しかも全てのプライマーがバリデート ＆ 最適化済！

図 .3 ホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片のレーザーダイセクション検体を用いた 2 種類のmicroRNA 発現解析ヒト大腸のホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片より、8000-13000 µm² サイズの正常組織、腫瘍組織、および腫瘍間質をレーザーダイセクションにより分離してサンプルとした（A）。total RNA 抽 出後、miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR SystemによりmicroRNA 発現レベルを定量した（B）。ノーマライズ後、正常組織との相対的発現レベルを log2 スケールで示した。リファレンスには hsa-miR-103 および hsa-let-7a を使用した。

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Expression level (Cq)

Serum/plasma microRNAs

let-7a

miR-126

miR-16

miR-337-3p

miR-451

　本製品は、microRNA の網羅的発現解析（miRNome パネル）、特定のサンプルに特化したスクリーニング (serum/plasma Focus Panel、Cancer Focus Panel)、中規模スクリーニング ( カスタムpick-&-mix パネル )、または単一のmiRNA 定量（primer set）にご利用頂ける qPCR システムです。次ページをご参照頂き、4タイプの製品からご自身の実験計画に合ったものをご選択ください。

　miRCURY LNA™ Universal RT PCR system では、わずか 40 ng のtotal RNA があればヒト（742 種類）または、マウスおよびラット（752 種類）のmicro RNA について網羅的発現解析が行えます。単一のmicroRNA であれば、わずか 1 pg の Total RNA から定量的発現解析が可能です。そのためホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片や血清 / 血漿などの臨床サンプル、total RNA 抽出が困難なサンプルにおける高精度のmicroRNA 発現解析が可能です（図 .3）。cDNAの増幅は必要ありません。

実験スケールに合わせて 4タイプのmiRNA qPCR

最小のサンプルで高精度のmiRNA qPCR解析

ミスマッチに対する特異性

血清・血漿など体液中のmicroRNAプロファイリング

　PCR 反応用のプライマーは、Forword / Reverse とも LNA™ オリゴを使用しているためわずか１塩基差のmicroRNA群も識別可能です。さらに、mature microRNA と precursor microRNA も識別できます（表 .1）。　PCR プライマーは全て最適化済みで、対象microRNA の特異的増幅やバックグラウンドノイズに関してバリデートされています（図 .4）。

　近年、体液中のmicroRNA はバイオマーカーとして認識が高まりつつあります。とくに、血清や血漿中にはわずかながらmicroRNA が存在し、これらは高い安定性、かつ無細胞状態で血中を循環することから、血中の RNA崩壊酵素から保護されていると考えられます。　がんを始めとする様々な疾患患者では、その血清 / 血漿中のmicroRNA 発現様式に変化が見られます。このことからmicroRNAは、さまざまな疾患および生物学的プロセスのバイオマーカーを非観血的に探索する有望な候補として注目されています。血液サンプルは、容易に入手できる上、組織診や外科手技に比べてリスクが低いことも理由のひとつです。しかし、短鎖であるといったmicroRNA の特性や、血清 / 血漿サンプルから得られる RNA 量が少ないことなどから、血液サンプルを用いたmicroRNA プロファイリングはこれまで容易ではありませんでした。　信頼性の高いmicroRNA プロファイリングを行うためには、実験結果に歪みが生じないよう血液細胞から RNAが混入していない血清 / 血漿を使用する必要があります。全血中に存在する RNA のうち、ほんの一部のものが血清や血漿に存在し、多くの RNA は主に白血球や血小板から構成されるバフィーコート中に存在しています（図 .5）。　また、これらのmicroRNA プロファイリングを行う際には、さらにいくつかの課題があります。

難困が理管度純ANRな的般一、めたい低が量含ANR　・ るれま含が剤害阻素酵RCPはにANR中漿血/清血　・

・　U6 などの一般的なリファレンス遺伝子は血清 /血漿中に含ま　　 れておらず、適切なリファレンス遺伝子選択が困難　これらの課題を克服するには非常に精度の高いmicroRNA 定量 PCR システムの利用が重要です。 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR systemは、血清 /血漿サンプルのmicroRNA 検出に高い信頼性がおけることが実験的に検証されています（図 .6）。　弊社では、EXIQON 社の血清 / 血漿のmicroRNA プロファイリングのノウハウを記載した「血清・血漿中からのmiRNA プロファイリングガイドライン」をご用意しております。実験準備の際にぜひご参照ください。弊社WEB サイト「カタログ請求」よりお申し込み頂けます。http://www.cosmobio.co.jp/catalog/catalog.asp

図 .4 microRNA を特異的かつ高感度に増幅可能ヒト大腸 total RNA の希釈段階系列（1 pg-100 ng） を 用 い て hsa-miR-145 を増幅した結果（n=3）。（A）増幅曲線（B）融解曲線増幅曲線より、わずか 1 pg の total RNA からも高感度かつ再現性の高い増幅が行うことができ、かつバックグラウンドノイズがほぼ無視できることがわかる。融解曲線では何れの濃度のテンプレートを使用した場合でも期待される Tm値にピークが得られ、hsa-miR-145 が特異的に増幅可能であることが示された。

図 .5 血清および血漿にはわずかな RNAが含まれる 多くの RNA はバフィーコートに存在する。血清 / 血漿にこれらの RNAを混入させないことが重要である。

図 .6 血清中の全microRNA プロファイリング EXIQON 社 の Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel は一般的に血清や血漿でみられる 175 種のヒトmicroRNA プロファイリング用にデザインしてある。500 種以上の血清サンプルより抽出した total RNA を、３回繰返しで RT 反応を行い、Serum/plasma Focus microRNA panel を用いてリアルタイム PCR によりプロファイリングを行った。miRNA 群の Cq値（quantifi cation cycle value）による平均発現レベルを図示した。血清 / 血漿中での高発現で知られる hsa-miR-16 およびmiR-451 は血清 / 血漿系における溶血 /血液細胞汚染の指標である（橙色）。その他の興味深い血漿miRNA群を赤色で示した。

　 　 　 　 　 　 　 　 　製品群 品名 品番 包装 希望販売価格

共通製品

Universal cDNA Synthesis Kit 203300 16-32 回分 ￥81,000203450 2,5 ml ￥91,000203400 25 ml ￥386,000

プロファイリング用パネル（human ）＊1＊2

microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V2. M　ABI 7900HT 他，多種の機器に対応 203607 1 Each (4 set ) ￥275,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V2. R　Roche LightCycler® 480 対応　　　　　　　　　　　　 203608 1 Each (4 set ) ￥275,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V2. M　ABI 7900HT 他，多種の機器に対応　　　　　　　　　 203609 1 Each (4 set ) ￥233,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V2. R　Roche LightCycler® 480 対応　 203610 1 Each (4 set ) ￥233,000

プロファイリング用パネル（Mouse& Rat）＊1＊2

microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II, V2. M　ABI 7900HT 他，多種の機器に対応 203703 1 Each (4 set ) ￥275,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II, V2. R Roche LightCycler® 480 対応 203704 1 Each (4 set ) ￥275,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I, V2. MABI 7900HT 他，多種の機器に対応 203705 1 Each (4 set ) ￥233,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I, V2. RRoche LightCycler® 480 対応 203706 1 Each (4 set ) ￥233,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel II, V2. MABI 7900HT 他，多種の機器に対応 203707 1 Each (4 set ) ￥233,000

microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel II, V2. RRoche LightCycler® 480 対応 203708 1 Each (4 set ) ￥233,000

OB

O

HO

HOLNA - Locked Nucleic Acid

miRNome Panel　～プロファイリング用 Ready-to -Use パネル (Human or Mouse & Rat)

　本製品は、Human またはMouse / Rat の micro RNA プロファイリングを目的とした、qPCR primer set が分注済みの 384 ウェル Ready-to-Use 定量 PCR パネルです。1st-cDNA および PCR master mix を加えるだけで、microRNA の qPCR 網羅解析が可能です。

＜ヒト Human ＞　Human パネルはⅠ、ⅡおよびⅠとⅡがセットになった 3タイプをご用意しています。384 well プレート 2枚を 1セットとして、742 種のヒトmicroRNA を網羅しています。　Human パネル I には重要度の高いとされる 375 種のmiRNA 用のプライマーセットが含まれております。これらのmicroRNA は、一般的により高発現されている、疾患に分化発現していることが多い、論文に引用されることが多いなどの特徴があります。Human パネル II には、パネル I と比較すると、重要度がそれほど高くないとされる 367 種のmiRNA 用のプライマーセットが含まれています。プレート配置図は、弊社WEB ページをご参照ください。各プレートには 6種類のリファレンス RNA（U6, SNORD38B, SNORD49A, hsa-miR-103, hsa-miR-191, hsa-miR-423-5p）とプレート間キャリブレーターおよびUniversal cDNA synthesis kit に付属の RNA spike-in 検出用コントロールプライマーが含まれます。　使用しているプレートは一般的な qPCR 機器に対応しています。

＜マウス Mouse ＆ ラット Rat ＞　2プレートで 752 種のマウス＆ラット microRNA を網羅しています。( マウス 333 種 ＋ ラット 246 種 )Mouse & Rat Panel I のプレート配置図は、弊社WEB ページをご参照ください。各プレートには 6種類のリファレンス RNA（U6 snRNA, RNU5G, RNU1A1, miR-103, miR-191, mmu-miR-423-3p）とプレート間キャリブレーターおよびUniversal cDNA synthesis kit に付属の RNA spike-in 検出用コントロールプライマーが含まれます。　使用しているプレートは一般的な qPCR 機器に対応しています。

※ 1　プロファイリング用パネルのレイアウトにつきましてはお問い合わせください。※ 2　品名の最後が「M」で終わる PCR panel ＝ ABI 7900HT およびその他の機種対応，「R」で終わる PCR panel ＝ Roche LightCycler® 480 対応。

LNA™ (Locked Nucleic Acid) とは？

　LNA™ とは、リボ核酸の 2’ 位の酸素原子と 4’ 位の炭素原子がメチレンを介して架橋した 2つの環状構造をもつ核酸です。EXIQON 社は、LNA™ に関する特許の総元で、LNA™ を用いた独自の配列デザイン技術を保有しており、各種プローブ作成に秀でています。 ☝　相補DNA / RNA に対する熱安定性が上昇 ☝ 高い生体内安定性 ・ 高い結合親和性を有する ・ exo-/endonuclease に対して安定☝　配列特異的に結合 ☝ 高感度かつ特異的検出を可能 ・ わずか 1塩基のミスマッチも検出 ☝ セルフアニーリングによるプローブ内☝　 天然 RNAに近い構造 二次構造形成の回避 ・ 細胞毒性が低い

[メーカー：EXQ]

　 　 　 　 　 　 　 　 　製品群 品名 品番 包装 希望販売価格

共通製品

Universal cDNA Synthesis Kit 203300 16-32 回分 ￥81,000

203450 2,5ml ￥91,000

203400 25ml ￥386,000

Cancer Focus microRNA qPCR Panel（human）

Cancer Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. RO) *1　 203820 1 Each (4 plates) ￥167,000

Cancer Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. AF) *2 203821 1 Each (4 plates) ￥167,000

Cancer Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. MI) *3 203822 1 Each (4 plates) ￥167,000

Cancer Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. ST) *4 203823 1 Each (4 plates) ￥167,000

Cancer Focus microRNA PCR Panel, 384 well (V1. R) *5 203828 1 Each (2 plates) ￥279,000

Cancer Focus microRNA PCR Panel, 384 well (V1. M) *6 203829 1 Each (2 plates) ￥279,000

Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel

（human）

Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. RO) *1 203824 1 Each (8 plates ) ￥215,000

Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. AF) *2 203825 1 Each (8 plates ) ￥215,000

Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. MI) *3 203826 1 Each (8 plates ) ￥215,000

Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel, 96 well (V1. ST) *4 203827 1 Each (8 plates) ￥215,000

Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel, 384 well (V1. R) *5 203830 1 Each (2 plates ) ￥184,000

Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel, 384 well (V1. M) *6 203831 1 Each (2 plates) ￥184,000

Cancer Focus microRNA qPCR Panel　～がん関連microRNA 用 Ready-to -Use パネル (Human)

Serum / Plasma Focus microRNA qPCR Panel　～血清 / 血漿中のmiRNA 定量発現解析用 Ready-to -Use パネル (Human)

　本製品は、がんに関与する 85 種類のmicroRNA 検出用miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR primer を予め搭載した PCR パネルです。cDNAや PCR マスターミックスを添加するだけで、すぐに実験が始められる 96 ウェルまたは 384 ウェルプレートのパネルをご用意しています。腫瘍形成やがん診断に重要であることが示されているmiRNA を対象としており、これらのmiRNA が 27 種類のがんのマーカーとして使用できることが示唆されています（表2）。対象miRNAは、数千ものFFPEサンプルを保有するバイオバンクや論文報告をもとに選択しています。がん進行、再発、転移などに関与するmicroRNA 解析用で、研究者が迅速かつ高精度にがんサンプルを解析でき、新規のmiRNA バイオマーカー探索に役立つようデザインされています。パネルに搭載した各miRNA のリファレンスは弊社WEB ページをご参照ください。

＜製品構成＞　 • 　96 ウェルプレート：1プレートに 1回（1検体）分のがんに関与するmicroRNA 検出用miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR primer な　　　　　　　　　　　　どを配置したプレートが 4枚セット（4種類のサンプルに利用可能）。　• 　384ウェルプレート： 1プレートに4回（4検体）分のmicroRNA検出用miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR primerなどを配置したプレー　　　　　　　　　　　　トが 2枚セット（8種類のサンプルに利用可能）。　パネルには以下のアッセイが搭載されています。 　• 　がんへの関与が知られる 85 種類のmicroRNA 　• 　３種類のmicroRNA リファレンス遺伝子：miR-103, miR-191, miR-423-5p　 • 　 snRNA リファレンス遺伝子：SNORD49A, U6 snRNA, SNORD38B 　• 　３種類のプレート間較正因子（UniSP3 IPC）および１種類の RNA spike-in（UniSP6 CP）　本製品はほぼ全てのリアルタイム PCR 機器に対応しています。

　本製品は、血清や血漿での存在が知られるmicroRNA 検出用miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR assay を導入した PCR パネルです。cDNAや PCR マスターミックスを添加するだけで、すぐ実験が始められる 96 穴または 384 穴プレートのパネルをご用意しています。　EXIQON社は血清 /血漿中のmicroRNA プロファイリングに関して広範な社内知見を持ち合わせています。例えば、健常個体の血清 /血漿中には通常どのmiRNA が発現しているか、特定疾患や他の生物学的プロセスによりどのmicroRNA が上方 /下方制御されているかなどです。　miRCURY LNA™ Universal RT microRNA assays の Serum / Plasma Focus panel に搭載した全 175 種のmiRNA 定量用プライマーは、血清 /血漿サンプルにおける EXIQON社独自の膨大なmiRNA 発現解析をはじめ、厳正した査読済み論文情報を元に慎重に選択されたものです。健常者および疾患患者の血清 /血漿サンプルを用いた社内および共同研究者による 100 万を超えるデータポイントを用いて本パネルに適したmiRNA 群を選択しました。例えば、種々のがんにおけるさまざまな疾患段階、神経疾患 /神経変性疾患、アレルギー /炎症などにおけるmiRNA 発現データも使用しています。EXIQON社のデータベースは血清 /血漿より抽出した全miRNA 情報を基盤としているため、特定の循環型miRNA に関してはそれがタンパク質結合型か否か、エクソソームや微小胞に存在するか、または区画化されているか等に関わらずこのフォーカスパネルに搭載されているはずであり、汎用性のある包括的パネルといえます。パネルに搭載した各miRNA のリファレンスは弊社WEB ページをご参照ください。

＜製品構成＞　 • 　96 ウェルプレート：2プレートにヒト血清 /血漿中に一般に存在するmiRNA および 7種のリファレンスmiRNA を含む全 168 種の LNA™ 　　　　microRNA primer set を配置（2プレートで 1検体分）したプレートが 8枚セット（4種類のサンプルに利用可能）。　• 　384 ウェルプレート：1プレートに 2回（2検体）分のヒト血清 /血漿中に一般に存在するmiRNA および 7種のリファレンスmiRNA を含む　　　全 168 種の LNA™ microRNA primer set を配置したプレートが 2枚セット（4種類のサンプルに利用可能）。

[メーカー：EXQ]

* 1　For Roche LightCycler® 480 * 4 For Stratagene Mx3000P* 2　For ABI Fast series StepOne Plus * 5 For Roche LightCycler® 480 * 3 For BioRad, Eppendorf, Stratagene, ABI7000 * 6 For ABI 7900HT and other instruments

　 　 　 　 　 　 　 　 　製品群 品名 品番 包装 希望販売価格

共通製品

Universal cDNA Synthesis Kit 203300 16-32 回分 ￥81,000203450 2,5 ml ￥91,000203400 25 ml ￥386,000

カスタム Pick-&-Mix パネル(human, mouse,rat) *1*2

Pick-&-Mix microRNA PCR Panel, 96 well Ready-to-Use 203801 1 SET [12 plates] ￥450,000Pick-&-Mix microRNA PCR Panel, 384 well Ready-to-Use 203802 1 SET [12 plates] ￥1,200,000

[ メーカー：EXQ]

　本製品は、7種類の基本レイアウトを元に、お客様独自の 96 ウェルまたは 384 ウェルmicroRNA qPCR プレートをご利用の PCR 機器、バッチサイズに合わせてデザイン頂けます。研究対象のmicroRNA のみに焦点を絞った検討ができますので、サンプルと時間の節約をすることができます。わずか 20 ng の total RNA を用いて、前段階の増幅を行うことなくパネルに搭載された数百ものmicroRNA の定量発現解析が可能です。デザインは、EXIQON社の online plate confi gurator を用いて miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR assay をパネル上にドラッグ＆ドロップするだけ、と非常に簡便です。プレートレイアウトファイルは EXIQON社の GenEx qPCR analysis software にもお使い頂けるため、簡単かつ迅速なノーマライゼーションやデータ解析が実現します。 作成したパネルは各ウェルに１回の反応量（10 µL）用に分注し、Ready-to-use の状態でお届け致しますので、cDNA合成キット（品番：203300）と SYBR® Green master mix（品番：203450）を加えてお使いください。　本製品は、中程度から大量のサンプル数を用いたmicroRNA 定量・発現解析に適しています。マイクロアレイや PCR パネルスクリーニング結果の検証に Pick-&-Mix microRNA PCR Panelをお使いください。研究対象の疾患または情報伝達経路特異的qPCRプレートをデザインしたり、バイオマーカー探索や大量サンプルの検証用に qPCR プレート をデザインしたり、幅広くご利用頂けます。

Custom microRNA qPCR pick-&-mix Panel～お好きなmicroRNA をお好みのレイアウトに配置！自分専用カスタムパネル (Human)

図 .9 EXIQON社の Online Pick-&-Mix microRNA PCR 　　 Panel plate confi guratorステップバイステップの plate confi gurator ツールを使いご自身の Pick-&-Mix microRNA PCR Panels を簡単に作成可能。ご希望のmicroRNA assays をプレートにドラック - ドロップして作成。プレートレイアウトファイルは Exiqon の GenEx qPCR analysis software にもお使い頂けるため、簡単かつ迅速なノーマライゼーションやデータ解析が実現。

図 10 Pick-&-Mix microRNA PCR Panel レイアウト 96 ウェルプレートに 3種類、384 ウェルプレート用に4種類のレイアウトを用意。色はmicroRNA　qPCRアッセイの繰返しを示している。各セットとも１サンプル用。 何れのプレートレイアウトもプレート間較正用コントロール（UniSp3 IPC）が配置済み。

　Pick-&-Mix microRNA PCR Panel のデザインは、EXIQON社の online plate confi guration tool を使ってステップバイステップの簡単な操作で行って頂けます（図 4）。下記の方法で、デザインを行って頂くと EXIQON社より自動的にお客様と弊社にご注文内容確認のメールが参ります。弊社よりお客様へご注文内容確認のご連絡を致しますので、ご利用の代理店へご注文ください。

パネルデザインとご注文方法

↑

→

※ 1　Online Pick-&-Mix microRNA PCR Panel plate confi gurator でご利用の定量 PCR 機器をご選択頂けます。※ 2　EXIQON社WEB サイトでカスタムパネルをデザイン頂くと、自動的に弊社へ連絡が参りますので、折り返し弊社よりご連絡致します。EXIQON社WEB サイト上ではご注文となりません。

　 　 　 　 　 　 　 　 　製品群 品名 品番 包装 希望販売価格

共通製品

Universal cDNA Synthesis Kit 203300 16-32 回分 ￥81,000203450 2,5 ml ￥91,000203400 25 ml ￥386,000

個別microRNAIndividual microRNA LNA™ PCR primer set ＊1 WEB 参照 200 回分 ￥42,000Custom microRNA primer set, UniRT 206999 200 回分 ￥61,000

コントロールプライマーセット

SNORD38B (hsa) PCR primer set, UniRT 203901 200 回分 ￥42,000SNORD44 (hsa) PCR primer set, UniRT 203902 200 回分 ￥42,000SNORD48 (hsa) PCR primer set, UniRT 203903 200 回分 ￥42,000SNORD49A (hsa) PCR primer set, UniRT 203904 200 回分 ￥42,000SNORA66 (hsa) PCR primer set, UniRT 203905 200 回分 ￥42,0005S rRNA (hsa，mmu) PCR primer set, UniRT 203906 200 回分 ￥42,000U6 snRNA (hsa, mmu) PCR primer set, UniRT 203907 200 回分 ￥42,000RNU5G (mmu, hsa) PCR primer set, UniRT 203908 200 回分 ￥42,000RNU1A1 (mmu, hsa) PCR primer set, UniRT 203909 200 回分 ￥42,000

　本製品は個別のmicroRNA の定量 PCR アッセイ用 Primer set(Foward/Reverse) です。LNA™技術を使用したプライマーは非常に高感度なため、わずか 1 pg の total RNA から定量することができます。751 種類（ヒト）、632 種類（マウス）、348 種類（ラット）のデザイン済microRNA 定量用qPCR プライマーセットをご用意しており、全品実験的検証済みです。コントロールは、9種類の内在性リファレンス RNAをご用意しております。弊社でご用意しております「血清・血漿中からのmiRNA プロファイリングガイドライン」などもご参照頂き、実験系に応じてお選びください。　ご希望のデザイン済プライマーセットがない場合や pre-microRNA 定量には、カスタムmicroRNA LNA™ PCR プライマーセットをご利用ください。

miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Primer～検証済み個別microRNA 定量用プライマー！ (miRBase 登録の全生物種 )

ご注文方法

*1　該当する個別microRNA 用 LNATM PCR primer set がない場合や pre-microRNA の定量プライマーをご希望の場合は，カスタムプライマーデザインツールをご利用ください。 Custom microRNA LNA™ PCR primer（品番 206999）design tool: http://www.exiqon.com/miRNA-qpcr-designer

[ メーカー：EXQ]

Component Volume / reaction Final conc. / amount

8 µL 1x

Nuclease-free water adjust to 40 µL

Enzyme mix 4 µL 1x

Template total RNA (adjusted)

8 µL (human) or 1 µL (mouse) RNA 5 ng/ µL (or 5.5 ng/ µL)

Total volume 40 µL

Component Volume / reaction Final conc. / amount

4 µL 1x

Nuclease-free water 10 µL

Enzyme mix 2 µL 1x

Template total RNA (adjusted) 4 µL 5 ng/ µL (or 5.5 ng/ µL)

Total volume 20 µL

Component Volume / reaction(96-well)

Volume / reaction (384-well)

SYBR® Green master mix 5 µL 5 µL

Template cDNA --- diluted* (* dilution varies) 4 µL 4 µL

PCR primer mix 1 µL 1 µL

Total volume 10 µL 10 µL

Component Volume / reaction (96-well)

Volume / reaction (384-well)

SYBR® Green master mix - 5 µL

Template cDNA --- diluted* (* dilution varies) - 5 µL

Total volume - 10 µL

Component Volume / reaction (96-well)

Volume / reaction (384-well)

SYBR® Green master mix 10 µL 5 µL

Template cDNA --- diluted* (* dilution varies) 10 µL 5 µL

Total volume 20 µL 10 µL

血清、血漿サンプル (individual, pix&mix, panel) 55 x

血清、血漿以外のサンプル (individual) 80 x

血清、血漿以外のサンプル (pick&mix, panel) 110 x

試薬使用量例<cDNA合成反応 > 実験系により cDNA合成量が異なる <RT-PCR 反応 >実験系により cDNA量、SYBR Green 量が異なる逆転写反応 ( 血清、血漿サンプル )

逆転写反応 ( 血清、血漿サンプル以外 )

cDNA 希釈率例

Reaction setup for real-time PCR (individual assay)

Reaction setup for real-time PCR (panel assay)

Reaction setup for real-time PCR (pick & mix panel assay)

※ この場合 cDNA合成キットは 16rxns となる

※ この場合 cDNA合成キットは 32rxns となる

SYBR®： Life Technologies 社の登録商標です。LightCycler®： Roche Diagnostics 社の登録商標です。

40

35

30

25

20

15

Raw Cq values RT1

Raw Cq values RT2

15 20 25 30 35

R2= 0.99

40

40

35

30

25

20

15

Raw Cq values RT1

Raw Cq values RT2

15 20 25 30 35

R2= 0.96

40

　個々のmicroRNA に特異的な 1st-strand cDNA を合成する他社製品と異なり、全ての PCR 反応に同一のテンプレート（1st-strand cDNA）を使用するため、操作が簡便で 3時間程度で終了します。ピペッティングなどの操作ステップの軽減により、実験操作によるバラツキが最小限に抑えられます。 日間差やラボ間での差がほとんどなく、高い再現性が得られます（図 7、図 8）。

　PCR 反応用のプライマーは、Forword / Reverse とも LNA™ オリゴを使用しているためわずか 1塩基ミスマッチがmicroRNA 配列のどのような位置にあっても識別可能です。　さらに、mature microRNA と precursor microRNA も識別できます（表 .1）。 PCR プライマーは全て最適化済みで、対象microRNAの特異的増幅やバックグラウンドノイズに関して EXIQON 社でバリデートされています。

　RNA抽出効率の確認には、RNA spike-in（合成 RNAコントロール）を加える方法があり、EXIQON社 Universal cDNA synthesis kit に付属しています。添加した RNA spike-in は、RT-PCR で逆転写されてcDNAとなり、EXIQON社の SYBR® Green master mix や microRNA Ready-to-Use PCR Panel に付属のプライマーで検出することができます。再懸濁した 1 µL の RNA spike-in（106 コピー / µL）を 200 µLのヒト血清に添加して使用します。　あるいは、RNA spike-in を cDNA合成ステップの確認に使用することもできます。cDNA 合成や PCR 酵素反応を阻害する可能性のある物質が RNAサンプルに残留しているかどうかの確認にもなります。cDNA 合成ステップの効率を確認するには、cDNA 合成反応カクテルに RNA spike-in を加えます。　一方、増幅物の融解温度（Tm）といったアッセイ特徴やアッセイ効率も品質管理に利用できます。 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR systemでの検出に SYBR® Green を使用することで、融解曲線を描くことができ、特異的増幅物の Tm値の再現性が反応間でとれているか確認することができます。このように、Tm値をもとに得られた増幅物がサンプル間で同一であるかどうかを判断できます。融解曲線のピークが１本であることにご留意ください。　融解曲線はよいコントロールである一方、qPCR 機器によって温度較正が異なる場合があり、使用する機器によって得られる Tm値が異なる可能性があります。そのため、各増幅物の期待される Tm値はポジティブコントロール使用のもとに、実験に使用する機器を用いて決定することが重要です。　EXIQON 社の microRNA Ready-to-use PCR panel および primer set は、Universal cDNA synthesis kit お よ び SYBR® Green master mix kit との併用に最適化してあります。他の試薬と併用することで結果の精度に影響を及ぼす可能性があります。

簡便・迅速・高い再現性

優れた特異性

cDNA合成キットと SYBR® Green master mix図 .7 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR systemによる日間の再現性心臓および肝臓から抽出した 40 ng total RNA のmicroRNA 発現様式を Ready-to-Use PCR human panel I および panel II を用いて複数日にわたり実施した。全microRNA のうち Cq値が 35 未満のものに関して、生 Cq値の相関関係を図示した（297 データポイント）。

図 .8 血清 total RNA を用いた RT 反応で得られた高い再現性65 µL の血清より抽出した total RNA を用いて２回繰り返しで RT 反応を行った（RT1, RT2）ところ、低い Cq 値が得られた。全 730 種類のmiRNA に関して発現プロファイルを確認し、Cq値が 35 未満のものについてのみ図示した（133データポイント）。

表 .1 mature と precursor microRNA 間の識別LNA™ Universal RT microRNA PCR assay では、mature と precursor microRNAターゲット間の識別が可能である。mature microRNA は precursor microRNAの 5p（A）または 3p（B）側のアームに由来する。mature 配列が 5p アーム由来の場合、precursor と mature 配列の識別がより効率よく行える。LNA™ Universal RT systemを用いて 3pアーム由来のmature microRNA を識別する場合、その識別限界は競合製品と同程度である。ここではmature ターゲットから得られたシグナルに対する precursor ターゲットから得られたシグナルの割合を示した（100%となるよう設定）。

+

y

Universal cDNA synthesis kit

Pick & Mix PCR Panels(Ready -to-Use) Human, Mouse&Rat

and Focus PCR panels(Ready -to-Use)

SYBR® Green mastermix(2.5ml or 25ml)

microRNA and referencegene primer sets

GenEX を使用した解析の手順

図 .11 フリートライアルバージョン (30 日間無償使用）のダウンロードhttp：//www.exiqon.com/qpcr-software にアクセスし、"software donload" のタブをクリック。

をクリックして、セットアッププログラムをダウンロードし、解凍、インストールしてご試用ください。シリアル番号なしで 30 日間試用することができます。オンラインマニュアルや、ステップ - バイ - ステップガイドもこのページからご覧頂けます。

図 .12 リファレンス遺伝子の選択NormFinder および geNorm の両アルゴリズムは、各遺伝子の変動値（NormFinder：SD、 geNorm：M-value）および最適な遺伝子もしくはその組合せを表形式で出力します。両アルゴリズムは、最も安定に発現されている遺伝子を棒グラフで出力します（最も安定に発現されている遺伝子が左側に来る）。NormFinder および geNormは異なるアルゴリズムな為、常に同じ結果を出力しませんが、ただし、これらアルゴリズムの結果を双方とも参照することで、「どの遺伝子が最も安定に発現されているか」のよい指標となります。

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EXIQON GenEx Academic 207002 1 EACH ￥250,000EXIQON GenEx Industrial 207001 1 EACH ご照会

GenEx qPCR analysis software　～クリックひとつで qPCR 解析データ解析！

　EXIQON社のmiRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR 用に最適化した qPCR 解析用ソフトウェアです。GenEx は、“ クリックひとつ ”でリファレンス遺伝子の選択およびバリデーション、データ処理および包括的な統計解析など、さまざまな解析が可能です。相対的定量実験と絶対的定量実験の何れの解析にも使用でき、プレゼンテーションツールでは、実験デザインが複雑であっても専門的な図表を簡単に作成することができます。　EXIQON 社のWEB サイトより無償で 30 日間試用できるトライアルバージョンをダウンロードすることができ、試用版にもステップ -バイ - ステップガイドが付属します。是非フリートライアルバージョンをダウンロードして、qPCR データ解析をお試しください。フリートライアルバージョンダウンロード：http：//www.exiqon.com/qpcr-software

[ メーカー：EXQ]