UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Uji Aktivitas …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/25955/1/NUR... · maupun vaksin yang effektif untuk hepatitis C. Penemuan ... heksan

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa L.) sebagai

Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

SKRIPSI

NUR QUROTUL A’YUNI

108102000018

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JANUARI 2013

iv

UIN Syarif Hdayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa L.) sebagai


SKRIPSI

Diajukan sebagai syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

NUR QUROTUL A’YUNI

108102000018

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JANUARI 2013

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Nur Qurotul A’yuni

NIM : 108102000018

Tanda Tangan :

Tanggal :

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

v


vi


ABSTRAK


Program studi : Farmasi

Judul : Uji Aktivitas Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa L.) sebagai


Hepatitis C merupakan penyakit peradangan hati. Hepatitis C disebabkan oleh

infeksi virus hepatitis C (HCV). Penggunaan ribavirin dalam kombinasi dengan

interferon telah menjadi obat standar untuk pengobatan HCV namun penggunaan

dosisnya yang tinggi sehingga mempunyai efek samping yang signifikan seperti

mual, anemia dan depresi. Penggunaan ribavirin dengan kombinasi interferon

mempunyai efektivitas sebesar 40% - 50%. Sampai saat ini belum ditemukan obat

maupun vaksin yang effektif untuk hepatitis C. Penemuan obat yang berperan

sebagai antivirus dapat dilakukan melalui target molekuler dengan mencari

inhibitor RNA helikase yang berperan dalam replikasi virus. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol

jintan hitam sebagai inhibitor RNA helikase. Aktivitas penghambatan dihitung

berdasarkan fosfat anorganik yang dilepaskan saat pengujian dengan kolorimetri

ATPase. Pengukuran jumlah fosfat anorganik dilakukan dengan menggunakan

microplate reader multiscan EX. Penggunaan jintan hitam (Nigella sativa L.)

sudah umum dikalangan masyarakat. Jintan hitam diketahui mempunyai aktivitas

sebagai antioksidan, antiinflamasi, antibakteri, antifungi, antialergi bahkan

sebagai antivirus. Pada penelitian ini, jintan hitam (Nigella sativa L.) diduga

memiliki potensi sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C. Ekstrak n-

heksan dengan konsentrasi 32.000ppm memiliki aktivitas sebesar 64,454%.

Ekstrak etil asetat dengan konsentrasi 32.000ppm memiliki aktivitas sebesar

38,804%. Ekstrak metanol dengan konsentrasi 32.000ppm memiliki aktivitas

sebesar 27,617%. Ekstrak n-heksan memiliki aktivitas paling besar diantara

ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Berdasarkan hasil identifikasi dengan

penapisan fitokimia diperkirakan senyawa dalam jintan hitam (Nigella sativa L.)

yang memiliki aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase adalah senyawa

steroid/triterpenoid, terpenoid dan minyak atisiri.

Keyword : antivirus, Nigella sativa L., ATPase Kolorimetri, RNA Helikase,

...ekstrak n-Heksan

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT


Program studi : Farmasi

Judul : Black Cumin (Nigella sativa L.) Extract Test Activity as Inhibitor

.,RNA Helicase Hepatitis C Virus

Hepatitis C is one of liver inflamation diseases. Hepatitis C is caused by hepatitis

C virus infection (HCV). Neither drugs nor vaccines for HCV is not been found

yet. For instance, the use of interferon in combination with ribavirin, which

efficacy is 40% - 50%, has been a standard drug for the treatment of HCV but its

use of a high dosage has significant side effects such as nausea, anemia and

depression. The discovery of antiviral which act as molecular target can be done

through the screening of inhibitor RNA helicase that plays a role in viral

replication. This research aims to determine the activity of black cumin extracts

that were extracted using the solvent n-hexane, ethyl acetate and methanol, as

inhibitors of the RNA helikase. Inhibitory activity was calculated based on

inorganic phosphate that were released during colorimetric ATPase assay.

Measurement of the amount of inorganic phosphate that has been released was

conducted by microplate reader multiscan EX. Black cumin (Nigella sativa L.)

has commonly been used as traditional medicine. Since it has already known as

antioxidant, anti-inflamatory, anti-bacterial, antifungi, anti-allergy and even as

antivirus. In this study, black cumin (Nigella sativa L.) has potential as an

inhibitor of RNA helicase HCV. By the concentration of 32000 ppm, the extract

of n-hexsane, ethyl acetat and metanol, has the RNA helicase HCV inhibitor

activity as 64,454%, 38,804% and 27,617%, respectively. n-Hexane extract has

the greatest activity amongst the ethyl acetate extract and methanol extract. Based

on the result of the phytochemicals analysis, it is estimated that

steroid/triterpenoid and essential oil in the n-hexane extract has the potential of

RNA helicase HCV inhibitor activity.

Keyword : antivirus, Nigella sativa L., colorimetric ATPase, RNA Helicase,

n-Hexane extract

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan yang Maha Esa, karena atas

berkat dan rahmatnya-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan

skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai

gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai

pihak, dari masa kuliah sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi

saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima

kasih kepada :

(1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt selaku pembimbing I dan Ibu Rifqiyah Nur

Umami, MS. selaku pembimbing II, yang memiliki andil besar dalam proses

penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan

bimbingan ibu dan bapak mendapat imbalan yang lebih baik dari Tuhan Yang

Maha Esa

(2) Bapak Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku Kepala Laboratorium

Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI

beserta staf (Ibu Linda Sukmarini, M.Eng, Bapak Muhamad Ridwan, S.Far,

Dwianty Putri Meitasari, S.Pt) atas penggunaan segala fasilitas dan

bantuannya selama penelitian

(3) Bapak Prof. Dr. Dr. (hc). MK. Tadjudin, Sp.And. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta

(4) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta

(5) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan

dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(6) Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta

(7) Teman seperjuangan dalam penelitian (Putri Syajarwati), sahabat-sahabat

(Intan, Yanti, Ratu, Sera, Yanti, Puser, Endah, Dewa, Kudou, Dina, Ikhsan,

Ogi Widya dan Sivia), teman-teman dilaboratorium (Aksar, Bia, Hary, Neng,

Krisna, Kak Bobby, Kak Iqbal, Kak Haris dan Kang Ace) beserta teman-

teman angkatan 2008 khususnya teman-teman ALCOOLIQUE yang sudah

membantu dalam berbagi informasi dan pengetahuan serta memberikan

dukungan sehingga saya selalu bersemangat dan bisa menyelesaikan tugas

akhir ini.

Tak lupa kepada orang tua saya, Ayahanda Zakaria dan Ibunda Neneng

Suryani, semoga segala amalan dan jerih payah keduanya mendapat balasan

kebaikan dari Tuhan Yang Maha Esa.

Akhir kata, saya berharap Tuhan Yang Maha Esa berkenan membalas

segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini membawa

manfaat bagi pengembangan ilmu.

Ciputat, Januari 2013

Penulis

.

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 108102000018

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya

dengan judul

UJI AKTIVITAS EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa L)

SEBAGAI INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain, yaitu : Digital

Library Perpustakaan Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk

kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di :

Pada tanggal :

Yang menyatakan,

(Nur Qurotul A’yuni)

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ......................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................ iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... v

ABSTRAK ......................................................................................................... vi

ABSTRACT ....................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ....................................................................................... ix

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................. x

DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiv

BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................. 1

1.1.Latar Belakang ................................................................................. 1

1.2.Perumusan Masalah.......................................................................... 3

1.3.Hipotesis ........................................................................................... 3

1.4.Tujuan Penelitian.............................................................................. 3

1.5.Manfaat Penelitian............................................................................ 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 4

2.1. Jintan Hitam (Nigella sativa L)...................................................... 4

2.1.1. Klasifikasi ............................................................................ 4

2.1.2. Nama Lain ............................................................................ 4

2.1.3. Budidaya .............................................................................. 4

2.1.4. Morfologi ............................................................................. 4

2.1.5. Kandungan Biji .................................................................... 5

2.1.6. Manfaat Biji ......................................................................... 6

2.2. Ekstraksi ......................................................................................... 7

2.3. Hepatitis C ..................................................................................... 9

2.4. RNA Helikase ................................................................................ 11

2.5. Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C .................................... 12

2.6. Ekspresi dan Purifikasi Helikase Virus Hepatitis C ...................... 13

2.7. SDS-PAGE .................................................................................... 14

2.8. Uji ATPase ..................................................................................... 15

BAB III. METODOLOGI ................................................................................ 16

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 16

3.2. Alat dan Bahan ............................................................................... 17

3.3. Tahapan Penelitian ......................................................................... 17

3.3.1. Determinasi Biji Jintan Hitam ............................................. 17

3.3.2. Pengamatan Organoleptik .................................................... 17

3.3.3. Pembuatan Ekstrak Jintan Hitam ......................................... 17

3.3.4. Penapisan Fitokimia Ekstrak................................................ 18

3.3.5. Susut Pengeringan ................................................................ 20

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.6. Kadar Abu ............................................................................ 20

3.3.7. Analisa Kadar Kapang ......................................................... 21

3.3.8. Produksi Enzim Helikase HCV ........................................... 21

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 26

4.1. Determinasi Tanaman .................................................................... 26

4.2. Rendemen Ekstrak ......................................................................... 26

4.3. Penapisan Fitokimia ....................................................................... 28

4.4. Parameter Standar .......................................................................... 29

4.5. Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ........................ 31

4.6. Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Jintan Hitam terhadap RNA Helik

Helikase Virus Hepatitis C ............................................................ 35

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 40

5.1. Kesimpulan .................................................................................... 40

5.2. Saran .............................................................................................. 40

DAFTAR REFERENSI

xiii


DAFTAR GAMBAR

.............................................................................................................................Halaman

Gambar 1. Nigella sativa L ................................................................................. 5

Gambar 2. Virus Hepatitis C ............................................................................... 9

Gambar 3. Peta Genomik HCV ........................................................................... 10

Gambar 4. Mekanisme Kerja RNA Helikase HCV ............................................ 11

Gambar 5. Perangkat SDS-PAGE ....................................................................... 14

Gambar 6. Elektroforesis SDS-PAGE RNA Helikase ........................................ 34

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel ....................................................................................................................Halaman

II.1. Inhibtor RNA Helikase .............................................................................. 12

IV.1. Rendemen Ekstrak ..................................................................................... 27

IV.2. Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak n-Heksan, Etil Asetat, Metanol ........ 29

IV.3. Parameter Standar ...................................................................................... 30

IV.4. Hasil Uji Aktivitas Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C ................. 36

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Sertifikat Determinasi Biji Jintan Hitam ................................................. 45

Lampiran 2. Kerangka Kerja ........................................................................................ 46

Lampiran 3. Ekstraksi Biji Jintan Hitam ...................................................................... 47

Lampiran 4. Produksi dan Purifikasi RNA Helikase Virus Hepatitis C ...................... 48

Lampiran 5. SDS-PAGE .............................................................................................. 49

Lampiran 6. Komponen Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE .......... 50

Lampiran 7. Uji ATPase RNA Helikase Virus Hepatitis C ......................................... 51

Lampiran 8. Uji Aktivitas Inhibisi Jintan Hitam .......................................................... 52

Lampiran 9. Rendemen Ekstrak ................................................................................... 53

Lampiran 10. Pembuatan Larutan Uji .......................................................................... 54

Lampiran 11. Penapisan Fitokimia .............................................................................. 56

Lampiran 12. Perhitungan Susut Pengeringan dan Kadar Abu ................................... 59

Lampiran 13. Data Aktivitas Inhibisi Jintan Hitam terhadap RNA Helikase HCV ..... 61

Lampiran 14. Perhitungan Persen Inhibisi ................................................................... 62

Lampiran 15. Kurva Persentase Aktivitas Ekstrak Jintan Hitam RNA Helikase Virus

Hepatitis C ............................................................................................ 63

Lampiran 16. Perhitungan Konsentrasi Ekstrak dalam Satu Well ............................... 64

Lampiran 17. Kurva Standar K2HPO4 ........................................................................ 66

Lampiran 18. Contoh Perhitungan Aktivitas ATPase RNA Helikase Setelah

Penambahan Sampel ............................................................................. 67

Lampiran 19. Kurva Aktivitas ATPase Sampel .......................................................... 68

Lampiran 20. Gambar Alat dan Bahan Penelitian ....................................................... 69

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Hepatitis C merupakan penyakit peradangan hati, yang disebabkan

oleh virus hepatitis C (HCV). Infeksi ini sering tanpa gejala, namun ketika

menginfeksi langsung, pada tingkat kronis dapat berkembang menjadi

fibrosis pada hati, sirosis hati hingga kanker hati (Lauer & Walker, 2001).

Diperkirakan bahwa hepatitis C telah menginfeksi hampir 200 juta orang di

seluruh dunia dan telah menginfeksi lebih dari 3 - 4 juta orang per tahun

(EASL, 2011). Berdasarkan data Kementrian Kesehatan Republik

Indonesia, pada tahun 2010 jumlah penderita hepatitis C di Indonesia cukup

tinggi yaitu sebesar 30 juta jiwa (Kementrian Kesehatan, 2010). Tingginya

jumlah penderita hepatitis C ini disebabkan karena belum adanya obat yang

efektif serta vaksin untuk hepatitis C.

HCV termasuk dalam famili Flaviviridae yang memiliki genom

tunggal RNA (ribonucleic acid) dan mempunyai gen yang mengkodekan

RNA. Salah satu enzim yang penting untuk replikasi genom virus adalah

RNA helikase yang mempunyai tiga aktivitas yaitu aktivitas pengikatan

RNA, pengikat ATP (adenosine triphospat), dan pembukaan rantai RNA

(Utama et al, 2000). Enzim inilah yang menjadi target potensial untuk

pengembangan obat anti hepatitis C (Borowski et al, 2000).

Biji jintan hitam sudah lama digunakan untuk berbagai tujuan oleh

masyarakat di berbagai negara dengan cara mereka sendiri. Selain itu, jintan

hitam telah digunakan dalam hal pengobatan Islam semenjak 2000 - 3000

tahun lalu dan Rasullullah SAW pun telah berkata bahwa jintan hitam

sebagai obat untuk berbagai pernyakit kecuali kematian (Hasnah, Norazah

& Err, 2001). Hal ini dikemukakan dalam hadist, yaitu :

2


Hadits riwayat Abu Hurairah Radhiyallahu’anhu: Rasulullah Shallallahu

alaihi wassalam bersabda: Sesungguhnya pada jintan hitam itu terdapat

obat untuk segala macam penyakit kecuali kematian. (H.R. Bukhori)

Penggunaan jintan hitam dalam bidang kesehatan sudah sangat luas

diantaranya jintan hitam mampu untuk mengobati batuk kronik, demam,

lelah, serta penyakit yang berkaitan dengan empedu dan limpa (Hasnah,

Norazah & Err, 2001).

Jintan hitam mempunyai efek terapeutik yang cukup banyak,

diantaranya aktif sebagai analgesik, anti inflamasi, antihistamin, anti alergi,

anti oksidan, anti kanker, stimulasi kekebalan tubuh, anti asma, anti

hipertensi, anti bakteri, anti jamur, anti parasit dan anti virus (Rhandawa,

2008). Jintan hitam juga telah digunakan sebagai agen anti virus terhadap

infeksi yang disebabkan oleh virus cytomegalovirus (Salem & Hossain,

2000).

Pengujian aktivitas jintan hitam sebagai inhibitor terhadap HCV

belum pernah dilakukan. Hal inilah yang melatarbelakangi dilakukannya

penelitian ini, sehingga diharapkan dapat dikembangkan produk yang dapat

dimanfaatkan sebagai alternatif pengobatan hepatitis C.

1.2. Perumusan Masalah

1.2.1. Jintan hitam sudah banyak diteliti dan digunakan sebagai obat, namun

belum diketahui dan digunakan untuk obat hepatitis C

1.2.2. Jintan hitam sebagai inhibitor RNA helikase HCV belum pernah ada

1.2.3. Belum diketahui apakah jintan hitam mempunyai aktivitas sebagai

inhibitor RNA helikase HCV

1.2.4. Kasus hepatitis C di indonesia cukup besar yaitu mencapai jumlah 30 juta

jiwa

1.3. Tujuan Penelitian

Mengetahui aktivitas jintan hitam (Nigella sativa L.) sebagai

inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

3


1.4. Hipotesis

Jintan hitam (Nigella sativa L.) mampu berperan sebagai inhibitor

RNA helikase virus hepatitis C.

1.5. Manfaat Penelitian

1.5.1. Manfaat penelitian secara teoritik

Hasil penelitian ini dapat menambah ilmu pengetahuan tentang

potensi jintan hitam (Nigella sativa L.) sebagai inhibitor RNA helikase

HCV

1.5.2. Manfaat penelitian secara metodologik

Metode yang dipakai dalam penelitian ini dapat digunakan

untuk penelitian-penelitian terhadap tumbuhan lainnya yang dapat

digunakan sebagai inhibitor RNA helikase HCV

1.5.3. Manfaat penelitian secara aplikatif

Hasil penelitian ini dapat dijadikan acuan dalam penelitian-

penelitian untuk mencari informasi tentang jintan hitam (Nigella sativa

L.) sebagai obat


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

2.1.1. Klasifikasi

Kingdom : Plantae

Sub Kingdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Magnoliidae

Ordo : Ranunculales

Famili : Ranunculaceae

Genus : Nigella

Spesies : Nigella sativa L. (Plantamor® , 2008)

2.1.2. Budidaya

Jintan hitam (Nigella sativa L.) tumbuh 2500 m di atas permukaan

laut. Jintan hitam dikenal sebagai tumbuhan liar dan dibudidayakan di

India, Mesir dan Timur Tengah. Selain di negara-negara tersebut jintan

hitam juga dibudidayakan di Sri Lanka, Bangladesh, Nepal, Mesir, Irak

dan Pakistan. Namun di negara-negara ini pembudidayaannya masih

dalam skala kecil. India termasuk negara produsen jintan hitam terbesar

(Malhotra, 2004).

2.1.3. Morfologi

Tanaman jintan hitam merupakan jenis tanaman berbunga, tumbuh

setinggi 30 - 35 cm, berbatang tegak, berkayu dan berbentuk bulat

menusuk. Daunnya runcing, bercabang, bergaris, kadang-kadang tunggal

atau bisa majemuk dengan posisi tersebar berhadapan. Bentuk daun bulat

telur berujung lancip, permukaan daun berbulu halus. Tanaman ini

memiliki bunga yang berbentuk beraturan, berwarna biru pucat atau putih

http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Ranunculaceae

http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Nigella

5


dengan 5 - 10 mahkota bunga, dan akan menjadi buah berbentuk bumbung

atau kurung berbentuk bulat panjang. Buahnya keras seperti buah buni,

berisi 3 - 7 folikel, masing - masing berisi banyak biji atau benih yang

sering digunakan sebagai bahan rempah. Rasa pahit yang tajam dengan

bau khas (Savitri, 2008).

2.1.4. Kandungan Biji Jintan Hitam

Biji jintan hitam mengandung asam amino yaitu berupa leucine,

valine, lysine, threonine, phenylalanine, isoleucine, histidine, methionine,

glutamic acid, arginine, aspartic acid, glysine, proline, serine, alanine,

tyrosine, cystine (Al-Jassir, 1992). Minyak atsiri (0,5 - 1,6%). Minyak

atisiri yang terkadung di dalam biji jintan ini meliputi nigellone,

thymoquinone, thymohydroquinone, dithymoquinone, thymol, carvacrol, α

dan β-pinene, d-limonene, d-citronellote, dan p-cymene (Al-Ali,

Alkhawajah, Rhandhawa & Shaikh, 2008).Kandungan lain dari biji jintan

hitam adalah dithymoquinone, thymoquinone, oxy-coumarin, 6-methoxy

coumarin 7-hidroxy-coumarin, steryl-glucoside (Randhawa, 2008).

Asam lemak (35,6 - 41,6%) yang terkandung di dalam biji jintan

hitam seperti asam arakidonat, asam linoleat, asam linolenat, asam oleat,

asam palmitat, asam stearat, dan asam miristat. Selain itu jintan hitam juga

mengandung protein (22,7%), asam amino meliputi albumin, globulin,

Gambar 1. Nigella sativa Linn (Naturakos, 2009)

6


lisin, leusin, isoleusin, valin, glisin, alanin, fenilalanin, arginin, asparagin,

cystine, asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin, treonin, triptopan dan

tirosin. Dalam jintan hitam terdapat juga senyawa alkaloid meliputi

nigellicine, nigellidine-N-oxide. Mineral (1,79 - 3,74%), meliputi Fe, Na,

Cu, Zn, P dan Ca. Vitamin seperti asam askorbat, tiamin, niasin,

piridoksin, dan asam folat. Karbohidrat (33,9%), serat (5,5%), dan air

(6%). Selain itu, terkandung juga senyawa flavonoid, saponin, terpenoid,

alpipatic alcohol, unsaturated α-β-hidroxy ketone, sterol, ester serta asam

organik. Bijinya juga mengandung lipase, fitosterol dan β-sitosterol

(Gilani, Jabeen & Khan, 2004).

2.1.5. Manfaat Jintan Hitam

Biji jintan hitam pada umumnya digunakan pada pengobatan

tradisional, seperti diuretik, antihipertensi, memperbaiki proses

pencernaan, antidiare, stimulan, analgesij, antibakteri dan digunakan untuk

penyakit kulit. Sudah dilakukan studi terhadap pemanfaatan jintan hitam,

dari hasil studi tersebut didapati hasil bahwa jintan hitam memiliki

aktivitas sebagai antidiabetes, antikanker, imumomodulator, antimikroba,

antiinflamasi, spasmolitik, bronchodilator, hepatoprotektif, pelindung

ginjal dan antioksidan (Gilani, Jabeen & Khan, 2004).

Kawther, Ahmed & Sakina (2008) telah melakukan penelitian

mengenai observasi efek jintan hitam. Dari hasil penelitian tersebut

dinyatakan bahwa jintan hitam memiliki potensi sebagai antiviral,

antikanker, anti angiogenic, dan antioksidan. Sedangkan Musa, Nihat,

Hatice, Gulruh, dan Muharrem (2004) menyatakan bahwa ekstrak etanol

jintan hitam berpotensi sebagai antitumor. Jintan hitam juga dapat

digunakan sebagai antimalaria menurut penelitan Abdulelah & Zainal,

(2007). Penelitian Ali, Gamze & Tugba (2007) melaporkan bahwa jintan

hitam memiliki potensi sebagai antimikotik dan antimikroba.

Biji jintan hitam telah diketahui memiliki sifat farmakologi seperti

obat penenang, anti inflamasi dan ekspektoran. Dari zaman kuno, jintan

hitam telah digunakan sebagai pelindung pakaian dari gangguan serangga.

7


Adanya fraksi karboksil nigellone dan non-karboksil dilaporkan dapat

digunakan sebagai antihistamin. Fraksi fenolik menunjukkan adanya

aktivitas sebagai antibakteri terhadap Micrococcus pyogenes var. aureus

and Escherichia coli. Pada penelitian lain menunjukkan bahwa jintan

hitam mempunyai imonomodulator yang kuat dan memiliki aktivitas

seperti interferon, dengan demikian jintan hitam mampu menghambat

perkembangan kanker dan sel endotel dan dapat mengurangi produksi

faktor pertumbuhan protein angiogenik fibroblastik yang dibuat oleh sel

tumor (Malhotra, 2004).

2.2.Ekstraksi

Menurut Departemen Kesehatan RI Direktorat Jendral Pengawasan

Obat dan Makanan Direktorat Pengawasan Obat tradisional tahun 2000,

ekstraksi adalah proses pelarutan kandungan kimia yang larut hingga terpisah

dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Ekstrak adalah sediaan

kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia

nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau

hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa

diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.

Metoda ekstraksi yang umum digunakan adalah sebagai berikut :

2.2.1. Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut

dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan.

Teknologi maserasi ini termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian

konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan

pengadukan yang kontinu (terus-menerus). Remaserasi berarti dilakukan

pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserasi

pertama dan seterusnya.

8


b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur

ruangan. Proses ini terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi

antara, tahap perkolasi sebenarnya (penampungan ekstrak), terus menerus

sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1 - 5 kali bahan.

2.2.2. Cara panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik

didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif

konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan

proses pada residu pertama sampai 3 – 5 kali sehingga dapat termasuk proses

ekstraksi sempurna.

b. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu

dengan jumlah perlarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik pada temperatur yang tinggi dari

temperatur ruangan yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40 - 50oC.

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96 -

98oC) selama waktu tertentu (15 - 20 menit).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30oC) dan

temperatur sampai titik didih air.

9


2.3. Hepatitis C

Kata hepatitis berarti radang hati. Sejumlah faktor penyebab hepatitis

yaitu alkohol, obat-obatan, racun, autoimunitas, masalah di peredaran darah

seperti gagal jantung (hepatitis iskemik), fatty liver (steatohepatitis

nonalkohol atau NASH) dan virus. Peradangan hati disebabkan oleh infeksi

virus yang disebut virus hepatitis (Worman, 2002).

Beberapa virus hepatitis pada manusia, khususnya pada hepatitis A

dan hepatitis E hanya menyebabkan penyakit akut. Beberapa virus hepatitis,

khususnya hepatitis C dan D dapat menyebabkan hepatitis akut dan kronis.

Hepatitis kronis didenifisikan sebagai hepatitis yang bertahan selama lebih

dari 6 bulan. Kronisitas merupakan hal yang signifikan dari HCV ini. Pada

kebanyakan kasus, infeksi kronis ini biasanya berlangsung seumur hidup

kecuali berhasil diobati. Meskipun ada kasus dimana seorang individu

terinfeksi dengan HCV dan kemudian secara spontan pulih, namun kasus ini

jarang terjadi. Pada kebanyakan kasus pasien tidak tahu kapan ia mulai

terinfeksi dan virus hepatitis ini bisa tetap dalam tubuh seumur hidup jika

tidak diobati (Worman, 2002).

HCV memiliki famili Flaviviridae dan merupakan anggota dari genus

Hepacivirus. Hepatitis C merupakan penyakit hati yang dihasilkan dari

Gambar 2. Virus Hepatitis C (Krekulova, Rehak & Riley, 2006)

10


infeksi HCV. HCV masuk ke sel hati menggunakan gen dalam sel untuk

menduplikasi HCV, lalu menginfeksi bagian sel lainnya (Volker,

Moradpour & Blum, 2006).

Genom Hepatitis C terdiri dari 10 kilobasa atau 10.000 basa

ribonucleotida, suatu bangunan dari RNA. RNA ini mengkode protein

sekitar 3.030 asam amino. Protein besar yang disandikan ke genom RNA

dibagi dalam sel inang yang terinfeksi ke beberapa protein yang strukturnya

lebih kecil dan ke protein nonstruktural. Inti E1 dan E2 adalah protein

struktural yang ada dalam partikel virus. Inti membentuk nukleokapsid (atau

inti pusat) dari virus dengan genom RNA yang berhubungan. Protein

nonstruktural (NS) yang diekspresikan hanya dalam sel yang terinfeksi dan

memiliki tugas yang diperlukan untuk replikasi virus. Protein berstruktur

besar dikode oleh RNA virus yang dimediasi oleh aksi protein sel inang

tertentu dan protein NS2 dan NS3 dari virus itu sendiri. Selama replikasi,

HCV membuat salinan genom RNA untuk menjadi partikel virus. Protein

Gambar 3. Peta Genomik HCV (Tellinghuisen, Evans, You, & Rice, 2007)

Kofaktor

C

Protein Struktural

Protein Nonstruktural

5’

NTR

3’

NTR

E1 E2 NS2 NS3 NS4A NS5B NS5A NS4B

Nukleokapsid

Pelindung Glikoprotein

Protein

transmembran

Metalloprotease

Serin protease

RNA helikase

Protein resisten IFN

RNA

Polimerase

11


Gambar 4. Mekanisme kerja RNA helikase HCV (Utama et al, 2005)

NS5B adalah RNA polimerase yang membuat salinan RNA virus. Sebagian

dari protein NS3 memfasilitasi untuk replikasi dan sintesis protein

(Worman, 2002).

Terapi hepatitis C biasanya menggunakan ribavirin. Ribavirin (1 – β –

D – ribofuranosyl - 1,2,4 – triazole – 3 - karboksamida) memiliki aktivitas

antivirus spektrum luas terhadap lebar kisaran pada RNA virus. Ribavirin

ini digunakan dengan berbagai tingkat keberhasilan untuk pengobatan pada

virus syncytial di pernafasan dan infeksi virus Lassa. Ribavirin dalam

kombinasi dengan interferon telah menjadi terapi standar untuk pengobatan

dengan HCV (Leyssen, Balzarini, Clercq & Neyts, 2005). Namun pada

kenyataannya pengobatan dengan menggunakan ribavirin membutuhkan

dosis yang tinggi sehingga mempunyai efek samping yang signifikan seperti

mual, anemia dan depresi (Crotty, Cameron & Andino, 2002).

2.4.RNA Helikase

Helikase berasal dari kata helic yang berarti struktur pasangan DNA

double helic dan ase yang berarti enzim. Helicase berarti enzim yang

memisahkan pasangan rantai DNA atau RNA, yang masing-masing

12


Tabel II.1. Inhibitor RNA Helikase HCV

kemudian diberi nama DNA helikase atau RNA Helikase. RNA helikase

pertama kali ditemukan pada E.coli, dan juga ditemukan pada bakteri,

khamir, dan virus. Pada HCV enzim ini dikodekan oleh NS3 RNA Helikase.

Enzim ini diperlukan dalam replikasi HCV. RNA helikase HCV memiliki

tiga aktivitas yaitu mengikat rantai RNA, menghidrolisi ATP dan membuka

ikatan dupleks antar RNA dari 3’ - 5’. RNA helikase merusak ikatan

hidrogen antara RNA berpasangan. Reaksi enzimatis tersebut memerlukan

energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP menjadi ADP dan P dan juga

kation divalen seperti Mg2+

(Kadare & Haenni, 1997). Mekanisme kerja

RNA helikase dapat dilihat dari gambar sebagai berikut :

Inhibitor dapat menghalangi pengikatan ATP pada enzim RNA

helikase sehingga enzim RNA helikase tidak mempunyai energi untuk

membuka untai rantai ganda RNA. Selain itu inhibisi juga dapat dilakukan

terhadap salah satu aktivitas RNA helikase yang secara tidak langsung akan

menghambat kerja RNA helikase karena RNA helikase membutuhkan

ketiga macam aktivitas tersebut. Inhibitor dapat diberikan untuk

menghalangi aktivitas pengikatan RNA sehingga RNA tidak dapat

membuka untai rantai ganda. Inhibitor juga dapat diberikan untuk

menghalangi pembukaan untai RNA, misalnya dengan cara menghambat

proses hidrolisis ATP sehingga RNA tidak mempunyai energi untuk

membuka untai ganda RNA (Utama et al, 2000).

2.5. Inhibitor RNA Helikase HCV

INHIBITOR

PERSEN

INHIBISI

DAFTAR

PUSTAKA

1 Protein kapang endofit CgKTm SF 89,45% Paturohman, 2011

2 Ekstrak metanol buah tanaman

mangrove Avicennia marina (Forsk)

Vierb.

76,705 % Kusumawati, 2011

3 Bakteriosin asam laktat S34 64,20 % Putri, 2011a

13


4 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011b

5 Ekstrak rimpang temulawak

(Curcuma zanthorrhiza Roxb.) 73,60 % Setianingsih, 2011

2.6. Ekspresi dan Purifikasi RNA Helikase HCV

Sebagai langkah awal untuk melakukan ekspresi RNA helikase

hepatitis C ini, E.coli BL21 (DE3) pLysS yang telah tersisipi gen penyandi

RNA helikase HCV ditumbuhkan di dalam medium LB cair yang

ditambahkan ampisilin. Selanjutnya medium tersebut diinkubasi selama 30

menit, setelah OD600 mencapai 0,3 (saat pertumbuhan bakteri mencapai fase

log), kemudian diinduksi dengan IPTG (isopropyl-β-D

thiogalactopyranoside). IPTG berperan dalam menginduksi sel bakteri

sehingga ekspresi protein rekombinan dapat maksimal (Sambrook, 2001).

IPTG yang sudah masuk ke dalam sel tidak akan dimetabolisme karena

IPTG ini bertindak bukan sebagai substrat, sehingga konsentrasi IPTG tetap

konstan. Setelah dilakukan penambahan IPTG selanjutnya kultur E.coli

tersebut diinkubasi hingga fase stasioner yaitu fase yang tidak terdapat

penambahan atau pengurangan jumlah sel bakteri tapi fungsi sel terus

berlanjut seperti metabolisme sekunder dan proses biosintesis (Utama et al,

2000).

Sentrifugasi dilakukan untuk pemisahan medium yang digunakan

dalam kultur dengan sel bakteri, dan dilakukan pada suhu 4oC untuk

mencegah denaturasi protein. Lalu untuk tahap purifikasi digunakan pelet

yang di dalamnya terdapat protein RNA helikase HCV.

Purifikasi RNA helikase dilakukan dengan menggunakan modifikasi

dari metode immobilizied metal chromatography (IMAC). Prinsip metode

ini adalah berdasarkan pada interaksi bolak-balik antara asam amino rantai

samping dan ion immobilizied. Berbagai rantai samping seperti histidin,

sistein, dan triptopan dapat berikatan dengan ion metal immobilizied.

Protein RNA diberi label 6xHis-tag (label protein dengan 6 histidin).

Ion nikel (Ni2+

), tembaga (Cu2+

), dan kobalt (Co2+

) memiliki afinitas yang

besar terhadap histidin sehingga purifikasi protein RNA Helikase 6xHis-tag

14


dapat dilakukan dengan menggunakan resin TALON. Protein RNA helikase

yang berikatan dengan resin TALON setelah dilakukan pencucian, lalu

dielusi sehingga diperoleh RNA helikase yang lebih murni. Pemurniaan ini

dapat dilakukan dengan menggunakan imidazol dalam buffer B karena

mempunyai keuntungan yaitu dapat mempertahankan protein kondisi asli

(native condition) maupun kondisi denaturasi (Utama et al, 2000).

2.7. SDS PAGE

Elektroforesis merupakan studi tentang pergerakan molekul muatan

dalam medan listrik. Media yang digunakan adalah selulosa atau gel tipis

terdiri dari poliakrilamida atau agarosa. Selulosa digunakan sebagai media

untuk penetapan nilai berat molekul yang rendah seperti asam amino dan

karbohidrat sedangkan agarosa dan gel poliakrilamid banyak digunakan untuk

molekul yang besar seperti protein.

Teknik-teknik elektroforesis pada umumnya tidak dapat digunakan

untuk mengukur berat molekul dari molekul biologis karena mobilitas zat

dalam gel dipengaruhi oleh muatan dan ukuran. Oleh karena itu, jika sampel

biologis diperlakukan sedemikian sehingga memiliki muatan yang seragam,

maka mobilitas elektroforesisnya hanya akan tergantung pada ukurannya saja.

Berat molekul protein dapat diperkirakan dengan elektroforesis menggunakan

sodium dodesil sulfat (SDS) dan merkaptoetanol.

Gambar 5. Perangkat SDS PAGE

(GTB 204 Molecular Biology Protocols 2001)

15


SDS mengukur struktur sekunder, tersier dan kuarterner protein untuk

menghasilkan rantai polipeptida linier yang dilapisi molekul SDS bermuatan

negatif. Setiap 1,4 gram SDS mengikat per gram protein. Merkaptoetanol

membantu denaturasi protein dengan mengurangi semua ikatan disulfida

(GTB 204 Molecular Biology Protocols, 2001).

2.8. Uji ATPase

Enzim RNA helikase selain memiliki aktivitas RNA helikase (ATP–

dependent helicase) juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan

ATPase (RNA stimulated ATPase). Karena aktivitas RNA tergantung ATP

maka uji ATPase dapat dilakukan dalam skrining inhibitor RNA helikase

(Utama et al, 2000).

Uji ATPase dapat dilakukan dengan kolorimetrik ATPase. Uji ini

digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna,

misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak

dapat menyerap cahaya. Dalam uji ini menggunakan pereaksi yang berwarna

(malachite green dan ammonium molibdat tetrahidrat). Jadi prinsip dari

kolorimetrik ini adalah perubahan warna yang muncul sebagai akibat adanya

reaksi antara zat yang tidak berwarna ditambah dengan pereaksi sehingga

menghasilkan produk yang berwarna. Dalam uji kolorimetrik ini

membutuhkan blanko (aquadest, master mix, dan pereaksi warna) yang

mendapatkan perlakuan sama dengan perlakuan terhadap sampel, blanko ini

digunakan sebagai faktor pengoreksi absorbansi dalam uji ATPase (Utama et

al, 2000).


BAB 3

METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

3.1.1. Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juni 2012 sampai dengan

Desember 2012.

3.1.2. Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Natural Product

Chemistry, Laboratorium Medicinal Chemistry UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta, Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian

Bioteknologi LIPI Cibinong, Bogor dan Herbarium Bogoriense Bidang

Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :

timbangan analitik, alat-alat gelas, rotary evaporator, autoklaf, laminar air

flow (LAF), lemari pendingin, inkubator goyang, vortex, centrifuge,

sonikator, rotator, micropipet, microplate reader (Multiscan EX),

waterbath, magnetic stirer, termometer, perangkat SDS-PAGE.

3.2.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji jintan

hitam (Nigella sativa L.), sel Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS – RNA

helikase HCV rekombinan, n-heksan teknis, etil asetat teknis, metanol

teknis, metanol p.a., media Luria-Bertani (LB) (yeast extract powder

HIMEDIA®

, NaCl MERK® dan Tryptone OXOID

®), 100µg/ml ampisilin,

0,3 mM IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactoside), resin TALON, buffer B (10

mM tris-HCl, 0,25% Tween 20), buffer elusi (buffer B, imidazol), loading

17


dye (1M tris HCl pH 6,8; 20 % SDS; 30 % gliserol 100 %; 16 % β-

merkaptoetanol; bromphenol blue; H2O), gel SDS (H2O; 0,5 tris pH 6,8

containing 0,4 % SDS; 1,5 tris pH 8,8 containing 0,4 % SDS; 30 %

akrilamid; 10 % ammonium persulfat; dan TEMED (N,N,N,N-tetrametina-

diamina), SDS running (Tris, glisin, SDS, H2O), marker precision plus

protein standard (BIORAD®), comassie blue (comassie brilliant blue,

metanol, asam asetat glasial, H2O), destain for comassie (H2O, metanol,

asam asetat glasial), 2 mM ATP (adenosine triphospate), MgCl2, 10 mM

MOPS (asam 4-morfolinopropanafosfat sulfonat), larutan pewarna (H2O,

malachite green, polivinil alkohol, ammonium molibdat tetrahidrat), Tube

50 ml, Eppendorf tube 1,5 ml, tips (1000 µl, 200 µl dan 20 µl) dan 96-well

microplate.

3.3. Tahapan Penelitian

3.3.1. Determinasi biji Jintan Hitam

Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran simplisia yang

digunakan dalam penelitian. Determinasi ini dilakukan di Herbarium

Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI, Cibinong Bogor.

3.3.2. Pengamatan Organoleptik

Pengamatan dilakukan dengan menggunakan panca indera untuk

mendiskripsikan bentuk dan warna sampel. Hal ini bertujuan sebagai

pengenalan awal yang sederhana.

3.3.3. Pembuatan ekstrak biji Jintan Hitam

Sampel berupa biji jintan hitam kering diblender hingga diperoleh

simplisia kering. Sekitar 370 gram simplisia kering diekstraksi secara

maserasi dengan menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol,

lalu filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak

kental (Juniarti et al.2009).

18


Perhitungan rendemen ekstrak :

3.3.4. Penapisan fitokimia ekstrak Jintan Hitam

Penapisan fitokimia ini dilakukan terhadap ekstrak n-heksan, etil

asetat dan metanol.

3.3.4.1. Identifikasi alkaloid

Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam 5 mL HCl 1% dan

dipanaskan dalam water bath. Filtrat sebanyak 1 mL ditetesi dengan

pereaksi Dragendorff. Terbentuknya endapan oranye mengindikasikan

adanya alkaloid (Magadula & Tewtrakul, 2010).

3.3.4.2. Identifikasi flavonoid

Tiga metode yang digunakan untuk menguji flavonoid. Pertama,

amonia encer (5 ml) ditambahkan ke sebagian filtrat encer dari

ekstrak, kemudian asam sulfat pekat (1 ml) ditambahkan. Sebuah warna

kuning yang hilang menunjukkan adanya flavonoid. Kedua, beberapa

tetes larutan aluminium 1% ditambahkan ke sebagian dari filtrat.

terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid. Ketiga,

ekstrak sebanyak 0,5 gram dipanaskan dengan 10 ml etil asetat yang

telah diuapkan selama 3 menit. Campuran kemudian disaring dan 4 ml

filtrat dikocok dengan penambahan 1 ml larutan amonia encer.

terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid (Ayoola,

2008).

3.3.4.3. Identifikasi saponin

Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditimbang dalam tabung reaksi lalu

ditambahkan air sebanyak 2 ml, kemudian tabung reaksi tersebut

diguncang-guncangkan. Jika busa yang dihasilkan berlangsung selama 10

Rendemen ekstrak = Bobot ekstrak total x 100 %

Bobot simplisia total

19


menit, maka hal tersebut menunjukkan adanya saponin

(Prashant,Bimlesh, Mandeep, Gurpreet & Harleen, 2011).

3.3.4.4. Identifikasi steroid dan triterpenoid

Ekstrak sebanyak 0,15 gram dicampurkan ke dalam 2 ml acetic

anhydride (CH3CO)2O, kemudian ditambahkan 2 ml H2SO4 1N. Adanya

cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan

adanya triterpen sedangkan munculnya warna hijau kebiruan

menunjukkan adanya steroid (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006).

3.3.4.5. Identifikasi terpenoid

Ekstrak sebanyak 0,2 gram ditambahkan 2 ml kloroform,

kemudian ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 ml. Adanya warna coklat

kemerahan menunjukkan adanya terpenoid (Ayoola, 2008).

3.3.4.6. Identifikasi tanin

Ekstrak sebanyak 0,2 gram dilarutkan dalam 20 mL akuades.

Filtrat sebanyak 2 mL ditambahkan 3 tetes FeCl3 10%. Terbentuknya

warna biru kehitaman atau hijau kehitaman mengindikasikan adanya

tanin. Cara yang lain adalah 2 mL filtrat ditambahkan 1 mL larutan brom,

apabila terdapat endapan maka positif mengandung tanin (Adegboye et

al, 2008).

3.3.4.7. Identifikasi kumarin

Ekstrak sebanyak 0,5 gram dilarutkan dalam air panas. Setelah

dingin, larutan dibagi ke dalam dua tabung reaksi yaitu tabung 1 sebagai

blanko dan tabung 2 ditambah 0,5 ml NH3 10%. Adanya pijaran yang

kuat dibawah sinar UV menunjukkan adanya kumarin dan turunannya

(Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006).

20


3.3.4.8. Identifikasi minyak atsiri

Ekstrak kental yang berupa minyak dan berbau enak ditambahkan

etanol, selanjutnya larutan alkoholik tersebut diuapkan kembali sampai

kering. Jika residu tetap berbau enak, menunjukkan ekstrak positif

mengandung minyak atsiri (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006).

3.3.5. Susut pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam

botol timbang dangkal tertutup yang sebelumnya telah dipanaskan

terlebih dahulu pada suhu 105o

C selama 30 menit dan telah ditara.

Sebelum ditimbang ekstrak ditarakan dalam botol timbang, dengan

menggoyangkan botol, hingga membentuk lapisan yang setebal 5 mm –

10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ektrak kental, ratakan dengan

bantuan pengaduk. Kemudian dimasukkan ke dalam ruang pengering

pada suhu 105o C hingga bobot botol tetap, kemudian didinginkan dalam

desikator (Depkes, 2000).

Perhitungan susut pengeringan :

3.3.6. Kadar abu

Lebih kurang 2 gram ekstrak yang telah digerus dan ditimbang

dimasukkan kedalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara,

kemudian diratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis,

dinginkan dalam desikator kemudian ditimbang (Depkes, 2000).

Perhitungan kadar abu :

Ket.

W = berat cawan kosong (gram)

W1 = berat cawan + sampel uji (gram)

W2 = berat cawan + abu (gram)

Susut pengeringan = – x 100 %

Bobot awal

21


3.3.7. Analisa angka kapang

3.3.7.1. Pembuatan Media Pembenihan

Sebanyak 39 gram serbuk Potato Dextrose Agar dilarutkan

dengan 1 liter air suling dalam erlenmeyer menggunakan hotplate dan

magnetic stirer hingga diperoleh larutan yang jernih. Media ini kemudian

disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC tekanan 15 lbs selama 15

menit (Hadiotomo, 1990).

3.3.7.2. Pebuatan Sampel Uji dan Analisa Angka Kapang

Sebanyak 1 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam 10 ml

aquades steril sehinga didapatkan konsentrasi suspensi sebasar 10%.

Dari stock yang ada diambil 1 ml pengenceran 10-1

ke dalam tabung yang

berisi pengenceran aquadest steril hingga diperoleh pengenceran 10-2

lalu

dibuat hingga pengenceran 10-4

. Dari masing–masing pengenceran

diambil 0,5 ml, dituangkan pada permukaan PDA, segera digoyang

sambil diputar, agar suspensi tersebar merata. Seluruh cawan diinkubasi

pada suhu 20 – 25o

C selama 3 - 4 hari. Sesudah 3 hari inkubasi, dicatat

jumlah koloni jamur yang tumbuh, pengamatan terakhir pada inkubasi

hari ke- 4. Koloni ragi dapat dibedakan dengan koloni kapang dari

bentuknya yang bulat kecil berwarna putih hampir menyerupai bakteri.

Lempeng agar yang diamati adalah lempeng dimana terdapat 40 – 60

koloni kapang (Hadiotomo, 1990).

3.3.8. Produksi enzim helikase HCV

3.3.8.1. Pembuatan Media

Media LB (Luria-Bertani) cair dibuat sebagai medaia untuk

pertumbuhan E.coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV

rekombinan. Media LB dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400

ml untuk kultur. Semua disterilisasi pada suhu 121o

C selama 15 menit

(Utama et al, 2000).

22


3.3.8.2. Pembuatan larutan dapar

Pembuatan dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM,

NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan

diaduk hingga homogen.

3.3.8.3. Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV .

a. Media LB 10 ml diberi ampisilin (100µg/ml) sebanyak 10 µl dan

dihomogenkan. Lalu dimasukkan bakteri E.Coli BL21 (DE3) pLsS

yang membawa gen RNA helikase HCV, kemudian diinkubasi

selama satu malam dalam inkubator goyang pada suhu 37o

C dengan

kecepatan 200 rpm.

b. Hasil prekultur tersebut diinokulasi ke dalam 400 ml LB yang telah

diberi ampisilin dan ditambahkan IPTG 0,3 mM. Lalu diinkubasi

dalam inkubator goyang pada suhu 37o C dengan kecepatan 200 rpm.

c. Hasil kultur E.coli BL21 (DE3) pLysS yang dinkubasi selama 3 jam

dalam inkubator goyang, pada suhu 37o

C, dipindahkan ke dalam

tabung-tabung sentrifus ukuran 50 ml, disentrifus dengan kecepatan

3500 rpm, selama 10 menit. Endapan dicuci dengan media LB,

disentrifugasi kembali selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm.

Pelet diambil dan dikumpulkan peletnya kemudian disimpan selama

satu malam pada suhu -20oC.

d. Purifikasi RNA Helikase. Pelet yang disimpan pada suhu -20oC

dilakukan freeze thawing atau pengeringbekuan sebanyak tiga kali.

Setelah itu disonikasi (pemecahan sel dengan alat sonikator) dengan

amplitudo 45 %, cycle 0,5, selama 15 detik dilakukan tiga kali

dengan interval masing-masing 1 menit. Kemudian disentrifus

dengan kecepatan 10000 rpm selama 20 menit untuk menghasilkan

pelet. Kemudian pelet ditambahkan resin TALON 300 µl pada

rotator pada suhu dingin selama 3 jam. Lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Supernatan sebagai inner

volume (IV) diambil 50 µl untuk di analisa dengan metode SDS-

PAGE, sedangkan pelet ditambahkan larutan buffer B sebanyak 10

23


ml, kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm

selama 5 menit. Supernatan diambil sebanyak 50 µl sebagai washing

pertama (W1) untuk analisa SDS-PAGE. Pelet ditambahkan

kembali buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebanyak

50 µl sebagai washing kedua (W2) untuk SDS-PAGE. Pelet

dipindahkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml kemudian

disentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit. Pelet yang ada di dalam

eppendorf tube 1,5 ml ditambahkan buffer elusi sebanyak 200 µl

kemudian di rotator pada suhu dingin semalaman. Setelah di rotator

semalaman, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm

selama 5 menit (supernatan dipindahkan ke dalam eppendorf tube

1,5 ml lainnya sebagai E1/elution pertama untuk analisa SDS-

PAGE). Sedangkan pelet ditambahkan buffer elusi kembali sebanyak

200 µl, kemudian dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan

3500 rpm selama 5 menit. Supernatan dipisahkan dari peletnya

sebagai E2/elution kedua untuk analisa SDS-PAGE (Utama et al,

2000).

e. Analisa enzim helikase dengan SDS – PAGE

Enzim RNA helikase ini dianalisa kemurniannya dengan

menggunakan SDS-PAGE. Glass plate sandwich (short plate &

spacer plate) dibersihkan dengan alkohol 70%. Short plate

ditempatkan di depan kaca spacer plate. Kedua kaca tersebut

kemudian dimasukkan ke dalam casting frame dengan posisi bagian

bawah kedua kaca sama rata lalu kunci dengan cams. Casting frame

dipasang pada casting stand. Setelah peralatan siap, larutan gel

separating dibuat sesuai dengan prosedur (Lampiran 6a). Larutan

tersebut dimasukkan diantara celah short plate & spacer plate

sampai dua per tiga bagian lalu ditambahkan aquades sampai dengan

batas atas kaca, kemudian ditunggu ± 20 menit sampai terbentuk gel.

Selama menunggu 20 menit, larutan gel stacking dibuat sesuai

dengan prosedur (Lampiran 6b). Sebelum gel stacking dimasukkan,

24


air yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking

dituang sampai batas atas kaca, comb dimasukkan, kemudian

ditunggu ± 20 menit sampai gel memadat.

Setelah gel memadat, gel dipindahkan dari casting frame

dengan cara menekan cams pada casting frame. Gel cassette

sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short

plate menghadap ke dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping

frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame.

Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu

diisi dengan working solution (buffer elektroforesis SDS 1x pH 8.3).

Masing-masing sampel (IV, W1, W2, E1, E2) diambil 4 µl

lalu dimasukkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml dan ditambahkan

Loading dye (Lampiran 6c) kemudian didenaturasi pada suhu 95o

C

selama 10 menit. Marker precision plus protein standard sebanyak 4

µl dimasukkan ke dalam well. Sampel yang telah didenaturasi

dimasukkan masing-masing sebanyak 5 µl/well. Kemudian gel

dirunning pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam

dalam commasie Blue G–250 staining solution (Lampiran 6d)

selama 1 jam sambil digoyang-goyang diatas rocker. Gel dibilas

dengan commasie blue G–250 destaining solution (Lampiran 6e) ±

20 menit, dengan dua kali pengulangan. Gel dibilas dengan H2O

sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4o C.

3.3.8.4. Uji aktivitas ATPase RNA Helikase HCV

Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini

menggunakan enzim RNA helikase yang telah dipurifikasi. Enzim RNA

helikase dibuat dengan berbagai pengenceran (5x, 10x, 20x, 40, 80x).

Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquabides dan 45 µl master mix

(H2O, MOPS, MgCl, dan ATP). Untuk sampel uji, konsentrasi akhir

reaksi sebesar 50 µl/well mengandung 45 µl master mix (H2O, MOPS,

MgCl, ATP, dan RNA helikase HCV) dan 5 µl enzim. Campuran reaksi

diinkubasi dalam microtiter plate 96-well, pada suhu ruang selama 45

25


menit. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan 100 µl/well

larutan pewarna (malachite green). Reaksi diinkubasi selama 5 menit,

kemudian ditambahkan sodium sitrat untuk menghentikan reaksi warna.

Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan referensi

405 nm (Utama et al,2000).

3.3.8.5. Uji Aktivitas Jintan Hitam (Nigella sativa L.) sebagai Inhibitor RNA

Helikase HCV

Pengujian inhibisi enzim helikase hepatitis C ini menggunakan

sampel berupa ekstrak kental biji jintan hitam dari 3 jenis pelarut (n-

heksan, etil asetat dan metanol). Pengujian ini dilakukan dengan

menggunakan uji ATPase kolorimetri (Utama et al, 2000), yaitu dengan

mengukur jumlah fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP

menjadi ADP dan Pi.

Masing-masing ekstrak kental jintan hitam dibuat dengan

berbagai konsentrasi yakni 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 4000 ppm,

8000 ppm, 16000 ppm dan 32000 ppm. Ekstrak kental jintan hitam ini

dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a.

Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquabides dan 45 µl

master mix (H2O, MOPS, MgCl, ATP dan RNA helikase) dan untuk

sampel konsentrasi akhir reaksi sebesar 50 µl/well menggandung 45 µl

master mix (H2O, MOPS, MgCl, ATP, dan RNA helikase HCV) dan 5 µl

ekstrak. Campuran reaksi diinkubasi dalam microtiter plate 96-well, pada

suhu ruang selama 45 menit. Hasil reaksi divisualisasikan dengan

penambahan 100 µl/well larutan pewarna (malachite green). Reaksi

diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahkan sodium sitrat untuk

menghentikan reaksi warna. Absorbansi diukur pada panjang gelombang

620 nm dengan referensi 405 nm (Utama et al, 2000). Persentase inhibisi

dapat dihitung dengan rumus :

Keterangan :

A = Absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel

I = Absorbansi enzim RNA helikase dengan penambahan sampel

% Inhibisi = A – I x 100 %

A


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Determinasi Biji Jintan Hitam

Determinasi dilakukan untuk mengidentifikasi sampel yang dipakai

dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang

Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor. Berdasarkan surat

keterangan yang diperoleh, dinyatakan bahwa sampel yang didapatkan dari

Pasar Impres Senen Blok B6 Jakarta Pusat termasuk jenis Nigella sativa L.

dari suku Ranuculaceae. Keterangan hasil determinasi sampel tersebut dapat

dilihat pada Lampiran 1.

4.2. Rendemen Ekstrak

Ekstraksi biji jintan hitam dilakukan dengan metode maserasi.

Metode maserasi ini dipilih karena metode ini sesuai untuk senyawa–senyawa

yang tidak tahan panas. Menurut Yuliani (2010) proses maserasi adalah

proses perendaman sampel dalam pelarut organik pada temperatur kamar.

Prinsip ekstraksi ini ditekankan pada interaksi yang cukup antara pelarut

dengan jaringan sampel yang akan diekstraksi. Proses ini sangat

menguntungkan dalam isolasi bahan alam karena selama proses perendaman

akan terjadi proses pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan

tekanan antara di dalam dan di luar selnya sehingga metabolit sekunder yang

ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik (Leny, 2006).

Kelebihan ekstraksi maserasi adalah metode yang dilakukan cenderung

murah dan alat-alat yang digunakan tergolong sederhana.

Proses ekstraksi didasarkan pada kelarutan komponen terhadap

komponen yang lain dalam campuran. Kelarutan suatu komponen tergantung

pada derajat kepolarannya. Hukum “like dissolved like” menyatakan bahwa

senyawa yang bersifat polar hanya dapat larut dalam pelarut polar dan

semipolar, begitupun sebaliknya senyawa yang bersifat nonpolar hanya dapat

larut dalam pelarut nonpolar dan semipolar (Yuliani, 2010).

27


Ekstraksi maserasi yang dilakukan adalah maserasi bertingkat

dengan menggunakan 3 pelarut yaitu n-heksan, etil asetat dan metanol.

Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk biji jintan hitam dengan

pelarut hingga pelarut mendekati tidak berwarna.

Sampel berupa serbuk jintan hitam sebanyak 370 gram pertama kali

dimaserasi dengan n-heksan yang bersifat non polar, sehingga diharapkan

senyawa-senyawa yang bersifat non polar ikut tertarik ke dalam pelarut non

polar tersebut. Filtrat yang diperoleh kemudian dikentalkan dengan rotary

evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan. Prinsip penggunaan

rotary evaporator adalah pemekatan filtrat dengan penguapan pada tekanan

rendah dan temperatur sesuai dengan pelarutnya (55oC). Pelarut pada sampel

akan teruapkan dan melewati kondensor sehingga berubah kembali menjadi

larutan dan tertampung pada receiving part sedangkan untuk ekstrak jintan

hitam terbentuk pada evaporation part. Pemekatan dihentikan ketika pelarut

tidak menetes pada receiving part dengan asumsi bahwa sudah tidak ada

pelarut yang terdapat pada sampel (Yuliani, 2010).

Ampas dari penyaringan filtrat n-heksan yang dihasilkan dilakukan

maserasi kembali dengan pelarut etil asetat yang bersifat semi polar sehingga

senyawa semi polar yang tidak tertarik dalam pelarut non polar bisa tertarik

dalam pelarut tersebut. Ekstraksi terakhir dilakukan dengan menggunakan

pelaurt metanol yang bersifat polar sehingga senyawa-senyawa polar yang

terdapat dalam sampel dapat tertarik ke dalam pelarut polar tersebut (Leny,

2006). Hasil dari masing-masing ekstraksi tersebut, kemudian diuapkan

dengan rotary evaporator sehingga berturut-turut diperoleh ekstrak kental etil

asetat dan ekstrak kental metanol. Bobot ekstrak kental serta rendemen

ekstrak dapat dilihat pada Tabel IV.1.

Tabel IV.1 Rendemen ekstrak

Nama Ekstrak Bobot Ekstrak

(gram)

Rendemen Ekstrak

(%)

Ekstrak n-heksan 24,571 6,640

Ekstrak etil asetat 15,122 4,725

Ekstrak methanol 8,278 2,759

28


Nilai rendemen yang didapatkan dari masing-masing ekstrak

menunjukkan bahwa ekstrak dengan pelarut n-heksan memiliki nilai

rendemen tertinggi. Hal ini dapat dijelaskan dengan adanya kemungkinan

bahwa biji jintan hitam mengandung senyawa non polar yang lebih banyak

dibandingkan dengan senyawa semi polar maupun polar.

Meskipun metode maserasi termasuk sederhana dan mudah

dilakukan, namun dengan penggunaan pelarut yang bersifat volatil diduga

menyebabkan berkurangnya nilai rendemen ekstrak pada saat proses filtrasi

yang pada akhirnya mempengaruhi nilai rendemen masing-masing ekstrak.

Ismet (2007) menyatakan bahwa faktor-faktor yang mempengaruhi proses

ekstraksi adalah lama ekstraksi, suhu dan jenis pelarut yang digunakan.

4.3. Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia merupakan metode yang digunakan untuk

mendeteksi tumbuhan tingkat tinggi berdasarkan golongannya dan sebagai

informasi awal untuk mengetahui senyawa kimia yang mempunyai aktivitas

biologi dari suatu tanaman (Yuliani, 2010). Jintan hitam mengandung

berbagai jenis metabolit sekunder, dimana masing-masing metabolit sekunder

memiliki bioaktivitas yang berbeda. Identifikasi pada sampel perlu dilakukan

untuk mengetahui golongan senyawa metabolit sekunder pada sampel

tersebut. Hasil penapisan fitokimia dari ekstrak dapat dilihat pada Tabel

IV.2.

Pada ekstrak n-heksan diidentifikasi adanya senyawa steroid yang

ditunjukkan dengan terbentuknya cincin warna hijau kebiruan, dan juga

senyawa triterpenoid yang ditunjukkan dengan terbentuknya cincin

kecoklatan pada perbatasan dua pelarut. Terpenoid diidentifikasi positif

dengan terbentuknya lapisan berwarna kemerahan setalah dilakukan

penambahan kloroform dan asam sulfat pekat. Kandungan minyak atsiri

dalam ekstrak ini ditandai dengan residu yang tetap beraroma enak.

Pada ekstrak etil asetat diidentifikasi adanya saponin. Uji ini

dilakukan dengan pengocokan keras terhadap sampel yang telah ditambahkan

air, lalu menghasilkan busa yang stabil. Sedangkan Kumarin diidentifikasi

29


positif pada ekstrak ini ditandai dengan adanya pijaran berwarna hijau dengan

penyinaran menggunakan sinar UV. Flavonoid diidentifikasi positif dengan

ditandai terbentuknya larutan kuning dengan penambahan amonia setelah

dilarutkan dengan etil asetat.

Ekstrak metanol dari hasil penapisan fitokimia diidentifikasi adanya

senyawa alkaloid. Identifikasi alkaloid ini dilakukan dengan menggunakan

pereaksi Dragendorff dan menghasilkan endapan kemerahan.

Keberadaan tanin ditandai dengan terbentuknya warna biru

kehitaman atau hijau kehitaman dengan penambahan FeCl3. Tanin tidak

teridentifikasi pada ketiga ekstrak. Identifikasi warna pada penapisan

fitokimia ini dapat dilihat pada Lampiran 11.

4.4. Parameter Standar

Parameter standar yang dilakukan terhadap ekstrak kental jintan

hitam dapat dilihat pada Tabel IV.3.

Ekstrak

n-Heksan

Ekstrak

Etil Asetat

Ekstrak

Metanol

Steroid/triterpenoid + - -

Terpenoid + - -

Minyak atsiri + - -

Saponin - ++ +

Kumarin - + - Flavonoid - + - Tanin - - -

Alkaloid - - +

Tabel IV.2. Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak n-Heksan, Ekstrak Etil Asetat

dan Ekstrak Metanol

30


Tabel IV.3. Parameter Standar

Parameter Ekstrak

n-Heksan

Ekstrak

Etil Asetat

Ekstrak

Metanol

Organoleptik

- Bentuk

- Warna

Cairan kental

Hijau kehitaman

Pasta

Kuning

Karamel

Kuning kecoklatan

Kadar Abu 0,314% 0,224% 0,147%

Susut

Pengeringan 3,689% 1,049% 3,453%

Angka Kapang 4 x 102 CFU/ml - 1 x 10

3 CFU/ml

Pemeriksaan kadar abu menggunakan prinsip dengan memanaskan

bahan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya terdekstruksi

dan menguap, sehingga hanya tertinggal unsur mineral dan anorganik. Tujuan

penetapan kadar abu adalah untuk memberikan gambaran kandungan mineral

internal dan eksternal yang berasal pada proses awal sampai terbentuknya

ekstrak. Persyaratan simplisia yang dijelaskan pada buku Materi Medika jilid

III, batas kadar abu total jintan hitam yang diperbolehkan yaitu tidak lebih

dari 8,00%. Masing-masing ekstrak mempunyai nilai kadar abu tidak lebih

dari 8,00%, hal tersebut menandakan bahwa masing-masing ekstrak masuk

dalam persyaratan yang dianjurkan. Sementara, nilai pada susut pengeringan

menyatakan jumlah maksimal senyawa yang mudah menguap atau hilang

pada proses pengeringan.

Pengujian cemaran kapang termasuk salah satu uji untuk syarat

kemurnian ekstrak. Uji ini mencakup penentuan jumlah mikroorganisme yang

diperbolehkan. Batas kontaminan kapang yang masih dianggap aman untuk

dikonsumsi pada obat tradisional sebesar kurang dari 104 CFU/ml (Pratiwi,

2005). CFU merupakan singkatan dari Colony Forming Unit yang

mencerminkan satuan mikroba yang membentuk sebuah koloni. Hasil uji

31


kapang dari masing-masing ekstrak yang tertera pada Tabel IV.3.

menunjukkan nilai yang berada pada batas aman untuk dikonsumsi.

4.5. Produksi dan Purifikasi Enzim Helikase HCV

4.5.1. Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV

Ekspresi enzim RNA helikase HCV ini diperoleh dari bakteri E.

coli BL21(DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan. Ekspresi RNA

helikase HCV dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama yaitu prekultur

dengan media LB (Luria Bertani) sebanyak 10 ml. Media LB ini

merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan bakteri. Dalam

prekultur ini juga menggunakan antibiotik ampisilin yang berfungsi

sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E.coli BL21(DE3) pLysS-

RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten

ampisilin. Oleh karena itu, dengan penambahan ampisilin ini diharapkan

hanya E.coli BL21(DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang

dapat tumbuh. Media dikultur pada suhu 37oC, diinkubasi dengan

menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 200 rpm (Pelzar &

Chan,1986).

Tahap kedua adalah kultur bakteri E.coli BL21(DE3) pLysS-RNA

helikase HCV rekombinan yang ditunjukkan dengan terbentuknya

suspensi berwarna kuning keruh. Pengukuran fase pertumbuhan E.coli

pada panjang gelombang 600 nm karena kultur mempunyai serapan

optimum pada panjang gelombang tersebut. Isopropil β-D-

thiogalaktopiranosida (IPTG) ditambahkan pada saat nilai OD600 kultur sel

E.coli mencapai 0,3 karena pada nilai tersebut kultur bakteri mencapai fase

logaritmik. Pada fase itulah bakteri rekombinan mulai mengekspresikan

enzim RNA helikase. Penambahan IPTG bertujuan untuk menginduksi gen

RNA helikase HCV agar terjadi ekspresi yang berlebih hingga fase awal

stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1 (Utama et al, 2000).

Kemudian E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV ini

dipanen dengan sentrifugasi bertingkat. Sentrifugasi bertingkat ini

bertujuan untuk memisahkan E.coli dengan media LB. Bakteri E.coli

32


mengendap sebagai pelet sedangkan media LB akan terpisah sebagai

supernatan. Pelet yang telah terkumpulkan disimpan pada suhu -20oC

untuk menghindari kerusakan pada sel dan menjaga stabilitas enzim RNA

helikase HCV (Schwen & Melling, 1985).

4.5.2. Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV

Purifikasi enzim RNA helikase HCV dilakukan untuk memurnikan

hasil ekspresi enzim RNA helikase HCV yang telah disisipkan dalam

bakteri E.coli BL21(DE3) pLySs.

Enzim dipurifikasi dengan pemecahan sel terlebih dahulu.

Pemecahan sel ini berlangsung dengan menggunakan dua tahap yaitu

dengan cara pengeringbekuan (freeze thawing) dan sonikasi.

Pengeringbekuan menyebabkan pembentukan kristal es pada sel E.coli yang

membawa gen RNA helikase HCV. Kristal es terbentuk akibat

dilakukannya pengeringbekuan yang berlangsung berulang terhadap cairan

intraselular dan cairan ekstraselular. Proses inilah yang memudahkan

pemecahan sel (Schwen & Melling, 1985).

Pemecahan sel tahap kedua menggunakan sonikasi yang bertujuan

untuk memecah dinding sel. Dengan sonikasi ini menyebabkan organel

dalam sel keluar namun tidak merusak integritas fungsionalnya. Pada saat

melakukan sonikasi ini pelet ditambahkan buffer B yang mengandung 10

mM Tris HCl pH 8,5 ; 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20. Tris HCl pH

8,5 ini berfungsi untuk mempertahankan aktivitas enzim selama proses

purifikasi enzim. Tween 20 digunakan untuk menghancurkan lipid bipolar

pada membran sel. Lipid bipolar ini berasosiasi dengan kompleks replikasi

sehingga enzim RNA helikase melekat pada membran (metabolit

intraselular). Dengan rusaknya lipid bipolar akan menyebabkan disosiasi

bagian hidrofobik enzim RNA helikase dengan membran sel. Sedangkan

NaCl berfungsi untuk menghilangkan asam nukleat dan kontaminan lainnya

yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase HCV dengan cara

interaksi ionik (Vanz et al, 2008).

33


Setelah dilakukan sonikasi, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dan

mengambil supernatannya. Supernatan ini berisi metabolit intraselular yang

perlu dimurnikan. Pemurnian ini dilakukan dengan metode kromatografi

afinitas. Metode pemurnian ini menggunakan resin TALON afinitas logam

(metal afinity) yang secara spesifik dapat mengikat RNA helikase yang telah

dilabel dengan 6xHis-Tag pada N terminalnya. Pengikatan residu His ini

dilakukan oleh logam Co2+

yang terdapat pada resin TALON. Menurut Petty

(1996), histidin akan berikatan secara selektif dengan logam Co2+

resin

TALON meskipun dalam resin tersebut terdapat ion metal bebas lainnya.

Pengikatan ini dilakukan di rotator. RNA helikase yang telah diikat oleh

resin TALON dipisahkan dengan metabolit intraseluler lainnya melalui

sentrifugasi. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA

helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Resin

yang telah berikatan dengan enzim, dimurnikan kembali dengan pencucian

menggunakan buffer B. Pencucian ini dimaksudkan untuk menghilangkan

protein non target. Pemurnian berikutnya, pengikatan imidazole yang

terdapat dalam buffer elusi dengan resin TALON, sehingga enzim akan

terlepas dari ikatan resin. Konsentrasi imidazole lebih dari 200 mM

menyebabkan protein yang memiliki residu His-tag terdisosiasi karena tidak

mampu lagi bersaing untuk berikatan dengan resin.

Setiap hasil sentifugasi pada tahap pemurnian enzim dikoleksi untuk

dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Analisis ini bertujuan

untuk mengetahui kemurnian enzim. SDS-PAGE merupakan teknik yang

digunakan untuk menganalisis bobot molekul suatu protein. Prinsip kerjanya

adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media penyangga.

Komposisi SDS-PAGE ini adalah akrilamid, Tris HCl, H2O, tetrametina-

diamina dan ammoium persulfat. Akrilamid berguna untuk pembentukkan

gel, Tris HCl sebagai inisiator dalam proses polimerasi akrilamid menjadi

poliakrilamid. Sedangkan tetrametina-diamina berguna sebagai katalisator

reaksi polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid. Untuk pewarnaan hasil

SDS-PAGE digunakan pereaksi warna commasie blue dan destain for

34


37 kDa

50 kDa

75 kDa

100 kDa

150 kDa

250 kDa

commasie sebagai pembilasnya sehingga dapat menampakkan pita protein

sesuai ukuran target yang diinginkan.

Dari hasil SDS-PAGE, enzim RNA helikase HCV yang telah

dipurifikasi dalam penelitian ini mempunyai ukuran protein sebesar 54 kDa

yang ditunjukkan pada Gambar 7 dengan marker sebagai pembandingnya.

Bobot molekul enzim ini sesuai dengan bobot enzim yang dilaporkan Utama

et al (2000). Sehingga dapat disimpulkan bahwa protein dalam E1 adalah

enzim RNA helikase murni. Inner volume (IV) merupakan larutan yang

diambil setelah dilakukannya proses pemecahan sel, namun belum

dilakukan tahap purifikasi dengan penambahan resin TALON sehingga

masih terdapat metabolit intraseluar yang belum termurnikan. Untuk lajur

W1 (washing 1) dan W2 (washing 2) tidak menunjukkan adanya pita protein

yang artinya pada proses ini tidak terbawa enzim RNA helikase virus

hepatitis C. Sedangkan untuk E1 (elution 1) dan E2 (elution 2) merupakan

hasil elusi enzim yang dilakukan dua kali. Pada Gambar 7 menunjukkan

54 kDa

Gambar 7. Elektroforesis SDS-PAGE RNA Helikase. (M : Marker, E :

Enzim, IV : Inner Volume, W : Washing)

M E1 E2 IV W1 W2

35


bahwa E1 dan E2 memiliki pita protein yang sama ukurannya, hanya pada

E1 pita tampak lebih tebal dikarenakan konsentrasi enzim yang lebih tinggi

pada proses elusi yang pertama.

4.6. Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Jintan Hitam terhadap Enzim RNA

Helikase HCV

Ekstrak kental jintan hitam dari hasil maserasi menggunakan n-

heksan, etil asetat dan metanol digunakan sebagai sampel dalam pengujian

aktivitas inhibisi enzim RNA helikase HCV ini. Masing-masing ekstrak

dibuat dalam berbagai konsentrasi yaitu 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm,

4000 ppm, 8000 ppm, 16000 ppm dan 32000 ppm. Pengujian aktivitas

inhibisi dilakukan dengan metode ATPase kolorimetrik. Uji kolorimetrik

melibatkan pengukuran serapan senyawa anorganik yang dilepaskan dalam

hidrolisis ATP oleh enzim RNA helikase.

Larutan master mix diperlukan pada uji kolorimetrik ATPase. Asam

4-morfolinopropanafosfat sulfonat (MOPS) digunakan sebagai buffer dalam

master mix. Buffer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas enzim. ATP yang

ditambahkan berperan sebagai substrat untuk RNA helikase. Keberadaan

Mg2+

diperlukan sebagai kofaktor RNA helikase sehingga MgCl2 berfungsi

sebagai donor kofaktor dalam master mix (Utama et al.2000).

Aktivitas enzim RNA helikase bergantung pada ATP sebagai donor

energi. Oleh karena itu, uji ATPase dapat digunakan untuk uji aktivitas

inhibisi RNA helikase HCV oleh sampel. Prinsip ujinya adalah pengukuran

fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan

ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Pi bebas akan

membentuk kompleks warna dengan pereaksi ammonium molibdat

membentuk fosfomolibdat. Fosfomolibdat dapat bereaksi dengan enzim

RNA helikase dan enzim akan mengendap dan menimbulkan kekeruhan.

Polivinil alkohol akan melarutkan kembali enzim yang terendapkan

sehingga tidak menimbulkan kekeruhan. Warna yang terbentuk sebanding

dengan konsentrasi Pi yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP

36


(Chan et al, 1986). Na sitrat digunakan untuk menghentikan reaksi

enzimatik yang mengakibatkan terjadinya warna yang berlebih.

Tahap berikutnya dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan

multiscan EX dengan panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang

gelombang 620 nm adalah serapan optimum warna hijau kebiruan yang

merupakan kompleks warna yang dibentuk dari hasil reaksi larutan pewarna

dengan fosfat bebas hasil hidrolisis ATP. Sedangkan warna kuning

merupakan warna yang dihasilkan oleh larutan pewarna yang tidak

berikatan dengan Pi. Penggunaan dua panjang gelombang bertujuan agar

perhitungan reaksi antara enzim dengan substrat lebih akurat. Perhitungan

konsentrasi Pi dihasilkan dengan membandingkan nilai absorbansi dari

pembacaan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986).

Data berikut merupakan hasil dari uji ATPase kolorimetrik dengan

menggunakan ekstrak jintan hitam :

Konsentrasi

Ekstrak

Aktivitas ekstrak sebagai inhibitor RNA helikase HCV(%)

Ekstrak

n-heksan

Ekstrak

etil asetat

Ekstrak

metanol

32.000 ppm 64,454 38,804 27,617

16.000 ppm 60,598 33,782 21,933

8.000 ppm 52,915 29,327 18,915

4.000 ppm 33,513 21,674 16,056

2.000 ppm 22,152 11,958 12,331

1.000 ppm 19,522 9,566 10,405

500 ppm 14,469 8,789 7,450

Tabel IV.4 . Hasil uji aktivitas inhibitor RNA helikase HCV

37


Data diatas menunjukkan bahwa jintan hitam berpotensi sebagai

inhibitor RNA helikase HCV. Ketiga ekstrak menunjukkan adanya aktivitas

untuk menghambat proses ATPase dari uji kolorimetri. Pada data tersebut

menyatakan bahwa dengan kenaikan konsentrasi sampel maka persentase

ekstrak sebagai inhibitor juga meningkat. Data diatas memperlihatkan dari

ketiga ekstrak, ekstrak n-heksan memiliki aktivitas yang lebih besar

dibandingkan ekstrak etil asetat maupun metanol. Persentase yang

ditunjukkan diduga menyatakan besarnya aktivitas penghambatan yang

dilakukan oleh ekstrak jintan hitam tersebut, namun untuk mengetahui

kepastian apakah masing-masing ekstrak tersebut menginhibisi atau tidak

belum adanya batas/nilai persentase yang dapat menyatakan bahwa ekstrak

tersebut dapat menginhibisi RNA helikase virus hepatitis C.

Pengujian inhibitor RNA helikase ini diilihat berdasarkan aktivitas

ATPase dalam uji kolorimetrik ATPase. Aktivitas ATPase pada enzim

helikase yang dipakai untuk n-heksan adalah sebesar 524,987 pmol

fosfat/ml/menit/pmol protein. Dengan penambahan ekstrak n-heksan pada

uji tersebut terlihat bahwa aktivitas ATPase menurun (Lampiran 19).

Pada saat pengujian sampel/masing-masing ekstrak jintan hitam

ditambahkan ke dalam satu well sebanyak 5 µl untuk masing-masing

konsentrasi. Volume akhir dalam satu well tersebut setelah penambahan

master mix adalah 50 µl. Pada konsentrasi terendah yaitu 500 ppm,

dinyatakan bahwa konsentrasi ekstrak yang berikatan dengan RNA helikase

virus hepatitis C adalah sebesar 0,05 µg/µl, untuk konsentrasi yang

berikatan pada masing-masing konsentrasi dapat dilihat pada Lampiran 16.

Ekstrak n-heksan jintan hitam ini berbentuk cairan kental seperti

cairan minyak pada umumnya. Senyawa thymoquinone merupakan senyawa

non polar yang terdapat dalam jintan hitam. Thymoquinone telah diketahui

mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (Burits M & F. Bucar, 2000).

Penelitian–penelitian sebelumnya telah memaparkan beberapa potensi dari

minyak jintan hitam ini, salah satunya telah diungkapkan oleh Salem dan

Hossain (2000) bahwa minyak jintan hitam mampu berperan sebagai agen

antivirus dari MCMV (Murine Cytomegalovirus). Penelitian ini sudah

38


dilakukan secara invivo dengan menggunakan tikus yang diberi 100 µg

BSO (black seed oil) per mencit. Dari penelitian tersebut Salem dan

Hossain menyatakan bahwa ada kemungkinan minyak jintan hitam mampu

untuk melawan kanker, AIDS dan penyakit parasit lainnya yang

berhubungan dengan kekebalan tubuh. Selain itu, Kawther, Ahmed dan

Sakina (2008) mengatakan bahwa jintan hitam memiliki potensi antivirus

terhadap Infectious Laryngotrachietis Virus (ILTV) dengan nilai EC50

sebesar 32 µM. Adanya potensi ekstrak jintan hitam sebagai inhibitor RNA

helikase HCV ini memperpanjang daftar potensi jintan hitam sebagai

antivirus.

Pengujian sampel pada uji kolorimetri ATPase, sampel dilarutkan

dengan menggunakan metanol p.a. Metanol yang secara kimia merupakan

zat denaturan enzim. Namun selama masih dalam konsentrasi kecil (5µl)

maka metanol tidak menganggu kerja ekstrak dalam menginhibisi enzim

RNA helikase HCV. Konsentrasi metanol dalam menganggu proses kerja

dapat dikontrol dengan cara menjadikan metanol sebagai kontrol negatif.

Pengujian ini tidak menggunakan kontrol positif dikarenakan belum

ditemukannya obat atau vaksin HCV yang sesuai dengan mekasisme

inhibisi RNA helikase HCV.

Hasil penapisan fitokimia didapatkan bahwa ekstrak n-heksan jintan

hitam mengandung steroid/terpenoid dan minyak atsiri. Hal ini sesuai yang

dilaporkan Erika (2010) bahwa ekstrak n-heksan jintan hitam mengandung

steroid/triterpenoid dan minyak atisiri. Dari hasil penapisan fitokimia

tersebut maka dapat diperkirakan bahwa yang berpotensi sebagai inhibitor

RNA helikase HCV adalah senyawa steroid/triterpenoid, dan minyak atsiri.

Pada penelitian sebelumnya, betulinic acid yang merupakan senyawa

dari triterpenoid diketahui mempunyai aktivitas sebagai antiviral HIV-1

(David et al, 2008). Fungus Ganoderma pfeifferi. diidentifikasi juga

mengandung senyawa triterpenoid (ganodermadiol, lucidadiol dan

applanoxidic acid) yang memperlihatkan adanya aktivitas sebagai agen

antivirus pada influenza virus type A dan herpes virus symplex-type 1

(Mothana, 2003). Pada jintan hitam, senyawa terpenoid (sabinene hydrate

39


methyl ether) mempunyai potensi sebagai antioksidan (Borgou, Pichette,

Lavoie, Marzouk & Legault, 2011). Tidak menuntut kemungkinan bahwa

senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV ini

merupakan senyawa terpenoid yang berada dalam ekstrak jintan hitam.

Ada beberapa kemungkinan mekanisme inhibisi RNA helikase.

Kemungkinan mekanisme pertama, inhibitor menempel pada RNA helikase

bukan pada sisi aktifnya, namun terjadi perubahan konformasi bentuk enzim

yang mengakibatkan berkurangnya interaksi enzim dengan substrat

(Borowski, Heising, Miranda, Liao, Choe & Baier, 2008). Mekanisme

kedua, inhibitor menyerupai substrat dan bersaing menempati sisi aktif

RNA helikase, sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim yang

menyebabkan enzim tidak memiliki energi untuk membuka untai ganda

RNA (Reece & Mitchell, 2002).


BAB 5

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

1. Melalui uji kolorimetri ATPase terhadap enzim RNA helikase HCV, ekstrak

n-heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol jintan hitam mempunyai

aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase HCV, masing-masing sebesar

64,454%, 38,804% dan 27,617% pada konsentrasi 32000 ppm

2. Berdasarkan analisis fitokimia ekstrak n-heksan jintan hitam memiliki

senyawa steroid/triterpenoid, terpenoid dan minyak atsiri yang diperkirakan

senyawa tersebut berperan sebagai inhibitor RNA helikase HCV

5.2. Saran

1. Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut terhadap ekstrak n-heksan jintan hitam

untuk mengetahui senyawa yang lebih spesifik yang berpotensi sebagai

inhibitor RNA helikase HCV.

2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan metode in vitro lainnya dan in

vivo untuk mendapatkan hasil senyawa yang benar-benar berkhasiat

menghambat aktivitas HCV.


DAFTAR REFERENSI

Abdulelah H.A.A. dan Zainal-Abidin B.A.H. 2007. In vivo Anti-Malarial Test of

Nigella sativa (Black Seed) Different Extracts. American Journal of Pharmacology and

Toxicology, Vol. 2 (2): 46-50. ISSN: 1557-4962.

Al-Ali A, Alkhawajah A.A, Rhandhawa A.R, dan Shaikh A.S. 2008. Oral and

Intraperitoneal LD50 of Thymoquinone, An Active Principle of Nigella sativa, in Mice

and Rats. Journal Ayub Medical College Abbottabad, Vol. 20 (2):25-7

Al-Jassir, M.S. 1992. Chemical Composition and Microflora of Black Cumin (Nigella

sativa, L.) seeds growing in Saudi Arabia. Department of Science and Technology.

College of Agriculture and Food Sciences. King Faisal University, Vol. 45: 239-242.

Ali O, Gamze B, dan Tugba A. 2007. Antimitotic and Antibacterial Effect of The

Nigella sativa L. Seed. Caryologia, Vol. 60 (3): 270-272.

Ayoola GA et al. 2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some

Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria. Tropical

Journal of Pharmaceutical Research. 7(3) : 1019 – 1024

BD Bioscience Clontech. 2003. BD TALON TM

Metal Affinity Resins User Manual.

Becton: Dickinson & Company. 47 hlm.

Borowski P et al. 2000. ATP-binding domain of NTPase/helicase as a target for

hepatitisC antiviral therapy. Acta Biochimica Piolica. Vol 47 173 – 180.

Borowski P et al. 2001. Inhibition of the helicase activity of HCV NTPase/helicase by 1-

b-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide-5¢-triphosphate (ribavirin-TP) Acta

Biochimica Piolica. Vol 48 No3 739-744

Borowski P, Heising V.M, Miranda B.I, Liao L.C, Choe J dan Baier A. 2008. Viral NS3

Helicase Activity Is Inhibited by peptides reproducing the Arg-Rich Conserved Motif of

the Enzyme (Motif VI). Biochemical Pharmacology 76-28-38

Bourgou S, Pichette A, Lavoie S, Marzouk B dan Legault J. 2011. Terpenoid Isolated

From Tunisian Nigella sativa L. Essential Oil with Antioxidant activity and The Ability

to Inhibit Oxide Production. Flavour and Fragrance Journal. (wileyonlinelibrary.com)

DOI 10.1002/ffj.2085

Burits M dan Bucar F. 2000. Antioxidant Activity of Nigella sativa Essential Oil.

Phylother Res, 14 : 323 - 328

42


Chan KM, Delfert D dan Junger KD. 1986. A direct Colorimetric Assay for Ca2+

Stimulated ATPase Activity. Anal Biochem 157:375 – 380

Crotty S, Cameron C dan Andino R. 2002. Ribavirin’s Antiviral Mechanism of Action:

Lethal Mutagenesis. J Mol Med 80 : 89-95

David G et al. 2008. Triterpene Based Compounds with Potent Anti-maturation Activity

Against HCV-1. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18 – 6377 - 6380

Departemen Farmakologi dan Terapetik Fakultas Kedokteran Universias Indonesia.

2007. Farmakologi dan Terapi Ed 5. UI Press : Jakarta.

Departemen Kesehatan RI Direktorat Jendral Pengawaan Obat dan Makanan Direktorat

Pengawasan Obat Tradisional. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat.

Departemen Kesehatan RI Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan

Direktorat Pengawasan Obat tradisional. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak

Tumbuhan Obat. Jakarta : Departemen Kesehatan.

Gawsronski JD dan Benson DR. 2004. Microtiter assay for gluthamine synthetase

biosintetic activity using inorganic phosphate detection. Anal Biochem 327 : 114 – 118

Gilani H. Anwar, Jabeen Q., Khan M. Usad. 2004. A Review of Medicinal Uses and

Pharmacological Activities of Nigella sativa. Pakistan Journal od Biological Sciences 7

(4)

Hasnah M. Sirat, Norazah B, dan Err M.F. 2001. Analisis Biji Jintan Hitam (Nigell

sativa). Malaysian Journal of Analytical Science Vol 7 No.1-245-248

Indrayani L, Soetjipto H dan Sihasale L. 2006. Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas

Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang

Artemia salina Leach (SKRIPSI). Berk Penel Hayati : 12 (57-61)

Ismet Samira Meutia et all. 2007. Penapisan Senyawa Biuaktif Spons Aaptos aaptos

dan Petrosia sp. Dari Lokasi yang Berbeda. Prosiding Konferensi Sains Kelautan dan

Ferikanan Indonesia I : IPB Dramaga

Juniarti, Osmeli D dan Yuhernita. 2009. Kandungan Senyawa Kimia, Uji Toksisitas

(Brine shrimp Lethality Test) dan Antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) dari

Ekstrak Daun Saga (Abrus precatorius). MAKARA SAINS. Vol 13 (50 – 54)

Kadare G dan Haenni A. 1997. Virus Encoded RNA Helicase. Journal of Virology p

2583-2590

Kawther S. Zaher, W.M Ahmed dan Sakina N. Zerizer. 2008. Observations on The

Biological Effect of Black Cumin Seed (Nigella sativa) and Green Tea (Camellia

sinensis). Global Veterinaria 2(4) : 198-204

43


Kusumawati I. 2011. Isolasi dan Identifikasi Pendahuluan Bahan Bioaktif sebagai

Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Ekstrak Metanol Buah Tanaman

Mangrove Avicennia marina (Forsk) Vierb (SKRIPSI). Depok : Universitas Pancasila

Krekulova L, Rehak V dan Riley L.W.2006. Structur and Function of Hepatitis C

Proteins : 15 Years After.Folia Microbiol. 51(6), 665-680

Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida dan Alkaloid. Sumut : USU

Respository.

Leyssen P, Balzarini, Clercq D. Erik dan Neyts J. 2005. The Predominant Mechanism

by Which Ribavirin Exerts Its Antiviral Activity In Vitro against Flaviviruses and

Paramyxoviruses Is Mediated by Inhibition of IMP Dehydrogenase. Journal of Virology

Vol 79 No. 3.1943-1947

Magadula J. Joseph dan Tewtrakul Supinya. 2010. Anti-HIV-1 Protease Activites of

Crude Extracts of Some Garcinia Species Growing in Tanzania. African Journal of

Biotechnology Vol 9(12) pp 1848-1852

Malhotra S.K. 2004. Chapter 13 : Nigella. National Research Centre of Seed Spices.

Edited by K.V. Peter. USA : Woodhead Publishing Ltd.

Materi Medika Jilid III. 1979. Departemen Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta.

Monthana RA et al. 2003. Antiviral Lanostanoid Triterpenes The Fungus Ganoderma

pfeifferi. Fitoterapia 74(1-2):177-80

Musa D, Nihat D, Hatice G, Gulruh U, dan Muharrem B. 2004. Antitumor Activity of An

Ethanol Extract of Nigella sativa Seeds. Biologia, Bratislava. Vol 59 (6): 735-740.

Paturohman M. 2011. Optimasi Pemurnian Protein Kapang Endofit CgKTm SF sebagai

Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C (SKRIPSI). Institut Pertanian Bogor : Bogor.

Pelzar MJ dan Chan ECS. 1988. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Hadietomo et al.,

penerjemah. Jakarta : UI Pr. Terjemahan dari: Element of Microbiology

Plantamor 2008 http://www.plantamor.com/index.php?plant=902 diakses tanggal 9 april

2012

Prashant T, Bimlesh K, Mandeep K, Gurpreet K dan Harleen K. 2011. Phytochemical

Screening and Extraction : Review. Internationale Pharmaceutical Sciencia An

International Riewed Peer Journal. Vol 1 Issue 1

Pratiwi, S.T. 2005. Pengujian Cemaran Bakteri dan Cemaran Kapang/Khamir Pada

Produk Jamu Gendong di Daerah Istimewa Yogyakarta (SKRIPSI). Pharmacon. Vol.6.

No 1 (Juni 2005) : 12 – 14

http://www.plantamor.com/index.php?plant=902

44


Putri P.H. 2011a. Isolasi dan Pemurnian Bahan Aktif dari Mikroalga BTM 11 sebagai

Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C (SKRIPSI). Institut Pertanian Bogor : Bogor

Putri S.F. 2011b. Isolasi dan Purifikasi Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari

Bakteriosin Bskteri Asam Laktat (SKRIPSI). Institut Pertanian Bogor : Bogor

Rhandawa M. Akram. 2008. Black Seed, Nigella sativa, Deserves More Ettention. J.

Ayub Med Coll Abbottabad 20-(2)

Rusdi. 1990. Tumbuhan sebagai Sumber Bahan Obat. Padang : Pusat Penelitian

Universitas Andalas

Salem L. Moh & Hossain M. Soharab. 2000. Protective effect of Black Seed Oil from

Nigella sativa against Murine Cytomegalovirus Infection. International Journal of

Immunopharmacology Vol 22 729-740

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring

Harbor Laboratory Press New York.

Savitri, E.S. 2008. Rahasia Tumbuhan Berkhasiat Obat Perspektif Islam. Malang: UIN

Press.

Schawen MD dan Melling J. 1985. Handbook of Enzyme Biotechnology. Alan

Wiseman, editor. West Sussex: Ellis Horword Ltd.

Setianingsih D. 2011. Isolasi dan Identifikasi Awal Senyawa Aktif dari Ekstrak

Rimpang Temulawak (Curcuma zanthorrhiza Roxb.) sebagai Inhibitor RNA Helikase

Virus Hepatitis C (SKRIPSI).Univerisitas Pancasila: Depok

Tellinghuisen TL, Evans MJ, Hahn T, You S, dan Rice CM. 2007. Studying hepatitis C

virus: making the best of a bad virus. J. Virology 81(17): 8853-8867.

Utama A et al. 2000. Identification and characterization of the RNA Helicase activity of

Japanese echepalitis virus NS3 protein.FEBS Letters 465 74-78

Vanz, et al. 2008 Human granulocyte colony stimulating factor (Hg-CSF): cloning,

overexpresion, purificarion, and characterization. Microbial Cell Factories 7:13 – 15

Volker B, Moradpour D dan Blum E.Hubert. 2006. Molecular Virology of Hepatitis C

Virus (HCV):2006 Update. International Journal of Medicinal Science. Vol 3 29-34

Worman J. Howard M.D. 2002. The Hepatitis C Sourcebook. McGraw-Hill Companies

: United States

Yuliani, D. 2010. Kajian Aktivitas Antioksidan Fraksi Etanol Jintan Hitam (Nigella

sativa L.) (SKRIPSI). Malang : Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim

45

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

LAMPIRAN

45


Lampiran 1. Sertifikat determinasi biji jintan hitam

46


Lampiran 2. Kerangka kerja

Uji aktivitas inhibisi

ekstrak kental jintan hitam

terhadap enzim RNA

helikase HCV dengan

kolorimetri ATPase

Biji kering Jintan

Hitam

Simplisia kering

Jintan Hitam

Ekstrak Kental

Jintan Hitam

Skrining Fitokimia

% INHIBISI

Ekstraksi jintan

hitam dengan n-

Heksan (Maserasi)

Hasil residu

dimaserasi kembali

dengan etil asetat

(Maserasi)

Hasil residu

diekstraksi kembali

dengan metanol

(Maserasi)

Ekstrak Kental

Jintan Hitam

Ekstrak Kental

Jintan Hitam

Produksi dan purifikasi

enzim RNA Helikase

HCV

Uji aktivitas enzim

RNA Helikase HCV

47


Lampiran 3. Ekstraksi biji jintan hitam

Skrining Fitokimia

Ekstrak kental

Biji kering jintan

hitam disortir

dari pengotor

Blender hingga

didapatkan

simplisia halus

Maserasi dengan pelarut n-heksan

(penggantian pelarut dilakukan

setiap 3 hari sekali atau sampai

bening)

Hasil residu dimaserasi kembali

dengan etil asetat



bening)

Hasil residu dimaserasi kembali

dengan metanol



bening)

Masing-masing filtrat

dievaporasi dengan

menggunakan rotary

evaporator sehingga

didapatkan ekstrak

kental

48


Lampiran 4. Produksi dan purifikasi RNA helikase HCV

Kultur E.coli BL21(DE3)pLySs yang mengandung pET-21b/HCV RNA helikase

dalam media LB

Induksi IPTG

Koleksi pelet pada suhu -20 °C

Freeze-thawing

Sonikasi

Fraksi terlarut

Afinitas kromatografi

RNA helikase HCV terpurifikasi

Uji Aktivitas Enzim dengan Kolorimetri ATPase

Konfirmasi Protein dengan SDS-PAGE

Sentrifugasi

Sentrifugasi

(+) Buffer B

49


Lampiran 5. SDS-PAGE

Preparasi gel (separating & stacking)

Sampel + loading dye

Destain for commasie blue

Commasie blue Staining

Denaturasi

Running SDS-PAGE

Hasil

50


Lampiran 6. Komposisi larutan-larutan yang digunakan dalam SDS-PAGE

Medium dan larutan-larutan Bahan-bahan

a Larutan separating 8% H2O 7,25 ml

1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4%

SDS 3,75 ml

30% Akrilamid 4 ml

10% Amonium Persulfat 0,05 ml

TEMED 0,015 ml

b Larutan stacking 3,9% H2O 3,05 ml

0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4%

SDS 1,25 ml

30% Akrilamid 0,65 ml

10% Amonium Persulfat 0,025 ml

TEMED 0,005 ml

c Dapar sampel SDS 2X (Loading Dye) 4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 ml

Gliserol 20 ml

SDS 4 g

β- mercaptoethanol (2-ME) 2 ml

Bromphenol blue 1 mg

H2O sampai 100 ml

d Commasie Blue G-250 Staining

Solution (500 ml) 45% H2O 225 ml

45% Metanol 225 ml

10% Asam asetat glacial 50 ml

0,05% Commasie brilliant blue 250 mg

e Commasie Blue G-250 Destaining

Solution (1000 ml) 50% H2O 500 ml

10% Asam asetat glacial 100 ml

40% Metanol 400 ml

51


Lampiran 7. Uji aktivitas RNA helikase HCV

* 0,1 M MOPS pH 6,5; 1 mM ATP; 1 mM MgCl2

** Enzim dibuat dengan berbagai pengenceran yaitu 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x

*** H2O : 0,081% malachit green : 2,3% polyvinylalcohol : 5,7% ammonium molibdate = 2 : 2 :

1 : 1

Reaction mixture* + 5 µl Enzim** (50 µl/well)

Inkubasi selama 45 menit pada suhu ruang

Tambahkan 100 µl dye solution***


Tambahkan 25 µl Na-sitrat

Pengukuran pada panjang gelombang 620 dan 405 nm dengan menggunakan microplate reader (multiscan EX)

52


Lampiran 8. Uji aktivitas inhibisi jintan hitam

* 0,1 M MOPS pH 6,5; 1 mM ATP; 1 mM MgCl2; 5 µl RNA helikase

** Ekstrak jintan hitam dibuat dengan berbagai konsentrasi yaitu 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000,

32000ppm

*** H2O : 0,081% malachit green : 2,3% polyvinylalcohol : 5,7% ammonium molibdate = 2 : 2 :

1 : 1

Reaction mixture* + 5 µl Ekstrak Jintan Hitam** (50 µl/well)


Tambahkan 100 µl dye solution***


Tambahkan 25 µl Na-sitrat

Pengukuran pada panjang gelombang 620 dan 405 nm dengan menggunakan microplate reader (multiscan EX)

53


Lampiran 9. Rendemen ekstrak

Rumus perhitungan rendemen :

1. Ekstraksi dengan pelarut n-heksan

2. Ekstraksi dengan pelarut etil asetat

3. Ekstraksi dengan pelarut metanol

54


Lampiran 10. Pembuatan larutan uji

Pembuatan larutan ini dilakukan terhadap masing – masing ekstrak.

Pembuatan larutan dilakukan terhadap beberapa konsentrasi dengan larutan baku

100.000 ppm, yaitu :

Rumus Pengenceran.

N1 x V1 = N2 x V2

Dimana :

N1 = Konsentrasi larutan stock

V1 = Volume yang diambil dari larutan stock

N2 = Konsentrasi larutan yang akan dibuat

V2 = Volume larutan yang akan dibuat

1. Pembuatan larutan dengan konsentrasi 32.000 ppm (32mg/ml)

100.000 x V1 = 32.000 x 1.000 µl

100.000V1 = 32.000.000

V1 = 320 µl


32.000 x V1 = 16.000 x 1.000 µl

32.000V1 = 16.000.000

V1 = 500 µl


16.000 x V1 = 8.000 x 1.000 µl

16.000V1 = 8.000.000

V1 = 500 µl


8.000 x V1 = 4.000 x 1.000 µl

8.000V1 = 4.000.000

V1 = 500 µl

55



4.000 x V1 = 2.000 x 1.000 µl

4.000V1 = 2.000.000

V1 = 500 µl


2.000 x V1 = 1.000 x 1.000 µl

2.000V1 = 1.000.000

V1 = 500 µl

7. Pembuatan larutan dengan konsentrasi 500 ppm (0,5mg/ml)

1.000 x V1 = 500 x 1.000 µl

1.000V1 = 500.000

V1 = 500 µl

56


Lampiran 11. Penapisan fitokimia

1. STEROID / TRITERPENOID

2. TERPENOID

3. SAPONIN

Ekstrak n-heksan (-) Ekstrak Etil asetat (++) Ekstrak metanol (+)

Ekstrak n-heksan

jintan hitam (+)

Ekstrak etil asetat

jintan hitam (-)

Ekstrak metanol

jintan hitam (-)

Ekstrak n-heksan

jintan hitam (+)

Ekstrak etil asetat

jintan hitam (-)

Ekstrak metanol

jintan hitam (-)

57


4. KUMARIN

5. FLAVONOID

Ekstrak n-heksan (-) Ekstrak etil asetat (+) Ekstrak metanol (-)

Ekstrak n-heksan (-)

Ekstrak etil asetat (+)

58


6. ALKALOID

Ekstrak n-heksan jintan

hitam (-)

Ekstrak etil asetat jintan

hitam (-)

Ekstrak metanol jintan

hitam (+)

Ekstrak metanol (-)

59


Lampiran 12. Perhitungan susut pengeringan dan kadar abu

1. Perhitungan Susut Pengeringan

Perhitungan susut pengeringan ekstrak n-Heksan

= 1,0707 -1,0312 x 100 % = 3,6891 %

1,0707

Perhitungan susut pengeringan ekstrak etil asetat

= 1,0672 – 1,056 x 100 % = 1,0494 %

1,0672

Perhitungan susut pengeringan ekstrak metanol

= 1,109 – 1,0707 x 100 % = 3,4535 %

1,109

2. Perhitungan Kadar Abu

Ket.

W = berat cawan kosong (gram)

W1 = berat cawan + sampel uji (gram)

W2 = berat cawan + abu (gram)

Perhitungan kadar abu ekstrak n-Heksan

= 25,5453 – 25,5388 x 100 % = 0,3143 %

27,6064 – 25,5388

60


Perhitungan kadar abu ekstrak etil asetat

= 25,0055 – 25,0010 x 100 % = 0,2245 %

27,0047 – 25,0010

Perhitungan kadar abu ekstrak metanol

= 24,4600 – 24,4569 x 100 % = 0,147 %

26,565 – 24,4569

61


Lampiran 13. Data aktivitas inhibisi jintan hitam terhadap RNA helikase HCV

Absorbansi

(tanpa inhibitor)

Sampel Absorbansi

(dengan inhibitor)

%inhibisi

Enzim 1,115 Kontrol negatif 1,036 7,025

n-heksan 32.000ppm 0,318 64,454

16.000ppm 0,361 60.597

8.000ppm 0,446 52,914

4.000ppm 0,663 33,512

2.000ppm 0,789 22,152

1.000ppm 0,819 19,521

500ppm 0,875 14,469


Etil

asetat

32.000ppm 0,604 38,804

16.000ppm 0,66 33.781

8.000ppm 0,709 29,327

4.000ppm 0,795 21,674

2.000ppm 0,903 11,958

1.000ppm 0,930 9,566

500ppm 0,938 8,789


Metanol 32.000ppm 0,676 27,617

16.000ppm 0,735 21,933

8.000ppm 0,766 18,914

4.000ppm 0,796 16,056

2.000ppm 0,834 12,331

1.000ppm 0,854 10,404

500ppm 0,885 7,450

62


Lampiran 14. Perhitungan persen inhibisi

Rumus :

%Inhibisi = A – I x 100 %

A

Keterangan :

A = Absorbansi RNA helikase rata-rata tanpa penambahan sampel

I = Absorbansi RNA helikase rata-rata dengan penambahan sampel

Contoh perhitungan pada ekstrak n-heksan jintan hitam konsentarsi 32000 ppm

A = 1,115

I = 0,318

%Inhibisi = 1,115 – 0,318 x 100%

1,115

= 71,48 %

Absorbansi aktivitas inhibisi dikurangi dengan kontrol negatif

= 71,48 % - 7,025 %

= 64,454%

63


0

10

20

30

40

50

60

70

Per

sen

In

hib

isi

Konsentrasi sampel (ppm)

AKTIVITAS INHIBITOR RNA HELIKASE HCV

Ekstrak N-Heksan

Ekstrak Etil Asetat

Ekstrak Metanol

Lampiran 15. Kurva aktivitas ekstrak jintan hitam sebagai inhibitor RNA helikase

HCV

64


Lampiran 16. Perhitungan konsentrasi ekstrak dalam satu well

Volume ekstrak yang ditambahkan ke dalam well = 5 µl

Volume master mix yang ditambahkan ke dalam well = 45 µl

Volume akhir dalam satu well = 50 µl

1. Untuk ekstrak dengan konsentrasi 32000 ppm

32000 ppm = 32000 µg/ml

= 32000 µg/ 1000 µl

= 32 µg/µl

Konsentrasi ekstrak dalam 1 well

= 160 µg/50µl

= 3,2 µg/µl

= 3200 µg/ml


16000 ppm = 16000 µg/ml

= 16000 µg/1000 µl

= 16 µg/µl


= 80 µg/50 µl

= 1,6 µg/µl

= 1600 µg/ml


8000 ppm = 8000 µg/ml

= 8000 µg/1000 µl

= 8 µg/µl


= 40 µg/50 µl

= 0,8 µg/µl

= 800 µg/ml


4000 ppm = 4000 µg/ml

= 4000 µg/1000 µl

= 4 µg/µl

65



= 20 µg/50 µl

= 0,4 µg/µl

= 400 µg/µl


2000 ppm = 2000 µg/ml

= 2000 µg/1000 µl

= 2 µg/µl


= 10 µg/50 µl

= 0,2 µg/µl

= 200 µg/ml

6. Untuk konsentrasi ekstrak 1000 ppm

1000 ppm = 1000 µg/ml

= 1000 µg/1000 µl

= 1 µg/µl


= 5 µg/50 µl

= 0,1 µg/µl

= 100 µg/ml

7. Untuk konsentrasi ekstrak 500 ppm

500 ppm = 500 µg/ml

= 500 µg/1000 µl

= 0,5 µg/µl


= 2,5 µg/50 µl

= 0,05 µg/µl

= 50 µg/ml

66


Lampiran 17. Kurva Standar K2HPO4

Konsentrasi K2HPO4

(mM)

Absorbasi 620 nm

dengan referensi 405 nm

0.0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.000

0.102

0.239

0.417

0.622

0.834

1.022

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Ab

s 6

20/4

05 n

m

[K2HPO4] (mM)

67


Lampiran 18. Contoh perhitungan aktivitas ATPase RNA helikase HCV

Diketahui :

y = 1,0207x + 0,0103

Konsentrasi sampel = sampel didilusi 40x

Masa inkubasi = 45 menit

1 well terdapat 5 µl enzim RNA helikase

Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/µl

1 pmol = 0,05 µg

Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab :

y = 1,0207x + 0,0103

1,115 = 1,0207x + 0,0103

x = 1,082 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,082 mM fosfat x 40

= 43,28 x 10-6

mol fosfat/ml

Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit = 43,28 x 10-6

mol fosfat/ml

45

= 0,961 x 10-6

mol fosfat/ml/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µl x 5 µl

= 91,6 µg = 1832 pmol protein

Aktivitas enzim RNA helikase = 0,961 x 106 pmol fosfat/ml/menit

1832

= 524,987 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein

68


Lampiran 19. Kurva aktivitas ATPase RNA helikase HCV setelah penambahan

sampel

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500 1000 2000 4000 8000 16000 32000

Ak

tiv

ita

s A

TP

ase

(pm

ol

fosf

at/

ml/

men

it/p

mo

l p

rote

in)

Axis Title

Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV

ekstrak n-heksan

ekstrak etil asetat

ekstrak metanol

470

480

490

500

510

520

530

Enzim 1 Enzim 2 Enzim 3

RNA Helikase

RNA Helikase

69


Lampiran 20. Gambar Alat dan Bahan Penelitian

Gambar Alat Penelitian

Multiscan EX reader

Shaker incubator

Sonikator

Sentrifuge

SDS-Page Vortex

Rotari Evaporator

Micropipipet

Hot plate

70


Biji Jintan Hitam

Ekstrak n-heksan

Ekstrak Metanol Ekstrak n-heksan

Gambar Bahan Penelitian

Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Uji Aktivitas …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/25955/1/NUR... · maupun vaksin yang effektif untuk hepatitis C. Penemuan ... heksan