Embed Size (px)
Citation preview
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------
TRẦN QUỐC KHÁNH
TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B
TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------
TRẦN QUỐC KHÁNH
TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B
TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ TRUNG
TS. NGUYỄN ĐÌNH THẮNG
Hà Nội – 2016
iii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Trung, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Đình Thắng (Bộ môn sinh lý thực
vật và hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) cùng các thầy giáo, cô giáo
trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực
vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong
thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại
Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện luận văn tại phòng.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động viên
tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016
Học viên
Trần Quốc Khánh
iv
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Máu và hệ thống nhóm máu ở người 3
1.2. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu 7
1.3. Kháng thể đơn dòng 10
1.3.1. Khái niệm 10
1.3.2. Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng 11
1.3.3. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 14
1.3.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam 17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19
2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Mẫu nghiên cứu 19
2.1.2. Sinh phẩm 19
2.1.3. Máy móc và thiết bị 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Gây miễn dịch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch 20
2.2.1.2. Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch 23
2.2.2. Chuẩn bị tế bào nền 23
2.2.3. Nuôi cấy tế bào myeloma 24
2.2.4. Dung hợp và tạo dòng tế bào lai 24
2.2.5. Sàng lọc tế bào lai 26
2.2.6. Tách dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên
B 27
2.2.7. Đánh giá tốc độ sinh trưởng và sản xuất kháng thể của tế bào lai 28
2.2.8. Phương pháp đếm tế bào lai (xác định số lượng tế bào sống) 29
2.2.9. Xác định loại globulin miễn dịch và kiểm tra tính đơn dòng của tế bào lai 29
v
2.2.10. Đánh giá kháng thể do tế bào lai sản xuất 31
2.2.11. Cô đặc kháng thể bằng ammonium sulfate 32
2.2.12. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu B 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1. Lựa chọn nguyên liệu và gây miễn dịch cho chuột 35
3.1.1. Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột 35
3.1.2. Cách thức gây miễn dịch cho chuột 35
3.2. Nghiên cứu tạo tế bào lai giữa myeloma và tế bào lympho B chuột 37
3.2.1. Nuôi cấy tế bào đại thực bào để tạo lớp tế bào nền 37
3.2.2. Nghiên cứu tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu
hồng cầu mang kháng nguyên B 38
3.2.2.1. Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của chuột
đã gây miễn dịch bằng hồng cầu B 38
3.2.2.2. Dung hợp giữa tế bào myeloma sp2/0 và hỗn hợp tế bào giàu tế bào
lympho B tách từ chuột gây miễn dịch bởi hồng cầu mẫu B 39
3.2.2.3. Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B 41
3.2.2.4. Khả năng sinh trưởng của tế bào B4D10C9 42
3.2.2.5. Khả năng sản xuất mAb kháng kháng nguyên B của dòng tế bào lai
B4D10C9 43
3.2.2.6. Xác định độ đặc hiệu mAb do B4D10C9 sản xuất 44
3.2.2.7. Cường độ và ái tính mAb do B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B 44
3.2.2.8. Xác định phân lớp mAb do dòng tế bào B4D10C9 sinh ra 45
3.2.2.9. Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 47
3.2.2.10. Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên Bảng Trang
Bảng 1.1. Các nhóm máu hệ ABO ở người 06
Bảng 1.2. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu 09
Bảng 1.3. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu 10
Bảng 3.1. Biến động hiệu giá kháng thể trung bình khi gây miễn dịch
theo các con đường khác nhau 35
Bảng 3.2. Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp
tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách và hạch bẹn
chuột gây miễn dịch bằng hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma
sp2/0 37
Bảng 3.3. Số giếng chứa tế bào lai tiết kháng thể gây ngưng kết hồng cầu
mẫu B 40
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình Trang
Hình 1.1. Kháng nguyên nhóm máu ở người 5
Hình 1.2. Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO
7
Hình 1.3. Sơ đồ truyền máu 8
Hình 1.4. Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu 11
Hình 1.5. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể 13
Hình 2.1. Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột 22
Hình 2.2. Gây miễn dịch cho chuột bằng cách tiêm vào hai gan bàn chân chuột
22
Hình 2.3. Cách đọc kết của của phản ứng ngưng kết hồng cầu trên đĩa 96 đáy chữ V
27
Hình 2.4. Sơ đồ pha loãng tới hạn 28
Hình 2.5. Vị trí các ô đếm trong buồng đếm tế bào 29
Hình 2.6. Cách đọc kết quả trên đĩa elisa của bộ kit Pierce® Rapid ELISA mouse mAb.
31
Hình 3.1. Hình ảnh tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh 38
Hình 3.2. Ảnh chụp tế bào lai quan sát dưới kính hiển vi soi ngược (độ phóng đại 1000 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x).
40
Hình 3.3. Minh họa 5 giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A và O
41
Hình 3.4. Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu mẫu B
42
Hình 3.5. Hiệu giá kháng thể của các dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết hồng cầu B
42
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng trong môi trường DMEM +10% FBS và DMEM+1% FBS
43
viii
theo thời gian
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian của dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trong môi trường DMEM+1%FBS và DMEM+10% FBS
44
Hình 3.8. Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B của mAb do tế bào lai B4D10C9 sinh ra
45
Hình 3.9. Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái tính mAb do dòng tế B4D10C9 sinh ra với hồng cầu mẫu B
45
Hình 3.10. Phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể do dòng tế bào B4D10C9 sản xuất
46
Hình 3.11. Dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trước và sau khi tủa
ammonium sulphate
47
Hình 3.12. Cường độ phản ứng của kháng thể kháng B trước và sau
khi tủa
48
Hình 3.13. Phản ứng ngưng kết hồng cầu của kháng thể kháng B thu
được sau khi tủa bằng ammonium sulphate
48
Hình 3.14. Kháng thể kháng B (anti-B) được hoàn nguyên trong dung
dịch hoàn nguyên màu vàng. A. dung dịch chứa kháng thể B
(anti-B); B. dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B
50
Hình 3.15. A. Phản ứng ngưng kết của sinh phẩm B với hồng cầu mẫu
A, B và O; B. Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B
50
ix
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng việt
anti-A Anti-A antibody Kháng thể kháng A
anti-AB Anti-AB antibody Kháng thể kháng AB
anti-B Anti-B antibody Kháng thể kháng B
BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's
Medium
Môi trường Dulbecco biến
đổi
DMSO Dimethyl sulfoxide
E. coli Escherichia coli
EBV Epstein – Barr virus Virus Epstein-Barr
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
ELISA enzyme-linked immunosorbent
assays
Fab Fragment antigen-binding Mảnh liên kết kháng
nguyên
FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bê
FCA Freund’s complete adjuvant Tá chất hoàn toàn
FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ
FIA Freund’s incomplete adjuvant Tá chất không hoàn toàn
HAT hypoxanthyl aminoteptrin
thymidine
HGPRT hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase
HT hypoxanthyl thymidine
mARN Messenger RNA ARN thông tin
PBS Phosphate buffered saline Đệm muối phosphate
PEG polyethylene glycol
RPMI Roswell Park Memorial Institute
medium
Môi trường RPMI
WHO World Health Organisation Tổ chức y tế thế giới
1
MỞ ĐẦU
Máu là thành phần vô cùng quý giá trong điều trị bệnh mà cho đến nay vẫn
chưa có một sinh phẩm nào có thể thay thế được, đặc biệt máu được sử dụng trong
điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học
cao cấp như ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận. Tuy nhiên, việc sử dụng máu
trong điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, do có sự ngưng kết giữa kháng nguyên
trên màng hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận. Để
quá trình truyền máu thành công phải có sự tương thích giữa máu người cho và
người nhận. Do đó, trước khi truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu.
Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn
300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau. Hầu hết các kháng nguyên trên màng
hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu được dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ
huyết thống, chỉ có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng
ngưng kết khi truyền máu dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm
máu ABO và kháng nguyên D của hệ nhóm máu Rh. Các nhóm máu nêu trên được
xác định bằng phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu hoặc huyết thanh
mẫu. Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên
nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB được sử dụng trong
xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ
Rh. Nhiều phương pháp được phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng như công
nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ
kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene. Phương pháp lai tế bào đã được
ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng
nguyên nhóm máu hệ ABO. Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có bản chất là
kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công như Blood Grouping (Prestige
Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international),
Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad).
Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy
việc sử dụng huyết thanh mẫu càng gia tăng. Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản
xuất được kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu
2
mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại. Việc sử
dụng hồng cầu mẫu làm thuốc thử xác định nhóm máu tốn ít chi phí nhưng lại mất
rất nhiều máu thu được từ người tình nguyện. Còn sử dụng huyết thanh mẫu nhập
ngoại lại có giá thành cao làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân. Xuất phát
từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng tế bào
lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu
người” với mục tiêu tạo ra dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng
kháng nguyên B sử dụng như thuốc thử xác định nhóm máu B ở người.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Máu và hệ thống nhóm máu ở người
1.1.1. Khái niệm máu và các thành phần của máu
Máu là một tổ chức di động được tạo thành từ thành phần là các tế bào (hồng
cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu) và huyết tương (chứa
protein, muối khoáng, nước) với vai trò cung cấp các chất nuôi dưỡng và cấu tạo
các tổ chức cũng như loại bỏ các chất thải trong quá trình chuyển hóa của cơ thể
như khí CO2 và acid lactic. Đồng thời máu cũng là phương tiện vận chuyển của các
tế bào (cả tế bào có chức năng bảo vệ cơ thể lẫn tế bào bệnh lý) và các chất khác
nhau (các amino acid, lipid, hormone) giữa các tổ chức và cơ quan trong cơ thể. Các
rối loạn về thành phần cấu tạo của máu hay ảnh hưởng đến sự tuần hoàn bình
thường của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng của nhiều cơ quan khác nhau [3,
4]. Máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60 - 70 ml/kg); thể tích máu ở nam khoảng
5 - 6 lít, nữ 4,5 – 5 lít; tỷ trọng 1,055 – 1,063, pH 7,33 – 7,43.
Hồng cầu
Hồng cầu trưởng thành là bào quan hình đĩa lõm, không chứa nhân và các
bào quan (ty lạp thể, polyribosom) do vậy không có khả năng tổng hợp protein,
hồng cầu chứa chủ yếu huyết sắc tố làm nhiệm vụ gắn O2 ở phổi vận chuyển tới các
tổ chức sau đó vận chuyển CO2 đào thải qua phổi. Hồng cầu trưởng thành sống 120
ngày, được phân giải chủ yếu ở lách và tổ chức liên võng khác. Sự cân bằng giữa
môi trường và hồng cầu được duy trì bởi hoạt động của bơm natri nằm trên màng
hồng cầu.
1.1.2. Vai trò của máu trong y học
Máu mang oxy và các chất dinh dưỡng (protein, gluco, lipit, muối khoáng,
các nội tiết tố ...) đến các tế bào, đồng thời cũng mang đi các sản phẩm dư thừa của
các tế bào này. Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để chống lại các
tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi mạch máu
bị tổn thương để ngăn chặn sự mất máu. Máu được vận chuyển đi khắp cơ thể qua
4
hệ thống tuần hoàn. Khi cơ thể bị viêm nhiễm, máu vận chuyển nhiều tế bào miễn
dịch đến vị trí lây nhiễm để ngăn chặn các tác nhân có hại [15].
Với những chức năng như trên máu đóng vai trò rất quan trọng đối với cơ
thể, thiếu máu hoặc máu không thực hiện được chức năng sẽ gây ra nhiều rối loạn
cho toàn bộ cơ thể. Mất máu do phẫu thuật, bị thương hoặc bị ốm. Cơ thể thiếu máu
(bệnh thiếu máu địa trung hải, bệnh thiếu máu cấp, tủy xương giảm khả năng sản
xuất hồng cầu đối với người xạ trị) hoặc do máu không thực hiện được chức năng
(bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm v.v) [4].
1.1.3. Phân loại các hệ thống nhóm máu ở người
Việc sử dụng máu để điều trị đã được áp dụng từ thế kỷ 17 và trong suốt thế
kỷ 18, tuy nhiên nhiều tai biến rất nguy hiểm đã xảy ra nhưng mãi đến năm 1900
con người mới bắt đầu hiểu được nguyên nhân của tai biến là do sự ngưng kết giữa
kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của
người nhận. Năm 1901, Karl Landsteiner là người đầu tiên phát hiện ra hệ thống
nhóm máu ABO, phân loại các nhóm máu dựa vào kháng nguyên bề mặt trên màng
tế bào hồng cầu, với phát hiện này, ông đã được nhận giải Nobel về sinh lý và y học
năm 1930. Nghiên cứu của ông chỉ ra rằng kiểu nhóm máu của những người khác
nhau có thể không giống nhau và phụ thuộc vào kháng nguyên tồn tại trên màng
hồng cầu. Do đó, nhóm máu được phân loại dựa vào sự có mặt hoặc không có mặt
của kháng nguyên A hoặc kháng nguyên B trên màng hồng cầu và việc xác định
nhóm máu trước khi truyền máu là cần thiết [5].
Năm 2014, theo thống kê của Hiệp hội truyền máu Quốc tế có khoảng 35 hệ
thống phân loại nhóm máu (hệ ABO, hệ Rh, hệ MNS, hệ Kell, hệ Kidd, hệ Lewis,
hệ Duffy, hệ Indian,…) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau [6]. Trên
màng hồng cầu người có khoảng 30 loại kháng nguyên thường gặp và hàng trăm
loại kháng nguyên hiếm gặp. Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng
cầu có tính kháng nguyên yếu, thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền chỉ
có 2 kháng nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ
thống nhóm máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong
5
truyền máu và trong sản khoa.
Kháng nguyên nhóm máu có thể là đường (glycan hoặc carbohydrate) hoặc
protein, chúng liên kết với các thành phần khác nhau trên màng hồng cầu. DNA của
người quy định kiểu kháng nguyên hình thành trên màng tế bào hồng cầu của họ:
kháng nguyên đường; kháng nguyên protein (protein xuyên màng một lần, nhiều lần
và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol). Kháng nguyên nhóm máu ABO
có bản chất là đường. Chúng được sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham
gia của các enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đường. DNA quy định kiểu
enzyme của mỗi cá thể thông qua đó quy định kiểu kháng nguyên đường hình thành
tương ứng trên màng tế bào hồng cầu. Ngược lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh
lại có bản chất là protein, DNA của cá thể mang thông tin di truyền quy định protein
- kháng nguyên. Gen RhD mã hóa kháng nguyên D, được biểu hiện ở những người
mang gen, một vài người có gen không sản xuất kháng nguyên D và do đó protein
RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ. Bên cạnh kháng nguyên đường, tế bào
hồng cầu có ba loại protein mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng
một lần, protein xuyên màng nhiều lần và protein liên kết
glycosylphosphatidylinositol (GPI) [9].
Hình 1.1. Kháng nguyên nhóm máu ở người
1.1.4. Hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên nhóm máu ABO
Theo Landsteiner, trên màng hồng cầu có những kháng nguyên được gọi là
6
ngưng kết nguyên. Có 2 loại ngưng kết nguyên là A và B. Ngưng kết nguyên là
polysaccharide có mặt trên màng hồng cầu từ giai đoạn sớm của bào thai. Ðồng thời
trong huyết tương có những kháng thể đặc hiệu của nhóm máu được gọi là ngưng
kết tố. Có 2 loại kháng thể đặc hiệu là kháng A (anti-A) và kháng B (anti-B). Các
kháng thể này có khả năng làm ngưng kết hồng cầu khi hồng cầu nhóm máu A gặp
anti-A, hoặc hồng cầu nhóm máu B gặp anti-B. Tùy theo, sự có mặt hoặc vắng mặt
của một trong hai hoặc cả hai kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu,
Landsteiner phân hệ thống nhóm máu ABO thành 4 nhóm máu A, B, AB và O
(Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các nhóm máu hệ ABO ở người
Nhóm máu
Hồng cầu có kháng nguyên A hoặc B
Huyết thanh có kháng thể anti-A hoặc anti-B
A A anti-B
B B anti-A
AB A và B (không có)
O (không có) anti-A và anti-B
Về bản chất, kháng nguyên nhóm máu ABO là các carbohydrate có mặt trên
màng hồng cầu và nhiều mô, được đặc trưng bởi một gốc đường đặc hiệu (Hình
1.2). Các chuỗi đường này được gắn trên bề mặt hồng cầu bởi một phần có cấu trúc
giống nhau được gọi là thân carbonhydrate (kháng nguyên H). Chuỗi đường cơ bản
này không gây ngưng kết hồng cầu nên hồng cầu mang chuỗi đường cơ bản được kí
hiệu là nhóm máu O. Khi chuỗi đường cơ bản gắn thêm một gốc đường galactose
hoặc galactosamine thì chúng gây ngưng kết hồng cầu B, nên đặc trưng cho nhóm
máu B. Chuỗi đường đặc trưng nhóm máu B được gắn thêm một nhóm N-acetyl thì
chúng gây ngưng kết hồng cầu A nên đặc trưng cho nhóm máu A [10].
7
Hình 1.2. Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO
(RBC – tế bào hồng cầu, GLU – Glucose, GAL – Galactose/Glucosamine,
FUC – Fructose, NAc – N-Acetyl)
Hệ miễn dịch có hiện tượng chống lại các kháng nguyên khác với kháng
nguyên tự thân của hồng cầu. Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu
mà không có kháng nguyên B do đó có kháng thể kháng kháng nguyên B trong
huyết thanh. Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng
thể kháng A trong huyết thanh. Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B
trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B
trong huyết thanh. Còn người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể
kháng A và kháng B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B [11].
1.2. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu
1.2.1. Nguyên tắc truyền máu
Truyền máu là quá trình đưa các thành phần của máu vào trong tĩnh mạch
của một người khác. Trước đây, sử dụng máu toàn phần để truyền máu nhưng hiện
nay các thành phần của máu được truyền trong các trường hợp khác nhau, hồng cầu
được sử dụng để tăng khả năng vận chuyển oxy máu, tránh sự mệt mỏi và các biến
chứng khác. Truyền máu mất khoảng 1-4 giờ phụ thuộc vào thành phần và thể tích
máu được truyền. Hầu hết truyền máu được thực hiện tại bệnh viện nhưng nó cũng
được thực hiện ở bất cứ nơi nào khi cần thiết. Trong hầu hết trường hợp, máu có
nguồn gốc từ những tình nguyện viên đã sàng lọc bằng huyết thanh 5 bệnh nhiễm
trùng: HIV, HCV, HBV, giang mai, sốt rét [12].
Màng của mỗi tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên tự thân, được
8
bỏ qua bởi hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, trong quá trình truyền máu, các kháng
thể nhóm máu có trong huyết tương của người nhận sẽ tấn công bất kỳ tế bào hồng
cầu cho nào mang kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau đó phá hủy
hồng cầu gây ra phản ứng tan máu cấp tính. Do đó, xác định sự tương thích nhóm
máu giữa người cho và người nhận cũng như sự tương tích nhóm máu giữa người
cho và người nhận là cần thiết để truyền máu an toàn [13].
Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt hồng cầu (A hoặc B) và kháng
thể trong huyết thanh (anti-A hoặc anti-B) quá trình truyền máu được thực hiện theo
nguyên tắc sau [15].
- Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng
nguyên B, có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh, do đó có thể
truyền máu cho người có nhóm máu A hoặc AB.
- Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể
kháng A trong huyết thanh, do đó có thể truyền máu cho người có nhóm máu B
hoặc AB.
- Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do
vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B trong huyết thanh, do đó chỉ
có thể truyền máu cho người có nhóm máu AB.
Người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng A và kháng B
do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B do đó có thể truyền máu cho
tất cả các nhóm máu.
Hình 1.3. Sơ đồ truyền máu
9
1.2.2. Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO
Nhóm máu hệ ABO được xác định bằng phương pháp huyết thanh mẫu hoặc
phương pháp hồng cầu mẫu. Theo thông tư của Bộ Y tế (2013) để kết luận một
nhóm máu thuộc hệ ABO thì mẫu máu phải được định nhóm bằng cả hai phương
pháp: phương pháp huyết thanh mẫu và phương pháp hồng cầu mẫu.
Phương pháp huyết thanh mẫu dùng huyết thanh đã biết trước kháng thể cho
phản ứng với hồng cầu của bệnh nhận để xác định sự có mặt của kháng nguyên trên
bề mặt hồng cầu từ đó xác định được kiểu nhóm máu của bệnh nhân. Các mẫu
huyết thanh dùng để xác định nhóm máu hệ ABO bao gồm: huyết thanh mẫu anti-
A, anti-B và anti-AB. Cách xác định nhóm máu thông qua phương pháp huyết thanh
mẫu như sau (Bảng 1.2).
- Không bị ngưng kết với 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu là nhóm máu O.
- Ngưng kết với cả 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu thuộc nhóm máu AB.
- Ngưng kết ở mẫu anti-A và anti-AB thì mẫu là nhóm máu A.
- Ngưng kết ở vị trí Anti-B và Anti-AB thì mẫu kiểm tra là nhóm máu B
Bảng 1.2. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu
Anti-A Anti-B Anti-AB
Nhóm máu A + - +
Nhóm máu B - + +
Nhóm máu AB + + +
Nhóm máu O - - -
(+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết; (-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết
Phương pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu đã biết trước kháng
nguyên cho phản ứng với kháng thể của bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt
trong huyết thanh từ đó xác định kiểu nhóm máu của bệnh nhân.
10
Bảng 1.3. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu
Hồng cầu mẫu A Hồng cầu mẫu B Hồng cầu mẫu O
Nhóm máu A - + -
Nhóm máu B + - -
Nhóm máu AB - - -
Nhóm máu O + + -
(+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết;
(-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết
1.3. Kháng thể đơn dòng
1.3.1. Khái niệm
Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng cảm ứng sự hình thành
kháng thể và phản ứng đặc hiệu với kháng thể được tạo ra. Chúng phản ứng với cả
thụ thể của tế bào T. Trên mỗi phân tử kháng nguyên có các yếu tố quyết định
kháng nguyên gọi là epitope và mỗi epitope đặc hiệu với một kháng thể do đó một
kháng nguyên có thể liên kết với nhiều kháng thể tại các vị trí liên kết khác nhau.
Hai đặc tính quan trọng của kháng nguyên là: 1) tính kháng nguyên (có khả năng
kích thích hệ miễn dịch của cơ thể); 2) tính miễn dịch (có khả năng kết hợp với
kháng thể và các tế bào lympho). Kháng nguyên chia ra thành 2 loại kháng nguyên
phụ thuộc tuyến ức (yêu cầu sự tham gia của tế bào T) hoặc kháng nguyên không
phụ thuộc tuyến ức (không yêu cầu sự tham gia của tế bào T để sản xuất kháng thể
mà trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu) [14].
Kháng thể là các phân tử glycoprotein sản xuất bởi tế bào B của hệ miễn
dịch. Mỗi phân tử kháng thể gồm 2 chuỗi polypeptide ngắn giống nhau được gọi là
chuỗi nhẹ và 2 chuỗi polypeptide dài giống nhau được gọi là chuỗi nặng. Bốn chuỗi
này được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ Y.
- Mỗi chuỗi nhẹ gồm một vùng cố định (trình tự axit amin không thay đổi có
thể là kappa - κ hoặc lamda - λ) và một vùng biến đổi (có trình tự axit amin biến đổi
là vị trí liên kết với kháng nguyên).
11
- Mỗi chuỗi nặng gồm ba hoặc bốn vùng cố định (CH1, CH2, CH3) và một
vùng biến đổi (VH) đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ, có trình tự amino
acid rất khác nhau giữa các phân tử kháng thể. Hầu hết phần khác nhau này thuộc
khu vực siêu biến đổi và thường chỉ gồm 6-10 amino acid. Chuỗi nặng của kháng
thể có thể là γ (IgG), α (IgA), µ (IgM), ε (IgE) hoặc δ (IgD), IgG, IgA và IgD có 3
vùng hằng định và một vùng bản lề, IgM và IgE có 4 vùng hằng định nhưng không
có vùng bản lề [17].
Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế bào B và
nhận diện đặc hiệu một epitope trên kháng nguyên.
Hình 1.4. Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu
1.3.2. Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng là công cụ hữu ích trong nhiều nghiên cứu y sinh và có
giá trị kinh tế cũng như giá trị y học lớn. Một số lượng lớn kháng thể đơn dòng đã
được ứng dụng cho chẩn đoán, trị liệu và các xét nghiệm có độ nhạy cao [18].
Một số ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong lĩnh vực khoa học, công
nghệ, y tế [6]:
- Xác định hormon: Kháng thể đơn dòng được sử dụng để xác định mức
hormon trong máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đoán các bệnh liên quan đến tuyến
nội tiết như định lượng các hormon LH, FSH, progesteron, ostrogen.
- Trong phân loại vi sinh vật: Kháng thể đơn dòng giúp định loại vi khuẩn,
12
virus, nấm gây bệnh ở người, động vật.
- Trong dược học: Nghiên cứu dược động học của thuốc (quá trình biến đổi
và đào thải của thuốc trong cơ thể). Dùng phát hiện các thuốc bị cấm sử dụng
(doping, các chất gây nghiện), các chất độc hại với cơ thể tồn dư trong lương thực,
thực phẩm.
- Trong ghép tủy xương: Sau khi ghép tủy xương, muốn tránh hiện tượng đào
thải mảnh ghép, người ta phải sử dụng thuốc chống đào thải làm ức chế hệ miễn
dịch dẫn đến hệ thống phòng ngự của cơ thể bị tê liệt, dễ nhiễm bệnh. Đưa mAb đặc
hiệu có định hướng vào cơ thể, chúng chỉ ức chế các yếu tố gây hiện tượng đào thải
mảnh ghép mà không ức chế toàn bộ hệ thống miễn dịch của cơ thể, vì vậy mà sức
đề kháng của cơ thể ít bị suy giảm hơn.
- Thử thai: Khi một người nữ mang thai, hormon HCG được bài tiết qua
nước tiểu. Dung dịch mAb kháng HCG liên kết với một enzyme sẽ bị biến đổi màu
khi có sự hiện diện của HCG (Human Chorionic Gonadotropin). Do đó, khi cho
dung dịch này vào ống nghiệm đựng nước tiểu nếu nước tiểu đổi màu thì có thai và
ngược lại.
- Trong bệnh tim mạch: Tơ myosin là một loại tơ cơ cấu thành nên các tế bào
cơ. Một phần myosin của cơ tim bị phá hủy sau cơn nhồi máu. Bằng cách tiêm mAb
đáp ứng với myosin ta có thể xác định được số lượng myosin mất để đánh giá tình
trạng tổn thương của tim. Kháng thể đơn dòng được dùng để xác định vị trí cục máu
đông trong cơ thể bệnh nhân bằng cách gắn vào sợi fibrin khi có cục máu đông. Việc
này giúp các bác sĩ chẩn đoán và xử lý kịp thời.
- Trong việc chống thải loại mô ghép: Kháng thể đơn dòng giúp xác định mô
người cho có tương thích với người nhận hay không và ngăn ngừa hệ thống miễn
dịch của bệnh nhân thải loại mô ghép.
- Trong lĩnh vực chẩn đoán: Việc ứng dụng mAb vào lĩnh vực chẩn đoán đã
đưa ra thị trường sản phẩm que thử nhanh, kit ELISA chẩn đoán nhanh (dựa trên
phản ứng ngưng kết kháng nguyên và kháng thể). Đây là ứng dụng nổi bật và phổ
biến nhất của mAb, trong đó mAb là yếu tố cơ sở không thể thiếu để sản xuất các
13
loại que thử nhanh, kit ELISA phát hiện nhiều loại kháng nguyên khác nhau như
hormon (que thử thai phát hiện HCG, que thử phát hiện LH xác định rụng trứng ở
phụ nữ), tác nhân gây bệnh, morphin, tồn dư kháng sinh, các dấu ấn ung thư như
PSA, AFP.
Hình 1.5. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể
- Trong việc định nhóm máu hệ ABO và Rh: Kháng thể đơn dòng là những
công cụ thiết yếu trong nghiên cứu, điều trị và kỹ thuật chẩn đoán [7, 24]. Nhưng
thành công lớn của mAb là sử dụng trong miễn dịch, huyết học. Ngày nay mAb dần
thay thế kháng thể đa dòng vì tính đặc hiệu, khả năng cung cấp với số lượng lớn, chi
phí sản xuất thấp.
Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO là huyết thanh đa dòng có
nguồn gốc từ người hoặc dịch chiết lectin của thực vật. Ngày nay, mAb được sử
dụng để tạo thuốc thử định nhóm máu hệ ABO [16]. Kháng thể đơn dòng chuột có
nhiều ưu điểm hơn so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người ở việc nhận
diện kháng nguyên A và B yếu, không lẫn tạp kháng thể, giá thành thấp và không bị
phụ thuộc. Đã có nhiều công bố về việc sản xuất thành công mAb chuột để định
nhóm máu hệ ABO. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều sinh phẩm định nhóm
máu hệ ABO có bản chất là mAb đã được thương mại như: Febrile Antigen
Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin
14
international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient).
1.3.3. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng
Một vài phương pháp được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng của
người gồm: bất tử tế bào B, công nghệ phage display, chuột chuyển gen, công nghệ
kháng thể đơn dòng tái tổ hợp [15].
Bất tử tế bào B sản xuất kháng thể đơn dòng
Bất tử tế bào B được thực hiện bằng công nghệ lai tế bào hoặc công nghệ bất
tử EBV (Epstein-Barr virus). Với công nghệ lai tế bào, sự dung hợp giữa tế bào
lympho B miễn dịch và tế bào myeloma (người hoặc chuột) tạo ra tế bào lai mang
đặc tính của cả 2 dòng tế bào đó là khả năng sinh trưởng vô hạn và sản xuất kháng
thể đặc hiệu với kháng nguyên gây miễn dịch. Biến nạp EBV là cách làm bất tử tế
bào lympho B. Tuy nhiên, tế bào lympho B biến nạp EBV không thể sinh trưởng vô
hạn bởi vì chúng không phải là các tế bào ung thư, chúng khó nhân dòng và chỉ sản
xuất một lượng nhỏ kháng thể. Công nghệ tế bào lai - EBV được thiết lập dựa trên
sự kết hợp của 2 phương pháp và duy trì những ưu điểm của cả hai.
Công nghệ phage display sản xuất kháng thể đơn dòng
Công nghệ phage display chọn lọc các gen quy định vùng chức năng (vùng
biến đổi) của kháng nguyên để biểu hiện các mảnh kháng thể chức năng. Các bước
chính trong phage display bao gồm: xây dựng thư viện kháng thể, biểu hiện trên bề
mặt phage, lựa chọn phage biểu hiện kháng thể, sàng lọc phage biểu hiện kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên đích.
Mảnh gen VH và VL được khếch đại từ mARN của tế bào lympho B sử dụng
RT-PCR. Mảnh gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi đơn (single chain fragment
variable - scFv) được tạo ra bằng cách tổ hợp ngẫu nhiên mảnh gen VH và VL sử
dụng PCR. Thư viện sau đó sẽ được tách dòng để biểu hiện scFv trên bề mặt của
thực khuẩn thể. Lựa chọn phage biểu hiện scFv đặc hiệu với kháng nguyên mong
muốn bằng cách cho các dòng thực khuẩn thể biểu hiện scFv liên liên kết với các
kháng nguyên hoặc hapten khác nhau. Các kháng thể không bám được loại bỏ bằng
cách rửa sau đó kháng thể bám được rửa giải và nhân lên bằng cách lây nhiễm vào
15
E. coli. Lặp lại bước này một vài lần thì có thể lựa chọn được các mảnh scFv đặc
hiệu kháng nguyên. Sau đó, sự đặc hiệu của mảnh scFv có thể được sàng lọc sử
dụng phương pháp miễn dịch enzyme hoặc lọc tế bào hoạt hóa huỳnh quang nếu
protein liên kết màng tế bào là đích. Khi sự đặc hiệu đã được phân lập, gen của các
vùng biến đổi kháng thể được đưa vào vector biểu hiện toàn bộ kháng thể người và
chuyển vào tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng người. Một thư viện phage
display phân lập mAb đã được cấp phép bởi FDA và ít nhất 35 mARN người tạo ra
từ công nghệ phage display đã được thử nghiệm lâm sàng.
Chuột chuyển gen sản xuất kháng thể đơn dòng
Sử dụng chuột biến đổi gen là một kỹ thuật khác để tạo kháng thể đơn dòng.
Kỹ thuật chuyển gen chuột gồm sự phân cắt các locus gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi
nhẹ của chuột và chuyển gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi nhẹ kappa của người vào.
Công nghệ kháng thể tái tổ hợp sản xuất kháng thể đơn dòng
Công nghệ kháng thể tái tổ hợp từ dòng tế bào B sản xuất kháng thể được
tiến hành như sau:đầu tiên tiến hành phân lập được tế bào B đơn từ lách chuột hoặc
tế bào máu ngoại vi người (bằng vi hạt mang marker chọn lọc tế bào B) sau đó tách
mRNA tổng hợp cDNA gen mã hóa cho các đoạn biến đổi trên chuỗi nặng và chuỗi
nhẹ của kháng thể (bằng RT-PCR), tiến hành tổ hợp các gen chuỗi nặng và chuỗi
nhẹ (sử dụng kỹ thuật PCR overlapping), cuối cùng biểu hiện trong vector nhân
dòng để sản xuất kháng thể đơn dòng người đặc hiệu in vitro. Đây là phương pháp
biểu hiện kháng thể đơn dòng người có hiệu quả cao, tạo ra lượng lớn kháng thể
đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên trong một thời gian ngắn và yêu cầu một số lượng
ít tế bào.
Công nghệ tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng
Tế bào lai là tế bào được tạo ra sau quá trình dung hợp 2 tế bào và có chức
năng sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn. Tạo tế bào lai sản xuất kháng thể
đơn dòng (kháng thể đặc hiệu kháng nguyên) được tiến hành như sau: gây miễn
dịch trên chuột với kháng nguyên đặc hiệu. Sau một vài tuần, thu máu từ chuột đã
gây miễn dịch để định lượng kháng thể trong huyết thanh. Khi hiệu giá kháng thể
16
đủ cao, thu lách chuột để tách tế bào lympho B. Dung hợp tế bào lympho và ung thư
tủy myeloma thiếu gen HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase),
nuôi cấy tế bào trong môi trường HAT (hypoxanthyl aminoteptrin thymidine). Tế
bào myeloma mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme HGPRT (enzyme
cho phép tế bào tổng hợp purine từ hypoxanthine). Ban đầu, sự vắng mặt của
HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đường thay thế để tổng
hợp purine. Tuy nhiên, khi tế bào nuôi cấy trong môi trường aminoteprin, chúng
không thể sử dụng con đường thay thế khác và nó phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT
để tồn tại. Tế bào lympho B được phân lập từ chuột có enzyme HGPRT và cũng có
khả năng sản xuất kháng thể, khi tiếp xúc với kháng nguyên nó sẽ biệt hóa thành
tương bào plasma sản xuất kháng thể nhưng đó lại là giai đoạn cuối cùng của quá
trình biệt hóa nên chúng không thể nhân lên trong nuôi cấy. Do vậy, chỉ có tế bào
lai mới có khả năng tồn tại trong môi trường HAT. Dịch nuôi cấy tế bào lai được
kiểm tra để tìm những tế bào sản xuất kháng thể mong muốn. Sau khi tạo được
dòng tế bào lai đặc hiệu kháng nguyên thì kháng thể đơn dòng được sản xuất bằng
cách tiêm dòng tế bào lai này vào khoang bụng của chuột hoặc sử dụng kỹ thuật
nuôi cấy tế bào in vitro [20-22].
Đáp ứng miễn dịch ở động vật không chỉ phụ thuộc loại kháng nguyên mà
còn còn phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như kiểu hình di truyền của động vật
chủ, liều lượng kháng nguyên, con đường gây miễn dịch và sự có mặt của các tá
chất miễn dịch. Cấu trúc di truyền của động vật chủ có ảnh hưởng lớn đến khả năng
sinh đáp ứng miễn dịch của động vật chủ cũng như cường độ của đáp ứng đó. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh các gen trong phức hợp MHC có liên quan đến việc
kiểm soát tính sinh miễn dịch của cơ thể. Các protein là sản phẩm của các gen này
tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên cho tế bào T và đóng vai trò trung
tâm quyết định cường độ đáp ứng miễn dịch với một kháng nguyên. Ngoài ra, đáp
ứng miễn dịch của động vật chủ với một kháng nguyên còn phụ thuộc vào các gen
mã hóa các thụ thể của tế bào B, tế bào T nhận diện kháng nguyên và các gen mã
hóa các protein khác tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch. Sự thay đổi di
truyền của tất cả các gen này sẽ ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của động vật
17
chủ với một kháng nguyên đã biết trước.
Tá dược là những chất khi được trộn với kháng nguyên sẽ làm tăng tính sinh
miễn dịch của kháng nguyên bằng cách kéo dài sự tồn tại của kháng nguyên trong
cơ thể của động vật gây miễn dịch. Các tá chất của Freund gồm có kháng nguyên
trong dung dịch nước, dầu khoáng và một chất nhũ hoá, tá chất này được phân tán
dầu thành các giọt nhỏ bao quanh kháng nguyên vì vậy kháng nguyên được giải
phóng rất chậm từ nơi tiêm vào cơ thể. Tá chất Freund hoàn toàn (FCA) có
thêm Mycobarterium đã bị giết bằng nhiệt có hiệu lực cao hơn tá chất Freund không
hoàn toàn (FIA) bởi vì các thành phần muramyl dipeptide của vách tế
bào Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào làm tăng hoạt động thực bào, kích
thích hoạt hoá các tế bào TH. Cả hoạt động trình diện kháng nguyên và các tín hiệu
đồng kích thích tế bào TH đều tăng lên khi có tá chất. Do vậy, tá chất Freund được
sử dụng gây nhũ với hồng cầu để gây miễn dịch cho chuột [28-30].
1.3.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam
Nghiên cứu về kháng thể đơn dòng tại Việt Nam
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về sản xuất kháng thể đơn dòng: Đỗ
Thị Thảo và đồng tác giả (2008) đã thành công trong việc tạo dòng tế bào lai sinh
mAb kháng protein vỏ VP28 của virus WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm sú;
Nguyễn Thị Trang và đồng tác giả (2010) cũng tạo được polyhedrin của virus MBV
gây bệnh còi trên tôm, progesteron-BSA AFP; Lê Quang Huấn và đồng tác giả đã
nghiên cứu tạo mAb kháng tế bào ung thư vú bằng kỹ thuật phase display [1, 2].
Tuy nhiên, đến nay chưa có báo cáo nào về việc tạo mAb kháng các kháng nguyên
trên hồng cầu nhằm ứng dụng trong chẩn đoán và định nhóm máu tại Việt Nam.
Sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu dùng định nhóm máu ở Việt Nam
Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO là huyết thanh đa dòng có
nguồn gốc từ người hoặc dịch chiết lectin của thực vật [14]. Ngày nay, kháng thể
đơn dòng được sử dụng để tạo thuốc thử xác định nhóm máu ABO. Kháng thể đơn
dòng chuột có nhiều ưu điểm hơn so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người
bao gồm nhận diện kháng nguyên A và B yếu, loại bỏ kháng thể lẫn tạp, hiệu quả
18
giá thành và nguồn kháng thể có sẵn không phụ thuộc vào người. Đã có nhiều báo
cáo sản xuất thành công kháng thể đơn dòng chuột để xác định nhóm máu hệ ABO
[23, 25]. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều thuốc thử xác định nhóm máu hệ
ABO có bản chất là kháng thể đơn dòng đã được thương mại như: Febrile Antigen
Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin
international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient).
Tuy nhiên, kháng thể đơn dòng sử dụng để xác định nhóm máu hệ ABO vẫn chưa
được sản xuất tại Việt Nam.
Cho đến nay, Việt Nam chưa có đơn vị hay tổ chức nào sản xuất được mAb
đặc hiệu dùng để định nhóm máu hệ ABO và hệ Rh. Hầu hết huyết thanh mẫu đang
được sử dụng để chẩn đoán nhóm máu đều nhập ngoại với giá thành khá cao. Trước
đây, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương đã tự sản xuất huyết thanh mẫu từ
huyết tương tách từ máu của nguời tình nguyện. Phương pháp này tốn ít chi phí
nhưng sử dụng nhiều máu thu gom từ tình nguyện viên. Nếu tiếp tục sản xuất huyết
thanh mẫu theo phương pháp này sẽ ảnh hưởng đến sản lượng máu dùng cho chữa
bệnh, mà mục tiêu và ý nghĩa cao cả của hiến máu nhân đạo là để chữa bệnh cứu
người khi cả thế giới chưa nghiên cứu được máu nhân tạo thay thế.
Trên thị trường Việt Nam, một số công ty được Bộ Y tế cấp phép nhập khẩu
huyết thanh mẫu có chứng chỉ CE như Bio-Rad Việt Nam và Biotech Việt Nam.
Biotech Việt Nam phân phối huyết thanh mẫu do hãng Spinreact, Tây Ban Nha sản
xuất với giá 280.000 đồng/bộ gồm 3 lọ huyết thanh anti A, anti B và anti AB (mỗi
lọ 10 ml). Còn hãng Bio-Rad đang chào bán huyết thanh mẫu với giá 600.000
đồng/bộ gồm 3 lọ huyết thanh anti A, anti B và anti AB (mỗi lọ 10 ml). Như vậy, số
tiền cần bỏ ra để nhập khẩu huyết thanh mẫu đủ để định nhóm máu hệ ABO thu
gom hàng năm khoảng vài chục tỷ đồng, và để xét nghiệm nhóm máu hệ ABO trên
toàn quốc lên đến vài trăm tỷ đồng. Đây là con số thực sự lớn trong bối cảnh nước
ta còn nghèo nhưng người bệnh lại phải chi trả tiền thuốc men chữa trị quá lớn.
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2): 203-208.
2. Lê Quang Huấn và Lã Thị Huyền (2009), “Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng”. NXB Khoa học và công nghệ, Hà Nội
Tài liệu Tiếng Anh
3. Abhyankar A (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific
for human blood group B”. Journal of Hematological Malignancies, 2(2), p. 7.
4. ATTC (2011), “Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for
continuous cell line”
5. Aymard JP (2012), “Karl Landsteiner (1868–1943) and the discovery of
blood groups”, Transfus Clin Biol, 19(4-5), P.244 -248
6. Berger M (2002), “Therapeutic applications of monoclonal antibodies”, The
American Journal of the Medical Sciences, 324(1), p.14-30
7. Borrebaeck CA (2000), “Antibodies in diagnostics - from immunoassays to
protein chips”, Immunology Today, 21(8), p.379 – 382
8. Committee I (2012) “Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats”. the
University of North Carolina at Chapel Hill
9. Council N (1999), “Monoclonal Antibody Production”. National Academy
Press, Washington.
10. Fouad (2005), “Production of a new anti-A monoclonal reagent”, African
Journal of Bioteachnology, 4(8), p.3.
11. Fulle A (1992), “Immunization of Mice”. Current Protocols in Molecular
Biology.
12. Greenfield E.A (2014), “Antibodies: A laboratory manual, second edition”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
13. Iyer YS (2006), “Production of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal
53
Medicin Research, 123(4), p. 561.
14. Izumi K, (2001), “Antigen–Antibody Binding”, Encyclopedia of life science
15. John B. Zabriskie (2009), “Essential Clinical Immunology”, Cambridge
University Press, United Kingdom.
16. Khan F (2002), “Lectins as markers for blood grouping”, Medical Science
Monitor, 8(12), p.293-300
17. Martine L (2001), “Molecular characterization of a monoclonal murine anti-
blood group A antibody”, Immunology Letters, 76(1),
18. Mika K,(2003), “Molecular characterization of a human monoclonal
antibody to B antigen in ABO blood type”, Immunology Letters, 86(1), pp. 45-51
19. Laura D (2005), “Chapter 1. Blood and the cells it contain, Blood groups and
red cell antigens”, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD).
20. Laura D (2005), “Chapter 2. Blood group antigen are surface marker on the
red blood cell membrane. Blood groups and red cell antigens”, National Center for
Biotechnology Information, Bethesda (MD).
21. Lundblad AK (1963), “Monoclonal antibody formulation for diagnostic use”,
US 4618486.
22. Parham, P (2009), “The Immune System, third edition”, Garland Science.
23. Pandey, S (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal
antibodies”. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research,
1(2): p. 7.
24. Pelegrin M (2004), Monoclonal antibody-based genetic immunotherapy,
Current Gene Therapy Journal, 4(3), p.347 – 356
25. Shinya S (2014), “Routes of Administration”. The Laboratory Mouse,
National Institute of Animal Health, Tsukuba, Japan.
26. Kamala T (2007), “Hock immunization: A humane alternative to mouse
footpad injections”, J Immunol Methods, 328(1-2), p.204–214.
27. Wang, S (2011), “Advances in the production of human monoclonal
antibodies”. Antibody Technology Journal, 2001(1): pp. 1-4.
28. Blood transfusion http://www.medicinenet.com/blood_transfusion/article.htm, 29/2/2016
54
29. International Society of Blood Transfusion (2014) http://www.isbtweb.org, 29/2/2016
30. A Report of the Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council, "Monoclonal Antibody Production", National Academy Press, 1999
http://grants.nih.gov/grants/policy/antibodies.pdf 26/09/2016
