Tema 7. DNA y la replicacion

7/26/2019 Tema 7. DNA y la replicacion

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Tema 7. El DNA y la replicacin

La transmisin de la informacin gentica

NucletidosEstructuras primaria, secundaria y terciaria del DNA

Desnaturalizacin e hibridacin

Superenrollamientos

Helicasas y topoisomerasas

Empaquetamiento y organizacin del DNA

Nucleosomas e histonas

Caractersticas de la replicacin del DNA

El replicn

Iniciacin de la replicacin

DNA polimerasas

Los replisomas de procariotas y eucariotas

Terminacin

Telmeros y telomerasa


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Replicacin y expresin gnica en organismos procariotas y eucariotas

Nucleolo

Ribosomas del

r. e. rugoso

Citoplasma

Membrana plasmtica

NcleoLa traduccin ocurre en el

citoplasma, en ribosomas

asociados o no al retculo

endoplsmico rugoso

La replicacin y

la transcripcin

transcurren en el

ncleo

Eucariotas

!"#$%&&'()

+,-.'&'()

!"#)/&"'-&'()

En Procariotas, al no haber un ncleo diferenciado, la replicacin, transcripcin

y traduccin tienen lugar en el mismo y nico compartimento intracelular. Las dos

ltimas suelen transcurrir simultneamente.


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Los cidos nucleicos son cadenas de nucletidos o polinucletidos:

ADN DNA : Acido desoxirribonucleico (polmero de desoxirribonucletidos)ARN RNA : Acido ribonucleico (polmero de ribonucletidos)

El DNAcontiene la informacin transmisible en cdigo de 4 letras (4 bases),pero no es el molde para la sntesis de protenas.

El RNA mensajero o mRNA contiene el mensaje codificado para la sntesis de

protenas: tripletes de 4 posibles bases para codificar 20 letras o aminocidos.

!"#$%&&'()

+,-.'&'()

!"#)/&"'-&'()

El material gentico: los cidos nucleicos

U

U

U

U

U

U

Hebra

codificante

Hebra

molde


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Estructura y nomenclatura de nuclesidos y nucletidos

Adems de formar parte de los cidos nucleicos, los nucletidos pueden ser

transportadores de energa qumica (ATP, GTP), sealizadores intracelulares(AMPc, GMPc), o componentes de coenzimas (NAD+, CoA, FAD, etc).

bsica

neutrocido

(DNA)

(RNA)


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Niveles estructurales de los cidos nucleicos

Estructura primaria: polmero lineal formado por la unin de numerosos

nucletidos mediante enlaces fosfodister

DNA de cadena sencilla (ssDNA) y RNA

Estructura secundaria: disposicin espacial relativa de los nucletidos

que se encuentran prximos en la secuencia

DNA Doble cadena polinucleotdica (dsDNA)

RNA Zonas de apareamiento parcial y zonas sin aparear, conprotuberancias, bucles y horquillas en determinadas regiones

Estructura terciaria: todas aquellas de orden superior a los niveles

primario y secundario

DNA Estructuras resultantes del superenrollamiento, de la asociacin

con protenas en la cromatina y los cromosomas, y de secuenciasespeciales (DNA H trplex, DNA G tetraplex, Holliday junctions)

RNA Plegamiento tridimensional definido (tRNAs y otras estructuras)


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Estructura primaria del DNA : cadena polinucleotdica

Extremo

5

Extremo

3

CGT GA

A

T

G

C

Desoxirribonuclesidos 5 monofosfatode

las 4 bases nitrogenadas A, T, G, C.

Tiene extremos distintos: 5-fosfato y 3-OH.

Tiene sentido, direccionalidad o polaridad,por los enlaces fosfodister 3-5.

Cada cadena de DNA tiene individualidad,

dada por su secuenciade nucletidos.

La secuencia siempre es 5 3:

5-ATGCG-3

ATGCG


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Estructura secundaria del DNA: hebras o cadenas antiparalelas

y complementarias unidas por puentes de H

Complementariedadentre bases:

siempre A-T (2 p. de H) y G-C (3p. de H)

A = T A / T = T / A = 1

G = C G / C = C / G = 1

Reglas de

Chargaff:

A + G= T + C= 50 % A + G / T + C = 1

pur = pir = 50% pur / pir = 1

3

35

5Disposicinautorreplicativa:

Cadenas antiparalelas:

ambas son 5-3 ensentidos opuestos

Hay igual distancia en los pares A-T y G-C entre los C1

de los enlaces glicosdicos (1,08 nm). As, el dsDNA tiene

el mismo grosor a lo largo de toda su estructura (2,4 nm)

Lado del surco mayor

Lado del surco menor


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surco

mayor

surcomenor

Tipos de dobles hlices de DNA: A, B, Z

Z: pur-pir, in vitro

DNA-A DNA-B DNA-ZDimetro de la hlice 2,55 nm 2,37 nm 1,84 nm

pb por giro de hlice 11 10,4 12

Rotacin por pb 33,6 34,6 -30

Rotacin de la hlice dextrgira dextrgira levgira

A: dsRNA, RNA/DNA B: dsDNA in vivo

La estructura ms

normal in vivo, y ladescrita por Watson y

Crick, es la forma B

Los esqueletos de DNA

y RNA son flexibles y, enbase a sus ngulos de

giro, puede adoptar

distintas conformaciones


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El apareamiento entre las baseses esencial para las

funciones de los cidos nucleicos: permite la separacinde las dobles hlices (desnaturalizacin o fusin) y su

asociacin (renaturalizacin e hibridacin)

Mantenimiento de la estructura secundaria del DNA

Estabilidad de la doble hlice- Puentes de H entre las bases complementarias apareadas

- Interacciones hidrofbicas entre las caras de las bases

- Fuerzas de van der Waals entre las bases apiladas, que

aumentan con la longitud del DNA

-

Solvatacin de los fosfatos, que disminuye su repulsin

electrosttica

- Interacciones electrostticas con Mg2+, histonas y otrasprotenas de carcter bsico, que interaccionan con las

cargas negativas de los grupos fosfato y reducen la repulsin


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Desnaturalizacin o fusin (melting) del DNA

Por cada 1% de aumento en G-C, la Tmaumenta ~ 0,4C

Al aumentar la fuerza inicasube la Tm, porque se favorecen

los apareamientos parciales

!"#$%

""#$%

Clculo de los valores de Tmde un

DNA a partir de su secuencia

Tm= 2 (A+T) + 4 (G+C)

Tm= 70 + 41 (G+C) / n - 675 / n

El DNA se puede desnaturalizar por calor, poragentes qumicos o por enzimas (helicasas).

El proceso opuesto es la renaturalizacin.

Al producirse un desapilamiento de las bases,

hay un aumento en la A260: efecto hipercrmico alpasar de dsDNA a ssDNA (o efecto hipocrmicodesde ssDNA a dsDNA).

Tm: temperatura para llegar al 50% de hipercromicidad

parcial

total

parcial

50% dsDNA y

50% ssDNA


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Hibridacin de cidos nucleicos

La hibridacin es la asociacin entre cidos nucleicos de cadena sencilla

de distinto origen (es decir, no la reasociacin de un dsDNA), con secuencias

parcial o totalmente complementarias: se pueden formar dobles hlicesimperfectas sin complementariedad total

Adems de ser clave en algunos aspectos de la funcionalidad celular de

los cidos nucleicos (p.e. interferencia de RNA), la hibridacin es la base de

mltiples tcnicas de Biologa Molecular (PCR, Northern, Southern, FISH).

En ellas se usan fragmentos de DNA o RNA que se unen a sus secuencias

complementarias y sirven para iniciar la sntesis de DNA (cebadores) o paraidentificar esas secuencias (sondas, con marcaje).

Identificacin o marcado de

cidos nucleicos mediante

una sonda de hibridacin


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Pueden ser desoxirribonucleasas (DNasas) o ribonucleasas (RNasas), y

endonucleasas o exonucleasas.

Las endonucleasascortan en el medio de la cadena polinucleotdica. Algunas

cortan de forma inespecfica, mientras que las llamadas endonucleasas derestriccin o enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas de

dsDNA y cortan en ambas cadenas.

Las exonucleasashidrolizan enlaces comenzando por un extremo (3 5) dela cadena polinucleotdica, provocando la escisin de nucletidos de uno en uno

desde ese extremo.

Hidrlisis enzimtica de cidos nucleicos: las nucleasas

Las nucleasas son enzimas capaces de hidrolizar

enlaces fosfodister entre nucletidos de los cidosnucleicos.

El corte puede ser a uno u otro lado del grupo fosfato.

Endonucleasa de restriccin (DNA)

Endonucleasa inespecfica (RNA o DNA)

Exonucleasa (RNA o DNA)


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Estructuras plegadas de ssDNA y RNA

Tanto en ssDNA como en RNA, se forman zonas dedoble hlice local entre regiones con secuencias

palindrmicas o con complementariedad parcial,

que resultan interrumpidas por protuberancias, buclesy horquillas en las zonas sin complementariedad.

Estas estructuras forman giros y dobleces en la doblehlice, que a su vez generan estructuras

tridimensionalesms o menos flexibles y definidas,cuyo ejemplo ms conocido son los tRNAs.

Cuando hay varios apareamientos y estructurasposibles, la ms probable es la que tenga una G deformacin ms negativa, es decir, la que ms

interacciones dbiles desarrolle.

Horquilla

Secuenciaspalindrmicas

o repeticiones inversas

ssDNA o RNA


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Hlice

Superhlice

Estructura terciaria del DNA. Superhlices

La estructura del dsDNA ms estable(con la mayor !G deformacin) es la que desarrolla elmximo apareamiento

entre bases, que precisa del nmero adecuado de pares de

bases por vuelta (10,4 para el DNA B), segn el ngulo degiro y la rotacin entre nucletidos.

En estructuras de DNA cerradaso inmovilizadas, la doblehlice no puede rotar libremente sobre su eje, y se suelen

generar defectos o excesos de vueltas en ellas. Ello alterael nmero de pares de bases por vuelta y no permite al DNA

adquirir la estructura ms estable.

Para compensar los defectos o excesos de vueltas, elDNA desarrolla vueltas en el mismo sentido o el opuesto

generando vueltas de superhlice, lo que le permite ajustarel nmero de pares de bases por vuelta y mantener el

mximo apareamiento.

Esta propiedad es de

carcter topolgico, ytiene lugar sin ruptura deenlaces covalentes.

Cuando se rompe unacadena, las superhlicesse deshacen.


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Superhlice negativa:giro en el mismo sentido al de la hlice B (dextrgiro).

Producida por una falta de enrollamientode la doble hlice, para generarnuevas vueltas.

Superhlice positiva:giro en sentido opuesto al de la hlice B (levgiro).Producida por un exceso de enrollamientode la doble hlice, para compensar

las vueltas de ms.

En las clulas, el DNA suele estar superenrollado negativamenteporque esms conveniente y favorable energticamente: permite generar zonas de

apertura local de la doble hlice.

Sin embargo, en zonas concretas puede estar superenrollado positivamente.

Superhlice

negativa

Superhlice

positivaDNA relajado

Estructura terciaria. Superhlices


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Estructura terciaria del DNA. Topoismeros

Al ir aumentando el superenrollamiento,

el DNA presenta:

- Mayor grado de compactacin:necesario para el empaquetamiento enlas clulas y ncleos

- Menor superficie y mayor densidad

- Mayor velocidad de sedimentacin

-

Mayor velocidad de migracin en uncampo elctrico. As, los topoismerosse pueden separar electroforticamente.

Topoismeros: ismeros topolgicos de la misma molcula de DNA, que se

diferencian entre s por el grado de superenrollamiento.

Se pueden interconvertir entre s gracias a la accin de las topoisomerasas,que son enzimas capaces de aadir o eliminar superenrollamientos.

nodo (+)

ctodo (-)DNA ms relajado

DNA ms superenrollado


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Importancia de las helicasas y topoisomerasas

helicasas

topoisomerasas

Para la copia, expresin y funcionalidad del DNA es necesario abrir la doble

hlice, lo que hacen las enzimas helicasas.

Al desenrollarla se introduce un exceso de vueltasde hlice en la zona

adyacente, que no puede rotar libremente, por lo que se crean superhlicespositivasen esas zonas.

Estas tienen que ser eliminadas por las topoisomerasas,para que la tensin

no sea excesiva y el DNA se pueda seguir abriendo.

Las topoisomerasas tambin pueden introducir nuevos superenrollamientos

para compactarel DNA.


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Helicasas

Helicasas replicativas:

DnaBen E. coli

Mcm2-7en eucariotas

Son enzimas que catalizan la rotura de los puentes de hidrgeno de la

doble hlice del DNA con gasto de ATP, produciendo una desnaturalizacinnatural, local y procesiva, y generando DNA de cadena sencilla.

Otras trabajan con hbridos DNA-RNA o con RNA de doble cadena.Requieren ATP para su unin al DNA y lo hidrolizan durante su accin.

Son hexamricas y circulares, lo que les da alta procesividad: se cierran

sobre una hebra, se deslizan y deshacen el dsDNA.

Algunas van en sentido 5!3 y otras en 3!5.

Funcionan en replicacin, transcripcin y reparacin del DNA, y en generalen todas las funciones del DNA y el RNA.

En los procesos de replicacin estn fsicamente asociadas a las primasas.


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En su actividad interconvierten topoismeros para solventar problemas topolgicos.

As, desenrollan, desanudan o desencadenan DNA eliminandosuperenrollamientos,pero tambin pueden compactar el DNA aadiendovueltas de superhlice.

Para su accin tienen actividades enzimticas nucleasay trans-esterificadora,que realizan acciones de corte y reempalme en una o las dos hebras del DNA.

Pueden relajar superhlices (-) y (+) e introducir superhlices (-) y (+): cada tipo de

topoisomerasa hace una o ms de esas opciones.

Las Topo I cortan el DNA en una

de las cadenas, relajando el DNA alquitar una vuelta de superhlice.

Las Topo II gastan ATP para cortar

el DNA en las dos cadenas,aadiendo o quitando dos vueltas desuperhlice o separando molculas

de DNA entrelazadas.

Cada una tiene sustratos y

acciones caractersticas en lareplicacin, transcripcin, reparacin,organizacin de la cromatina, mitosis

o recombinacin.

Topoisomerasas


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Dentro de la clula, el DNA est condensado y empaquetado con protenas,

formando un nucleoideen Procariotas y cromatinaen Eucariotas.

La condensacin y empaquetamientodel DNA sirve para:

Compactarlo, para que quepa en la clula.

Protegerlode lesiones, sobre todo en mitosis.

Transmitireficazmente el DNA a las clulas hijas.

Organizarla molcula de DNA para facilitar los procesos en los que interviene.

La condensacin se realiza gracias a la asociacin con protenas especficas, quelo pliegan,enrollan y forman bucles, dando niveles de organizacin superioresyevitando que el DNA se convierta en un ovillo enmaraado inaccesible.

Empaquetamiento del DNA con protenas

En Procariotas, el nico

cromosoma o nucleoide,casi siempre circular, est

empaquetado y organizadogracias a las nucleoid

associated proteinso NAPs.


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Empaquetamiento del DNA en eucariotas: cromatina

Cromatina: ~ 1 DNA / 1 histonas / 1 protenas no histonas

Cromatina interfsica- el DNA est menos empaquetado o condensado

- resulta accesible para las protenas

Eucromatina: poco condensada, replicacin temprana

Heterocromatina: muy condensada, replicacin tarda

- h. constitutiva: centrmeros, telmeros y otras regiones

- h. facultativa: caracterstica de cada tipo celular

- El estado de la cromatina est controlado por los sistemas epigenticos y

por unin de protenas, que deciden el grado de compactacin

- Para la actividad transcripcional hace falta que la cromatina est en forma

de eucromatina

Cromosomas mitticos

- DNA con mximo empaquetamiento

- formacin controlada por el ciclo celular


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DNA de doble hlice

Cromatina en cuentas de

collar formadas pornucleosomas sin H1empaquetado 6 veces

Fibra de cromatina de 30 nm

con nucleosomas y H1, en

solenoide o zig-zag

empaquetado 40 veces

Lazos de eucromatina en

interfase

empaquetado 103-104veces

Seccin condensada

de un cromosoma

Cromosoma

metafsico entero

"#$%&'(#&)

Niveles de condensacin del DNA eucaritico

solenoide zig-zag


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Nucleosoma:el elemento bsico de la cromatina

Un nucleosoma est formado por 146 pb de DNA coreque rodea al ncleo

o core histnico, de carcter proteico, al que se une mediante mltiplesinteracciones electrostticas y puentes de H.

Es una especie de cilindro plano de 11 nm de dimetro y 6 nm de altura.La relacin entre la masa del DNA y de las protenas es 1:1.

Ncleo o corehistnico: est formado por un octmero de histonas (2x)

H2A, H2B, H3 y H4. No tiene histona H1.

El DNA forma 1,65 vueltas superenrolladas negativamente, lo que

disminuye los problemas topolgicos al desenrollarlo.

Entre cada dos nucleosomas hay DNA espaciador.

DNA ncleoo core

ncleo o corehistnico

DNAespaciador

nucleosoma

DNA del

nucleosoma

DNA ncleo o core: 146 pb

DNA espaciador: 13-110 pb

DNA total: "160-260 pb

histonas

DNA

En humanos hay unos 3 x 107

nucleosomas por clula


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H2B

H2B

Tetrmero H3-H4 Octmero de histonas

Las histonas core forman sus dmeros y tetrmeros, e interaccionan con el DNA,

a travs de un dominio conservado llamadopliegue histnico

Son muy ricas en

aminocidos bsicos

Estn muy conservadas

evolutivamente entre ellas yentre distintas especies

Hay variantes histnicas

de H1, H2A y H3

Propiedades generales de las histonas

Tipo de histona Histona P mol Lys + Arg

Histonas core H2A 14000 20 %

H2B 13900 22 %H3 15400 23 %

H4 11400 24 %

Histona ligadora H1 20800 32 %

Pliegue histnico:


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La compactacin y organizacin funcional de la

cromatina est facilitada por el superenrollamientoy alta concentracin del DNA, y por la accin de

protenas arquitectnicas.La unin de la histona H1permite formar a la

cromatina una estructura ms empaquetada: de la

fibra de 10 nm a la de 30 nm.Las colas histnicas sobresalen del nucleosoma

e intervienen en la compactacin y funcionalidad dela cromatina.

Elementos que controlan el empaquetamiento de la cromatina

Las colas sufren modificaciones qumicas reversibles

(acetilacin, metilacin, fosforilacin) en residuosespecficos, que controlan el estado estructural y

funcional de la cromatinaa travs de interacciones entreellas y con otras protenas (cdigo de las histonas)


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La cromatina interfsica se une y organiza sobre un soporte

estructural formado por protenas y RNA llamado matriz nuclear

En interfase, los cromosomas

se posicionan en territorioscromosmicosespecficos

Metafase

Interfase

Protenashistnicas y

no histnicasFibra de30 nm

Nucleosoma(11 nm)

DNA (2 nm)Poro nuclear

Fibras de la matriz nuclear

Fibra decromatina

Membrana nuclear

*+%&,-

$."/#+&

0+-)1 2# 34&+

2# "&)(+5$+

2# 67 $(

8,4&+ 2#

"&)(+5$

+ 2# 67

$(


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Las SAR/MARo S/MAR

son regiones especiales

del DNA mediante lascuales la cromatina se unea las estructuras de la

matriz y del scaffold o

armazn cromosmico

Empaquetamiento cromosmico y armazn o scaffold

*+%&,- )

/.$

S/MAR

Armazn

o scaffold


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Principios de la replicacin del DNA

1.- El genoma completo se replica una sola vez en cada ciclo celular.

Si hay ms de un origen, como en eucariotas, lo hacen de forma

sincronizada, pero no necesariamente simultnea.2.- La divisin celularno tiene lugar mientras no se haya completado

la replicacin: ha de haber alternancia. Los reguladores del ciclo celular

disparan los mecanismos que inician la replicacin y la divisin celular.

3.- La replicacin es semiconservativa, requiere un cebadorparaempezar la sntesis de DNA, y sta slo procede en direccin 5!3.

Fases de la replicacin

- Iniciacin: reconocimiento del origen por el iniciador proteico y apertura

del DNA por las helicasas.

- Elongacin: sntesis del DNA por los replisomaso complejos de

replicacin en las horquillasde replicacin.- Terminacin: procesos especiales en los finales de los replicones

circulares procariotas o de los lineales eucariotas.


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La replicacin del DNA es semiconservativa

En la replicacin, cada cadena sirve de molde para la sntesis de otra

cadena complementaria, que queda apareada con ella. As, cada nueva

doble hlice tiene una cadena parental y otra de nueva sntesis, por loque la replicacin es semiconservativa.

Experimento de Meselson y Stahl (1958):

la replicacin es SEMICONSERVATIVA

5 -A-T-C-G-T-A-C- 3

3 -T-A-G-C-A-T-G- 5

5 -A-T-C-G-T-A-C- 3

3 -T-A-G-C-A-T-G- 5

5 -A-T-C-G-T-A-C- 3

3 -T-A-G-C-A-T-G- 5

Replicacin


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Hay un solo replicnen Procariotas pero muchos en Eucariotas,

para disminuir el tiempo de replicacin de los genomas grandes

Procariotas: un replicn:un solo origen de replicacin

Escherichia coli: 4,6 Mpb = 1 origen x 2 horquillas x 60 kb/min x 30 min

Eucariotas: muchos replicones: muchos orgenes coordinados

Homo sapiens: 2900 Mpb = 50.000 orgenes x 2 horquillas x 2-3 kb/min x 10 min

Un replicnes un fragmento de DNA que se replica de forma autnomaa

partir de un origende replicacin. Es decir, es una unidad de replicacin.

Contiene un inicio (origen) y a veces un final (terminador).

La replicacin es bidireccionala partir del origen

procariotas

eucariotas

horquillas dereplicacin

unidireccional

bidireccional

origen

origen


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Inicio de la replicacin en E. coli: origen oriCe iniciador DnaA

primosoma

SSB

girasa(topoisomerasa)

DnaB: helicasa

DnaC: cargador de la helicasa

DnaG:

primasa

SSB: protena de unin a ssDNAreplisoma

oriC

Para la iniciacin de cualquier evento de replicacin, es necesaria la interaccin

entre una secuencia llamada origen de replicacin o replicador (que es loprimero que se replica), y un factor proteico llamado iniciador.


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En los cromosomas de eucariotas hay muchos orgenes potenciales

sobre los que se forman complejos prerreplicativos preRC, que luego

pueden ser o no usados como orgenes de replicacin

En Eucariotas los orgenes no estn definidos

por secuencias determinadas, sino por variosposibles elementosde secuencia, estructura

y modificaciones de la cromatina, as como

por la unin de protenas a ellos

Los orgenes son activados por la unin

de determinadas protenas y finalmente

la fosforilacin de la helicasa Mcm 2-7,

que abre el DNA

No todos los posibles orgenes son activados y

usados como orgenes en cada ciclo replicativo

Los dominios replicativos tienen mltiples

orgenes, y no se replican a la vez


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Pueden usar rNTPs o dNTPs, pero usan ms los

primeros por su abundancia, por lo que loscebadores suelen ser de RNA.

Pueden comenzar la sntesis copiando cualquier

secuencia, pero tienen ciertas preferencias. P.e., laprimasa DnaG de E. colitiene preferencia por 3-

GTC.

En eucariotas la actividad Pol

-primasa produce

cebadores hbridos, con una parte inicial de RNA(8-12 nt) y otra final de DNA (10-20 nt).

Las primasasinician la sntesis de cadenas polinucleotdicas

primasacebador

de RNA

Son RNA polimerasasdependientes de DNA, y sintetizan cebadores de

5-12 nt para que sea posible la iniciacin de la replicacin del DNA molde.


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Son enzimas capaces de replicar DNA, es decir, de sintetizar una hebra deDNA copia usando como molde otra hebra de DNA.

Las que sintetizan el DNA en la replicacin se llaman REPLICASAS.

+ requerimientos

- molde:cadena complementaria

- cebador:RNA o DNA con un extremo 3-OH

- los 4 desoxirribonuclesidos 5 trifosfato:dATP, dGTP, dCTP, dTTP

- Mg2+(o Zn2+):para la catlisis

+ reaccin: (DNA)n+ dNTP!

(DNA)n+1+ PPi G0

= - 6 kJ/mol+ direccin o polaridad de sntesis 5'!3

+ tienen un solo sitio activopara los 4 posibles sustratos

+ tienen alta fidelidad y altaprocesividad

Caractersticas de las DNA polimerasas (DNA pol)

Actividades que pueden estar presentes en las DNA polimerasas

-

polimerasa 5'!

3: adicin de 1 nucletido a un extremo 3-OH libre,elegido por su apareamiento con el molde.

- exonucleasa 3'!5correctorao editora: verifica el apareamiento y corta

el ltimo nucletido si no es correcto.

- exonucleasa 5'!3: elimina DNA (o RNA) de forma procesiva desde unamella. Junto con la polimerasa hace corrimiento de mella.


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Sntesis de DNA: elongacin de una cadena de DNA

por la actividad DNA polimerasa

La energa para la reaccin

proviene del enlace fosfato del

dNTP. Tambin est favorecida

por la liberacin e hidrlisis delPPi (!G0= - 31 kJ/mol)

Sntesis de una cadena de DNA complementaria a la molde mediante la formacin deun enlace fosfoster entre una cadena creciente con un extremo 3-OH libre (cebador) y

un dNTP entrante. Las DNA pol tienen un solo centro activo, y seleccionan el nucletido

correcto slo en base a la geometra del par formado con la base del molde.

Si el apareamiento es correcto, el

grupo 3-OH hace un ataque

nuclefilo sobre el fosfato #del

dNTP entrante y se forma el enlaceCebador

Molde


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El proceso replicativo de E. colicomete un error por cada 108-1010 nt aadidos

(tasa de error 10-8-10-10). Como el genoma es de 4,6 x 106pb, ello implica 1 errorpor cada ~ 20 a 2000 replicaciones.

Esto mejora notablemente las tasas de error para las sntesis de RNA yprotenas, que son del orden de 10-4.

Es una tasa de error muy baja para deberse slo al apareamiento y geometra

de los pares de bases en el centro activo de la replicasa.

Tasas de error:

- polimerasa: 10-4

-10-5

- exonucleasas editoras: 10-2-10-3

- sistemas de reparacin posreplicativos: 10-2-10-3

Fidelidad de la replicacin

Actividad editora o correctora


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Polaridad 5!3 en la replicacin

hebra

adelantada

5!3 global

hebra

retrasada3!5 global

cebadorde RNA

Horquilla de

replicacin

origen

Direccin de movimiento

de las horquillas

hebra adelantada

fragmento de Okazaki

en crecimiento

f. de Okazaki previo

( "1000 nucletidos)

La hebra de DNA con el extremo 3

cerca de la horquilla se llama hebraadelantaday se sintetiza en direccin

5-3 de forma continua.

La hebra retrasadase sintetiza en

direccin 5-3 de forma discontinua

mediante los fragmentos de Okazaki,cada uno con su propio cebador.

Los fragmentos son luego unidospara dar un crecimiento global 3-5.

Ambas hebras se pueden sintetizar

simultneamente gracias a ladisposicin del replisoma.

El DNA slo se sintetiza

en sentido 5-3


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Thumb (pulgar)Palm (palma)Fingers (dedos)3 5 exonucleasa

Las estructuras cristalinas de numerosas DNA polimerasas

unidas a DNA han mostrado la misma disposicin general.

Dominios

Lmina "con

sitio cataltico

Primera estructura de una DNA pol

(fragmento Klenow deE.colipol I, 1985)


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Mecanismo de adicin de un nucletido al cebador

hebra

molde

hebra

cebadora

- entrada del dNTP

- apareamiento con el molde

-

cierre de los dedos

- formacin del enlace fosfodister

- reapertura de los dedos con

desplazamiento de un par de bases

del cebador-molde

Cada uno de estos pasos est muy estimuladopor el apareamiento correcto entre la base deldNTP entrante y la correspondiente en el molde

La actividad exonucleasa 3-5

correctora se activa cuando seincorpora un nucletido mal

apareado y se altera la geometrade las interacciones

El proceso de correccin se

realiza sin liberar el DNA


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DNA polimerasas de E. coli.

La DNA pol IIIes la REPLICASA

La DNA pol Isustituye los cebadores de RNA de los fr. de Okazaki por DNA

La DNA pol II, IV y Vestn implicadas en distintos procesos de reparacin del DNA


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$

Holoenzima DNA polimerasa III (DNA pol III*)

Complejo de carga &de la

abrazadera o pinza ', que

carga sta en la hebra

retrasada en cada

fragmento de Okazaki.

- es la replicasa: sintetiza a la vez las dos hebras

- tiene alta procesividad: hasta #500.000 nt

- potencia cataltica: 250-1000 nt/seg

-

tiene alta fidelidad

- hay unas 10-20 por clula de E. coli

- tiene 791,5 kDa, con 10 s.u. distintas

- es un dmero asimtrico (#!"#2)2$%2&&''$

Polimerasa ncleo o core


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La flexibilidaddel DNA permite que la hebra retrasada forme un lazo para que

la sntesis sea simultneaen ambas hebras, lo que restringe la exposicin de

DNA de cadena sencilla, ms vulnerable.Los elementos que componen el replisoma (DNA pol, helicasa, primasa, etc)

estn funcionalmente conservadosen todos los organismos.

Las funciones propias de cada uno estn coordinadaspor numerosas

interaccionesmutuas.

Sntesis de las dos hebras en la misma direccin: el replisoma

Hebraadelantada

Hebraadelantada

DNAparental

DNA polimerasa

DNA polimerasa


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Hay 300-400 pinzas ''por clula, unas 20 veces ms que DNA pol III*

Modelo del lazo o del trombn (de varas)

"1000 nucletidos / seg ciclos de 1-2 seg fr. Okazaki: 1-2 kb

L DNA li I ti l i l l li i


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Cierre por DNA ligasa

La DNA polimerasa I tiene un papel esencial en la replicacin:

elimina los cebadores de los fr. de Okazaki por corrimiento de mella

gracias a las actividades 5!3 exonucleasa y 5!3 polimerasa


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Protenas del replisoma de la bacteria Escherichia coli

DNA li d i t


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DNA polimerasas de eucariotas

En total hay unas 13-15.

La Pol (sintetiza la h. adelantada y la Pol )la h. retrasada.

La Pol #sintetiza parte de los cebadores.La Pol *est implicada en el ajuste temporal

de la replicacin.El resto estn implicadas en su mayora en

procesos de reparacin del DNA.

Protenas de la horquilla

de replicacin de

ncleos eucariticos


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El DNA (2,4 nm) pasa a travs del agujero de las pinzas replicativas, que tiene

unos 3,5 nm y est cargado positivamente: hay unin topolgica, que implicaun anclaje mvil de la pinza al DNA.

Pinza '% PCNA%

P t f i l l h ill


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Protenas con funciones anlogas en las horquillas

de replicacin de procariotas y eucariotas

Si t d t i i li i l i t


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Sistemas de terminacin en replicones circulares procariotas:

trampas direccionales para horquillas replicativas

+permisiva

, no permisiva

Ubicacin de los

terminadores Ter

Punto de

encuentro

Secuencias

atrapadoraspara la

horquilla B

horquilla

A

horquilla

B

Secuencias

atrapadoraspara la

horquilla A

La protena terminadora Tusse une

a las secuencias Ter, donde bloqueadireccionalmente a la helicasa DnaB y

al replisoma, que se desarma

El bl d l d li i d l


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El problema de la duplicacin de los extremosy

el mantenimiento de la longitud de los telmeros

en replicones lineales como los de eucariotas

eliminacin cebador RNA

ligacin fr. Okazaki

5

53

3

5

53

3

hebra adelantada

h. retrasada

53

5

3

5

3

hebra

adelantada

hebra

retrasada

movimiento de la horquilla

5

cebador

Fr. de Okazaki

Soluciones:

- circularizar el DNA

- usar una protena cebadora

- aadir repeticiones al extremo 3

copia incompleta del extremo 5

y acortamientos enreplicaciones sucesivas:

prdida de material gentico

telmeros


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Replicacin de los telmeros

La telomerasa extiende el extremo 3

usando su secuencia de RNA paraaparear con la zona de ssDNA, y su

funcin transcriptasa reversaparaaadir nucletidos al mismo.

Usa como molde la parte no apareada

de su secuencia de RNA, y comocebador el extremo 3-OH.

Se realizan varias repeticiones del

proceso, aadiendo copias de la mismasecuencia para prolongar la hebra con el

extremo 3.

La hebra con el extremo 5 se rellena

por replicacin convencional de lahebra retrasada: la pol #-primasa

sintetiza un cebador que es extendidopor la DNA pol ).

Luego el cebador de RNA se elimina,

dejando de nuevo un saliente de 12-16nt de ssDNA en el extremo 3

%#/)(#&+1+

9:;

Documents

Tema 7. DNA y la replicacion