Biosintesis de DNA. Cambios Post-replicacion

8/17/2019 Biosintesis de DNA. Cambios Post-replicacion

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Biosíntesis de DNA.

Cambios post-replicación

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Facultad de Medicina

C. Arizmendi


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Cambios en el DNA genómico

Epigenética

Reparación

Recombinación

Transposición


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C. Arizmendi

“……la epigenética ayuda a entender el desarrollo de

muchos tumores, pero, además, es lo que permiteexplicar porqué el hombre y el chimpancé son tan

distintos si comparten el 99% de los genes , y otras

muchas cuestiones que escapan a la genética…….

…¿porqué un organismo clonado no es exactamenteigual al original ? ¿porqué dos gemelos idénticos tienen

enfermedades y personalidades distintas si tienen el

mismo DNA? “ Dr. M. Esteller. (Centro Nacional de Investigaciones

Oncológicas. Especialista en Epigenética)

epigénesis. (De epi- y -génesis).1. f. Biol. Doctrina según la cual los rasgos que caracterizan a un ser vivo se configuran en el curso

del desarrollo, sin estar preformados en el huevo fecundado. (Diccionario de la RAE)


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Procariotas: Catalizada por metilasas con S-Adenosil

metionina como donador de -CH3. Ejs.:

1- A en secuencias GATC: Dam metilasas

2- Cs en secuencias CCA/TGG: Dcm metilasas

Función:

Distinguir la hebra antigua de la recién replicada (reparación)

Distinguir DNA propio de extraño, y así poder atacar este porenzimas modificadoras

C. Arizmendi


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Metilación del DNA

• Un evento temprano en la carcinogénesis delos tumores sólidos parece ser una alteraciónen la metilación del DNA.

C. Arizmendi


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Eucariotas: 5-Metil citosina en secuencias CG

Función:

-Evidencias circunstanciales indican que la metilación

desconecta la expresión de genes

-La expresión diferencial de genes de herencia paterna o

materna podría depender de su grado de metilación

(imprinting= impronta)

-El perfíl de metilación se autoperpetúa, si bien no se sabe

cómo se establece en la línea germinal (por primera vez)

o se modifica en la diferenciación celular C. Arizmendi


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C. Arizmendi


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C. Arizmendi


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Secuencias AluLas repeticiones Alu son las secuencias repetitivas móviles más abundantesdel genoma humano. Son secuencias cortas, de unos 300 pares de bases,ricas en guanina y citosina.

El genoma humano puede albergar una secuencia Alu cada 3 kilobases.Cada secuencia Alu está formada por dos repeticiones de unasecuencia de unos 120 pares de bases a las que se les llama monómeros.Flanqueando los monómeros hay repeticiones directas de menor tamaño

(de 6 a 18 pares de bases) y, en el extremo de cada monómero apareceuna zona rica en adenina, en una hebra, y de timina en la hebracomplementaria.

Las secuencias Alu son retrotransposones. Las secuencias Alu participan

también en la regulación epigenética de la expresión génica. Las citosinasde estas repeticiones puede ser metiladas alterando así el grado deempaquetamiento del DNA.

En procesos como el envejecimiento y el cáncer se aprecia una desmetilación

significativa de los elementos Alu.


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Cambios en la secuencia del DNA

Errores de la replicaciónTautomería amino>


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Citosina Adenina(Tautómero imino, raro)


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Radiaciones solares

La luz solar son radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas.Ultravioletas: UVC, UVB y UVA. Pueden provocar cáncer de piel,tanto de tipo “melanoma” como de “no melanoma”.

Factores que influyen en la acción del sol sobre la piel

Altitud geográfica, a mayor, mayor intensidad.La estación del año, el momento del día y la latitud de la zonageográfica.

El clima: la lluvia y las nubes absorben parte de las radiaciones.La superficie: la nieve refleja hasta el 85% de los rayos, y la arenaseca hasta el 17%.


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Anillociclobutilo

La exposición a luz ultravioleta

(principalmente UVA) provoca laformación de dímeros entrebases pirimidínicas consecutivasen una misma hebra

Reparación por sistemas múltiples:

- Reparación directa: Fotoliasa

- Reparación por escisión

- Reparación por recombinación

C. Arizmendi

*

•Las distancias interatómicas entre los C

del ciclobutilo no están a escala


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XERODERMA PIGMENTOSO (XP) es una enfermedad

hereditaria autosómica recesiva que se caracteriza por una

gran sensibilidad a la luz solar.

En XP, aumenta 2000 veces la velocidad de desarrollo de

cancer de piel con desenlace fatal.

La etiología molecular de la enfermedad es el defecto de alguno

de los sistemas de reparación de dímeros de pirimidina. Se conocen

hasta 7 defectos genéticos distintos XP-A a XP-G, lo que indica que al

menos hay 7 genes distintos implicados en la reparación de daños

por luz U.V., cuya mutación causa la enfermedad.

C. Arizmendi


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Sustancias cancerígenasSustancias cancerígenas y mutagénicas

C. Arizmendi


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Mutágenos químicos

• Auerbach y Robson (1946) demostraron lacapacidad mutagénica del gas mostaza y susderivados.

(Un arma química, el “gas mostaza”, que provoca

metilación del DNA , fue considerado secreto militardurante la Segunda Guerra Mundial)

C. Arizmendi


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AGENTES ALQUILANTES

Mostaza nitrogenada Etil nitroso urea

BASES CONRADICALES ALQUILO

O6

-metil guanina

Los agentes alquilantes provocan transversiones

C. Arizmendi

Esta metilación es mutagénica: ¡NO CONFUNDIR CON LAMETILACIÓN EPIGENÉTICA!


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5-Bromo uracilo Guanina(tautómero enol)


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• La presencia de Bromo desoxiuridina,además, provoca roturas en el DNA,por lo que se ha propuesto comoantiviral y antineoplásico


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•Si los cambios no se reparan, aparecen:

-Mutaciones puntuales (transiciones otransversiones)

-Delecciones

-Inserciones

•La acumulación de mutaciones

>>>>>>>CANCER


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DETECCIÓN YREPARACIÓN DEEMPAREJAMIENTOS

ERRÓNEOSEN PROCARIOTAS

EN EUCARIOTAS SE HANDESCRITO PROTEÍNASCON FUNCIÓN SIMILAR


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REPARACIÓN del DNA ___________________

Sistemas múltiples-directo: fotoliasa y alquil transferasas-escisión:

-de bases: cuando una base está modificada o se ha

perdido (espontáneamente):DNA glicosilasasEndonucleasas APDNA polimerasa y ligasa

-de nucleótidos: ej: en reparación de dímeros de timinas

-recombinación:

C. Arizmendi


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Reparación directa

- Fotoliasa ó enzima foto-reactivante.

Rompe ciclobutilo en dos etapas:

La primera puede ocurrir enoscuridad; la segunda, requiere luzvisible (300-500nm) que es captada porN5,N10 metilenFH4, el cual, a través delintermediario coenzima FADH, cede unelectrón al anillo ciclobutilo, que sedeshace .

C. Arizmendi


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Reparación directa

-Alquil transferasas

Proteínas que captan los residuos metilo y

etilo de las bases aminadas, modificándose ellas.(No se deberían llamar enzimas porque se modifican covalente e

irreversiblemente en el transcurso de la reacción que catalizan).

Los agentes alquilantes provocan cancer si

fracasa la reparación.

C. Arizmendi


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Reparación por escisión de bases:

DNA Glicosilasa o despurinación espontánea

C. Arizmendi


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Endonucleasas apurínicas y apirimidínicas:

catalizan la hidrólisis de dos enlaces fosfodiéster: se liberauna pentosa fosforilada si esta ha perdido la base púrica ypirimidínica, respectivamente.

DNA polimerasa y ligasa:

catalizan la formación de un enlace fosfodiéster que “inserta” el nucleótido que falta (polimerasa) y “sella” la última uniónfosfodiéster (ligasa)

C. Arizmendi


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MECANISMO DE REPARACIÓN POR ESCISIÓN DEDÍMEROS DE PIRIMIDINAS y REPARACIÓN DE MELLAS

UvrABC endonucleasa

DNA polimerasa, ligasa

12 NT en E.coli;>25 NT en

eucariotas

C. Arizmendi

REPARACIÓN DE MELLAS


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REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN

DNA con dímero de pirimidina

Hebra parental dañadaHebra hija mellada

REPLICACIÓN

DNA bicatenario normalReparación porrecombinación

Hebra parental dañada

Hebra hija reparada

Hebra hija melladaHebra hija normal

Reparación demella DNA con dímero de pirimidina a

reparar por otra vía

DNA bicatenario normal

REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN

C. Arizmendi


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MUCHOS GENES DE REPARACIÓN SE ACTIVAN CONJUNTAMENTE:

RESPUESTA SOS*

Proteína represoraLexA

Proteína LexAdegradada

Autoproteolisisactivada porssDNA-RecA

Niveles bajos de mRNAde proteínas de

reparación

Niveles elevados demRNA de proteínas de

reparación

C. Arizmendi*SOS= “ Save Our Souls”


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Dos moléculas de DNA bicatenariointercambian parcialmente secuencias

homólogas.

En células eucariotas se ha observado queocurre durante la meiosis.

Recombinación homóloga


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INTERSECCIÓN DE HOLLIDAY

Holliday,

https://moodle.usal.es/mod/resource/view.php?inpopup=true&id=591863


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Holliday,1967 Alineamiento

Corte

Migración

Invasión

Empalme

Migración de la rama

Giro, resolución yseparación

RecA implicada en la


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DIRECCIÓN DEL INTERCAMBIO DELA HEBRA

DNA cuádruple

DNA triple

RecA implicada en larecombinación

R

RecA

RecA utiliza energía de ATP, que hidroliza


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La importancia de la reparación por

recombinación en humanos se pone de manifiestopor la observación de que los defectos en lasproteínas BRCA1 y BRCA2, -que ambas interactúancon RAD51-, están asociados con un aumento en la

incidencia de cánceres de páncreas, ovarios, mama,y próstata.

Rec A es una proteína de E.Coli. En eucariotas la

proteína homóloga funcional de RecA se llamaRAD51.


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Rec BCD (300 kD;actividad helicasa ynucleasa) y RuvA, B

y C (migración de larama y resolución)participan en larecombinación,

además de SSBs,topoisomerasa, yligasa

RuvB: ATPasa

necesaria paraconducir la migraciónde la rama


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Transposición

Barbara McClintock (1931 a 1957) en maíz. Recibió el premioNobel de Fisiología y Medicina en 1983…….

"for her discovery of mobile genetic elements“

Lecture:The Significance of Responses of theGenome to Challenge

“….The responses of genomes to unanticipated challenges are not so preciselyprogrammed. Nevertheless, these are sensed, and the genome responds in a

descernible but initially unforeseen manner………”


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LOS TRANSPOSONES MÁS SENCILLOS SON

SECUENCIAS DE INSERCIÓN: IS

(


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REPETICIÓN

INVERTIDA

TRANSPOSÓN

REPARACIÓN DE MELLA YLIGACIÓN


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TRANSPOSONES (nivel de complejidadsuperior a IS):

• COMPLEJOS: con genes implicados en el

mecanismo de transposición y, además, genesde resistencia a antibióticos. P.e., el transposónTn3 (4957 bp) de E. Coli.


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amp tnpA tnpR

REPETICIÓN

INVERTIDA

SITIO DERESOLUCIÓN

INTERNA

TRANSPOSASA

REPETICIÓN

INVERTIDA

Represor yresolvasa

-Lactamasa

MAPA DEL TRANSPOSÓN Tn3 (E. coli)


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TRANSPOSONES (nivel de complejidadsuperior a IS):

COMPLEJOS: con genes implicados en el

mecanismo de transposición y genes deresistencia a antibióticos, p.e., el transposónTn3

COMPUESTOS: con genes de cualquier tipoen la región central, además de los genes quellevan los transposones complejos


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LA TRANSPOSICIÓN ES RESPONSABLE

DE MUCHOS REORDENAMIENTOS GENÉTICOS.

Los transposones promueven cambiosde secuencia y delecciones

MECAMECANISMO


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Transposones conorientaciones invertidas

Transposomisma or

Emparejamiento de

repeticiones invertidas

A

rep

Recombinación

Segmento invertido Cromosoma conteniendo

un transposón

MECAD

DELE

MECANISMODE

INVERSIÓN

A) B)

MECANISMONISMO


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ones cons invertidas

Transposones con lamisma orientación

pareamiento de

eticiones invertidas

Emparejamiento de

repeticiones directas

Recombinación

nvertido Cromosoma conteniendo

un transposón

Segmento deleccionadoconteniendo otro

transposón

MECANISMODE

DELECCIÓN

NISMODERSIÓN

B)


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COMPOSICIÓN DEL GENOMA HUMANO

DNA ¿”chatarra”?

TRANSPOSONES

3%


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Los transposones de eucariotas recuerdan

a los retrovirus: reciben el nombre de

retrotransposones o retroposones. Seconsideran fósiles genéticos

Los retrovirus son virus RNA que mediante

la actividad transcriptasa inversa se

convierten en DNA bicatenario que sepuede integrar en el genoma de la célula

infectada.


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RNA MONOCADENA

dNTPs DNA polimerasa dirigida porRNA

Híbrido RNA-DNA

RNAsa H

DNA MONOCADENA

NMP

DNA polimerasa dirigida por DNAdNTPs

DNA DOBLE CADENA

Transcriptasa

Inversa


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Transcriptasa inversa del virus HIV consiste en dos

subunidades, p66 :p51, codificadas por un único gen delgenoma viral

p66 tiene dominio DNA polimerasa y

dominio RNAsa H.

p51 tiene dominio DNA polimerasa y

dominio RNAsa H truncado.

TRANSCRIPTASA INVERSA DEL VIRUS


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TRANSCRIPTASA INVERSA DEL VIRUSHIV (SIDA)

(HIV-1 RT: Human Immunodeficiency Virus-1

Reverse Transcriptase) ESTRUCTURA DIMÉRICA p66-p51


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20% de los cánceres se atribuyen a virus exógenos. Porejemplo, HIV 1 y HIV2 son causa indirecta de linfomas y sarcoma deKaposi. Papilomavirus humanos pueden causar cáncer de cuello deútero y de pene.

Los virus endógenos HERV (H uman E ndogenous Retrov irus)también se han asociado al desarrollo de diversas patologías. Existenelementos ligados a HERVs que se repiten masivamente en el genomahumano. Por ejemplo, los elementos Alu: secuencias genéticas

específicas que pueden inducir mutaciones que alteran la expresióngénica.

Secuencias Alu


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Secuencias AluLas repeticiones Alu son las secuencias repetitivas móviles más abundantesdel genoma humano. Son secuencias cortas, de unos 300 pares de bases,ricas en guanina y citosina.

El genoma humano puede albergar una secuencia Alu cada 3 kilobases.Cada secuencia Alu está formada por dos repeticiones de unasecuencia de unos 120 pares de bases a las que se les llama monómeros.Flanqueando los monómeros hay repeticiones directas de menor tamaño

(de 6 a 18 pares de bases) y, en el extremo de cada monómero apareceuna zona rica en adenina, en una hebra, y de timina en la hebracomplementaria.

Las secuencias Alu son retrotransposones. Las secuencias Alu participan

también en la regulación epigenética de la expresión génica. Las citosinasde estas repeticiones puede ser metiladas alterando así el grado deempaquetamiento del DNA.

En procesos como el envejecimiento y el cáncer se aprecia una desmetilación

significativa de los elementos Alu.


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Dichas secuencias Alu son retrotransposones, y se considera que son

responsables de:

- algunos trastornos en la línea germinal, individual y/o familiar,como neurofibromatosis, hemofilia, cáncer de mama y síndrome deApert

- generar "recombinaciones ectópicas", que se consideransubyacentes a la diabetes tipo 2 (insulinorresistente), a la enfermedadde Tay- Sachs, a la hipercolesterolemia familiar y a la alfa-talasemia.

- cánceres como el sarcoma de Ewing, y la leucemia mieloideaguda.


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Existen incluso posibles interacciones de Alu con retrovirusexógenos como el HIV-1.

Cánceres asociados con los HERV son el seminoma,teratocarcinoma testicular, coriocarcinoma, y cáncer pulmonarde células pequeñas.

(Asimismo, se han relacionado con HERV algunos casos de distrofiamuscular, con enfermedades autoinmunes como los trastornosreumáticos, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple.Sin embargo, hasta la fecha no se ha probado ninguna de estas

asociaciones como causa definitiva de patología ).

Debe tenerse en cuenta que los HERV no son virus agudos,sino “elementos simbióticos” que han estado integrados en elgenoma humano durante millones de años.

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