Upload
recalo-paulina
View
288
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1. Introducere
1.1. Mioglobina
Mioglobina este localizată in celulele musculare şi are ca funcţie preluarea oxigenului din
sânge şi stocarea acestuia pană la momentul la care este consumat în aceste celule în vederea
producerii de energie.
In mioglobină, hemul este înconjurat de un lanţ polipeptidic, care se împachetează în
spaţiu pentru închide în interiorul său fierul, limitând accesul potenţialilor liganzi dinspre
exterior. Mai mult, sistemul imidazolic aparţinând catenei laterale a uneia dintre histidinele din
lanţul polipeptidic se coordinează la fier, care ajunge astfel să fie pentacoordinat, cu o singură
poziţie de coordinare liberă; această poziţie liberă este menţinută special pentru legarea
oxigenului molecular.
Mioglobina este o hemoproteina, structural şi funcţional foarte similar cu hemoglobina, o
proteină care constă dintr-un lanţ polipeptidic relativ mic, de 153 reziduuri aminoacizi care
conţine un hem cu un atom de fier.
Hemul este pigmentul propriu-zis a hemoglobinei şi gruparea prostetică a acesteia, în
timp ce globina, alcătuită în special din aminoacizii lizină şi histidină, constituie partea proteică a
macromoleculei. Hemul respirator se formează doar în jurul fierului bivalent (ion feros - Fe2+),
ionul feric (Fe3+) fiind incapabil de a fixa oxigenul gazos.
Mioglobina şi hemoglobina au trăsături similare, un examplu: ambele existe în formele:
deoxi-, în care fierul este complet redus la forma Fe+2, oxi-, formată prin reacţia oxigenului
(HbO2 , MbO2) şi met- în care fierul este oxidat la Fe+3 şi nu reacţionează cu oxigenul. Când
oxigenul reacţionează cu forma redusa (deoxi-) este favorizată şi oxidarea Fe+2 la Fe+3 (forma
met), care se suprapune peste adiţia reversibilă a oxigenului la forma deoxi.
1.2. Spectrometria UV-VIS Metoda se bazează pe interacţiunea radiaţiilor UV-Vis de regulă din domeniul spectral
120 – 900 nm cu proba. Domeniul spectral 120 – 400 nm este domeniul ultraviolet (sub 190 nm
domeniul UV de vid), iar domeniul 400 – 800 nm domeniul vizibil.
Se bazeaza pe trimiterea unui fascicul luminos prin proba de interes, si pe determinarea in
ce măsură proba absoarbe această lumină, responsabili de aceasta absorbţie fiind electronii din
straturile de valenţă ale moleculelor din probă, care, absorbind lumina, sunt promovaţi pe orbitali
de energie superioară, anterior liberi.
Interacţiunea poate avea loc cu atomii, ionii şi moleculele din probă sau pot avea loc
interacţiuni pe baza proprietăţilor optice ale probelor de a reflecta, dispersa şi de roti planul
luminii polarizate.
Elemente componente ale unui spectrofotometru sunt:
• Sursa primară de radiaţie;
• Dispozitivul de monocromare a radiaţiei şi selectare lungime de undă (monocromatoare
sau policromatoare);
• Detectorul optic;
• Sistemul de condiţionare a semnalului (amplificatorul);
• Sistemul de citire şi afişare rezultat;
Legea lui Lambert – Beer descrie relaţia de legătură dintre absorbanţă, grasimea stratului
absorbant de probă (grosimea cuvei) şi concentraţia speciilor absorbante.
A=b*c*l
2. Materiale şi metodeSe prepara solutii tampon pentru valorile de pH 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, concentratiile
acestora fiind de 200 mM. Soluţiile tampon se prepară în apa de ultrapura. Soluţiile se
etichetează şi se depozitează în sticle, de preferinţă închise la culoare. Soluţiile se depozitează la
rece dar trebuie aduse la temperatura camerei înainte de fiecare experiment. Se va verifica (şi
ajusta, dacă este cazul) pH-ul la începutul fiecărei şedinţe săptămânale, dacă soluţia respectivă
urmează să fie folosită.
Calea aleasa pentru prepararea solutiilor de pH dorit a fost pregatirea solutiei uneia dintre
componente, la concentratia dorita, si ajustarea ulterioara a pH-ului cu un acid sau o baza dupa
caz, monotorizandu-se cu pH-metrul.
Pentru a calcula cantitatea necesară de materiale solide, utilizate în prepararea soluţiilor
tampon se foloseşte relaţiile:
n=c ∙V
n= mM , n reprezentant numarul de moli,
c = 200 mM ( 0.2 M )
V = 250 ml
m=M ∙200 ∙250[mM ]=0.05 ∙M
Macetat = 136 g
Mfosfat = 138.011 g
Mborat = 202 g
MCAPS = 221 g
Mglicina = 75.07 g
Tabel 1
pH Material pKa Cantitatea [g] Apă [ml]
2 Fosfat 2.15 6.9 250
3 Glicina 2.35 3.753 250
4Acetat
4.766.8
250
5 4.76 250
6
Fosfat
7.20
6.9
250
7 7.20 250
8 7.20 250
9Borat
9.2310.1
250
10 9.23 250
11 CAPS 10.40 11.05 250
12Fosfat
12.336.9
250
13 12.33 250
Se prepară soluţiie tampon dupa cantităţiile prevăzute în Tabelul 1.
pH-ul se ajustează cu ajutorul unui pH metru, al cărui electrod se ţine în CCl4, şi înainte de
folosire se spală bine cu apă ultrapură, după care se calibrează cu o soluţie tampon (de calibrare),
care are un pH constant la o temperatură dată.
• Soluţia tampon cu pH=2;
pHinitial = 5.76 + HCl => pH=2;
• Soluţia tampon cu pH=3;
pHinitial = 6 + HCl => pH=3;
• Soluţia tampon cu pH=4;
pHinitial = 8.26 + HCl => pH=4;
• Soluţia tampon cu pH=5;
pHinitial = 8.56 + HCl => pH=5;
• Soluţia tampon cu pH=6;
pHinitial = 5.27 + NaOH => pH=6;
• Soluţia tampon cu pH=7;
pHinitial = 5.55 + NaOH => pH=7;
• Soluţia tampon cu pH=8;
pHinitial = 5.33 + NaOH => pH=8;
• Soluţia tampon cu pH=9;
pHinitial = 9.29 + HCl => pH=9;
• Soluţia tampon cu pH=10;
pHinitial = 9.28 + NaOH => pH=10;
• Soluţia tampon cu pH=11;
pHinitial = 4.6 + NaOH => pH=11;
• Soluţia tampon cu pH=12;
pHinitial = 5.27 + NaOH => pH=12;
• Soluţia tampon cu pH=13;
pHinitial = 5.20 + NaOH => pH=13;
Soluţiile tampon se păstrează închise, ferite de lumină şi de căldură.
Solutia de mioglobina se pastreaza, preferabil, in concentratii de 1-5 mM. Peste
mioglobina ferica adaugam apa pura, pe urma se agita cu grija si asteptam sa se aseze solutia.
Extragerea probelor din solutiile stoc se va face tot timpul cu varfuri noi, utilizandu-se pipete
Eppendorf. In acest caz, solutia de mioglobina are concentratia de 1 mM si se pastreaza
obligatoriu in frigider. Pentru prepararea solutiei de mioglobina s-a realizat un amestec
echimolar (1:1) de mioglobina din inima de cal si apa ultrapura.
Inainte de fiecare utilizare se verifica concentratia solutiei pentru a avea reproductibilitate
in metoda utilizata. Pentru aceasta se verifica absorbanţa la pH=7, deoarece acest pH este cel mai
apropiat de pH-ul fiziologic. In cuva se pune 700 µl de soluţie tampon, cu care se face Baseline-
ul. După ce a fost stabilita linia de zero, se scoate cuva din spectrometru, se adaugă peste 5 µl
mioglobina şi traseaza spectrul. Se stabileste astfel, lungimea de unda la care absorbanta solutiei
este maxima.
A = ε · b · c
b = 1 cm
A = 1.383663
ε = 188
c= Aε ∙b
=1.3836631 ∙188
=7.36 ∙10−3mM
Deoarece în cuvă am pus 5 µl de mioglobina şi 700 µl de soluţie stoc, concentraţia
iniţială se calculează după ecuaţia:
C1 · V1 = C2 · V2
C1=7.36 ∙10−3 ∙705
5=1.038mM
Concentraţia soluţiei tampon va fi 50 mM. Domeniul de realizare a spectrului UV-Vis
pentru o proteină este de obicei 260-800 nm, insa de multe ori pentru mioglobină şi alte
hemoproteine se înregistrează spectrul doar în domeniul 400-750 nm. Pentru o proteină se va
observa întotdeauna un maxim în jur de 280 nm, datorat materialului proteic. Alături de acesta,
proteine ca mioglobina prezintă cofactori sau grupări prostetice cu absorbanţa în domeniul
vizibil. Un spectru UV-VIS ideal are absorbanţele cuprinse în intervalul 0.1-1 unităţi.
Pentru a determina absorbanţele soluţiile tampon se diluează de 3 ori ( 1 soluţie tampon :
3 apă ultrapură), se pune 700 µl, cu care se face linia de zero, după care se adaugă 5 µl
mioglobină, şi se înregistrează spectrul. Absorbanţele se citesc la lungimile de unda, la care s-a
stabilit ca apare maximul de absorbtie.
280 330 380 430 480 530 580 630 6800
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
pH = 2pH = 3pH = 4pH = 5pH = 6pH = 7pH = 8pH = 9pH = 10pH = 11pH = 12pH = 13
Lungimea de unda
Abso
rban
ta
Fig. 2. Spectrul UV-VIS al mioglobinei la pH = 2÷ 13 (Domeniul 280-650 nm)
La pH = 2 ÷ 4 proteina se denaturează, rupandu-se legaturile de hidrogen din structura.
Când are loc creşterea pH-ului se obţin benzi asemănătoare cu spectrul mioglobinei,
deoarece pH-ul se apropie de pH-ul fiziologic. Se observă o bandă intensă (banda Soret) la,
aproximativ, 410-430 nm, care in mediu acid sunt mai intense, iar în mediu bazic mai putin.
La pH bazic Fe este hexacoordinat, şi are loc o acumulare de OH -. Dacă la Fe se leagă
OH- acesta devine de spin jos, iar când face legătură cu apa, acesta devine de spin înalt.
Influenţa pH-ului asupra mioglobinei
450 470 490 510 530 550 570 590 610 630 6500
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
pH = 2pH = 3pH = 4pH = 5pH = 6pH = 7pH = 8pH = 9pH = 10pH = 11pH = 12pH = 13
Lungimea de unda
Abso
rban
ta
Fig. 3. Influenţa pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 ÷ 13 ( 450-650 nm)
580 590 600 610 620 630 640 6500
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Punctul izosbestic
pH = 2pH = 3pH = 5pH = 6pH = 7pH = 8pH = 9 pH = 10pH = 11pH = 12pH = 4pH = 13
Lungimea de unda
Abso
rban
ta
Fig. 4. Influenţa pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 ÷ 13 ( 580-650 nm)
In intervalul de 450 – 650 nm se observă suprapunerea benzilor pe la aproximativ 620
nm, ceea ce sugereaza existenta Fe in 2 forme de oxidare, in functie de pH diferind ligandul si
tiupl spinului.
La pH< 5 scade absorbanta şi la fel şi concentraţia mioglobinei, dar la pH > 8 are loc
creşterea absorbanţei, deci şi creşterea concentraţiei mioglobinei (absorbanta este direct
proportionala cu concentratia conform legii lui Lambert-Beer). La lungimi de undă mai mari
decat 700 nm mioglobina nu mai absoarbe.
In domeniul de pH în care proteina nu este denaturată, pH>4, se poate defini o constantă
pKa (logaritm zecimal din constanta de aciditate), care indică punctul de de echivalenţă dintre Fe
în stare de spin înalt sau jos. Pentru determinarea pKa-ului, se foloseşte un program de tip excel
reprezentându-se grafic absorbanţa în funcţie de pH, valoarea acesteia fiind determinată din
grafic, in acest caz punctul de echivalenta coincide cu acest pKa. Din grafic se poate vedea ca
pKa = 9.
2 4 6 8 10 12 140.015
0.017
0.019
0.021
0.023
0.025
0.027
0.029
0.031
pKa
pKa
Fig. 5. Determinarea pKa (absorbanta in functie de pH)
Influenţa unui agent reducător (ditionit de sodiu) asupra mioglobinei
Se prepară o soluţie de mioglobină la pH = 7; 10; 12, cu concentraţie de 20 mM. La
soluţii cu pH = 7 şi 10 se adaugă ditionit de sodiu, iar cu pH = 12 dioxid de tiouree.
Soluţiile tampon se diluează 1:5, folosindu-se apa ultrapura. Se pun în cuvă 700 µl din
această soluţie şi trage Baseline-ul, după care se pun 5 µl mioglobină şi se înregistrează spectrul.
Pentru urmărirea efectului unui agent reducător se adauga si câteva cristale de ditionit de sodiu în
cuvă şi se înregistrează încă odată spectrul.
370 420 470 520 570 6200
0.5
1
1.5
2
2.5
ph = 7pH = 7 cu ditionitpH = 10pH = 10 cu ditionitpH = 12pH = 12 cu tiouree
Lungimea de unda
Abso
rban
ta
Fig. 6. Efectul ditionitului de sodiu şi dioxidului de tiouree asupra concetraţiei mioglobinei
In cazul probei la pH = 7 s-a observat scăderea absorbanţei şi benzile se deplasează spre
vizibil. In cazul spectrului formei ferice maximul de absorbtie apare la 410 nm, iar în cazul
formei feroase apare la 430 nm, iar aceeasta scazand de la 0.9881132 la 0.6654195.
470 490 510 530 550 570 590 610 630 6500
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
pH = 7 cu ditionitpH = 7pH = 10pH = 10 cu ditionitpH = 12pH = 12 cu tiouree
Lungimea de unda
Abso
rban
ta
Fig. 7. Efectul ditionitului de sodiu şi dioxidului de tiouree asupra concetraţiei mioglobinei
Din spectrul inregistrat se poate observa ca la pH = 10 nu apar schimbări semnificative
faţă de pH = 7.
La pH = 12 se observă două peakuri la bandă fără dioxid de tiouree, iar cu agentul
reducător se observă doar un singur peak. Are loc o creştere a absorbanţei, de la 0.7285849 la
1.08099.
Dozarea activităţii peroxidazice printr-o metodă spectrofotometrică
Peroxidaza este o enzimă din clasa oxidoreductazelor ce catalizează oxidarea unor
substraturi organice pe seama reducerii apei oxigenate:
peroxidaza + H2O2 + substrat -> peroxidaza + H2O + substrat oxidat
Prepararea soluţiei de ascorbat
Mascorbat = 176.12 g/mol
200 mM = 0.2 M = 0.2 mol/l
n= mM
m = n · M = 0.2 · 176.12 = 25.224 g
25.224 g ............................1000 ml
x......................................1 ml
x = 0.0252 g
Soluţia de ascorbat de 200 mM se prepară prin dizolvarea 0.0252 g în 1 ml de soluţie
tampon pH = 5.
Se verifică concentraţia soluţiei de ascorbat prin spectrometrie UV-VIS. Se traseaza
Baseline-ul cu solutie tampon de pH=5, apoi se adauga ascorbatul si se inregistreaza spectrul.
A ~ 1 la λ = 290 nm
Prepararea soluţiei de peroxid
Se ia 50 µl de peroxid, peste care adauga 1 ml de apă ultrapură.
Se verifică concentraţia, când se face Baseline-ul cu apă ultrapură, după care se adauga
50 µl soluţie de peroxid şi se traseaza spectrul.
A = 2.62111
b = 1 cm
ε = 41
A = ε · b · c
c= Ab∙ ε
=2.6211141∙1
=0.0639M=36mM
Pentru a prepara soluţia cu concentraţia dorită (50 mM), soluţia necesară pentru determinare se calculează cu formula:
C1 · V1 = C2 · V2
10 · 64 = 50 · x => x = 12.8 ml
480 500 520 540 560 580 600 620 6400
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
Influenta ascorbatului
pH = 6pH = 8pH = 6 cu H2O2pH = 8 cu H2O2pH = 6 cu H2O2 si ascorbatpH = 8 cu H2O2 si ascorbat
Lungimea de unda
Abso
rban
ta
Fig. 8. Influenţa ascorbatului asupra mioglobinei, în soluţii cu pH = 6 şi 8
Prin adăugarea apei oxigenate Fe(II) oxideaza la Fe(III). La pH = 6 după adăugarea
ascorbatului intensitatea benzii scade, ceea ce înseamnă, că fierul tinde să revine la starea de
oxidare initiala. In cazul probei la pH = 8 banda reprezintă două maxime, după adăugarea
ascorbatului, care înseamnă că forma ferică la pH=8 este mai stabilă decât cea feroasa.
Se studiază comportamentul mioglobinei la pH = 6, când se adaugă peroxidază în
diferite concentraţii.
Soluţia tampun cu pH = 5
[µl]Mioglobina [µl] Ascorbat [µl] Peroxid [µl]
982.6 15.38 2 0
980 15.38 2 2
970 15.38 2 10
960 15.38 2 20
948 15.38 2 32
Se prepară soluţiile dupa datele intabelate.
In cuvă se pune soluţia tampon, cu care inregistreaza punctul zero, după care se adauga
ascorbatul şi peroxidul şi se porneşte reacţia. După aproximativ 5 secunde se deschide
spectrometrul, se adauga rapid cantitatea de mioglobină, se agită şi se măsoară în continuare
spectrul.
Vpanta se citeşte din panta dreptei, reprezentându-se mai intai grafic absorbanţa în funcţie de timp,
pentru fiecare concentraţie.
Peroxid [µM] vpanta vcalc Vmax 0.05 Vteoretic Diferenta Suma
Km 600 0 0 0.0000 0.000 0 0.00018 kcat
100 0.0055 0.0157 0.007 7.25771E-05 0.004167500 0.0083 0.0236 0.023 8.24878E-07
1000 0.0124 0.0353 0.031 1.64907E-05 1600 0.0161 0.0458 0.036 8.99375E-05
0 200 400 600 800 100012001400160018000.00000.00500.01000.01500.02000.02500.03000.03500.04000.04500.0500
Curba de saturare pentru peroxid
Curba de saturare pentru peroxidLogarithmic (Curba de saturare pentru peroxid)Polynomial (Curba de saturare pentru peroxid)
Conc. Peroxid
Vite
za
Dupa utilizarea opţiunii SOLVER, se obtin urmatoerele date:
Peroxid [µM] vpanta vcalc Vmax 0.05965 Vteoretic Diferenta Suma
Km 600 0 0 0.0000 0.000 0 7.3E-05 kcat
100 0.0055 0.0157 0.009 5.09878E-05 0.004971500 0.0083 0.0236 0.027 1.20991E-05
1000 0.0124 0.0353 0.037 3.88374E-06 1600 0.0161 0.0458 0.043 6.07605E-06
0200
400600
8001000
12001400
16001800
0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.050
Curba de saturare pentru peroxid
Curba de saturare pentru peroxidLogarithmic (Curba de sat-urare pentru peroxid)Polynomial (Curba de sat-urare pentru peroxid)
Conc. Peroxid
Vite
za
Concluzii
Mioglobina la pH < = 4 se denaturează, la pH>5 este stabilă
La pH = 6 forma oxidată a mioglobinei este mai puţin stabilă decât la pH = 8