1

Translacija

SADRŽAJ

TRANSLACIJA ....................................... ................................................................................................ 1

TRANSPORTNE RNK .............................................................................................................................. 2 Primarna struktura tRNK .................................................................................................................. 2 Sekundarna struktura tRNK ............................................................................................................. 3 Tercijarna struktura tRNK ................................................................................................................. 5 Aktivacija aminokiselina ................................................................................................................... 5 Interakcija kodonantikodon ........................................................................................................... 8

RIBOZOMI .............................................................................................................................................. 9 Komponente ribozoma ..................................................................................................................... 9 Ribozomske RNK ........................................................................................................................... 10 Ribozomski proteini ........................................................................................................................ 12 Funkcionalni centri ribozoma ......................................................................................................... 14 Biogeneza ribozoma....................................................................................................................... 16

MEHANIZAM TRANSLACIJE .................................................................................................................... 19 Opšti pregled translacije ................................................................................................................. 19 Inicijacija translacije kod prokariota ................................................................................................ 20 Inicijacija translacije kod eukariota ................................................................................................. 24 Elongacija translacije...................................................................................................................... 27 Terminacija translacije.................................................................................................................... 31

SAVIJANJE PROTEINA U NATIVNU KONFORMACIJU .................................................................................. 32 POSTTRANSLACIONE MODIFIKACIJE PROTEINA ...................................................................................... 33 REGULACIJA EKSPRESIJE GENA NA NIVOU TRANSLACIJE ........................................................................ 34

Regulacija brzine translacije .......................................................................................................... 34 Kontrola degradacije iRNK ............................................................................................................. 36

INHIBITORI SINTEZE PROTEINA ............................................................................................................... 36 TAČNOST TRANSLACIJE ........................................................................................................................ 37

Translacija je proces u kome se genetička informacija sadržana u redosledu nukleotida

u iRNK prevodi u linearni redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu. Translacija ili sinteza proteina u ćeliji je kompleksan proces koji se odvija u nekoliko faza, uz učešće složenog ćelijskog aparata za translaciju čije su komponente: tRNK, ribozomi, iRNK i veliki broj enzima.

Kada se uzme u obzir da su proteini realizatori genetičkih informacija od čije strukture i funkcije zavisi odvijanje svih vitalnih procesa u ćeliji, jasno je da je upoznavanje molekulske osnove njihove biosinteze jedan od najvažnijih zadataka biohemije i molekularne biologije. Kada se kaže molekulska osnova biosinteze proteina, misli se na mehanizme svih reakcija koje su u taj proces uključene, na strukturu i ulogu svih makromolekula koji u njima učestvuju, kao i na brojne interakcije makromolekula koje imaju izuzetan funkcionalni značaj. Naime, u toku translacije dolazi do specifičnog prepoznavanja izmeñu iRNK i tRNK, iRNK i rRNK, tRNK i rRNK, RNK i proteina, kao i izmeñu različitih molekula proteina. Detaljno upoznavanje molekulske osnove procesa biosinteze proteina, kao jednog od vitalnih procesa koji su konzervisani u toku evolucije, doprineće da se rasvetle mnogi biološki fenomeni, a pored ostalog i najraniji dogañaji koji su doveli do pojave života na Zemlji, kao i najranije faze

2

biološke evolucije. U ovom poglavlju počećemo od upoznavanja tRNK i ribozoma kao komponenti ćelijske “translacione mašinerije”, da bismo na kraju razmotrili mehanizam ovog složenog procesa.

Transportne RNK

U toku procesa translacije nikada ne dolazi do direktne interakcije izmeñu kodona u iRNK i odgovarajućih aminokiselina. Prepoznavanje kodona od strane odgovarajuće aminokiseline ostvaruje se posredstvom adapterskog molekula koji se jednim krajem vezuje za kodon, a drugim za odgovarajuću aminokiselinu. Ulogu adapterskih molekula imaju transportne RNK (tRNK) . One su uključene u niz interakcija u toku procesa translacije: intereaguju sa odreñenim mestima na ribozomu, sa aminokiselinama, enzimima aminoacil-tRNK sintetazama, iRNK, kao i sa faktorima inicijacije i elongacije translacije. Sve tRNK odlikuju se zajedničkom, specifičnom trodimenzionalnom strukturom koja je takva da im omogućuje da ostvare sve ove funkcije. Iako su sve tRNK prostorno organizovane na vrlo sličan način, izmeñu pojedinih tRNK ipak postoje male, ali značajne razlike u strukturi koje odreñuju specifičnost pojedinih tRNK prema odreñenim aminokiselinama. Sve tRNK koje pokazuju specifičnost prema jednoj aminokiselini nazivaju se izoakceptorske tRNK . Vezivanje aminokiselina za odgovarajuće tRNK katalizuju enzimi aminoacil-tRNK sintetaze. Kompletan set tRNK u ćeliji može se podeliti u 20 izoakceptorskih grupa i za svaku od njih postoji specifična aminoacil-tRNK sintetaza.

Primarna struktura tRNK

Transportne RNK sadrže 75−95 nukleotida, a njihov sedimentacioni koeficijent iznosi 4S1. Kada je ispitana primarna struktura većeg broja tRNK konstatovano je da se na nekim mestima u polinukleotidnom lancu u 90−95% slučajeva nalazi ista baza. Te pozicije su označene kao nepromenljive. Nañeno je, takoñe, da se na nekim položajima, koji su označeni kao polupromenljivi, uvek nalazi purinski, odnosno pirimidinski nukleotid. Transportne RNK su jedinstvene meñu ostalim RNK i po tome što sadrže tzv. neobi čne tj. modifikovane baze . One nastaju enzimskom modifikacijom uobičajenih baza (A, G, U, C) posle njihovog ugrañivanja u polinukleotidni lanac. Modifikovane baze nalaze se i u drugim RNK, posebno rRNK, ali se modifikacije baza u njima najčešće sastoje od metilacije. U slučaju tRNK postoji čitav niz različitih modifikacija, od metilacije pa do potpunog restrukturiranja purinskog prstena (slika 1). Pored modifikovanih baza, u tRNK se često mogu naći i metil grupe na 2’-O atomu riboza. Smatra se da ove promene u primarnoj strukturi obezbeñuju strukturnu raznolikost tRNK i mogu biti važne za njihove funkcije.

1 Sedimentacioni koeficijent (s) je veličina proporcionalna brzini sedimentacije molekula u gustinskom gradijentu, te se uzima kao mera za veličinu molekula. Jedinica kojom se ova veličina izražava je 1 Svedberg (S) koji iznosi 10-13sec. Radi poreñenja, sedimentacioni koeficijenti se obično preračunavaju na vrednost koja bi se dobila na temperaturi od 20°C i u rastvaraču čija gustina i viskozitet odgovaraju vodi. Tada se sedimentacioni koeficijent označava sa s20,w.

3

HN

O

N

NH CH3

riboza riboza

CHNH

N

2 CH

Inozin

riboza

N

HN

O

O

CH3

N

HN

O

O

riboza

H

HHH

riboza

N

HN

O

O

NH

riboza riboza

S

Ribotimidin Dihidrouridin Pseudouridin Tiouridin

O

HN

N

CH3

riboza

3-metilcitidin

N

NO

NH

5-metilcitidin

N

NO

NH2

CH3

riboza

N

NN

N

N

N

N

N

N

N

NN

N

N

N

CCH

CH

3

3

O

6-Metiladenozin 6-Izopenteniladenozin

3

7-Metilguanozin Kjuozin

CH

NH

COOCH

COOCH

3

3

O

riboza

N N

NN

N

CH

CH

CH2

2

3

O

riboza

N N

NHN

H2N

CH 2

NH

OH

OH

O

+N

N N

N

H2N

CH

riboza

-

CH3

Viozin

Slika 1. Modifikovane baze u tRNK

Do sada je nañeno preko 50 različito modifikovanih nukleotida u raznim tRNK. Reakcije modifikacija baza katalizuju specifični enzimi, a dogañaju se u različitim fazama sazrevanja tRNK. Prisustvo nekih modifikovanih baza na odreñenim pozicijama u lancu tRNK je nepromenljiva karakteristika njihove primarne strukture. Npr. kod svih tRNK se na odreñenom mestu nalazi triplet TψC (ψ = pseudouridin, pseudoU), a na 3’-kraju antikodona modifikovani purin. Neke modifikovane baze karakteristične su, meñutim, samo za neke tRNK ili pojedine izoakceptorske grupe.

4

Sekundarna struktura tRNK

Na osnovu redosleda nukleotida u većem broju ispitanih tRNK moglo se zaključiti da sve tRNK imaju istu sekundarnu strukturu koja se može prikazati modelom trolisne deteline (slika 2). Sekundarna struktura tRNK održava se H-vezama izmeñu komplementarnih baza koje pripadaju istom polinukleotidnom lancu. Na osnovu primarne strukture većeg broja različitih tRNK, i podataka o evolutivnoj očuvanosti pojedinih pozicija, bilo je moguće pretpostaviti koji se nukleotidi u lancu tRNK meñusobno sparuju, pa se došlo do toga da je raspored H-veza u svim ispitanim tRNK takav da molekul podseća na list deteline. Četiri kratka segmenta molekula imaju oblik dvolančane A-zavojnice, tako da molekul sadrži četiri kraka, a u okviru tri od njih po jedan dvolančani segment (tzv. stablo) i jednolančanu petlju.

Slika 2. Sekundarna struktura tRNK

Akceptorski krak je jedini krak koji ne sadrži petlju. Sastoji se od 6 komplementarnih parova baza i nesparenog, jednolančanog niza od 4 nukleotida na samom 3’-kraju lanca. Na ovom kraju svake tRNK nalazi se triplet 5’-CCA-3’ za koji se vezuje aminokiselina. Triplet CCA dodaje se na 3’-kraj posle transkripcije tj. sinteze tRNK, delovanjem enzima nukleotidil transferaze.

5

T krak (ili T ψψψψC krak) sadrži spiralizovani deo od 5 bp i petlju od 7 nukleotida, meñu kojima se nalazi triplet TψC po kome je ovaj krak i dobio ime.

Antikodonski krak sadrži stablo od 5 parova nukleotida i petlju od 7 nukleotida u čijoj se sredini nalazi antikodon, tj. triplet nukleotida komplementaran kodonu u iRNK.

D krak (ili dihidrouridinski krak) sadrži dvolančani segment od 3−4 bp i petlju od 8−12 nukleotida meñu kojima se nalazi dihidrouridin po kome krak nosi ime.

Dužine tRNK variraju od 75 do 95 nukleotida, a varijacije potiču od razlika u dužini D petlje i tzv. promenljive petlje koja se nalazi izmeñu TψC i antikodonskog kraka. Kod većine tRNK ove petlje sadrže samo 3−5 nukleotida, a ponekad i 20-ak.

Tercijarna struktura tRNK

Za ispitivanje tercijarne strukture tRNK bilo je neophodno dobiti čistu tRNK u kristalnom stanju i ispitati je rendgenskom kristalografijom. Prva ispitana tRNK bila je tRNK za fenilalanin (tRNKPhe2) iz kvasca. Spiralizovani delovi sekundarne strukture održavaju se i u tercijarnoj strukturi, a rasporeñeni su tako da formiraju dve zavojnice koje stoje pod pravim uglom: akceptorski i TψC kraci formiraju jednu, a antikodonski i D krak drugu. Tako, molekul tRNK ima prostorni oblik koji podseća na latinično slovo L, u kome pregib čine petlje TψC i D krakova (slika 3). Deo akceptorskog kraka za koji se vezuje aminokiselina i antikodon nalaze se na suprotnim krajevima molekula. Različite tRNK razlikuju se po veličini ugla izmeñu dva kraka slova L i po još nekim detaljima tercijarne strukture.

Tercijarnu strukturu održavaju H-veze izmeñu baza koje nisu sparene u sekundarnoj strukturi i koje često formiraju nestandardne bazne parove. H-veze koje održavaju sekundarnu strukturu označene su kao sekundarne , a one koje održavaju tercijarnu strukturu, kao tercijarne H-veze . Tercijarne H-veze uglavnom se formiraju izmeñu nepromenljivih ili polupromenljivih baza, što znači da je oblik molekula zajednički za sve tRNK. Najveći broj tercijarnih H-veza formira se u predelu TψC i D petlji. Pretpostavlja se da je tercijarna struktura u rastvoru i u prisustvu proteina podložna promenama, i da fleksibilnost molekula tRNK u velikoj meri utiče na njegovu funkciju.

Slika 3. Tercijarna struktura tRNK

2 Po konvenciji, tRNK specifične za pojedine aminokiseline označavaju se tako što se data aminokiselina piše u indeksu. Npr. tRNKPhe označava tRNK koja specifično vezuje fenilalanin.

6

Aktivacija aminokiselina

Transportne RNK su ključni molekuli u procesu translacije. Dve važne uloge ovih molekula u translaciji su: da omoguće aktivaciju aminokiselina i da obezbede njihovo ugrañivanje u polipeptidni lanac redosledom koji je odreñen redosledom kodona u iRNK (slika 4).

Aminokiseline se pre polimerizacije u polipeptidni lanac vezuju svojim COOH krajem za 3’-kraj tRNK i time se aktiviraju, tj. zadobijaju energiju koja će potom biti upotrebljena za formiranje peptidne veze. Ustvari, svaka aminokiselina donosi sa sobom aktivacionu energiju koja će se upotrebiti za vezivanje sledeće u polipeptidni lanac. Proces aktivacije je neophodan preduslov za sintezu proteina, jer se neaktivirane aminokiseline ne mogu ugraditi u polipeptidni lanac, s obzirom da je formiranje peptidne veze praćeno utroškom energije. Kao što je već rečeno, enzimi koji katalizuju aktivaciju aminokiselina su aminoacil-tRNK sintetaze. Svaka aminoacil-tRNK sintetaza prepoznaje samo jednu aminokiselinu i sve tRNK koje toj aminokiselini odgovaraju (izoakceptorske tRNK). Reakcija vezivanja aminokiseline za tRNK odvija se u aktivnom centru enzima, u dve faze (slika 4-1). U prvoj fazi ovog procesa enzim katalizuje vezivanje COOH grupe aminokiseline za AMP nastao pirofosfatnom hidrolizom ATP-a. U drugoj fazi, AMP se oslobaña, a COOH grupa aminokiseline se prenosi na OH grupu riboze adeninskog nukleotida na 3’-kraju tRNK, tako da nastaje kompleks aminoacil-tRNK u kome je aminokiselina vezana za 3’-kraj tRNK aktiviranom estarskom vezom.

Slika 4. Aktivacija aminokiselina

Biohemijskim i genetičkim eksperimentima nesumnjivo je dokazano da upravo tRNK odreñuju mesto svake pojedinačne aminokiseline u polipeptidnom lancu (slika 4-2) i da ribozomi u tom procesu “slepo” prihvataju svaki kompleks aminoacil-tRNK koji se ispravno vezuje za antikodon. U biohemijskim eksperimentima, aminokiseline su posle vezivanja za odgovarajuće tRNK hemijski modifikovane u druge aminokiseline. Na primer, posle vezivanja za “svoju” tRNK (tRNKCys) cistein se može konvertovati u alanin. Kada je takav „hibridni” kompleks, u kome je alanin vezan za tRNKCys, upotrebljen u in vitro sistemu za sintezu proteina, na svakom kodonu za cistein, u polipeptidni lanac se ugradio alanin. U genetičkim eksperimentima je pokazano da tRNK sa mutacijom u antikodonu uvek ugrañuje aminokiselinu na pogrešan kodon. Prema tome, ispravno “čitanje” genetičke informacije za vreme translacije (tačnost translacije) zavisi u velikoj meri od mehanizama koji obezbeñuju da se svaka aminokiselina veže za sebi odgovarajuću tRNK.

7

Naravno, postavlja se pitanje na koji način enzimi prepoznaju i vezuju svaku aminokiselinu za njoj odgovarajuću tRNK, odnosno kakav je mehanizam ovog diskriminatornog procesa? Ovo pitanje je utoliko interesantnije, ukoliko se ima u vidu da su aminokiseline mali molekuli i da su neke od njih meñusobno veoma slične po strukturi. Pretpostavlja se da se reakcija vezivanja aminokiseline za tRNK odigrava sve do odreñenog koraka u kome će se ustanoviti da li je odabrana odgovarajuća aminokiselina ili nije. To su potvrdili eksperimenti u kojima je pokazano da slične aminokiseline mogu biti vezane za istu tRNK, ali da takvi kompleksi nisu stabilni i u narednom koraku mogu biti odbačeni. Aktivacija aminokiseline, po svemu sudeći, obuhvata vezivanje bilo koje aminokiseline za neku tRNK. Potom, ako je par odgovarajući, ova veza biva stabilizovana konformacionom promenom enzima koja omogućuje da se reakcija aktivacije završi veoma brzo. Ukoliko, meñutim, aminokiselina ne odgovara datoj tRNK, izostaje konformaciona promena enzima i reakcija se nastavlja toliko sporo, da postoji velika verovatnoća da će aminokiselina disosovati sa tRNK pre nego što se proces završi. Prema tome, reakcija aktivacije aminokiselina se sastoji od ciklusa vezivanja i hidroliza sve dok se ne pronañe odgovarajući par aminokiselina-tRNK. Slični diskriminatorni procesi se javljaju i na drugim nivoima ekspresije gena (npr. sparivanje baza u toku replikacije i transkripcije, sparivanje kodon-antikodon itd). Radi se o procesima u kojima svi članovi jedne familije imaju podjednake šanse da ostvare kontakt sa aktivnim centrom enzima, ali samo jedan od njih (npr. jedan nukleotid od četiri, jedna aminokiselina od 20, jedna tRNK od 40) biva odabran, dok ostali bivaju odbačeni.

Postoje i dokazi, bar kada je reč o nekim aminoacil-tRNK sintetazama, da je u proces aktivacije aminokiselina uključen i korektivni mehanizam (eng. proofreading) sličan onome koji je zastupljen u replikaciji DNK. Naime, neke aminoacil-tRNK sintetaze pored katalitičkog centra poseduju i ”korekcioni centar” u vidu udubljenja čije su dimenzije takve da se u njega mogu smestiti svi aminoacil-tRNK kompleksi manjih dimenzija od onog pravog. Smeštanje aminoacil-tRNK kompleksa u korekcioni centar dovodi do njegove hidrolize, tako da korekcioni centar deluje kao molekulsko sito koje isključuje ispravan par aminokiselina-tRNK. Dakle, proces aktivacije aminokiselina kontrolisan je u dva koraka: prvo, prilikom samog vezivanja aminokiseline za tRNK, a potom i korekcijama koje nastupaju posle vezivanja. U svakom od ova dva koraka tačnost procesa aktivacije aminokiselina se povećava za faktor 100, što čini da ukupna učestalost grešaka bude 10-4.

Pored specifičnog prepoznavanja aminokiseline od strane aminoacil-tRNK sintetaze, druga specifična interakcija bitna za aktivaciju aminokiselina je specifično prepoznavanje odgovarajućih izoakceptorskih tRNK od strane ovih enzima. Pošto je svaki od ovih enzima specifičan za jednu aminokiselinu i prepoznaje samo tRNK koje pripadaju istoj izoakceptorskoj grupi, to znači da se tRNK jedne izoakceptorske grupe odlikuju nekim specifičnim strukturnim karakteristikama. Prvobitna ideja bila je da postoje kratki nizovi nukleotida karakteristični za pojedine grupe izoakceptorskih tRNK. Ispitivanja primarne i sekundarne strukture izoakceptorskih tRNK pokazala su, meñutim, da osnova za njihovo specifično prepoznavanje od strane aminoacil-tRNK sintetaza ne leži samo u njihovoj primarnoj i sekundarnoj strukturi, već da je specifičnost prema aminoacil-tRNK sintetazi bar delimično obezbeñena varijacijama tercijarne strukture, koja je do sada ispitana na ograničenom broju tRNK. U interakciju sa enzimom su uključena dva regiona molekula tRNK, i to akceptorski krak i antikodonska petlja (slika 5). Reakcija prepoznavanja je veoma precizna i zasniva se na kontaktu malih regiona tRNK sa enzimom, a specifičnost

8

obezbeñuju razlike u nukleotidnoj sekvenci i geometriji molekula tRNK u tim malim regionima.

Slika 5. Interakcija tRNKGln sa aminoacil-tRNK sintetazom

Interakcija kodon antikodon

Interakcija kodona i antikodona koja omogućuje ugrañivanje odgovarajuće aminokiseline u polipeptidni lanac, zasniva se na sparivanju komplementarnih baza, ali pod manje strogim uslovima nego sparivanje unutar dvolančane DNK ili RNK koje je ograničeno samo na A=T (odnosno A=U) i G≡C parove.

Genetički kod je degenerisan: većini aminokiselina odgovara više od 2 kodona, pri čemu se kodoni koji odreñuju jednu aminokiselinu najčešće razlikuju samo u jednom nukleotidu i to trećem po redu. Pošto za 20 aminokiselina postoji 61 kodon, moglo bi se očekivati da za svaki kodon postoji tRNK koja sadrži odgovarajući antikodon. Meñutim, eksperimenti sa in vitro sintezom proteina su pokazali da jedna tRNK može da prepozna više različitih kodona. Na primer tRNKPhe iz kvasca koja ima antikodon GmAA (Gm označava metilovani guanozin) prepoznaje kodone UUC i UUU, a tRNKAla, čiji je antikodon IGC (I je inozin, tj. dezaminovani adenin), prepoznaje kodone GCU, GCC i GCA. Ovde treba imati u vidu da se antikodon i kodon sparuju antiparalelno, što znači da se prva baza antikodona (ona na 5’-kraju antikodona) sparuje sa trećom bazom kodona (onom na 3’-kraju kodona).

U in vitro sistemu za sintezu proteina pokazano je da u sparivanju prve baze antikodona sa trećom bazom kodona, onom koja je najčešće „izroñena”, često dolazi do odstupanja od standardnog principa A=U i G≡C. Zato se za prvu bazu antikodona kaže da je „kolebljiva”. Kombinujući strukturne analize i logičko zaključivanje Francis Crick je postavio hipotezu o kolebljivosti interakcije kodon antikodon (eng. wobbling hypothesis), po kojoj sparivanje baza na prve dve kodonske pozicije uvek odgovara standardnim pravilima, dok na trećoj poziciji može doći do odstupanja. Polazeći od toga da se konformacije parova baza, zbog strukturnih ograničenja, ne mogu drastično razlikovati od Watson-Crickove geometrije i analizirajući poznate slučajeve nestandardnog sparivanja, Crick je zaključio koji nestandardni parovi se mogu naći na prvoj antikodonskoj poziciji i utvrdio pravila o sparivanju na trećoj poziciji kodona koja dozvoljavaju i sparivanje G=U pored standardnog G≡C. Tako,

9

ako se na prvoj antikodonskoj poziciji nalazi U, moguće je sparivanje sa A ili sa G na trećoj poziciji kodona; ako je prva baza antikodona G, na trećoj poziciji kodona se može naći U ili C, a ako je na prvoj poziciji antikodona I, onda se na trećoj kodonskoj može naći U, C ili A. Meñutim, ako se na prvoj poziciji antikodona nalaze C ili A, moguće je samo standardno sparivanje sa G, odnosno U na trećoj poziciji kodona (Tabela 1).

„Kolebanje” je, po svemu sudeći, moguće zbog specifične konformacije antikodonske petlje tRNK koja obezbeñuje fleksibilnost u sparivanju, a ona zavisi od prisustva modifikovanih baza u neposrednoj blizini prve antikodonske baze.

Tabela 1. Sparivanje nukleotida na trećoj poziciji kodona.

Prvi nukleotid antikodona Treći nukleotid kodona

C G A U U A ili G G U ili C I U, C ili A

Zbog „kolebanja” prvog antikodonskog nukleotida, postoji više načina da se konstruiše

set tRNK koji pokriva kodone za sve aminokiseline, te broj tRNK ne mora biti jednak ni broju aminokiselina, ni broju kodona. Kada se uzmu u obzir sve mogućnosti, minimalan set morao bi da se sastoji od 31 tRNK, odnosno 32 jer je za inicijaciju translacije neophodna još jedna, specifična tRNK. Mnoge ćelije sadrže, meñutim, mnogo više od 32 tRNK, meñu kojima neke sadrže iste antikodone. U različitim ćelijama, različite tRNK (sa različitim antikodonima) „čitaju” iste kodone, tj. jednom kodonu može odgovarati nekoliko različitih tRNK. Takoñe, tRNK sa istim antikodonima mogu se vezivati za različite kodone. Ovakvu fleksibilnost, čiji je biološki smisao efikasna zaštita od mutacija, omogućuju modifikacije baza u tRNK i konformacija antikodonske petlje, odnosno, ukupna tercijarna struktura tRNK. Ipak, za svaku grupu izoakceptorskih tRNK postoji samo po jedna specifična aminoacil−tRNK sintetaza.

Ribozomi

Komponente ribozoma

Ribozomi su supramolekularne strukture – veliki ribonukleoproteinski kompleksi koji sadrže molekule ribozomskih RNK (rRNK) i veliki broj različitih molekula proteina.

Ribozomi prokariotskih i eukariotskih ćelija su veoma slični po organizaciji i funkcijama koje vrše. I jedni i drugi se sastoje od dve subjedinice: male i velike. Prokariotski ribozomi su nešto manji po veličini i sadrže nešto manji broj komponenti od eukariotskih. Veoma su slični ribozomima u eukariotskim organelama mitohondrijama i hloroplastima. Glavne komponente ribozoma su rRNK kojih ima četiri vrste (dve velike i dve male) i ribozomski proteini.

Svi bakterijski ribozomi su meñusobno identični i imaju sedimentacioni koeficijent od 70S (slika 6). Mala subjedinica (30S) sadrži 1 molekul rRNK čiji je sedimentacioni koeficijent 16S (1500 nukleotida) i 21 protein (označeni su kao S1−S21). Velika subjedinica prokariotskih ribozoma ima sedimentacioni koeficijent od 50S i sadrži: 1 molekul 23S rRNK (2900 nukleotida), 1 molekul 5S RNK (120 nukleotida) i 31 molekul proteina (L1−L35). Sa

10

izuzetkom jednog proteina koji je prisutan u četiri kopije, svi ostali su zastupljeni sa samo jednim molekulom. U obe subjedinice prokariotskih ribozoma, rRNK čine najveći deo mase (60% u maloj, odnosno 70% u velikoj subjedinici).

Slika 6. Komponente prokariotskih ribozoma

Eukariotski ribozomi su veći (80S), sadrže veće molekule rRNK i veći broj različitih proteina (slika 7). Mala subjedinica (40S) sadrži 1 molekul 18S rRNK (1900 nukleotida) i 33 proteina. Oko 50% mase ove subjedinice čine proteini i isto toliko rRNK. Velika subjedinica (60S) sadrži 1 molekul 28S rRNK (4800 nukleotida), dve male rRNK (5S i 5,8S) i 50 proteina koji su zastupljeni sa po jednim molekulom. rRNK čine oko 65% mase ove subjedinice, a proteini 35%.

Eukariotske ćelije sadrže ribozome i u organelama kao što su mitohondrije i hloroplasti. Ovi ribozomi se razlikuju od citoplazmatičnih i po mnogim karakteristikama su slični prokariotskim ribozomima. U eukariotskim ćelijama citoplazmatični ribozomi su često vezani za membrane endoplazmatičnog retikuluma. To su ribozomi koji su angažovani u sintezi sekretornih proteina i posebno su brojni u ćelijama sa izraženom sekretornom funkcijom. Sintezu citosolnih i većine drugih nesekretornih proteina obavljaju slobodni ribozomi (slika 8).

Slika 14.2. Komponente eukariotskih ribozoma

Primarna struktura: Osnovu ribozomskih subjedinica čini rRNK koja se proteže duž cele strukture i odreñuje položaje pojedinih proteina koji sa njom intereaguju. Po baznom sastavu rRNK se razlikuju od prosečnog baznog sastava DNK. Obe velike rRNK imaju relativno visok sadržaj parova G≡C i izraženu sekundarnu strukturu. Sadržaj parova G≡C varira od vrste do vrste i raste sa položajem vrste na evolutivnoj lestvici, što ukazuje da je evolucija išla ka stabilizaciji sekundarne strukture. Naime, dvolančani delovi RNK su zaštićeni od delovanja ribonukleaza tako da RNK sa izraženijom sekundarnom strukturom imaju duži metabolički vek.

Slika 7. Komponente eukariotskih ribozoma

Ribozomske RNK

Posebna karakteristika primarne strukture rRNK je prisustvo modifikovanih baza. Najzastupljenije modifikovane baze su pseudouracil, 2-metilguanozin, 3-metilcitozin i 3-metiluracil. Metilacija se često vrši i na 2’-OH grupi riboze. Kod eukariotskih rRNK

11

metilacija baza je više izražena nego kod prokariotskih. 16S rRNK sadrži oko 10 metil grupa uglavnom u 3’ delu molekula, a 23S rRNK sadrži oko 20 metilovanih baza. Eukariotske 18S i 28S rRNK sadrže čak 43, odnosno 74 metil grupe (oko 2% baza je metilovano). Metilovanjem baza se stabilizuje konformacija jednolančanih petlji. Neravnomeran raspored metilovanih baza ukazuje da su pojedini delovi molekula stabilniji od drugih. Nañeno je, takoñe, da su metilovane baze više zastupljene u onim delovima molekula rRNK koji su bolje očuvani u toku evolucije.

Slika 8. Slobodni i ribozomi vezani za membrane endoplazmatičnog retikuluma

Iako je primarna struktura svih rRNK poznata, teško je predvideti njihovu sekundarnu strukturu zato što su molekuli rRNK relativno veliki, pa postoji mnogo različitih mogućnosti za spiralizaciju unutar molekula. Na osnovu proračuna stabilnosti pojedinih regiona predloženo je više modela sekundarne strukture pojedinih rRNK. Meñutim, najbolji pristup za predviñanje sekundarne strukture je uporeñivanje redosleda nukleotida u rRNK različitih organizama, jer oni regioni koji su bitni za sekundarnu strukturu obično su evolutivno očuvani. Iz takvih ispitivanja proizašli su najprihvatljiviji modeli sekundarne strukture 16S i 23S rRNK. Molekul 16S rRNK sadrži četiri glavna domena u kojima je blizu polovine nukleotida spareno. Pojedinačni dvolančani delovi su kratki (do 8 bp), a dvolančane spirale često nisu savršene, već na mnogim mestima sadrže petlje od po nekoliko nesparenih nukleotida (slika 9).

Slika 9. Model sekundarne strukture 16S rRNK

12

Ovaj model sekundarne strukture odnosi se na strukturu slobodne 16S rRNK u rastvoru, ne uzimajući u obzir interakcije sa ribozomskim proteinima koje mogu da utiču na sparivanje baza u pojedinim regionima. Ispitivanja sekundarne strukture 16S rRNK unutar subjedinice ribozoma su pokazala da se ovaj model može primeniti i na strukturu 16S rRNK u sastavu male ribozomske subjedinice, s tim što u okviru ribozoma molekul ima nešto manje spiralizovanih regiona. Drugo važno pitanje bilo je da li je struktura 16S rRNK promenljiva? Ispitivanja reaktivnosti 16S rRNK u okviru slobodne subjedinice i kompletnog ribozoma, u slobodnim ribozomima i onima koji učestvuju u sintezi proteina pokazala su da se struktura rRNK, a prema tome i samog ribozoma, menja prilikom vezivanja iRNK za malu subjedinicu, u toku asocijacije subjedinica, kao i prilikom vezivanja tRNK za ribozom. Još uvek se ne zna da li zapažene promene nastaju zbog direktne interakcije rRNK sa iRNK ili tRNK, ili do tih interakcija dolazi indirektno, ali u svakom slučaju struktura ribozoma je fleksibilna.

Na slici 10 prikazan je model sekundarne strukture 23S rRNK u kome se razlikuje šest strukturnih domena.

Slika 10. Model sekundarne strukture 23S rRNK. Polinukleotidni lanac je na nekim mestima prekinut kako bi struktura bila prikazana na pregledniji način.

Velika ribozomska subjedinica i kod prokariota i kod eukariota sadrži pored velike (23S odnosno 28S) i tzv. malu, 5S rRNK. Ribozomi u mitohondrijama sisara, meñutim, ne sadrže ovu RNK. I prokariotska i eukariotska 5S rRNK sadrže evolutivno očuvane regione, ali nemaju meñusobno homolognu primarnu strukturu. 5S rRNK ima važnu strukturnu ulogu u rekonstrukciji biološki aktivne 50S subjedinice prokariotskih ribozoma. Takoñe, ona pomaže vezivanje kompleksa aminoacil-tRNK za ribozom i učestvuje u vezivanju tRNK za kodon, pri čemu se interakcija kodon−antikodon stabilizuje sparivanjem nekih baza iz tRNK sa bazama iz 5S rRNK.

U velikoj subjedinici eukariotskih ribozoma prisutna je još jedna mala rRNK - 5,8S rRNK, koja je H-vezama vezana za 3’-kraj 28S rRNK. Slična mala rRNK (4,5S) nalazi se i u ribozomima hloroplasta viših biljaka. Po nekim osobinama 5,8S rRNK je slična bakterijskoj 5S rRNK. Uloga joj još uvek nije rasvetljena, ali izgleda da su eukariotske 5S i 5,8S rRNK podelile uloge bakterijske 5S RNK: eukariotska 5S rRNK učestvuje u vezivanju inicijatorske tRNK za ribozom, dok 5,8S rRNK učestvuje u vezivanju ostalih tRNK.

Ribozomski proteini

Ribozomske RNK na odreñenim mestima vezuju ribozomske proteine (r-proteine). Za izolovane rRNK, meñutim, čvrsto se vezuju samo neki r-proteini. Prilikom in vitro

13

rekonstrukcije ribozoma od njihovih komponenti, ovi proteini se prvi vezuju za rRNK i zajedno sa njom grade jezgro ribozomske subjedinice, pa su označeni kao proteini jezgra ribozoma. Oni se mogu ukloniti iz ribozoma samo drastičnim tretmanom sa jonskim deterdžentima. Mesta na rRNK za koja se ovi proteini vezuju mogu se odrediti tako što se odrede regioni rRNK zaštićeni od digestije nukleazama. Takvi eksperimenti dali su linearne mape zaštićenih mesta na rRNK na kojima se može videti da do interakcija proteina sa rRNK dolazi uglavnom u dvolančanim regionima koji sadrže nesparene baze.

Drugoj grupi r-proteina pripadaju slabije vezani proteini koji se ne vezuju za izolovane rRNK i do njihovog vezivanja može doći samo ukoliko su proteini jezgra prethodno već vezani za rRNK. To znači da je konformacija rRNK, koju ona zadobija posle interakcije sa proteinima jezgra, od presudnog značaja za formiranje vezivnih mesta za slabo vezane proteine. Oni se mogu ukloniti sa ribozoma povišenom koncentracijom soli.

Trećoj grupi r-proteina pripadaju tzv. uslovno ribozomski proteini. Oni su vezani za ribozome samo u odreñenim fazama biosinteze proteina, i u ovu kategoriju spadaju proteinski faktori inicijacije, elongacije i terminacije translacije.

Raspored r-proteina u subjedinicama ribozoma izučavan je primenom različitih eksperimentalnih pristupa. U principu, r-proteini se nalaze na površini ribozoma i ispunjavaju udubljenja koje formiraju rRNK u unutrašnjosti ribozoma. Položaj svih proteina male i većine proteina velike subjedinice ribozoma bakterije E.coli odreñen je elektronskom mikroskopijom uz primenu specifičnih antitela na pojedine proteine. Analiziranjem parova r-proteina koji nastaju kada se nativna subjedinica ribozoma tretira specifičnim, bifunkcionalnim reagensima za unakrsno vezivanje proteina dobijeni su takoñe značajni podaci o rasporedu proteina u ribozomima, jer pod odreñenim uslovima do unakrsnog vezivanja dolazi samo izmeñu onih proteina koji se nalaze u neposrednoj blizini. Primenjene su i biofizičke metode kao što je rasejanje neutrona na subjedinicama u koje su ugrañeni r-proteini obeleženi deuterijumom. Posebno korisni podaci o funkciji pojedinih r-proteina dobijeni su ispitivanjem bakterijskih i eukariotskih ćelija koje nose mutacije u genima koji ih kodiraju. Spektar različitih mutacija je veoma širok. Neke su letalne, dok neke dovode do minornih defekata u translaciji. Mutacija u nekom r-proteinu mogla je biti povezana sa defektom koji se uočava, pa je, izmeñu ostalog i na taj način, do sada utvrñena funkcija svih r-proteina.

Posebno značajne informacije o strukturi ribozoma dobijene su razgradnjom i rekonstrukcijom ribozoma in vitro. Kada se subjedinice bakterijskih ribozoma centrifugiraju u gradijentu gustine CsCl, jedna grupa proteina napušta subjedinice od kojih ostaju jezgra (23S od male i 42S od velike subjedinice). Pošto nastale čestice uvek imaju istu veličinu, tj. sedimentacioni koeficijent, moglo se zaključiti da se proteini odvajaju od ribozoma u grupama (paketima). Bilo je, dakle, očigledno da se radi o kooperativnom uklanjanju grupa proteina, i to onih koji su slabo vezani. Disocijacija proteina je reverzibilna, tako da se uklanjanjem CsCl i dodavanjem jona Mg2+ mogla postići rekonstitucija subjedinica koje su bile aktivne u sintezi proteina. Eksperimenti in vitro razgradnje ribozoma pomogli su da se razvije sistem za in vitro rekonstrukciju funkcionalnih ribozoma počevši od njihovih komponenti.

Rekonstrukcija ribozoma in vitro je bila je još jedan način da se ispitaju funkcije pojedinih r-proteina. Izostavljanjem pojedinih proteina iz smeše za rekonstrukciju i korišćenjem takvih ribozomskih subjedinica u in vitro sistemu za sintezu proteina, moglo se ustanoviti kakvu ulogu imaju pojedini r-proteini u procesu translacije. Tako je konstatovano da najčešće nekoliko proteina zajedno ostvaruju jednu ulogu i da je svaki pojedinačni protein obično uključen u nekoliko funkcija ribozoma. Npr. jedna grupa proteina je odgovorna za

14

metilaciju baza u 16S rRNK, druga grupa inhibira metilaciju, treća je odgovorna za tačnost prevoñenja genetičke šifre, četvrta za vezivanje tRNK za ribozom itd. Pri tome se neki proteini pojavljuju kao važni faktori u nekoliko grupa.

Funkcionalni centri ribozoma

Detaljno upoznavanje strukture ribozoma, posebno prostornog rasporeda njihovih komponenti, bilo je neophodan preduslov za utvrñivanje lokalizacije funkcionalnih centara ribozoma kao što su mesta vezivanja iRNK, tRNK, proteinskih faktora translacije, peptidil transferaze itd.

Slika 11. Model strukture prokariotskog ribozoma

Podaci o obliku i veličini ribozoma i pojedinačnih subjedinica dobijeni su elektronskom mikroskopijom, kao i difrakcijom X-zraka i sporih neutrona. Oblik prokariotskih i eukariotskih ribozoma je sličan. Mala subjedinica je spljoštena, izdužena i asimetrična sa izraženim udubljenjem u centralnom delu (slika 11). Velika subjedinica se sastoji od kompaktnog tela sfernog oblika sa tri jasno izražena ispupčenja. Dve subjedinice su povezane ostvarivanjem kontakta izmeñu udubljenja na maloj i centralnog produžetka na velikoj subjedinici. Eukariotske male subjedinice su veoma slične prokariotskim, dok se velike unekoliko razlikuju.

Tri značajna mesta na ribozomu su ona za koja se vezuju molekuli tRNK. Označena su kao P mesto (od peptidil-tRNK mesto ), A mesto (od aminoacil-tRNK mesto ) i E mesto (od “exit” mesto) . Sva tri mesta se nalaze na granici izmeñu dve ribozomske subjedinice i zahvataju i malu i veliku. P mesto sadrži region 16S RNK odmah iza njenog 3’ terminusa, kao i nekoliko proteina velike subjedinice. U njegovoj neposrednoj blizini nalazi se A mesto koje sadrži 16S RNK i neke proteine velike subjedinice. Za E-mesto se vezuje deacilovana tRNK neposredno pre napuštanja ribozoma. U svakom trenutku u toku translacije za ribozom

15

su vezane najmanje dve tRNK, jedna za P-mesto i jedna za A-mesto. Kada je i E-mesto zauzeto, onda su za ribozom vezane čak tri tRNK. S obzirom da su molekuli tRNK relativno veliki u odnosu na ribozom, oni se smeštaju u udubljenje na površini ribozoma koje se nalazi na granici izmeñu dve subjedinice (slika 12). Veličina molekula tRNK je tačno tolika da može da premosti rastojanje izmeñu dva najvažnija aktivna centra ribozoma: peptidil transferaznog centra koji se nalazi na velikoj subjedinici i odgovoran je za formiranje peptidne veze i dekodiraju ćeg centra na maloj subjedinici u okviru koga aminoacil-tRNK “čita” genetičku informaciju tj. dešifruje kodone u iRNK.

Slika 12. Vezivanje tRNK za ribozom

U maloj subjedinici ribozoma postoje kanali kroz koje iRNK “ulazi” u dekodirajući centar i “izlazi” iz njega (slika 13). Kroz ulazni kanal, koji je veoma uzan, može da proñe samo izdužena jednolančana RNK – svako sparivanje baza je isključeno, što olakšava očitavanje kodona. U regionu izmeñu ova dva kanala susreću se antikodonske petlje tRNK koje su vezane za A i P mesto sa susednim kodonima u iRNK. U tom regionu iRNK gradi pregib na mestu tačno izmeñu dva kodona. Zbog postojanja ovog pregiba pozicija upražnjenog A mesta tj. narednog kodona se razlikuje od ostatka iRNK, pa se na taj način održava ispravan okvir čitanja genetičke poruke tj. smanjuje verovatnoća da se nova aminoacil-tRNK veže za pogrešan triplet nukleotida.

U velikoj subjedinici ribozoma nalazi se kanal kroz koji prolazi rastući polipeptidni lanac (slika 13). Zbog relativno male širine ovog kanala savijanje rastućeg polipeptidnog lanca je ograničeno. Unutar kanala on može da formira samo α spiralu, dok su drugi oblici sekundarne strukture kao i bilo kakve tercijarne interakcije onemogućeni. Zbog toga, novosintetisani polipeptidni lanac može da zauzme konačnu 3D strukturu tek pošto se njegova sinteza završi i on napusti ribozom.

Peptidil transferazni centar se nalazi na velikoj subjedinici ribozoma i sastoji se isključivo od velike rRNK. Delovi nekih r-proteina koji se nalaze u blizini ovog centra imaju ulogu u održavanju konformacije rRNK. Ribozomske RNK, dakle, ne predstavljaju samo strukturne komponente ribozoma, već obavljaju i veoma važnu funkciju kao što je katalitička funkcija formiranja peptidne veze3. Pored toga, u toku translacije 16S rRNK ostvaruje i značajne interakcije sa antikodonskim petljama aminoacil-tRNK, kao i sa kodonima u iRNK, o čemu će kasnije biti više reči. 3 Molekuli RNK koji poseduju katalitičku aktivnost nazivaju se ribozimi , po analogiji sa proteinskim katalizatorima koji se nazivaju enzimi.

16

Slika 13. Model strukture 70S ribozoma bakterije E. coli.

Biogeneza ribozoma

Ribozomi čine čak 40−50% ćelijske mase bakterijske ćelije. U jednoj bakterijskoj ćeliji nalazi se oko 150000, a u eukariotskoj oko deset miliona ribozoma. Njihova biosinteza mora biti strogo kontrolisana, jer je to proces koji podrazumeva koordinisanu sintezu velikog broja komponenti (r-proteina i rRNK), kao i organizovanje tih komponenti u funkcionalno aktivne ribozome. Takoñe, ćelija može obezbediti adekvatne količine rRNK, koje su finalni produkti gena koji ih kodiraju, zahvaljujući tome što su ovi geni prisutni i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama u većem broju kopija.

Slika 14. Raspored gena za rRNK u prokariotskom genomu

U genomu bakterije E. coli nalazi se sedam zasebnih transkripcionih jedinica od kojih svaka obuhvata po jedan gen za 16S, 23S i 5S RNK. Primarni transkript, prema tome, sadrži sve tri rRNK, ali i oko 20% nukleotida više nego što je zbir nukleotida u njima. Povezivanjem sva tri gena za rRNK u jednu transkripcionu jedinicu, obezbeñena je koordinacija sinteze različitih rRNK, pa je u ćeliji uvek prisutan jednak broj molekula svake od njih za formiranje ribozoma. Sve transkripcione jedinice koje kodiraju rRNK smeštene su u regionu oko mesta inicijacije replikacije, a unutar svake od njih geni su rasporeñeni na sledeći način (slika 14): posle gena koji kodira 16S rRNK, nalazi se unutrašnja margina u okviru koje su smešteni geni za neke tRNK, zatim deo koji kodira 23S rRNK i najzad deo koji kodira 5S rRNK.

17

Primarni transkript (oko 30S) podleže obradi još u toku transkripcije. Obrada transkripta se sastoji od isecanja delova koji kodiraju tri rRNK ribonukleazom III. Potom se za pojedine rRNK vezuju r-proteini, a na kraju se, modifikacijom pojedinih baza, završava sazrevanje rRNK. R-proteini se vezuju u paketima, slično kao pri in vitro rekonstrukciji ribozoma. Oni se sintetišu na policistronskim iRNK. Proteini sintetisani na istoj iRNK formiraju komplekse (pakete) koji se vezuju za rRNK, što ubrzava formiranje ribozoma i povećava kooperativnost procesa. Količina r-proteina u ćeliji reguliše se mehanizmom povratne sprege na nivou translacije koji obezbeñuje da u ćeliji sinteza r-proteina i rRNK bude koordinisana. Vezivanjem r-proteina za rRNK u toku formiranja male subjedinice (30S) nastaje prekurzor sedimentacionog koeficijenta 22S, a u toku formiranja velike (50S) subjedinice nastaju prekurzori čiji sedimentacioni koeficijenti iznose 26S, 30S i 40S. Ovaj poslednji obuhvata i 5S RNK.

Slika 15. Raspored gena za rRNK u eukariotskom genomu

Kod eukariota biosinteza ribozoma se odvija u nukleolusu. Geni za rRNK zastupljeni su u genomu različitih eukariota sa 50−5000 kopija i organizovani su na sličan način kao kod bakterija, osim što su geni za 5S rRNK fizički odvojeni (ne nalaze se u nukleolusu). Ispred gena koji kodira 18S rRNK nalazi se niz nukleotida koji se ne transkribuje (spoljašnja margina) i niz koji se transkribuje (unutrašnja margina), a iza njega je gen za 5,8S rRNK ograničen unutrašnjim marginama sa obe strane i najzad gen koji kodira 28S rRNK iza koga se nalazi još jedna unutrašnja margina (slika 15). Kao proizvod transkripcije nastaje prekurzor rRNK koji sadrži oko 13000 nukleotida i ima sedimantacioni koeficijent 45S (slika 16). Pre hidrolize ovog prekurzora na pojedinačne rRNK (18S, 5,8S i 28S rRNK), on podleže intenzivnoj hemijskoj modifikaciji koja uključuje metilaciju 2’-OH grupa na oko 100 mesta i izomerizaciju oko 100 uridina u pseudouridin. Modifikacije, kao i hidroliza 45S prekurzora, odvijaju se na specifičnim pozicijama u polinukleotidnom lancu koje odreñuje nekoliko stotina malih nukleolarnih RNK (snoRNK od eng. small nucleolar RNA,). Ove RNK, koje su, inače, poznate pod imenom vodiči (eng. guide RNA), hibridizuju sa ciljnim nukleotidnim sekvencama 45S prekurzora i na ta mesta dovode enzime koji modifikuju ili presecaju polinukleotidni lanac.

18

Slika 16. Obrada 45S prekurzora rRNK u eukariotskoj ćeliji

Elektronske mikrografije aktivnih nukleolusnih gena pokazuju veoma intenzivnu sintezu rRNK, tj. transkripcione jedinice u obliku božićne jelke. Vrh svakog nascentnog lanca transkripta obogaćen je proteinima, što znači da pridruživanje r-proteina počinje još u toku transkripcije. Za primarni transkript, 45S prekurzor, još pre nego što napusti nukleolus, vezuju se r-proteini sintetisani u citoplazmi gradeći veliku ribonukleoproteinsku (RNP) česticu sedimentacionog koeficijenta 80S. Od ovog prekurzora degradacijom endonukleazama nastaju 65S i 55S RNP čestice koje, kao prekurzori ribozomskih subjedinica, sadrže 41S i 32S prekurzore rRNK. Ostatak primarnog transkripta (oko 6000 nukleotida) degradira se do sitnih fragmenata.

Slika 17. Biogeneza ribozoma u eukariotskoj ćeliji.

19

Nukleolus napuštaju prekurzori rRNK sedimentacionih koeficijenata od 20S i 32S. Od prekurzora 20S nastaće 18S rRNK, a od prekurzora 32S nastaće 28S i 5,8S rRNK (slika 17). Iskrajanje pojedinih rRNK iz ovih prekurzora katalizuje endonukleaza slična bakterijskoj ribonukleazi III, koja deluje samo na prekurzore, ali ne i na zrele rRNK. U jedru se završava sazrevanje rRNK i pridružuje se 5S RNK sintetisana izvan nukleolusa. Formiranje male subjedinice prethodi formiranju velike. Mala subjedinica koja nosi 18S rRNK napušta jedro i pojavljuje se u citoplazmi oko 30 min posle početka transkripcije. Poslednji koraci u sazrevanju ribozoma obavljaju se u citoplazmi. To je mehanizam kojim se eukariotska ćelija štiti od eventualnog započinjanja translacije u jedru, gde bi zreli ribozomi mogli doći u kontakt sa još neobrañenim transkriptima.

Mehanizam translacije

Opšti pregled translacije

U prokariotskim ćelijama translacija započinje na 5’-kraju još nezavršenog transkripta. Drugim rečima, ona se odvija istovremeno sa transkripcijom. Kod eukariota, meñutim, ovi procesi su i vremenski i prostorno odvojeni. Jedarni ovoj ima i tu ulogu da onemogući vezivanje ribozoma za transkript pre nego što se završi njegova obrada do zrele iRNK.

Osnovna hemijska reakcija na kojoj se zasniva sinteza polipeptidnog lanca je formiranje peptidne veze izmeñu COOH grupe na kraju rastućeg polipeptidnog lanca i NH2 grupe aktivirane aminokiseline. Polipeptidni lanac se, prema tome, sintetiše u smeru od NH2- ka COOH-kraju. Formiranje peptidne veze je energetski favorizovano, jer je tokom sinteze polipeptidnog lanca COOH-kraj rastućeg lanca aktiviran kovalentnim vezivanjem za tRNK, gradeći peptidil-tRNK molekul. U svakom ciklusu ova kovalentna veza se raskida i odmah zamenjuje istom takvom vezom koja se gradi izmeñu COOH-kraja rastućeg lanca i NH2 grupe nove aminokiseline. Tako, svaka aminokiselina donosi sa sobom aktivacionu energiju koja će se upotrebiti za vezivanje sledeće (slika 18).

Slika 18. Hemizam translacije

U toku translacije, redosled nukleotida u iRNK čita se u setovima od po tri u smeru 5’→3’. Mesto svake aminokiseline u polipeptidnom lancu koji se sintetiše odreñuje se na osnovu komplementarnosti kodona i antikodona uz „kolebanje” na trećoj kodonskoj poziciji. Translaciona mašinerija, meñutim, “prevodi” samo deo iRNK, i to deo koji počinje START

20

kodonom i završava se STOP kodonom. Taj kontinuirani niz nukelotida izmeñu START i STOP kodona koji predstavlja genetičku informaciju za sintezu jednog polipeptidnog lanca naziva se otvoreni okvir čitanja (eng. ORF od open reading frame).

Ključne uloge u procesu translacije pripadaju molekulima RNK (slika 19): iRNK nose genetičku informaciju o strukturi proteina koji se sintetiše, tRNK prevode genetičku informaciju sa ”jezika nukleotida” na ”jezik aminokiselina”, a rRNK katalizuje formiranje peptidne veze.

Slika 19. Tri uloge RNK u translaciji

Proces sinteze proteina odvija se u ribozomima. Ribozomi su veliki ribonukleoproteinski kompleksi u kojima kompaktni paket proteina i rRNK formira nekoliko aktivnih centara sposobnih da katalizuju različite reakcije u toku sinteze polipeptidnog lanca. Ribozomi koji su u datom trenutku angažovani u sintezi proteina vezani su u nizu za iRNK i grade polizome (ili poliribozome ). Prosečan razmak izmeñu pojedinačnih ribozoma u polizomu je 80 nukleotida (50−150 Å). Poliribozomi se mogu lako odvojiti od ribozoma ako se ćelijski ekstrakt centrifugira kroz gradijent gustine saharoze, a izolacija neke iRNK iz polizoma predstavlja dokaz da se u ćeliji iz koje su polizomi izolovani ta iRNK prevodi u protein.

Proces sinteze polipeptidnog lanca može se podeliti u tri faze. To su inicijacija, elongacija i terminacija translacije .

Inicijacija translacije kod prokariota

Inicijacija translacije je proces u kome se ribozomske subjedinice i tRNK udružuju sa iRNK gradeći kompleks koji može da otpočne elongaciju polipeptidnog lanca i to sa tačno odreñenog mesta na iRNK. U principu, jedan isti niz nukleotida u RNK se može prevesti na tri različita načina od kojih će svaki dati potpuno različit polipeptidni lanac. To zavisi od toga da li prevoñenje počinje od prvog, drugog ili trećeg nukleotida u nizu. Odabiranjem tačnog mesta u polinukleotidnom lancu od koga treba da započne prevoñenje genetičke šifre odreñuje se okvir čitanja (eng. reading frame). U ćeliji, on je odreñen stvaranjem inicijacionog kompleksa za translaciju na onom mestu na iRNK od koga treba da započne očitavanje kodona.

21

Proces inicijacije translacije je veoma složen i u njemu, pored ribozoma, iRNK i tRNK, učestvuju i proteini koji su označeni kao faktori inicijacije translacije . Mehanizam ovog procesa u prokariotskim i eukariotskim ćelijama se bitno razlikuje.

Slika 20. Formilacija metionina

Kod bakterija postoje dve tRNK koje specifično vezuju metionin. Jedna od njih, inicijatorska tRNK , koristi se samo u inicijaciji, a druga tokom elongacije translacije. Kada se metionin veže za inicijatorsku tRNK, ubrzo se na njegovoj slobodnoj NH2 grupi odigra reakcija formilacije, tako da nastaje N-formilmetionil-tRNK, ili skraćeno fMet-tRNKf

Met (slika 20). Reakciju formilacije katalizuje enzim koji specifično prepoznaje samo inicijatorsku tRNK, a donor formil grupe je N10-formil-tetrahidrofolat.

Inicijatorska tRNK (tRNKfMet) služi samo za inicijaciju, a ne i za elongaciju translacije i

prepoznaje start kodone, a to su AUG i ponekad GUG. Druga tRNK koja vezuje metionin (tRNKm

Met) prepoznaje samo unutrašnje AUG kodone koji šifruju metionin, a metionin koji je za nju vezan ne može biti formilovan. Prema tome, ove dve aminoacil-tRNK se razlikuju i po tRNK i po statusu NH2 grupe metionina koji nose. Posle završetka translacije ili u toku elongacije, kada nascentni lanac dostigne dužinu od 15−30 aminokiselina, na NH2-kraju novosintetisanog polipeptidnog lanca počinje reakcija uklanjanja formil grupe metionina specifičnom deformilazom, koju u nekim slučajevima prati i reakcija uklanjanja samog metionina aminopeptidazom. Zato većina bakterijskih proteina ne sadrži formilmetionin, odnosno metionin kao prvu aminokiselinu, iako sinteza svih proteina počinje sa formilovanim metioninom.

U procesu inicijacije kod bakterija učestvuju tri inicijaciona faktora. Kao i ostali proteinski faktori translacije oni spadaju u kategoriju uslovno ribozomskih proteina, jer su vezani za ribozome samo u toku odreñenih faza translacije. Ta tri faktora su IF1, IF2 i IF3 (oznaka IF je akronim od inicijacioni faktor) i svaki od njih ima ključnu ulogu u inicijaciji translacije:

IF1 se vezuje za malu subjedinicu ribozoma u regionu koji će postati deo A mesta. Na taj način ovaj inicijacioni faktor onemogućuje vezivanje aminoacil-tRNK za buduće A mesto. Pored toga ovaj faktor pomaže vezivanje IF2, tako što ga vezuje za sebe.

IF2 učestvuje u vezivanju inicijatorske tRNK za nekompletno P mesto na 30S subjedinici. IF2 formira kompleks isključivo sa fMet-tRNKf

Met, a ne i sa ostalim aminoacil-tRNK i na taj način obezbeñuje da samo inicijatorska tRNK može da učestvuje u inicijaciji. Pored toga, IF2 vezuje GTP i poseduje GTP-aznu aktivnost.

IF3 se vezuje za malu subjedinicu ribozoma i to u regionu koji će postati deo E mesta. Dakle, u prisustvu sva tri inicijaciona faktora, samo je nekompletno P mesto slobodno da

22

primi fMet-tRNKfMet, dok su A i E mesto blokirani vezivanjem IF1, odnosno IF3. Glavna uloga

IF3 je da učestvuje u disocijaciji ribozoma na subjedinice. Naime, ribozomi se u toku translacije nalaze vezani za iRNK u 70S obliku i kao takvi se i oslobañaju sa iRNK prilikom terminacije translacije. U citoplazmi, kompletni ribozomi se nalaze u dinamičkoj ravnoteži sa slobodnim subjedinicama (slika 21a). IF3 se vezuje za 30S subjedinice i stabilizuje ih u slobodnom stanju, tj. sprečava njihovu reasocijaciju sa 50S subjedinicama (slika 21b). Broj slobodnih 30S subjedinica koje su neophodne za inicijaciju translacije zavisi od koncentracije IF2 u ćeliji. Prema tome, IF3 utiče na učestalost translacionih ciklusa u ćeliji.

Kada se sva tri inicijaciona faktora vežu za malu subjedinicu ribozoma (slika 21c), tada postoje uslovi za formiranje 30S inicijacionog kompleksa (slika 21d), čije komponente su: mala (30S) subjedinica ribozoma, GTP, inicijacioni faktor 2 (IF2), fMet-tRNKf

Met i iRNK. Inicijatorska tRNK i iRNK se pridružuju ovom kompleksu nezavisno i ne uvek istim redosledom. U svakom slučaju, 30S inicijacioni kompleks se formira na vodećem nizu iRNK (eng. leader sequence), gde desetak nukleotida uzvodno od start kodona sve iRNK prokariota sadrže tzv. Šajn-Dalgarnov niz koji je komplementaran 3’-kraju 16S rRNK. Na 3’-kraju 16S rRNK nalazi se jedan evolutivno konzervisan invertovani ponovak koji može da nagradi intramolekulsku zavojnicu (ukosnicu). S obzirom da je Šajn-Dalgarnov niz komplementaran sa delom ove ukosnice, u toku vezivanja male subjedinice za iRNK dolazi do sparivanja baza izmeñu iRNK i 16S rRNK. Pošto 3’-kraj 16S rRNK ne može istovremeno da gradi ukosnicu i da vezuje iRNK, verovatno je da u toku inicijacije dolazi do narušavanja ukosnice i stvaranja hibrida iRNK-rRNK koji se posle inicijacije razgrañuje rekonstituisanjem ukosnice.

Kada se mala subjedinica veže za Šajn-Dalgarnov niz, najbliži AUG (ili GUG) kodon se nañe u regionu P mesta na maloj subjedinici. To je, u tom trenutku, nekompletno P mesto, a kompletno će se formirati tek po vezivanju velike subjedinice. Prema tome, kod prokariota inicijacija se odigrava na onom AUG (ili GUG) kodonu koji se nalazi pored signala za vezivanje male subjedinice. Šajn-Dalgarnovi nizovi se mogu naći na više mesta duž lanca iRNK, jer su bakterijske iRNK u većini slučajeva policistronske. Tako, iako bakterijski ribozomi prepoznaju stop kodon kao signal za završavanje polipeptidnog lanca, oni se mogu ponovo vezati za sledeći Šajn-Dalgarnov niz na istoj iRNK i započeti translaciju na sledećem start kodonu koji se nalazi u njegovoj neposrednoj blizini.

23

Slika 21. Inicijacija translacije kod prokariota.

Vezivanje fMet-tRNKfMet za START kodon prouzrokuje konformacionu promenu male

subjedinice ribozoma, usled koje dolazi do disocijacije IF3. Sada je moguće da se u sledećem koraku 30S inicijacionom kompleksu pridruži i velika (50S) subjedinica ribozoma (slika 21e), što je praćeno hidrolizom GTP-a i oslobañanjem inicijacionih faktora IF1 i IF2. Inicijacioni faktori, dakle, napuštaju ribozom na kraju faze inicijacije i neće imati nikakvog uticaja na proces elongacije polipeptidnog lanca. Nastali 70S inicijacioni kompleks (slika 21f) zadobija odgovarajuću konformaciju na račun slobodne energije hidrolize GTP-a, tako da može da započne sintezu polipeptidnog lanca.

Vezivanjem velike subjedinice ribozoma formira se kompletno P mesto u kome je vezana fMet-tRNKf

Met, a A mesto je slobodno i spremno da primi aminoacil-tRNK čiji je

24

antikodon komplementaran kodonu u A mestu (prvi posle start kodona). Prva peptidna veza formira se izmeñu formilmetionina na inicijatorskoj tRNK i aminokiseline u A mestu. Pri tome se fMet-tRNKf

Met ponaša kao analog peptidil-tRNK u smislu da nudi jednu aminokiselinu umesto restućeg polipeptidnog lanca. Svaki AUG (odnosno GUG) kodon dalje u nizu poslužiće sada, kada je kompletan ribozom prisutan na iRNK, kao šifra za metionin (odnosno valin), jer u odsustvu inicijacionih faktora, samo elongaciona tRNK može da se veže za ribozom.

Inicijacija translacije kod eukariota

Slika 22. Inicijacija translacije kod eukariota

U inicijaciji translacije u eukariotskim ćelijama učestvuje više od 30 proteinskih faktora i proces inicijacije se u nekim aspektima bitno razlikuje u odnosu na prokariote (slika 22). Pre svega, kao start signal služi samo kodon AUG. Zatim, iako postoje dve vrste kompleksa metionil-tRNK (za inicijaciju: Met-tRNKi

Met i za elongaciju: Met-tRNKMet), ti kompleksi se razlikuju samo po tRNK komponenti, jer metionin nikada nije formilovan. Za malu subjedinicu ribozoma uvek se prvo vezuje Met-tRNKi

Met, da bi se tek potom mala subjedinica vezala za iRNK. Posebno značajne razlike u odnosu na prokariote sastoje se u načinu vezivanja male subjedinice ribozoma za iRNK i u načinu pronalaženja START kodona.

25

Eukariotski inicijacioni faktori eIF1A i eIF3 (prefiks „e” označava da se radi o eukariotskom faktoru) vezuju se za male subjedinice ribozoma na sličan način i imaju slične uloge kao i njihovi prokariotski analozi, IF1 i IF3 (slika 22a). U prvim fazama nastajanja inicijacionog kompleksa, dva inicijaciona faktora sa GTP-aznom aktivnošću, eIF2 i eIF5B, imaju ulogu da regrutuju Met-tRNKi

Met. Pri tome, uloga faktora eIF2 je da prvo veže GTP, a potom i Met-tRNKi

Met. Tako nastaje ternarni kompleks eIF2*GTP*Met-tRNKiMet koji će se uz

pomoć faktora eIF5B vezati za malu subjedinicu ribozoma. Uloga eIF5B je analogna ulozi prokariotskog faktora IF2. Faktor eIF5B se vezuje za malu subjedinicu posredstvom eIF1A koji je vezan u oblasti nekompletnog A mesta na sličan način kao što se njegov prokariotski analog, IF1, vezuje za malu subjedinicu. Vezan za malu subjedinicu, a u kompelksu sa GTP-om, eIF5B omogućuje vezivanje ternarnog kompleksa eIF2*GTP*Met-tRNKi

Met za 40S subjedinicu i to na takav način da se Met-tRNKi

Met pozicionira u oblast budućeg P mesta. Kao rezultat ovih dogañaja nastaje 43S preinicijacioni kompleks za translaciju.

Tek pošto je inicijatorska tRNK vezana za malu ribozomsku subjedinicu, može doći do vezivanja male subjedinice za iRNK. Za razliku od prokariota kod kojih, usled komplementarnog vezivanja 3’-kraja 16S RNK i Šajn-Dalgarnovog niza u vodećem nizu iRNK, mala subjedinica biva postavljena na početni AUG kodon, kod eukariota se mala subjedinica uz pomoć proteina eIF4F vezuje za sam početak iRNK, tj. za 5’-kapu. Faktor eIF4F se sastoji od tri subjedinice (eIF4E, eIF4G i eIF4A), od koji se jedna vezuje za 5’-kapu, a druge dve za iRNK (slika 22b). Ovom faktoru pridružuje se faktor eIF4B koji aktivira helikaznu aktivnost jedne od subjedinica eIF4F. Uloga ove helikaze je da naruši (“ispegla”) sekundarnu strukturu iRNK, što je neophodan preduslov za vezivanje 43S preinicijacionog kompleksa za iRNK, koje se odvija posredstvom interakcije izmeñu inicijacionih faktora eIF4F i eIF3.

Mala subjedinica, zajedno sa vezanim inicijacionim faktorima i inicijatorskom tRNK, sada se kreće duž vodećeg niza iRNK sve dok ne naiñe na prvi AUG kodon (slika 23). Ovo kretanje omogućava faktor eIF4F tj. njegova subjedinica sa helikaznom aktivnošću, a energija je obezbeñena hidrolizom ATP-a. Prepoznavanje startnog kodona omogućeno je njegovim komplementarnim sparivanjem sa antikodonom na Met-tRNKi

Met. Sparivanje kodon-antikodon prouzrokuje da inicijacioni faktori eIF2 i eIF3 budu osloboñeni, čime se stiču uslovi za pridruživanje velike ribozomske subjedinice. Kada se velika subjedinica veže, oslobañaju se i preostali inicijacioni faktori, a nastali 80S inicijacioni komplaks je spreman da prihvati novu aminoacil-tRNK na prazno A mesto, pošto se u njegovom P mestu nalazi Met-tRNKi

Met. Startni AUG kodon je najčešće prvi AUG kodon koji se nalazi nizvodno od 5’-kape.

Jedna iRNK obično sadrži više AUG kodona, ali će samo onaj koji se nalazi prvi u nizu posle 5’-kape poslužiti kao početni, a svi ostali kao šifra za metionin. Takoñe, kod eukariota prvi STOP kodon označava kraj genetičke poruke i na tom kodonu translacija se završava. Zato su eukariotske iRNK uvek monocistronske4.

4 I pored ovog ograničenja, funkcionalno povezani enzimi kod eukariota mogu se sintetisati sa jedne iRNK. U tom slučaju iRNK se prevodi u jedan veliki polipeptid, koji posle translacije može biti isečen specifičnim proteazama, tako da dâ nekoliko aktivnih enzima. Takav polipeptid se naziva poliprotein. Ponekad, meñutim, ovaj veliki polipeptid ostaje celovit, tako da posle savijanja u nativnu konformaciju od njega nastaje protein koji sadrži nekoliko različitih domena i obavlja nekoliko različitih funkcija. U tom slučaju govorimo o multifunkcionalnom proteinu. Kod bakterija, multifunkcionalni proteini obično se sastoje od nekoliko polipeptidnih lanaca koji su sintetisani svaki zasebno sa iste iRNK.

26

Slika 23. Pronalaženje START kodona

U nekim slučajevima, ipak, eukariotska ćelija ne koristi prvi AUG kodon nizvodno od 5’ kape kao startni signal za translaciju. Na primer, kada se AUG kodon koji je najbliži 5’-kapi ne nalazi u odgovarajućem kontekstu5, translaciona mašinerija može da ga “preskoči”. Takoñe, kod eukariota se sreću i slučajevi da se uzvodno od glavnog otvorenog okvira čitanja (ORF-a) nalazi vrlo kratak tzv. uzvodni ORF (uORF od eng. upstream open reading frame) koji kodira oligopeptid od 10-ak aminokiselina. Često se iza uORF-a nalaze nukleotidne sekvence koje omogućuju jednom delu malih subjedinica ribozoma da nastave da “skeniraju” iRNK u potrazi za startnim AUG kodonom i posle prevoñenja uORF-a. Najzad, neke eukariotske iRNK i mnoge virusne iRNK sadrže nizvodno od prvog AUG kodona tzv. IRES sekvence (od eng. internal ribosome entry sites), koje mogu da regrutuju 43 S preinicijacione komplekse i omoguće im da započnu translaciju sa nekog od unutrašnjih AUG kodona.

Eukariotske iRNK često imaju kružni oblik (slika 24). Njihova cirkularizacija je rezultat interakcije izmeñu proteina vezanog za 5’-kapu, a to je trimerni faktor eIF4F, i proteina vezanih za poli A rep. Kao rezultat te interakcije, kada ribozom završi translaciju stigavši do

5 Termin kontekst koristi se da označi nukleotidnu sekvencu koja okružuje nukleotid, sekvencu, kodon ili regulatorni element o kome se govori, u ovom slučaju AUG kodon.

27

STOP kodona i disosuje sa iRNK, on se nañe u neposrednoj blizini 5’-kape, te može brzo da započne novi ciklus translacije.

Slika 24. Cirkularizacija eukariotskih iRNK

Elongacija translacije

U trenutku kada je ribozom formiran na inicijacionom kodonu, A mesto je kompletno i može da primi bilo koju aminoacil-tRNK izuzev inicijatorske, a na P mestu se nalazi inicijatorska tRNK koja nosi metionin, odnosno formilmetionin. Tada počinje druga faza translacije − elongacija polipeptidnog lanca. U ovoj fazi, proces translacije u prokariotskim i eukariotskim ćelijama razlikuje se samo po izvesnim detaljima i mnogo manje nego u fazi inicijacije.

Slika 25. Elongacija translacije

Elongacija polipeptidnog lanca na ribozomu odvija se u tri koraka (slika 25): 1. Vezivanje aminoacil-tRNK za A mesto: Vezivanje aminoacil-tRNK se odvija uz

pomoć elongacionog faktora EF-T kod bakterija, odnosno eEF1 kod eukariota. Bakterijski

1

2

3

28

EF-T se sastoji od dve komponente, od koji je jedna termostabilna (EF-Ts), a druga termolabilna (EF-Tu). EF-Tu vezuje GTP i aminoacil-tRNK gradeći ternarni kompleks: aminoacil-tRNK*EF-Tu*GTP. U ovom kompleksu EF-Tu se vezuje za 3’-kraj tRNK maskirajući aminokiselinu, tako da ona ne može da učestvuje u formiranju peptidne veze sve dok EF-Tu ne disosuje (slika 26). EF-Tu nikada ne vezuje inicijatorsku tRNK, već samo one tRNK koje učestvuju u elongaciji, što je važno za raspoznavanje početnog AUG kodona od onih koji šifruju metionin. Pošto se aminoacil-tRNK postavi u A mesto, GTP hidrolizuje i binarni kompleks EF-Tu*GDP se oslobaña, zato što je afinitet EF-Tu prema aminoacil-tRNK znatno manji kada je za njega vezan GDP nego kada je za njega vezan GTP. Iz istog razloga kompleks EF-Tu*GDP ne može da veže novu aminoacil-tRNK. GTP-azna aktivnost faktora EF-Tu je slaba i potrebno je da bude stimulisana da bi uopšte došlo do hidrolize GTP-a. Do stimulacije dolazi kada se ostvari interakcija izmeñu EF-Tu i odgovarajućeg domena velike ribozomske subjedinice, centra za vezivanje faktora , a ta interakcija je moguća samo pod uslovom da se za A mesto vezala aminoacil-tRNK i to ona koja ostvaruje ispravnu interakciju sa antikodonom. Ukoliko se za A mesto veže neodgovarajuća aminoacil-tRNK, EF-Tu ne ostvaruje vezu sa centrom za vezivanje faktora, izostaje hidroliza GTP-a i umesto da se oslobodi EF-Tu*GDP, dolazi do oslobañanja celog ternarnog kompleksa aminoacil-tRNK*EF-Tu*GTP, a A mesto ostaje upražnjeno. Očigledno je da je GTP-azna aktivnost elongacionog faktora EF-Tu u velikoj meri odgovorna za tačnost translacije.

Slika 26. Vezivanje aminoacil-tRNK za A mesto

Kao što je rečeno kompleks EF-Tu*GDP ne može da veže novu aminoacil-tRNK. Da bi učestvovao u novom ciklusu elongacije potrebna je njegova regeneracija, a ona se vrši uz pomoć EF-Ts, koji istiskuje GDP formirajući originalni, kombinovani faktor EF-Ts*EF-Tu. Zatim dolazi do zamene EF-Ts GTP-om i nastaje novi aktivan kompleks EF-Tu*GTP koji

29

može da vezuje aminoacil-tRNK. Eukariotski faktor elongacije, eEF1, sastoji se od dve subjedinice od kojih jedna ima ulogu kao EF-Tu, a druga kao EF-Ts.

Kada se za A mesto veže ispravna aminoacil-tRNK i EF-Tu disosuje, tada tRNK rotira tako da se njen 3’-kraj sa vezanom aminokiselinom, koji je prvobitno bio udaljen od peptidil transferaznog centra, smešta u ovaj centar. Ovaj proces, tzv. akomodacija , omogućuje da se dve aminokiseline nañu u takvom meñusobnom položaju u okviru peptidil transferaznog centra da se izmeñu njih može formirati peptidna veza (slika 27). U slučaju nepotpunog sparivanja kodon-antikodon, u toku akomodacije dolazi do disocijacije aminoacil-tRNK iz A mesta, tako da je i ovaj proces značajan za tačnost translacije.

Slika 27. Akomodacija

2. Transpeptidacija: Veza izmeñu COOH-kraja rastućeg polipeptidnog lanca i tRNK u P mestu se raskida, a umesto nje formira se peptidna veza sa NH2 grupom aminokiseline koja je vezana za tRNK u A mestu. Ovu reakciju katalizuje peptidil transferaza koja je ribozim. Naime, peptidil transferazna aktivnost se pripisuje velikoj ribozomskoj RNK, 23S RNK. Konačan dokaz da je peptidil transferaza ribozim dobijen je kada je detaljno ispitana 3D struktura ribozoma. Tada je ustanovljeno da rastojanje izmeñu katalitičkog centra u 23S RNK i njemu najbliže aminokiseline iznosi 18 Å, što isključuje mogućnost da aminokiseline učestvuju u katalitičkom procesu. U trenutku kada se završi formiranje peptidne veze, u P mestu se nalazi deacilovana tRNK, a u A mestu rastući polipeptid, tj. peptidil-tRNK (slika 25).

3. Translokacija: Nova peptidil-tRNK se translocira iz A u P mesto, dok se ribozom pomera za tačno tri nukleotida duž iRNK. Ovaj korak zahteva energiju i praćen je serijom konformacionih promena ribozoma koje su omogućene hidrolizom GTP-a. U toku ovog koraka, slobodna (deacilovana) tRNK koja je u toku transpeptidacije nastala na P mestu vezuje se za E mesto, pri čemu prethodno deacilovana tRNK biva osloboñena sa ovog mesta i vraćena u citoplazmu. Kada se translokacija završi, A mesto pokriva novi triplet nukleotida i slobodno je da primi novi kompleks aminoacil-tRNK, čime ciklus može da otpočne ponovo (slika 25).

Proces translokacije je složen i odvija se u dve faze (slika 28). U prvoj fazi, formiranje peptidne veze uzrokuje da se akceptorski krak nove peptidil-tRNK prebacuje iz A u P mesto na velikoj subjedinici, dok njen antikodon ostaje vezan za A mesto na maloj subjedinici (slika 28-2). Tako nastaje hibridno A/P vezivno mesto. Akceptorski kraj deacilovane tRNK se istovremeno premešta iz P mesta u E mesto na velikoj subjedinici, a njen antikodon ostaje vezan za P mesto na maloj subjedinici, čime se formira još jedno hibridno vezivno mesto,

30

P/E mesto. U drugoj fazi, vezivanje kompleksa elongacionog faktora EF-G sa GTP-om i hidroliza GTP-a, stimulisana kontaktom faktora EF-G sa centrom za vezivanje faktora, dovode do toga da se antikodonski krajevi ovih tRNK zajedno sa iRNK pomere u odnosu na malu subjedinicu tako da se peptidil-tRNK nañe u P mestu na obe subjednice ribozoma (P/P vezivno mesto), a deacilovana tRNK u E mestu na velikoj subjedinici (slika 28-3). Kada se hidroliza GTP-a završi, kompleks EF-G*GDP ima izmenjenu konformaciju i disosuje sa ribozoma. Ciklus elongacije se sada može završiti oslobañanjem tRNK iz E mesta i vezivanjem nove aminoacil-tRNK za osloboñeno A mesto (slika 28-4).

Slika 28. Translokacija

Kod bakterija, u translokaciju je, dakle, uključen elongacioni faktor EF-G. Ovaj faktor se vezuje za ribozom samo u prisustvu GTP-a, čija hidroliza obezbeñuje energiju za translokaciju. Interesantno je da ribozom ne može da veže istovremeno i EF-T i EF-G, zato što se oba faktora vezuju za isto mesto - centar za vezivanje faktora. Zato se elongacija odvija uz alternativno vezivanje i oslobañanje ovih faktora. EF-Tu*GDP mora biti uklonjen pre nego što se veže kompleks EF-G*GTP, a EF-G*GDP mora disosovati pre nego što se veže sledeći kompleks aminoacil-tRNK*EF-Tu*GTP. Kod eukariota postoji faktor eEF2 koji je analogan bakterijskom EF-G i funkcioniše na sličan način.

Za sintezu proteina se u većini ćelija utroši više energije nego za bilo koji drugi proces. Kod bakterija u fazi brzog rasta na sintezu proteina se potroši oko 80% od ukupnog utroška energije. Sve u svemu, za formiranje jedne peptidne veze raskinu se tri energijom bogate fosfoestarske veze nukleozid trifosfata (ATP-a odn. GTP-a). Jedan molekul ATP-a utroši se za formiranje aminoacil-tRNK kompleksa tj. za aktivaciju aminokiseline. Ova energija će se

31

iskoristiti za formiranje peptidne veze u koraku transpeptidacije. Prilikom vezivanja aminoacil-tRNK za A mesto utroši se jedan molekul GTP-a. Najzad, treći nukleozid trifosfat, i to ponovo GTP, utroši se za translokaciju ribozoma.

Terminacija translacije

Kada se jedan od stop kodona (UAA, UAG ili UGA) nañe u A mestu, za njega se vezuje terminacioni faktor. Kod E. coli postoje tri terminaciona faktora: RF1, RF2 i RF3 (RF je akronim od eng. release factor). RF1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG, RF2 prepoznaje UAA i UGA, a RF3 vezuje GTP i stimuliše disocijaciju prva dva faktora sa ribozoma posle oslobañanja polipeptidnog lanca. Kada se terminacioni faktor RF1 ili RF2 veže za A mesto, stimulisana je hidroliza veze izmeñu tRNK i nascentnog polipeptida. Kao rezultat toga COOH-kraj rastućeg polipeptidnog lanca oslobaña se od tRNK. Pošto je ovo jedina veza kojom je rastući polipeptidni lanac vezan za ribozom, on se oslobaña u citoplazmu (slika 29a). Kod eukariota postoji jedan faktor terminacije, označen kao eRF1, koji je analogan prokariotskim faktorima RF1 i RF2, i jedan, označen kao eRF3, koji je analog bakterijskog RF3.

Slika 29. Terminacija translacije.

Pošto se veže za ribozom i prouzrokuje oslobañanje nascentnog polipeptida, terminacioni faktor RF1 (ili RF2) treba da bude uklonjen sa ribozoma. Tu ulogu obavlja RF3.

a b

32

Za razliku od većine proteina koji vezuju GTP, RF3 pokazuje veći afinitet prema GDP-u nego prema GTP-u. Zato se u slobodnom stanju u ćeliji nalazi u kompleksu sa GDP-om. Kompleks RF3-GDP vezuje se za ribozom samo ako je RF1 (ili RF2) već vezan (slika 29a). Oslobañanje polipeptida dovodi do konformacione promene RF1 (ili RF2) i ribozoma, što za posledicu ima zamenu GDP-a GTP-om. U kompleksu sa GTP-om RF3 zadobija visok afinitet prema ribozomu tj. prema centru za vezivanje faktora i potiskuje RF1 (ili RF2). Kao i u slučaju vezivanja drugih faktora, interakcija sa ovim centrom stimuliše hidrolizu GTP-a. Kada se završi hidroliza GTP-a, kompleks RF3-GDP disosuje, jer u odsustvu RF1 (iliRF-2) ima nizak afinitet prema ribozomu.

Posle oslobañanja polipeptida i terminacionih faktora, ribozom je još uvek vezan za iRNK, a za njega su u P i E mestu vezane dve deacilovane tRNK. U bakterijskim ćelijama, za slobodno A mesto vezuje se faktor RRF (od eng. ribosome recycling factor), koji regrutuje EF-G (slika 29b). EF-G stimuliše oslobañanje deacilovanih tRNK iz P i E mesta uz hidrolizu GTP-a, a zatim i sam disosuje sa ribozoma u kompleksu sa GDP-om. U oslobañanje iRNK uključuje se IF-3 koji ostaje vezan za malu subjedinicu ribozoma održavajući je u slobodnom stanju. Tek sada ribozom je spreman da učestvuje u narednom ciklusu translacije i zato se proces prikazan na slici 29b naziva recikliranje ribozoma .

Savijanje proteina u nativnu konformaciju

Kada se završi sinteza polipeptidnog lanca, to još uvek nije kraj složenog procesa ekspresije gena. U toku, i posle translacije sledi obrada polipeptidnog lanca koja ima za cilj njegovo prevoñenje u biološki aktivan oblik. Da bi mogao da obavi svoju biološku ulogu, polipeptidni lanac nakon sinteze mora da zauzme nativnu konformaciju. Pored toga, u nekim slučajevima neophodno je da bude kovalentno modifikovan, lokalizovan u odreñeni deo ćelije do koga, naravno, mora biti transportovan, a često mora biti i udružen u kompleks sa istim ili drugačijim polipeptidima.

Još u toku translacije, rastući polipeptidni lanac može da ostvari prerane interakcije sa delovima istog ili drugih polipeptida. Takvi prerani kontakti izmeñu proteina moraju u ćeliji biti sprečeni, da ne bi doveli do agregacije i pogrešnog savijanja novosintetisanog polipeptida. Iako nema nikakve sumnje da primarna struktura proteina u potpunosti odreñuje njegov finalni trodimenzionalni oblik (konformaciju), eksperimentalno je dokazano da se savijanje proteina u nativan oblik može postići, a agregacija sprečiti samo u uslovima niske temperature i koncentracije proteina. Meñutim, uslovi u ćeliji su suprotni: citosol se odlikuje visokom koncentracijom proteina, a fiziološke temperature se kreću od 25 do 37°C. Uz to, ako se novosintetisani polipeptid mora transportovati kroz ćelijske membrane kako bi dospeo do svog definitivnog odredišta u ćeliji, on mora biti odvijen, jer samo u takvom obliku može nesmetano proći kroz membranu. I u toku transporta kroz membrane postoji opasnost od neželjenih kontakata sa drugim proteinima. To znači da u ćeliji postoji potreba za mehanizmima koji bi sprečavali agregaciju i omogućavali savijanje proteina u nativnu konformaciju (eng. folding), kao i bezbedan transport proteina kroz membrane. Nosioci ovih mehanizama su proteini pratioci ili molekularni šaperoni (od eng. chaperones) u koje, izmeñu ostalih, spadaju i proteini toplotnog stresa (HSPs od eng. heat shock proteins). Uloge molekularnih šaperona su: (1) da omoguće savijanje nascentnih polipeptida u nativnu konformaciju, (2) da omoguće transport proteina kroz biološke membrane u odvijenom

33

obliku, a bez neželjenih interakcija sa drugim proteinima, (3) da omoguće udruživanje polipeptida u funkcionalno aktivne oligomerne komplekse, (4) da spreče agregaciju i pogrešno savijanje novosintetisanih polipeptida, (5) da dovedu do dezagregacije, odvijanja i ponovnog savijanja u biološki aktivan oblik onih proteina koji su već parcijalno denaturisani i/ili agregirani.

Slika 30. Uloga molekularnih šaperona

Teoretski polipeptidni lanac se u ćeliji može naći u tri različita stanja (slika 30): odvijenom („O”), ispravno savijenom („S”) i agregiranom i/ili denaturisanom („A/D”). U ravnoteži favorizovani su oblici „S” i „A/D” zbog toga što su kompaktni. Stanje „O” je samo prolazno stanje u kome se polipeptid nalazi neposredno nakon sinteze ili posle aktivnog odvijanja (uz utrošak energije). Pod odreñenim uslovima, in vitro, polipeptidni lanci se spontano savijaju i prelaze iz stanja „O” u „S”. U ćeliji, meñutim, favorizovan je prelaz iz „O” u „A/D” zbog visoke temperature i koncentracije proteina. Ovakav prelaz je naročito favorizovan u uslovima stresa, pa se tada u ćeliji akumulira velika koncentracija nefunkcionalnih proteina. Uloga šaperona bila bi da omoguće savladavanje energetske barijere pri prelazu iz stanja „A/D” u „O”. Ovi proteini mogu da obave takvu ulogu zahvaljujući činjenici da poseduju enzimsku aktivnost, i to ATP-aznu i odvijajuću aktivnost (eng. unfoldase activity). Oni, prema tome, omogućuju prelaz iz stanja „A/D” u „O” na račun slobodne energije hidrolize ATP-a, a prelaz iz stanja „O” u „S” se i inače odvija spontano. Smatra se da se na taj način, aktivnim odvijanjem pogrešno savijenih polipeptida uz pomoć šaperona i njihovim ponovnim spontanim savijanjem u nativnu konformaciju, održava u ćeliji maksimalan mogući broj polipeptida u „S” stanju.

Posttranslacione modifikacije proteina

Posle translacije mnogi polipeptidi podležu i kovalentnim modifikacijama od kojih često zavisi njihova biološka aktivnost. Većina polipeptida biva podvrgnuta obradi koja podrazumeva nekoliko tipova kovalentnih modifikacija.

Najzastupljeniji tip kovalentne modifikacije polipeptida u ćelijama je proteolitičko uklanjanje vodećeg metionina (odnosno formilmetionina) sa NH2-kraja polipeptida.

Česta modifikacija je i ograni čena proteoliza tokom koje se inaktivni proteinski prekurzori (proproteini), uklanjanjem odreñenih oligopeptida ili polipeptida (propeptida)

34

prevode u aktivne proteine. Ovakvoj obradi posle translacije podležu npr. neaktivni prekurzori proteolitičkih enzima himotripsina i tripsina, himotripsinogen i tripsinogen.

Mnogi transmembranski i proteini namenjeni sekreciji sintetišu se sa tzv. signalnim peptidima na NH2-kraju (preproteini). Signalni peptidi obično sadrže 13-36 hidrofobnih aminokiselinskih ostataka i omogućuju prolaz novosintetisanih proteina kroz ćelijske membrane. Posle ugrañivanja u membranu, sekrecije ili zauzimanja definitivne lokalizacije u ćeliji, signalne peptide uklanjaju specifične peptidaze.

Neki proteini se sintetišu u obliku poliproteina , jednog polipeptidnog lanca koji sadrži nekoliko proteina. Posle translacije, specifične proteaze hidrolizuju odgovarajuće peptidne veze oslobañajući pojedine aktivne proteine. Na ovaj način se sintetiše i posttranslaciono obrañuje većina polipeptidnih hormona.

Poznato je, takoñe, više od 150 različitih kovalentnih modifikacija aminokiselinskih bočnih grupa kojima podležu sve aminokiseline u sastavu proteina osim alanina, glicina, izoleucina, leucina, metionina i valina. Najčešće modifikacije su: fosforilacija, acetilacija, glikozilacija, hidroksilacija, metilacija, ADP-ribozilacija i sl. Reverzibilne modifikacije kao što je fosforilacija ili ADP-ribozilacija često imaju regulatorni značaj i predstavljaju univerzalan mehanizam putem koga ćelija brzo i efikasno odgovara na signale iz spoljne sredine, modulišući aktivnost mnogih enzima i drugih proteina (receptora, hormona i sl.). Fosforilaciju katalizuju enzimi proteinske kinaze, koje prenose terminalnu fosfatnu grupu ATP-a na serinske, treoninske ili tirozinske ostatke u proteinu i time menjaju njegovu biološku aktivnost. U nekim slučajevima fosforilacijom se stimuliše, a u nekim smanjuje katalitička aktivnost enzima, odnosno biološka aktivnost drugih proteina.

Posttranslacione kovalentne modifikacije proteina uključuju i vezivanje koenzima (npr. biotina, piridoksal fosfata) za proteinske komponente enzima. Ove modifikacije su ireverzibilne.

Regulacija ekspresije gena na nivou translacije

Regulacija brzine translacije

U prokariotskim ćelijama iRNK su „kratkoživeće”. Degradiraju se već nekoliko minuta nakon sinteze. Ekspresija gena je skoro u potpunosti regulisana na nivou transkripcije, a potrebe za regulacijom na nivou translacije su minimalne. U nekim slučajevima, meñutim, izražena je i kontrola na nivou translacije. Na primer, samo postojanje Šajn-Dalgarnovog niza u okviru vodećeg niza neke bakterijske iRNK nije garancija da će translacija na toj iRNK zaista i započeti. Ovaj niz može biti „sakriven” i nedostupan za interakciju sa 16S rRNK, a pored toga i njegova efikasnost može biti modulisana vezivanjem nekih proteina. Menjanjem dostupnosti i/ili efikasnosti ovog niza može se, prema tome, regulisati sinteza proteina, tj. ekspresija pojedinih gena i na nivou translacije.

Jedan od primera kontrole ekspresije gena na nivou translacije u bakterijskim ćelijama je regulacija sinteze ribozomskih proteina (r-proteina). Geni za r-proteine rasporeñeni su u genomu bakterije u setovima koji obuhvataju više gena, a svaki set predstavlja zaseban operon, koji kodira policistronsku iRNK. Meñu proteinskim produktima svakog operona nalazi se po jedan protein koji je označen kao klju čni r-protein . To su r-proteini koji se mogu vezati za sopstvene policistronske iRNK u oblasti Šajn-Dalgarnovog niza, blokirajući njihovu

35

translaciju i stimulišući njihovu degradaciju. Kada brzina sinteze r-proteina u bakterijskoj ćeliji prevaziñe brzinu sinteze rRNK, slobodni r-proteini se akumuliraju, a oni koji su ključni vezuju se za Šajn-Dalgarnove nizove na sopstvenim iRNK, tako da svaki od njih inhibira sintezu svih onih r-proteina koji pripadaju njegovom operonu. Ključni r-proteini se takoñe, vezuju i za rRNK i to za nizove slične onima u iRNK, tako da se translaciona kontrola, u stvari, zasniva na kompeticiji izmeñu rRNK i iRNK za vezivanje ključnih r-proteina. Drugim rečima, kada u ćeliji ima dovoljno slobodnih rRNK, tada je favorizovano vezivanje ključnih r-proteina za njih i formiranje ribozoma, a kada je koncentracija rRNK niska, tada se ključni r-proteini vezuju za iRNK i zaustavljaju dalju produkciju r-proteina. Na taj način, r-proteini se nikada ne sintetišu brže nego što ih ćelija može upotrebiti za biosintezu ribozoma, jer je njihova sinteza usaglašena sa sintezom rRNK. Kada translacija započne, njena brzina zavisi od dostupnosti različitih aminoacil-tRNK komplementarnih kodonima u iRNK. Različite tRNK su, u normalnim uslovima, prisutne u bakterijskoj ćeliji u različitim koncentracijama, a koncentracija pojedinih tRNK obično je proporcionalna zastupljenosti odgovarajućeg kodona u iRNK.

U eukariotskim ćelijama, kontrola brzine translacije je veoma izražena, a poluživot iRNK se meri satima ili danima. Ispitivanja načina regulacije brzine sinteze proteina u eukariotskim ćelijama vršena su na ćelijama gajenim u kulturi, kao i u in vitro sistemu za sintezu proteina baziranom na lizatu retikulocita, ćelija čiji je aparat za translaciju gotovo u potpunosti posvećen sintezi globina (proteinske komponente hemoglobina). Ova ispitivanja su dovela do zaključka da je eIF2 ključni faktor regulacije brzine sinteze proteina u eukariotskim ćelijama.

Eukariotski IF2 je oligomerni protein sastavljen od tri subjedinice (α, β i γ), koji vezuje GTP, a zatim i Met-tRNKi

Met, omogućujući njeno vezivanje za A mesto na ribozomu. Funkcija ovog proteina regulisana je fosforilacijom njegove najmanje (α) subjedinice. U retikulocitnom lizatu, fosforilacija α subjedinice eIF2 je stimulisana odsustvom hema, a u drugim eukariotskim ćelijama ona može biti stimulisana energetskim ograničenjima (npr. nedostatkom glukoze, aminokiselina i sl.), virusnom infekcijom, delovanjem teških metala i mnogih agenasa koji inhibiraju rast i proliferaciju ćelija. Nasuprot tome, agensi koji stimulišu rast i proliferaciju ćelija uzrokuju smanjenje fosforilacije ove subjedinice. Mehanizam regulacije brzine translacije koji je zasnovan na fosforilaciji/defosforilaciji α subjedinice eIF2 i verovatno univerzalan za sve eukariotske ćelije, sastoji se u sledećem: Posle inicijacije translacije koja je praćena hidrolizom GTP-a vezanog za eIF2, neophodno je da se binarni kompleks eIF2-GTP regeneriše za novi ciklus zamenom GDP-a sa GTP-om. Ovu zamenu obavlja inicijacioni faktor eIF2B koji je u ćeliji prisutan u znatno nižoj koncentraciji nego eIF2. Kada je α subjedinica eIF2 fosforilisana, tada ovaj faktor čvršće vezuje eIF2B, što ubrzo dovodi do nedostatka slobodnog eIF2B, i nemogućnosti regeneracije binarnog kompleksa eIF2-GTP neophodnog za inicijaciju, a time i do usporavanja translacije. Fosforilaciju α subjedinice eIF2 katalizuje specifična kinaza, a delovanje mnogih faktora koji utiču na rast i proliferaciju ćelija može se objasniti upravo stimulacijom ili inhibicijom ovog enzima. Naime, agensi koji stimulišu rast i ćelijsku deobu uzrokuju smanjenje aktivnosti i/ili koncentracije ove kinaze, a time dovode i do ubrzanja sinteze proteina koji su ćeliji neophodni za rast i deobu. Suprotno tome, agensi koji na rast i proliferaciju ćelija deluju inhibitorno ostvaruju ove efekte povećanjem aktivnosti i/ili koncentracije ovog enzima. Na sličan način, moduliranjem aktivnosti kinaze odgovorne za fosforilaciju α subjedinice eIF2, usaglašava se brzina translacije i sa energetskim stanjem u ćeliji. Regulacija inicijacije translacije posredstvom

36

eIF2 nije jedini, ali je u većini eukariotskih ćelija verovatno najznačajniji mehanizam kojim se reguliše brzina sinteze proteina.

Kontrola degradacije iRNK

Brzine degradacije različitih iRNK u eukariotskim ćelijama se veoma mnogo razlikuju. Neke od njih opstaju satima ili danima, dok se druge degradiraju već pola sata pošto su dospele u citoplazmu. U principu, zapaženo je da na stabilnost iRNK utiče poli(A) rep na 3’-kraju, koji sadrže skoro sve eukariotske iRNK. Histonske iRNK koje ga ne sadrže imaju kraći životni vek od većine drugih iRNK. Pored ove, postoji još jedna strukturna karakteristika iRNK koja utiče na njihovu stabilnost, a to je karakterističan niz nukleotida u 3’ nekodirajućem delu iRNK u kome se često nalazi dublet AU. Sve iRNK koje sadrže ovakav niz, podležu ubrzanoj degradaciji. Pretpostavlja se da ovakve strukturne odlike mogu predstavljati signale za selekciju iRNK za degradaciju. Meñutim, s obzirom da još uvek nisu identifikovane nukleaze koje katalizuju degradaciju različitih iRNK, mehanizmi koji su odgovorni za ovu selekciju nisu razjašnjeni. U nekim slučajevima, degradacija iRNK je kontrolisana hormonima, tako da u zavisnoti od hormonskog statusa životinje, jedna ista iRNK može imati različit poluživot. Npr. poluživot iRNK za vitelogenin u oviduktu pileta se menja pod delovanjem estrogena: u prisustvu ovog hormona on iznosi 480, a u odsustvu samo 16 sati.

Inhibitori sinteze proteina

Mnogi antibiotici, toksini i druge supstance deluju inhibitorno na sintezu proteina. Različiti antibiotici se vezuju za različite proteine ribozoma, pa shodno tome inhibiraju različite faze sinteze proteina. Neki od njih pokazuju selektivnost u odnosu na strukturne i funkcionalne razlike prokariotskih i eukariotskih ribozoma, pa se zahvaljujući tome mogu primenjivati u medicini u relativno visokim koncentracijama, bez opasnosti od toksičnih efekata. Meñu antibiotike koji deluju samo na prokariotske ribozome spadaju: tetraciklin koji blokira vezivanje aminoacil-tRNK za A mesto na ribozomu, streptomicin koji u visokim koncentracijama sprečava prelaz iz inicijacionog kompeleksa u kompletan ribozom, a u niskim povećava učestalost grešenja u prevoñenju genetičke šifre, hloramfenikol koji reverzibilno inhibira peptidil transferazu i eritromicin koji blokira translokaciju. Neki antibiotici, npr. puromicin, deluju inhibitorno na sintezu proteina i kod prokariota i kod eukariota. Puromicin je analogon 3’-kraja tRNK tako da ga ribozom ne razlikuje od tRNK i ugrañuje ga u A mesto, što uzrokuje prerano oslobañanje nascentnog polipeptidnog lanca (peptidil-puromicina). Neke supstance, kao npr. cikloheksimid koji reverzibilno inhibira peptidil transferazu, deluju samo na eukariotske, a ne i na prokariotske ribozome. Ribozomi mitohondrija i hloroplasta su u pogledu osetljivosti na inhibitore sinteze proteina veoma slični prokariotskim ribozomima. Tako u eukariotskim ćelijama hloramfenikol blokira sintezu proteina samo u mitohondrijama ili hloroplastima, dok cikloheksimid inhibira samo citoplazmatičnu sintezu proteina. Na osnovu efekata ova dva jedinjenja može se, prema tome, zaključiti da li se odreñeni protein sintetiše u citoplazmi ili u organelama. Primena različitih inhibitora sinteze proteina u istraživanjima je u velikoj meri doprinela upoznavanju mehanizama translacije i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama.

37

Tačnost translacije

Translacija se odvija veoma precizno. Prosečna učestalost grešaka iznosi do 10-4 po kodonu, što znači da se pogrešno ugrañuje samo jedna od 10 000 aminokiselina. Dva glavna izvora grešaka u translaciji su aktivacija aminokiselina i interakcija kodon−antikodon. Pored toga na tačnost prevoñenja genetičke šifre utiču i drugi faktori kao što su struktura ribozoma, tj. pojedinih ribozomskih komponenti, faktori koji menjaju afinitet tRNK prema ribozomu, brzina elongacije itd.

Kao što je već rečeno (odeljak Aktivacija aminokiselina), proces aktivacije aminokiselina kontrolisan je u dva koraka: prvo, prilikom samog vezivanja aminokiseline za tRNK, a potom i korekcijama koje nastupaju posle vezivanja. Aktivacija po svemu sudeći obuhvata vezivanje bilo koje aminokiseline za bilo koju tRNK, a potom, ako je tRNK odgovarajuća, veza se stabilizuje konformacionom promenom enzima koja omogućuje da se reakcija završi veoma brzo. Ukoliko, meñutim, aminokiselina ne odgovara datoj tRNK, izostaje konformaciona promena enzima i aktivacija se nastavlja tako sporo da postoji velika verovatnoća da će aminokiselina disosovati sa enzima pre nego što se proces završi. Uz to, neke aminoacil-tRNK sintetaze pored katalitičkog centra poseduju i ”korekcioni centar” koji funkcioniše kao molekulsko sito koje isključuje ispravan par aminokiselina-tRNK.

Greške koje nastaju zbog nepravilnog sparivanja kodona i antikodona javljaju se takoñe retko (jednom u 104 slučajeva). Ovaj podatak je, meñutim, iznenañujući, jer specifičnost interakcije kodon−antikodon je, zbog kolebanja na trećoj kodonskoj poziciji, suviše mala da bi obezbedila tako nisku učestalost grešaka. Kada se tRNK i iRNK nalaze u rastvoru, antikodoni se vezuju za kodone sa relativno niskim afinitetom, a veza izmeñu tripleta koji su potpuno komplementarni je samo deset puta stabilnija od veze izmeñu tripleta kod kojih su komplementarne samo dve baze. Ovakvi nalazi su sugerisali da je u ćeliji za proveravanje sparivanja kodon−antikodon odgovoran ribozom koji na neki način može da napravi razliku izmeñu ispravnog i neispravnog para kodon−antikodon. I zaista, ribozom koristi više različitih mehanizama kojima se selektiraju one aminoacil-tRNK koje se svojim antikodonima ispravno sparuju sa sva tri kodononska nukleotida, a odbacuju one druge.

Jedan od mehanizama koji doprinosi tačnosti prepoznavanja kodona zasniva se na postojanju dva susedna adeninska ostatka u 16S rRNK. Ovi nukleotidi uspostavljaju interakciju sa baznim parovima koje formiraju prve dve kodonske baze sa odgovarajućim bazama antikodona i to u malom žljebu. S obzirom da su u malom žljebu razlike izmeñu baznih parova G≡C i A=U relativno male, adeninski ostaci ih prepoznaju kao ispravne tj. uspostavljaju sa njima interakcije (slika 31). Nasuprot tome, nestandardni bazni parovi u interakciji kodon-antikodon se ne prepoznaju kao ispravni, interakcije adeninskih ostataka sa njima izostaju, i kao rezultat toga, veza tRNK sa ribozomom ostaje slaba, a verovatnoća da tRNK disosuje se značajno povećava.

Drugi mehanizam kojim se proverava interakcija kodon-antikodon zasniva se na GTP-aznoj aktivnosti elongacionog faktora EF-Tu. Dovoljno je da samo jedan nukleotid kodona ne bude ispravno sparen sa antikodonom, pa da to dovede do drastične redukcije GTP-azne aktivnosti ovog faktora. Suprotno tome, ispravno sparivanje kodon-antikodon na sve tri pozicije snažno stimuliše hidrolizu GTP-a, što ima za posledicu značajno povećanje verovatnoće formiranja peptidne veze (videti odeljak Elongacija translacije).

38

Treći mehanizam koji obezbeñuje tačno sparivanje kodon-antikodon povezan je sa procesom akomodacije. Smatra se da rotacija tRNK u A mestu povećava napetost u interakciji kodon-antikodon, tako da samo tripleti ispravno spareni na sve tri pozicije uspevaju da je ”prežive”. Pogrešne aminoaci-tRNK, stoga, napuštaju A mesto još tokom akomodacije, odnosno pre nego što doñe do formiranja peptidne veze.

Slika 31. Mehanizam za proveru ispravnocti interakcije kodon-antikodon

Još jedan mehanizam koji učestvuje u kontroli vernosti translacije zasniva se na delovanju kodona kao alosteričnog efektora. Prilikom ostvarivanja interakcije kodona i odgovarajućeg antikodona dolazi do promene konformacije u antikodonskoj petlji koja se zatim prenosi i na druge delove molekula tRNK. Zbog alosteričnih promena u drugim delovima tRNK, neka mesta na tRNK bivaju demaskirana, tako da mogu da ostvare interakcije sa homolognim nizovima nukleotida u rRNK (npr. TψC triplet se komplementarno vezuje za CGA sekvencu u 5S rRNK). Moguće interakcije drugih delova tRNK sa komponentama ribozoma, pored interakcije kodon−antikodon, mogu višestruko uvećati specifičnost selekcije odgovarajuće aminoacil-tRNK i stabilnost njene veze sa ribozomom.

39

KLJUČNI KONCEPTI

• Translacija je proces u kome se genetička informacija sadržana u redosledu nukleotida u iRNK prevodi u linearni redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu. U ćeliji je to veoma kompleksan proces koji se odvija u nekoliko faza, uz učešće složenog ćelijskog aparata za translaciju čije su komponente: tRNK, ribozomi, iRNK i veći broj proteinskih faktora.

• Nukleotidna sekvenca koja kodira jedan polipeptidni lanac, tzv. otvoreni okvir čitanja (ORF), se sastoji od kontinuiranog niza kodona koji počinje START kodonom a završava se STOP kodonom.

• Ključna uloga u prevoñenju genetičke informacije pripada molekulima tRNK koje imaju ulogu adaptera tj. posrednika u prepoznavanju kodona od strane odgovarajuće aminokiseline.

• Sve tRNK imaju sličnu trodimenzionalnu strukturu: na jednom kraju molekula, čiji oblik podseća na latinično slovo L, nalazi se akceptorski krak za koji se vezuje aminokiselina, a na drugom antikodonska petlja koja sadrži antikodon (triplet nukelotida komplementaran odgovarajućem kodonu u iRNK).

• Zbog mogućnosti nestandardnog sparivanja baza prilikom interakcije kodon-antikodon, jedna tRNK može da se veže za više različitih kodona, a jedan kodon može da veže više različitih tRNK. Meñutim, u svakom slučaju, uvek se “ispravna” aminokiselina ugrañuje u polipeptidni lanac.

• Pre ugrañivanja u polipeptidni lanac aminokiselina se aktivira vezivanjem za 3’-kraj tRNK koja sadrži odgovarajući antikodon. Aktivaciju aminokiselina katalizuju enzimi aminoacil-tRNK sintetaze. Svaka aminoacil-tRNK sintetaza specifično prepoznaje jednu aminokiselinu i sve tRNK koje pripadaju istoj izoakceptorskoj grupi. Aktivirana aminokiselina nosi energiju koja će se iskoristiti za formiranje peptidne veze.

• Ribozomi su veliki ribonukleoproteinski kompleksi koji obavljaju sintezu proteina u ćeliji i sastoje od dve subjedinice (male i velike). Svaka subjedinica se sastoji od jednog velikog molekula rRNK (16S i 23S kod prokariota, odnosno 18S i 28S kod eukariota) i većeg broja različitih proteina. Pored toga, velike subjedinice sadrže i “pomoćne” molekule rRNK, kao što su 5S kod prokariota, odnosno 5S i 5,8S kod eukariota.

• U toku translacije, u svakom trenutku za ribozom su vezana najmanje dva molekula tRNK. Mesta vezivanja tRNK su: A mesto – za vezivanje aminoacil-tRNK, P mesto – za vezivanje peptidil-tRNK i E mesto – za vezivanje deacilovane tRNK. Pored toga u maloj subjedinici se nalaze kanali za ulaz i izlaz iRNK, a u velikoj kanal kroz koji prolazi rastući polipeptidni lanac.

• Važni aktivni centri ribozoma su dekodirajući centar, peptidil transferazni centar i centar za vezivanje faktora. Dekodirajući centar je deo male subjedinice u okviru koga se odvijaju interakcije kodon-antikodon. Peptidil trasferazni centar se nalazi u velikoj ribozomskoj subjedinici, sastoji se isključivo od velike rRNK, ribozima koji katalizuje reakciju formiranja peptidne veze. Centar za vezivanje faktora je deo velike subjedinice za koji se vezuju ključni proteinski faktori inicijacije i elongacije translacije.

• Biogeneza ribozoma je proces koji podrazumeva koordinisanu sintezu velikog broja ribozomskih komponenti (r-proteina i rRNK), kao i organizovanje tih komponenti u funkcionalno aktivne ribozome. Geni za rRNK su prisutni u genomu u većem broju kopija, i to u formi tandemski ponovljenih transkripcionih jedinica od kojih svaka obuhvata gene za sve rRNK (osim gena za 5S rRNK kod eukariota). Kod eukariota geni za rRNK su skoncentrisani u oblasti nukleolusa. Kao proizvod transkripcije gena za rRNK nastaje prekurzor rRNK kome se još u toku transkripcije pridružuju r-proteini gradeći prekurzore ribozomskih subjedinica. Sazrevanje rRNK i ribozomskih subjedinica uključuje intenzivne hemijske modifikacije, kao i hidrolizu prekurzora rRNK endonukleazama do pojedinačnih rRNK koje će zajedno sa vezanim r-proteinima nagraditi subjedinice.

• U prokariotskim ćelijama translacija započinje na 5’-kraju još nezavršenog transkripta i odvija se istovremeno sa transkripcijom. Kod eukariota, meñutim, ovi procesi su odvojeni kako prostorno, jedarnim ovojem, tako i vremenski, procesima obrade primarnog transkripta.

• Sinteza polipeptidnog lanca se zasniva na reakciji formiranja peptidne veze izmeñu COOH grupe na kraju rastućeg polipeptidnog lanca i NH2 grupe aktivirane aminokiseline. Polipeptidni lanac se, prema tome, sintetiše u smeru od NH2- ka COOH-kraju. Formiranje peptidne veze je energetski favorizovano, jer svaka aminokiselina donosi sa sobom aktivacionu energiju koja će se upotrebiti za vezivanje sledeće.

40

• U svakoj fazi translacie (inicijaciji, elongaciji i terminaciji) učestvuju specifični proteinski faktori meñu kojima ključnu ulogu imaju oni koji vezuju GTP i hidrolizuju ga pošto se reakcija u kojoj učestvuju uspešno okonča.

• Mehanizam translacije se bitno razlikuje izmeñu prokariotskih i eukariotskih ćelija samo u fazi inicijacije, dok je u fazama elongacije i terminacije sličan.

• Kod prokariota, u toku inicijacije mala ribozomska subjedinica se vezuje za iRNK interakcijom dela 16S rRNK sa delom vodeće sekvence iRNK, pri čemu se START kodon postavlja u oblast nekompletnog P mesta. Ovu interakciju omogućuju inicijacioni faktori IF1, IF2 i IF3 koji učestvuju u disocijaciji/asocijaciji ribozomskih subjedinica i pomažu vezivanje inicijatorske aminoacil-tRNK za nekompletno P mesto na maloj subjedinici. Sparivanje START kodona sa antikodonom inicijatorske tRNK je signal za vezivanje velike subjedinice.

• Kod eukariota, mala ribozomska subjedinica se vezuje za 5’-kapu na iRNK, a potom klizi duž vodećeg niza u potrazi za prvim AUG kodonom koji će prepoznati kao startni. U inicijaciji učestvuje veliki broj proteinskih faktora. Pronalaženje startnog kodona je, kao i kod bakterija, signal za pridruživanje velike subjedinice.

• Na kraju faze inicijacije ribozomske subjedinice su vezane za iRNK tako da je za START kodon svojim antikodonom vezana inicijatorska aminoacil-tRNK (fMet-tRNKf

Met kod prokariota, odn. Met-tRNKi

Met kod eukariota) koja zauzima P mesto. • Faza elongacije započinje vezivanjem amino-acil tRNK za upražnjeno A mesto na ribozomu

uz pomoć elongacionih faktora i uz niz mehanizama kojima se kontroliše sparivanje kodona sa antikodonom. Sledi formiranje peptidne veze koje je praćeno prebacivanjem rastućeg polipeptidnog lanca iz P mesta u A mesto. Na kraju, ribozom se, uz pomoć elongacionih faktora translocira duž iRNK tako da se A mesto nañe na prvom slobodnom kodonu, peptidil-tRNK ponovo u P mestu, a deacilovana tRNK u E mestu.

• Translacija se završava kada ribozom naiñe na STOP kodon koga prepoznaju terminacioni faktori. Prvo se oslobaña nascentni polipeptid, a zatim i iRNK i deacilovane tRNK. Na kraju ribozom disosuje na subjedinice, tako da mala subjedinica može da započne novi ciklus translacije.

• Polipeptidni lanac nakon sinteze mora da zauzme nativnu konformaciju, što često uključuje i udruživanje u kompleks sa istim ili drugačijim polipeptidima. Pored toga, neophodno je da bude transportovan do odreñenog dela ćelije gde obavlja svoju biološku ulogu. Uslovi u ćeliji su takvi da je većini polipeptida u tome potrebna pomoć koju im obezbeñuju proteini sa ulogom molekularnih šaperona.

• Prevoñenje polipeptida u biološki aktivan oblik u mnogim slučajevima podrazumeva i kovalentne modifikacije njihove strukture. Ove modifikacije su najčešće reverzibilne (npr. fosforilacija, ADP-ribozilacija, glikozilacija i sl) i imaju regulatorni značaj.

• Kod bakterija regulacija ekspresije gena na nivou translacije je relativno retka i zastupljena je npr. u regulaciji sinteze r-proteina. U mnogim eukariotskim ćelijama translaciona regulacija je veoma izražena, a jedan od mehanizama se zasniva na fosforilaciji male subjedinice eIF2.

PITANJA

1. Navedite osnovne komponente ćelijske translacione mašinerije. 2. Koje RNK učestvuju u translaciji i šta su njihove uloge? 3. U koje sve interakcije stupaju tRNK u toku translacije? 4. Šta su izoakceptorske tRNK? 5. Opišite primarnu strukturu tRNK. 6. Opišite sekundarnu strukturu tRNK. 7. Opišite tercijarnu strukturu tRNK. 8. Koje veze održavaju sekundarnu, a koje tercijarnu strukturu tRNK? 9. Koji enzimi katalizuju aktivaciju aminokiselina i koliko ih različitih ima u ćeliji? 10. Opišite reakciju aktivacije aminokiseline. 11. Kako se može dokazati da redosled ugrañivanja aminokiselina u polipeptidni lanac zavisi od

tRNK, a ne od ribozoma? 12. Objasnite ulogu aminoacil-tRNK sintetaza u aktivaciji aminokiselina. U koje specifične

interakcije (prepoznavanja) su ovi enzimi uključeni? 13. Opišite dva mehanizma koji obezbeñuju da se aminokiselina uvek veže za odgovarajuću

tRNK prilikom aktivacije. 14. Šta se podrazumeva pod „kolebanjem“ u interakciji kodon-antikodon?

41

15. Navedite komponente prokariotskih i eukariotskih ribozoma. 16. Navedite osnovne karakteristike primarne i sekundarne strukture rRNK. 17. Šta je uloga rRNK u translaciji? 18. Opišite mesta na ribozomu za koja se vetuju tRNK, iRNK i rastući polipeptidni lanac. 19. Koji aktivni centri ribozoma imaju ključnu ulogu u translaciji? 20. Šta je karakteristično za raspored gena za rRNK i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama? 21. Gde se nalaze geni za rRNK u eukariotskim ćelijama? 22. Opišite ukratko biogenezu ribozoma u eukariotskim ćelijama. 23. Kako se formira peptidna veza? 24. Šta je otvoreni okvir čitanja gentičke poruke? 25. Po čemu se razlikuje inicijatorski kompleks metionil-tRNK od elongatorskog kod prokariota, a

po čemu kod eukariota? Napišite odgovarajuće oznake za ove komplekse. 26. Navedite prokariotske inicijacione faktore i njihovu ulogu u translaciji. 27. Opišite kako nastaje 30S inicijacioni kompleks kod prokariota. 28. Opišite kako nastaje 70S inicijacioni kompleks kod prokariota. 29. Opišite kako nastaje 43S pre-inicijacioni kompleks kod eukariota. 30. Opišite kako nastaje 80S inicijacioni kompleks kod eukariota. 31. Kako i zašto eukariotske iRNK zadobijaju kružni oblik u toku translacije? 32. Svaki ciklus elongacije polipeptidnog lanca odvija se u tri koraka. Navedite ih. 33. Objasnite kako se aminoacil-tRNK vezuje za A mesto i koji elongacioni faktori u tome

učestvuju kod prokariota i kod eukariota. 34. Na koji način GTP-azna aktivnost faktora EF-Tu utiče na tačnost translacije? 35. Opišite proces akomodacije tRNK i objasnite na koji način utiče na tačnost translacije. 36. Opišite korak transpeptidacije. 37. Opišite korak translokacije ribozoma. 38. Kakav je energetski bilans translacije? 39. Navedite prokariotske i eukariotske terminacione faktore i njihove uloge. 40. Opišite proces terminacije translacije. 41. Šta je uloga molekularnih šaperona u ćeliji? 42. Za koje posttranslacione modifikacije proteina znate? 43. Kako se reguliše sinteza ribozomskih proteina kopd bakterija? 44. Objasnite ulogu eIF2 u regulaciji brzine translacije u eukariotskim ćelijama. 45. Navedite najvažnije izvore grešaka u translaciji. 46. Nabrojte i objasnite najvažnije mehanizme za kontrolu tačnosti translacije.