Cold-PCR &Droplet Digital PCR

”Fortynding” af cancer med normale celler

Cancercelle ”fortyndet” i normale celler

Cold-PCR vs konventionel PCR

Lightscanner & heteroduplex princip

Homoduplexer

G CA C G T A T

HeteroduplexerA T

G C

Fortyndinger og LightScanner resultater

Ved forbrug af 50ng DNA/reaktion vil forholdet mellem WT kopier og variant DNA kopier være følgende: 1:1 - 50% - 8325/8325 kopier1:10 - 10% - 14985/1665 kopier1:20 - 5% - 15818/833 kopier1:40 - 2,5% - 16234/416 kopier1:80 - 1,25% - 16442/208 kopier1:160 - 0,625% - 16546/104 kopier1:320 - 0,3125% - 16598/52 kopier

Sekventering af fortyndingerKonventionel vs Cold-PCR

Konventionel PCR – heterozygot 1:1

Konventionel PCR – fortynding 1:20

Cold-PCR – diverse fortyndinger

10%

5%

2,5%

1,25%

0,625%

Reference-artikel Coren A. Milbury et al. Clin.Chem.

Droplet Digital PCR Introduktion

Taqman-prober til detektion (1)

FRET FRET

Match Mismatch

FRET

FRET

Taqman-prober til detektion (2)

SNP: A T

VIC

AT

FRET

FAM

TA

FRET

Taqman kromatogram (3)

Droplet Digital PCR – 3rd Generation af PCR

PCRKvantificering

1st 2nd 3rd

Real-time PCRRelativ Kvantificering

Droplet Digital PCRAbsolut Kvantificering

Droplet Digital PCR Workflow

1. Mix reagenser og prøver i 20,000 droplets2. Udfør PCR på termocycler 3. Kvantificer target DNA/RNA ved at tælle prøve-droplets via

fluorescence-signal 4. Digital aflæsning giver absolut måling af target DNA

Lav Droplets PCR Droplets Aflæs Droplets

Produktion af DropletsPlacer engangs cartridge med prøver og droplet-olie i QX100 Droplet Generator20,000 droplets per prøve, 2 ½ min for 8 prøver

Ensartede droplets

Droplets på PCR maskine

Forskellige experimenter på samme plade Er ikke låst fast i specifikke PCR protokoller, men kan tilpasses det ønskede target

Overfør emulsion til 96-brønds PCR plade

Aflæsning af Droplets Load 96-pladen i QX100 Droplet Readeren

Autosampler håndterer den enkelte prøve uafhængigtDroplets ledes forbi optisk detector, der detekterer flourescenssignal fra hver droplet (32 brønde / time)

Precision fra 10% fortyndinger

1.1-fold fortyndingsrække af S. aureusKonstant humant gDNA

DNA fra 7 cellelinier med kendt copy number variationResultaterne er normaliseret overfor en kopi af

RNase P

Copy Number Variation

ddPCR individual wells ddPCR merged wells

BRAF V600E fortynding af DNA